2 Materialien und Methoden

2.1  Materialien

2.1.1  Chemikalien und Biochemikalien

Wenn nicht anders angegeben, ist der Reinheitsgrad der Chemikalien p. a., der der Lösungsmittel HPLC-grade. Gebräuchliche Chemikalien stammen von den Firmen Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) und Sigma (Deisenhofen) und sind nicht gesondert aufgeführt. HPLC-Laufmittel wurden bei Baker (Deventer, Niederlande) erworben.

Die verwendeten Substrat-Fettsäuren

• cis-11,14-Eicosadiensäure
• cis-5,8,11-Eicosatriensäure
• cis-8,11,14-Eicosatriensäure
• cis-11,14,17-Eicosatriensäure
• cis-5,8,11,14-Eicosatetraensäure (Arachidonsäure)
• cis-9,12-Octadecadiensäure (Linolsäure)
• cis-6,9,12-Octadecatriensäure (γ-Linolensäure) und
• cis-9,12,15-Octadecatriensäure (α-Linolensäure)

stammen von Sigma, Deisenhofen.

Ungewöhnliche Arachidonsäure-Derivate (siehe 3.2.1) wurden von I. Ivanov (Lomonosov State Academy of Fine Chemical Technology, Moskau, Russland) synthetisiert (Ivanov et al., 2000).

In dieser Arbeit wurden zwei Modellbiomembranen verwendet:

Submitochondriale Partikel (SMPs) wurden von Dr. Kerstin Schnurr, Deutsches Institut für Ernährungsforschung, Bergholz-Rehbrücke, zur Verfügung gestellt und wurden aus Rinderherzen präpariert (Crane et al., 1956).

Eine Präparation von Endoplasmatischem Retikulum (EKRM, EDTA-high-salt-stripped rough microsomes) erfolgte aus Hunde Pankreas und wurde von Dr. Martin Wiedmann, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, zur Verfügung gestellt.

LB-Medium:

• 1% Bacto-Trypton
• 0,5% Hefe-Extrakt
• 0,5% NaCl
• 1 mM NaOH

LB-Agar:

LB-Medium + 1,5% Bacto-Agar

Die Antibiotikakonzentrationen in den Medien betrugen 100 mg/l Ampicillin (Amp) und für Bakterienklone, die das Prep4-Plasmid enthielten zusätzlich 25 mg/l Kanamycin (Kan).

PBS (phosphate buffered saline):

• 150 mM NaCl
• 3 mM KCl
• 8 mM Na₂HPO₄
• 1,5 mM KH₂PO₄
• pH 7,4

TAE-Puffer (Tris/Acetat/Essigsäure-Puffer) :

• 40 mM Tris
• 20 mM Natriumacetat
• 29,6 mM Essigsäure
• 2 mM EDTA
• pH 7,8

Weitere Puffer für spezielle Methoden werden in den entsprechenden Abschnitten beschrieben.

Es wurden folgende Primer für die Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX verwendet, deren Synthese von der Firma TIB MOLBIOL, Berlin, durchgeführt wurde:

Einführung der Sal I-Schnittstelle am N-Terminus:

Agg AAA CAg gTC gAC ggT gTC TAT CgC gTC

Trunkationsexperimente:

Mutanten für Versuche zur Membranbindungsfähigkeit der 15-LOX:

Primer für die humane 5-LOX:

Einführung der Sal I-Schnittstelle am N-Terminus:

Agg AAA CAg gTC gAC CCC TC TAC ACg gTC

Als zweiter Primer bei Mutagenesen diente jeweils die komplementäre Sequenz.

Die molekularbiologischen Arbeiten erfolgten nach Standardprotokollen aus der Literatur (Sambrock et al., 1989) bzw. entsprechend der Herstellerangaben. Hierzu zählen die Spaltung der DNA mit Restriktionsendonukleasen, die Ligation von DNA Fragmenten, die Präparation kompetenter Bakterien-Zellen, die Transformation von E. coli, sowie Arbeiten zur Gewinnung und Reinigung von DNA wie Plasmidpräparation im analytischen und präparativen Maßstab und Agarosegelelektrophoresen.

2.2.1  Polymerasekettenreaktion

Für die Umklonierung der rekombinanten Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX und der humanen 5-LOX, sowie für die Erzeugung von Punktmutationen (s. u.) kam die Polymerasekettenreaktion (PCR) zum Einsatz.

Es wurde folgendes Standardprotokoll verwendet:

PCR-Ansatz:

• 25 ng Template DANN
• 5 µl Puffer (10x)
• 3 µl Mg SO4 (25 mM)
• 5 µl 5’-Primer (5µM)
• 5 µl 3’-Primer (5µM)
• 1 µl dNTP-Mix (je 10 mM)
• 0.5 µl Polymerase (5 U/µl)
• mit bidest auf 50 µl

Zeitprogramm:

1. 1. 94°C 4 min
2. 94°C 40 s
3. 3. 65°C 1 min
4. 4. 72°C 2 min (Schleife an 2., 29 Zyklen)
5. 5. 72°C 10 min

Zur Erzeugung von Punktmutationen wurde die Überlappungs-Verlängerungs-Technik (overlap-extension) verwendet. Hierzu wurde zunächst für jeden der beiden DNA-Stränge eine PCR mit dem entsprechenden Mutagenese-Primer und einem stromauf- bzw. stromabwärtsliegenden Primer durchgeführt, so dass man zwei sich überlappende DNA-Fragmente jeweils mit der Punktmutation erhielt. In einer anschließenden dritten PCR wurden diese DNA-Fragmente als Template und die beiden außen liegenden Primer aus den PCRs 1 und 2 eingesetzt, so dass ein einzelnes DNA-Produkt mit der entsprechenden Punktmutation synthetisiert wurde. Nach Spaltung mit Restriktionsenzymen erfolgte dann abschließend die Ligation in den entsprechend gespaltenen Wildtyp-Expressionsvektor.

Einige der Mutanten zur Untersuchung der Membranbindungsfähigkeit sowie die Mehrfachmutanten wurden mit dem QuikChange Site-directed-Mutagenesis-Kit der Firma Stratagene unter Verwendung des Standardprotokolls erzeugt.

Um eine einfache und schnelle Reinigung der LOX zu ermöglichen, wurde das Enzym als (His)₆-tag Fusionsprotein exprimiert. Als Expressionsplasmid wurde pQE-9 gewählt, welches einen N-terminalen His-tag im richtigen Leserahmen gewährte.

2.3.1  Ligation der 15-LOX-cDNA in pQE-9

Um die 15-LOX in das pQE-9 Plasmid ligieren zu können, musste zunächst eine Sal I Schnittstelle unter Mutation des Start-Methionins eingeführt werden. Dazu wurde eine add-on PCR mit Taq-Polymerase durchgeführt, wobei der 3’-Primer hinter einer unikalen Sfi I Schnittstelle innerhalb der kodierenden Region der cDNA liegend gewählt wurde. Das Produkt wurde über ein Agarose-Gel gereinigt und in den pgem-T Vektor ligiert, aus dem das gewünschte DNA-Fragment dann mit den Restriktionsenzymen Sal I und Sfi I herausgeschnitten wurde. Das zweite benötigte Fragment wurde aus der 15-LOX cDNA mit Sfi I und Hind III herausgeschnitten. Da die direkte Ligation der beiden Fragmente in das Expressionsplasmid pQE-9 nicht gelang, wurde zunächst in den mit Sal I und Hind III geschnittenen und dephosphorilierten pBluescript-Vektor ligiert. Nach Transformation in Top10-Zellen wurde aus dem präparierten Plasmid die komplette 15-LOX cDNA dann wieder mit Sal I und Hind III herausgeschnitten und in den mit den gleichen Restriktionsenzymen behandelten und dephosphorilierten pQE-9 Vektor ligiert. Dies führte zu einer Änderung des Enzym-N-Terminus (Met-Arg-Gly-Ser-(His) ₆ -Gly-Ser-Val-Asp-LOX-(Gly-Val...)).

Das 15-LOX-pQE-9 Plasmid wurde in M15[prep4]-Zellen transformiert, diese auf LB_Amp/Kan-Platten ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden verschiedene Klone auf ihre 15-LOX-Aktivität überprüft (2.4.1.2). Der Klon mit der höchsten Enzymaktivität wurde zur Kontrolle durchsequenziert und für eine Vorkultur verwendet (15 ml LB_Amp/Kan), die bei 37°C und 200 UpM über Nacht inkubiert wurde. 4 ml der Vorkultur wurden verwendet, um jeweils 1 l Hauptkultur (LB_Amp/Kan) zu inokulieren. Diese Kultur wuchs bei 37°C und 200 UpM bis zu einer optischen Dichte (OD_600nm) von ca. 1,0 (ungefähr 16 h), bevor die Enzymexpression durch Zusatz von 1 mM IPTG (Endkonzentration) induziert wurde. Nach einer Inkubation bei 30°C für 2 h wurden die Zellen abzentrifugiert (4000 g, 4°C, 15 min), mit PBS gewaschen und bis zur weiteren Verwendung bei –80°C gelagert. Diese Vorgehensweise ergab sich aus einer Optimierung der Expressionsbedingungen. Es konnte keine 15-LOX-Aktivität gemessen werden, wenn nach Zugabe von IPTG eine Inkubation bei 37°C erfolgte. Ebenso führte eine längere Expression, sowie eine IPTG-Zugabe bei geringerer optischer Dichte zu einem Verlust von Enzymaktivität.

Die Zellen der Expressionskultur wurden in PBS resuspendiert (10 ml pro l Ausgangskultur) und entweder mit Ultraschall lysiert (5 mal 10 s 300 W Impulse, 0°C) oder mit einem Zellhomogenisator (Emulsiflex C5, Avestin) aufgeschlossen. Letzteres führte zu einer deutlich höheren Ausbeute an aktivem Enzym. Zelltrümmer wurden abzentrifugiert (14000 UpM im SS34 Rotor, 4°C, 30 min) und der Überstand mit Nickel-Agarose (200 µl pro l Ausgangskultur) bei 4°C für 30 min im Überkopf-Schüttler inkubiert. Die Ni-Agarose wurde niedertourig abzentrifugiert (2 min 1000 UpM), in eine Leersäule überführt und zweimal mit dem fünffachen Säulenvolumen Waschpuffer gewaschen. Das Enzym wurde anschließend in halbsäulenvolumen-Fraktionen mit dem Elutionspuffer eluiert und entweder mit 10% Glyzerin versetzt, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80°C bis zur Verwendung gelagert oder über Q-Sepharose weiter gereinigt.

Eine höhere Imidazolkonzentration im Waschpuffer führte bereits zur teilweisen Elution des Enzyms und konnte daher nicht verwendet werden.

Um eine Bindung des Enzyms an Q-Sepharose zu ermöglichen, musste die Imidazol- und Salzkonzentration der Enzymlösung nach der Ni-Agarose Reinigung verringert werden. Als am effektivsten wurde eine 1:50 Verdünnung mit 10 mM Tris/HCl-Puffer pH 7,4 mit 10% Glyzerin ermittelt. Eine Dialyse war weniger geeignet, da zum einen das Enzym längere Zeit 4°C ausgesetzt gewesen wäre (Verlust der Aktivität), zum anderen es bei konzentrierten Proben zu Proteinpräzipitation kam. Die verdünnte Enzymlösung wurde über 200 µl Q-Sepharose pro Liter Ausgangskultur in einer Polypropylensäule gegeben, mit dem fünffachen Säulenvolumen Tris/Glyzerin-Puffer gewaschen und das Enzym in Halbsäulen-Fraktionen mit 120 mM KCl in Tris/Glyzerin-Puffer eluiert. Weitere gebundene Proteine wurden mit vier Säulenvolumen 1 M KCl in Tris/Glyzerin-Puffer eluiert. Die Enzymfraktionen wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80°C gelagert.

Die cDNA der positionsspezifitätverändernden Mutanten lag in dem Arbeitskreis bereits vor. Die relevanten LOX-Fragmente konnten daher mit geeigneten Restriktionsenzymen herausgeschnitten und in den analog behandelten 15-LOX-pQE-9 Vektor ligiert werden.

F353L mit Kpn I und Dra III ♢ ca. 1300 bp
I418A mit Kpn I und Dra III ♢ ca. 1300 bp
I593A mit Dra III und Hind III ♢ ca. 400 bp

Eine Transformation dieser Konstrukte und der Mutanten, die über die Überlappungs-Verlängerungs-Technik erzeugt wurden, erfolgte analog zum Wildtyp in M15[prep4]-Zellen. Ebenso entspricht das weitere Vorgehen zur Enzympräparation dem der (His)₆-15-LOX.

Bei Mutanten, für deren Erzeugung das QuikChange Site-Directed-Mutagenesis-Kit verwendet wurde, erfolgte eine Transformation in XL-1 Blue-Zellen. Da aus diesen Zellen eine vergleichbare Enzymmenge gewonnen werden konnte, wie aus den M15[prep4]-Zellen, wurde auf eine Umklonierung verzichtet. Die Expression des Enzyms erfolgte analog mit Medien, die nur Ampicillin als Antibiotikum enthielten.

Eine zur Expression der 15-LOX analoge Strategie für die humane 5-LOX gelang nicht, da das entsprechende His-tag-5-LOX-Fusionsprotein katalytisch inaktiv war. Die 5-LOX wurde daher über das Expressionsplasmid pkk5LOX in Top10 Zellen gewonnen:

Die Expression der 5-LOX erfolgte analog zur 15-LOX, jedoch wurde bereits bei einer optischen Dichte von OD₆₀₀=0,6-0,8 die Enzymexpression durch Zusatz von 1 mM IPTG induziert. Die weitere Inkubation erfolgte bei 30°C über Nacht. Die Bakterien wurden abzentrifugiert und nach Waschen mit PBS in 2 ml Puffer A pro Liter Ausgangskultur aufgenommen. Nach Zelllyse durch Ultraschall wurden die Zelltrümmer abzentrifugiert und der Überstand entweder als Enzympräparation eingesetzt oder über ATP-Sepharose gereinigt. Hierzu wurde die Sepharose zunächst mit Puffer C beladen und mit Puffer A gewaschen, um ungebundenes ATP zu entfernen. Anschließend wurde das Bakterienlysat auf die Säule gegeben, mit 10 ml Puffer B gewaschen und die 5-LOX mit 12 ml Puffer C in 2 ml Fraktionen eluiert. Analog wurde die 5-LOX-vierfach-Mutante F359W,A424I, N425M,A603I gereinigt.

Zur Sicherung der Lipoxygenase-exprimierenden bakteriellen Klone wurden jeweils Glyzerinkulturen angelegt. Hierzu wurde 1 ml einer Übernacht-Schüttelkultur mit 1 ml Glyzerinkultur-Lösung gemischt und zu 250 µl Portionen in flüssigem Stickstoff eingefroren und gelagert.

2.4.1  Messung der Lipoxygenaseaktivität

2.4.1.1  Photometrischer Aktivitätsassay

Photometrische Messungen wurden an dem Spektrophotometer UV-160 A der Firma Shimadzu durchgeführt. Dabei wurde die zeitabhängige Absorptionszunahme bei dem Absorptionsmaximum des Reaktionsproduktes, 235 nm für konjugierte Diene, und einer Temperatur von 20°C verfolgt. Der Standardassay bestand aus 950 µl Phosphatpuffer
pH 7,4, dem Enzym und 50 µl Substratlösung (Endkonzentrationen Substrat 260 µM, Cholat 0,2%). Die Reaktion wurde durch Zugabe des Substrats gestartet und der Absorptionsverlauf nach kurzem Rühren gemessen. Für viele Messungen wurde auch eine Substratkonzentration von 100 µM ohne Cholat-Zusatz verwendet.

Die Umsetzung des Substrats (100 µM) mit LOX im Standardassay erfolgte in 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,4 in einem Volumen von 500 µl für 15 min bei Raumtemperatur. Anschließend wurden die gebildeten Hydroperoxyverbindungen mit Natriumborhydrid reduziert, der pH-Wert mit konzentrierter Essigsäure auf 3-4 eingestellt und 500 µl Methanol zugegeben. Nach Vortexen und Zentrifugation (10 min 20000 g) wurde der Überstand direkt für die Umkehrphasen-HPLC (RP-HPLC) verwendet.

Für Umsätze mit der 5-LOX bzw. deren Mutanten wurde als Puffer PBS mit den Zusätzen 0,1 mM ATP, 0,1 mM EDTA und 12,5 µg/ml Dipalmitoylphosphatidylcholin verwendet.

Für die Aktivitätsuntersuchung einzelner Bakterienklone wurde das Pellet einer 5 ml Kultur (2.3.2) in 500 µl des entsprechenden Puffers resuspendiert und Bakterien nach Substratzugabe (100 µM) mit Ultraschall aufgeschlossen (50 W, 2 mal 15 Impulse, 0°C). Anschließend wurde wie für den Standardassay beschrieben weiterverfahren.

RP-HPLC wurde an einer HP-Chemstation mit einem HP 1040A Diodenarraydetektor durchgeführt. Als Trennsäule diente eine Nucleosil C-18 Säule (250 x 4 mm, Machery-Nagel, Düren) mit einer entsprechenden Vorsäule (30 x 4 mm). Das Laufmittel bestand aus Methanol/Wasser in unterschiedlichen Verhältnissen, meist 80/20, und 0,1% Essigsäure, die Flussrate betrug 1 ml/min. Die Detektion erfolgte im Extinktionsmaximum der zu untersuchenden Verbindung:

• 235 nm konjugierte Diene (Hydro(pero)xyfettsäuren)
• 242 nm doppelt-konjugierte Diene (DiH(P)ETE)
• 270 nm konjugierte Triene (DiH(P)ETE)
• 300 nm konjugierte Tetraene (Lipoxine)
• 210 nm Fettsäuren

2.4.2  Produktanalyse

LOX-Produkte konnten häufig bereits in der RP-HPLC über den Vergleich der Retentionszeiten und der Absorptionsspektren mit denen von authentischen Standardsubstanzen identifiziert werden. Über Eichkurven erstellt mit Standardsubstanzen konnten die entsprechenden Verbindungen über die Flächen der detektierten Peaks quantifiziert werden.

Zur weiteren Analyse wurden einzelne Produkte aufgefangen und, nachdem das Laufmittel unter Vakuum verdampft wurde, der Normalphasen-HPLC (SP-HPLC), Chiralphasen-HPLC (CP-HPLC) oder der Massenspektrometrie (MS) zugeführt.

2.4.2.1  Normalphasen-HPLC

Neben der Identifizierung der Produkte über Retentionszeit und Spektrum in der RP-HPLC ist es zum Teil notwendig, eine weitere Untersuchung von Produkten durchzuführen, die in der RP-HPLC nur unzureichend getrennt wurden. Dazu werden die zur Trockne eingeengten Fraktionen aus der RP-HPLC in n-Hexan/0,1% Essigsäure aufgenommen und über die SP-HPLC weiter untersucht. Dies erfolgte über eine Nucleosil 100-7 Säule (250x4 mm, Machery-Nagel, Düren) mit einem SPD-M6A-Detektor (Shimadzu). Die Detektion erfolgte wie bei der RP-HPLC bei dem Extinktionsmaximum des untersuchten Produktes, in der Regel also bei 235 nm für konjugierte Diene (HETE, HODE). Als Laufmittel diente ein n-Hexan/Isopropanol Gemisch (unterschiedliche Verhältnisse, meist 2% Isopropanol) mit 0,1% Essigsäure und einer Flussrate von 1 ml/min.

Produkte aus nicht-enzymatischen Reaktionen, z. B. aus Autoxidation, sind racemisch, während die LOX-Reaktion stereospezifisch abläuft unter Bildung von Produkten in der S-Konfiguration (Ausnahme R-LOXn). Zur Überprüfung, ob tatsächlich ein LOX-Produkt vorliegt, musste also die Enantiomeren-Zusammensetzung bestimmt werden. Hierzu wurde das entsprechende aufgefangene und zur Trockne eingeengte Produkt aus RP- oder SP-HPLC in n-Hexan/0,1% Essigsäure aufgenommen und der Chiralphasen-HPLC (CP-HPLC) zugeführt. Hier erfolgte eine Trennung der Enantiomeren über chirale Säulen (Chiralcel OD bzw. OB, 250x4,6 mm, Diacel Chem. Industries, USA) mit dem Laufmittel n-Hexan/2-Propanol (wechselnde Zusammensetzung) und 0,1% Essigsäure. Die Flussrate betrug 1 ml/min, die Detektion erfolgte bei der entsprechenden Wellenlänge (235 nm für konjugierte Diene) mit dem SPD-M6A Detektor (Shimadzu). Aufgrund gleicher Absorptionseigenschaften der beiden Enantiomere konnte deren Verhältnis aus den Peakflächen berechnet werden.

Die Strukturen der Produkte, für die es keinen authentischen Standard gab, der für die Cochromatografie in der HPLC verwendet werden konnte, wurden über Massenspektrometrie (MS) bestimmt.

LC/MS:

Hierzu wurden die HPLC gereinigten Substanzen in einem 1:1 Gemisch aus Methanol und 50 mM Ammoniumhydrogencarbonat pH 8.0 aufgenommen und über die Negativ-Ionen-Massenspektrometrie analysiert. Aliquots der Probe wurden mit 3 µl/min in die auf 200°C erhitzte Injektions-Kapillare eines LCQ-Ionenfallen-Massenspektrometers (Thermoquest, Engelsbach) eingespritzt. Die Ionisierung der Proben erfolgte mittels Elektrospray bei
4 kV. Die Ionen wurden im negativ-Modus in einem Bereich von m/z 100-500 detektiert. Weitere Fragmentierung einzelner Molekül-Ionen (MS/MS) erfolgte bei einer Spannung zwischen 10 und 40 Volt.

GC/MS:

Für die Analyse von Produkten über GC/MS wurden diese zunächst über RP- bzw. SP-HPLC gereinigt. Anschließend mussten sie folgenderweise derivatisiert werden: Carboxylgruppen wurden mit Diazomethan verestert (2.8.3) und Hydroxygruppen mit Bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamid in trockenem Pyridin silyliert. Die Messungen wurden an einem Shimadzu GC/MS QP-2000 System, ausgerüstet mit einer fused silica Kapillare SPB 1 (30 m x 0,32 mm, Beschichtungsdicke 0,25 µm), durchgeführt. Eine Injektor-Temperatur von 270°C, Ionenquellen-Temperatur von 180°C und Elektronen-Energie von 70 eV wurden eingestellt. Die Fettsäurederivate wurden mit folgendem Temperaturprogramm eluiert: 2 min 180°C isotherm, danach Erhöhung der Temperatur mit einer Rate von 5°C/min bis 290°C, abschließend 5 min isotherm bei 290°C.

Für weiterführende Analysen wurden vor der Silylierung der Hydroxygruppen Doppelbindungen der Fettsäurederivate hydriert. Dazu wurden 10 µg der Fettsäure in 1 ml Ethanol mit 5 mg Palladium/Aktivkohle als Katalysator versetzt und anschließend Wasserstoff für zwei Minuten bei Raumtemperatur hindurchgeleitet. Nach Abfiltrieren des Katalysators wurde das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand in 20 µl Dodekan aufgenommen.

Zur Bestimmung der Proteinkonzentration wurde das Roti-Quant System (Roth, Karlsruhe), basierend auf der Methode nach Bradford, verwendet. Für die Eichung wurden verschiedene BSA-Konzentrationen im Bereich von 1 mg/ml bis 8 mg/ml verwendet.

Für SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophoresen (SDS-PAGE) wurde die Methode nach Laemmli angewandt (Laemmli, 1970). Es wurden 10% Mini-Gele verwendet und die Elektrophorese bei 27-30 mA durchgeführt. Anschließend erfolgte die Färbung der Proteine mit Coomassie und Trocknung des Gels oder ein Western Blot.

Proteine wurden nach Auftrennung über die SDS-PAGE auf eine Nitrozellulose-Membran nach der semi-dry Methode geblottet (1 h, 10 V). Der Blot wurde mit 5% Magermilch in PBS/0,1% TWEEN-20 blockiert und mit dem ersten Antikörper inkubiert (1 h). Nach intensivem Waschen mit PBS/TWEEN kam als zweiter Antikörper ein Peroxidase-Konjugat zum Einsatz (Inkubationszeit 1 h). Der Blot wurde nach erneutem intensiven Waschen mit PBS/TWEEN mit dem Western-Lightning Chemilumineszenz Plus Reagenz behandelt und zwischen 1 s und 20 s auf einen Röntgenfilm (Kodak) gelegt. Für eine quantitative Auswertung wurde die Intensität der Banden auf dem Röntgenfilm unter Verwendung des Programms Phoretix 1D (Phoretix International, Newcastle, Großbritannien) densitometrisch bestimmt.

2.5  Bestimmung von Enzymeigenschaften

2.5.1  Kinetische Konstanten K_M und V_Max

Die Bestimmung der kinetischen Konstanten K_M und V_Max erfolgte über ein Lineweaver-Burk-Diagramm. Hierzu wurde für verschiedene Substratkonzentrationen zwischen 5 und 150 µM ein photometrischer Aktivitätsassay durchgeführt und die linearen Anfangsgeschwindigkeiten des Substratumsatzes gemessen. Für jede Substratkonzentration wurden mindestens drei Messungen durchgeführt und die Standardabweichungen bestimmt. Aus der doppelt reziproken Auftragung von Substratkonzentration und Reaktionsgeschwindigkeit (Lineweaver-Burk-Diagramm) wurden die kinetischen Konstanten durch Extrapolation ermittelt.

Es wurde jeweils ein Standard-Aktivitätsassay bei verschiedenen pH-Werten zwischen 6 und 11 durchgeführt und Produkte über die RP-HPLC quantifiziert. Als Puffer wurden für pH-Werte zwischen 6 und 9 Phosphat-Borat-Puffer nach Kolthoff eingesetzt, für höhere pH-Werte Borat-Puffer nach Sörensen.

Zur Bestimmung der Substratspezifität der 15-LOX und deren Mutanten wurden photometrische Aktivitätsassays (2.4.1.1) mit verschiedenen Substratfettsäuren (100 µM) durchgeführt. Aus dem linearen Abschnitt des Absorptionsverlaufs bei 235 nm wurde die jeweilige Umsatzrate bestimmt. Zur Ermittlung der Positionsspezifität wurden Produkte über RP-HPLC aufgetrennt (2.4.1.2).

Die Substratspezifität der 5-LOX und deren Mutanten wurde ausschließlich über die HPLC ermittelt (2.4.1.2). Auch hier wurden die verschiedenen Fettsäuren jeweils in einer Konzentration von 100 µM eingesetzt.

2.6  Untersuchungen mit Hemmstoffen

2.6.1  Bestimmung von IC₅₀-Werten

Eine Größe für die Messung der inhibitorischen Wirkung eines Stoffes ist der sogenannte IC₅₀-Wert. Dieser Wert gibt die Hemmstoffkonzentration an, bei der nur noch 50% der ursprünglichen Enzymaktivität vorhanden sind. Für die Ermittlung ist also immer die Bestimmung der ungehemmten Enzymaktivität zur Normierung notwendig. Darüber hinaus werden verschiedene Hemmstoffkonzentrationen eingesetzt, aus denen sich die Halbhemmungskonzentration inter- bzw. extrapolieren lässt. Hier wurde für die Bestimmung der Enzymaktivität der photometrische Aktivitätsassay eingesetzt (2.4.1.1), wobei Enzym (29 nM native 15-LOX) und Hemmstoff für 30 s vorinkubiert wurden und der Reaktionsstart durch Zugabe von Substrat (260 µM Linolsäure) erfolgte.

Zur Bestimmung des Hemmmechanismus von Ebselen wurden Kinetiken bei unterschiedlichen Hemmstoffkonzentrationen am Photometer aufgenommen (2.5.1). Dabei erfolgte die Zugabe des Ebselens als konzentrierte Lösung in Methoxyethanol, so dass die Lösungsmittelkonzentration immer unter 2% blieb, wodurch die LOX-Reaktion nicht beeinflusst wurde. Es erfolgte entweder eine Inkubation der Grundzustands-Fe[II]-LOX (29 nM) mit Ebselen (0-1 µM) für 30 s vor dem Reaktionsstart durch Zugabe des Substrats, oder es wurden Substrat und Ebselen (0-10 µM) vorgelegt und durch LOX-Zugabe (29 nM) gestartet (keine Vorinkubation). Die für beide Varianten aufgenommenen Kinetiken wurden jeweils in einem Lineweaver-Burk-Diagramm aufgetragen, aus dem über den Schnittpunkt der Grafen die Art der Hemmung, kompetitiv oder nicht-kompetitiv, ermittelt wurde.

Darüber hinaus wurde der Einfluss von Glutathion auf die Hemmung der Fe[II]-LOX untersucht, indem ein 300facher molarer Überschuss Glutathion entweder vor oder nach der Vorinkubation von Ebselen und LOX zugesetzt wurde.

Die Untersuchung einer möglichen Modifizierung von Ebselen erfolgte über RP-HPLC. Ebselen und dessen Metabolite wurden über eine Nucleosil C-18-Säule (KS-System, 250 x 4 mm, Partikelgröße 5 µm, Machery-Nagel GmbH, Düren, Deutschland) mit einem Laufmittel bestehend aus Methanol/Wasser/Essigsäure im Verhältnis 55/45/0,1 und einer Flussrate von 1 ml/min aufgetrennt. Die Absorption bei 325 nm wurde gemessen.

Zur Überprüfung, ob Ebselen kovalent an die 15-LOX bindet, wurden Versuche mit ¹⁴C-Ebselen durchgeführt. Dazu wurde die native 15-LOX (32 nM) mit 0, 0,5 und 2 nmol ¹⁴C-Ebselen für 5 min in 1 ml 10 mM Ammoniumhydrogencarbonatpuffer pH 7,0 inkubiert. Anschließend wurde der Puffer unter Vakuum verdampft und der Rückstand in Elektrophorese-Probenpuffer ohne Merkaptoethanol aufgenommen. Aliquots wurden für die SDS-PAGE eingesetzt (2.4.4). Das Gel wurde mit Coomassie gefärbt, getrocknet und für die Exposition eines Röntgenfilms verwendet. Ein Kontrollexperiment wurde mit Merkaptoethanol im Probenpuffer durchgeführt.

Um die Stöchiometrie der 15-LOX-Ebselen-Wechselwirkung zu bestimmen, wurden Dialyseexperimente durchgeführt. Hierzu wurde die native 15-LOX (380 nM) mit ¹⁴C-Ebselen (8 µM) in 1 ml 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,4 für 2 min inkubiert. Anschließend wurde dieser Ansatz gegen 2 l des gleichen Puffers dialysiert und zu verschiedenen Zeitpunkten (0-30 h) Aliquots aus dem Dialyseschlauch entnommen. Die Radioaktivität in diesen Aliquots wurde durch Flüssig-Szintillationszählung bestimmt und das Verhältnis von Ebselen zu LOX ermittelt (spezifische Radioaktivität des ¹⁴C-Ebselens: 8 Ci/mol). In einem zweiten Dialyseexperiment wurde dem Dialysepuffer 1 mM Glutathion zugesetzt.

2.6.5.1  Grundlagen der Röntgenabsorptionsspektroskopie

Eine geeignete Methode zur Untersuchung der Ligandensphäre von Metallen stellt die Röntgenabsorptionsspektroskopie dar, wenn bereits Kenntnisse über die vermutlichen Geometrien vorliegen. Hiermit können Anzahl und Entfernung der Metallliganden bestimmt werden, jedoch nur bedingt deren Typ (Stickstoff, Sauerstoff usw.). Im Fall von verdünnten Proben und damit auch der Untersuchung von Ligandensphären in biologischen Proben wird die Fluoreszenz gemessen. Der Verlauf dieser Spektren ist im Wesentlichen identisch zu den Absorptionsspektren.

Grundlage ist die Absorption von Röntgenstrahlung durch innere, d.h. kernnahe, Elektronen (z. B. 1s) eines Metalls und damit deren Anregung. Erreicht die Röntgenstrahlung eine bestimmte Energie, wird ein Elektron ins Kontinuum promoviert, d.h. es wird aus dem Atom ’herausgeschlagen’. Bei dieser Energie tritt eine Kante (edge) im Absorptionsspektrum auf (Abb. 10). Vor dieser Kante (pre-edge) werden Absorptionseffekte beobachtet, die auf einer Anregung von kernnahen Elektronen auf höhere Energieniveaus beruhen. Die Lage der Kante und der Bereich kurz vor bis kurz nach der Kante liefern Informationen über die Art des Metallatoms (z. B. Eisen, Kupfer usw.), dessen Oxidationszustand (z. B. Fe[II], Fe[III]) sowie Anzahl und Geometrie der Liganden (XANES, X-ray Absorption Near Edge Structure). Der Bereich ca. 30 bis maximal 1000 eV oberhalb der Absorptionskante (erweiterte Region) weist eine Feinstruktur auf, aus der die Abstände der Liganden bestimmt werden können (EXAFS, Extended X-ray Absorption Fine Structure).

	Abb. 10 : Beispiel eines Absorptionsspektrums mit der Kantenregion. Der Bereich um die Absorptionskante wird in der XANES-Spektroskopie ausgewertet, die Feinstruktur der erweiterten Region ist für EXAFS-Untersuchungen wichtig.

Diese Feinstruktur geht auf ein Interferenz-Phänomen zurück. Das durch Absorption der Röntgenstrahlung einer Energie knapp oberhalb der Absorptionskante emittierte Photoelektron breitet sich gemäß der Quantenmechanik als Welle aus (Wellenlänge λ_Elektron, Abb. 11) und kann somit an benachbarten Atomen gestreut werden. Dabei kommt es bei der Überlagerung von zurückgestreuter und ausgehender Welle durch Phasenverschiebung zu Interferenzen. Die Wellen können sich am Absorberatom (hier Eisen) konstruktiv (resultierendes Maximum, Abb. 11a) oder negativ überlagern (resultierendes Minimum, Abb. 11b). Das entstehende Absorptionsmuster, die Feinstruktur, ist charakteristisch für die Art der zurückstreuenden Atome sowie deren Abstand zum Ursprung der ausgehenden Welle (dem Metallatom). Dies macht man sich in EXAFS-Untersuchungen zu Nutze.

	Abb. 11 : Entstehung der Röntgenabsorptions-Feinstruktur am Beispiel eines Eisenatoms mit Stickstoff-Liganden. Emittierte und zurückgestreute Welle überlagern sich, wodurch sich das Absorptionsmuster bildet.

4 ml einer 40 µM Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX-Lösung wurden mit einem zehnfachen molaren Überschuss Ebselen für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert, was zu einer mehr als 90%igen Inaktivierung führte. Anschließend wurde ungebundenes Ebselen durch Gelfiltration entfernt (Econopak PD-10 Säulen, Pharmacia, Uppsala, Schweden) und der Puffer wurde gegen einen flüchtigen Ammoniumbicarbonat-Puffer pH 7,0 ausgetauscht. Nach Lyophilisierung wurde die Probe in die Plastikmesszelle überführt und bis zur Messung bei -80°C gelagert. Analog wurde mit einer LOX-Referenz-Probe (keine Ebselen-Behandlung) verfahren. Die Röntgenabsorptions-Untersuchungen wurden am European Molecular Biology Laboratory (EMBL) bei HASYLAB (Deutsches Elektronen Synchrotron, Hamburg) von Dr. R. Wiesner und J. Rathmann (Institut für Biochemie, Charité, Humboldt-Universität zu Berlin) durchgeführt. Eine absolute Energie-Einteilung wurde durch eine Kalibrierungstechnik nach Pettifer und Hermes eingeführt, die zu einer Genauigkeit besser als 0,2 eV führte (Pettifer und Hermes, 1985). Es wurden Serien von 32 Spektren für die Ebselen-behandelte Probe, bzw. 25 für die LOX-Referenz aufgenommen. Der Messbereich lag zwischen 6900 und 7900 eV, in der Nähe der Absorptionskante wurde die Energie in 0,3 eV Schritten erhöht. Aus Vergleichen von erstem und letztem Spektrum einer Serie konnte keine Schädigung der Proteinproben während der Messungen festgestellt werden.

In Abb. 12 ist der Aufbau für EXAFS-Messungen dargestellt. Aus Synchrotron-Strahlung wird die entsprechende monochromatische Welle über zwei Silizium(III)-Kristalle herausgefiltert und harmonische Wellen höherer Ordnung durch Regulation des zweiten Kristalls minimiert. Die Probe befindet sich in einer Plastikzelle, deren Messfenster von einer Kaptonmembran verschlossen sind. Sie wird auf 20 K gekühlt, um Schädigungen der Probe und Atombewegungen zu minimieren. Es werden sowohl Fluoreszenz als auch Absorption gemessen.

	Abb. 12 : Instrumenteller Aufbau für EXAFS-Messungen (nach W. Meyer-Klaucke, EMBL).

Zur Extraktion der Spektren aus den Rohdaten wurde ein Programmpaket von H.-F. Nolting und C. Hermes verwendet (EXPROG: EMBL EXAFS data analysis and evaluation program package for PC/AT, H.-F. Nolting und C. Hermes, 1992). Hiermit wurden die Spektren auf Artefakte untersucht, normiert und energiekalibriert. Die Werte der verbliebenen Fluoreszenzkanäle wurden anschließend addiert und gemittelt. Aus dem so
erhaltenen Spektrum wurde die Feinstruktur extrahiert, indem eine lineare Funktion an den Untergrund vor der Kante und eine Spline-Funktion mit wenigen Knoten oberhalb der Kante angepasst wurde.

Die Auswertung der EXAFS-Spektren erfolgte mit dem Excurve Programm (Version 92, CCLRC Daresbury Laboratory, Warrington, England). Zunächst wurde das theoretische Spektrum eines Modells (2.8.1) berechnet, welches anschließend durch Variation verschiedener Parameter an das experimentelle Spektrum angepasst wurde. Dabei wurden die Spektren mit k² gewichtet. Der Amplitudenreduktionsfaktor wurde konstant gehalten (0,8), die Fermi-Energie freigegeben. Imidazolringe wurden zunächst nur als Ganzes in ihrem Abstand variiert. Für sie wurde Mehrfachstreuung verwendet.

Das Modell für die Kinetik der Hemmung der LOX durch Ebselen wurde in Kooperation mit Dr. Holzhütter, Institut für Biochemie, Charité, Humboldt-Universität zu Berlin, erstellt. Für den Fit der beiden Gleichungen (1) und (2) (3.2.2.5)an die experimentellen Daten wurde das SIMFIT Software-Paket verwendet.

2.7.1  Membranbindungsassay

Die eingesetzten gereinigten Enzyme wurden zur Abtrennung von Präzipitationen 10 min bei 4°C und 20000 g zentrifugiert. Es folgte eine 5 minütige Inkubation bei Raumtemperatur von 1 µg (bzw. 2,5 µg) LOX mit 200 µg SMP als Modellmembranen in 50 mM HEPES Puffer pH 7,4 mit 150 mM NaCl, 5 mM MgCl₂ und 1 mM DTT. Das Gesamtvolumen betrug 25 µl. Anschließend wurden die Proben auf 100 µl eines Sacharose-Kissens
(500 mM Sacharose in dem gleichen Puffer) gegeben und in einer Beckmann Tabletop Ultrazentrifuge für 15 min bei 100000 g und 4°C zentrifugiert. Das Pellet beinhaltet den membrangebundenen Teil der LOX und wurde in 25 µl zweifach Probenpuffer (Roti Load, Roth, Karlsruhe) aufgenommen. Der zuvor vorsichtig abgenommene Überstand wurde zur besseren Handhabung mit einer Ovalbumin-Lösung versetzt (Endkonzentration 60 µg/ml) und Proteine mit Trichloressigsäure (Endkonzentration 10%) gefällt. Nach Zentrifugation (20000 g, 20 min, 4°C) wurde das Pellet ebenfalls in 25 µl zweifach Probenpuffer aufgenommen und Aliquots (10 µl) der 20000g und 100000 g Pellets in einer SDS-PAGE aufgetrennt (2.4.4). Als Kontrolle erfolgten analoge Versuche ohne Membranzugabe. Anschließend wurde ein Western Blot durchgeführt (2.4.5). Als erster Antikörper wurde ein RGS-His-Antikörper in der Verdünnung 1:4000 verwendet, als zweiter kam ein Peroxidase gekoppelter anti-Maus-IgG Antikörper, ebenfalls in der Verdünnung 1:4000, zum Einsatz. Nach Behandlung mit dem Western-Lightning Chemilumineszenz Plus Reagenz und Exposition eines Röntgenfilms wurden die Anteile der 15-LOX in Pellet und Überstand densitometrisch bestimmt (2.4.5) und miteinander verglichen.

Zur Bestimmung der Zeitabhängigkeit der Membranbindung wurde die LOX mit SMP inkubiert und zu verschiedenen Zeitpunkten (5 min bis 2 h) jeweils der membrangebundene Enzymanteil bestimmt.

Die jeweilige LOX-Spezies wurde mit 0,5 mg SMP in PBS für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert, das Gesamtvolumen des Ansatzes betrug 500 µl. Zur Kontrolle erfolgte eine Inkubation ohne Enzym. Die Reaktion wurde mit Methanol gestoppt, Peroxide mit Natriumborhydrid reduziert und nach Einstellung eines sauren pH-Wertes mit Essigsäure, die Lipide nach der Methode von Bligh-Dyer (Bligh und Dyer, 1959) extrahiert. Anschließend erfolgte eine alkalische Hydrolyse der extrahierten Lipide mit 6% methanolischer KOH unter Argon-Atmosphäre bei 60°C für 30 min. Nachdem mit konzentrierter Essigsäure ein saurer pH-Wert eingestellt und Präzipitate abzentrifugiert wurden (10 min, 20000 g, 4°C), konnten Aliquots der Probe direkt in der RP-HPLC verwendet werden. Zur besseren Quantifizierbarkeit und Vergleichbarkeit verschiedener Proben wurde in einigen Fällen das Hydroxyfettsäure/Fettsäure-Verhältnis für Linolsäure und Arachidonsäure und deren Derivate bestimmt.

Neben der Quantifizierung der gebildeten Hydroxyfettsäuren aus Biomembranen als Substrat wurde noch ein weiteres Experiment zur Untersuchung der Membranoxygenaseaktivität von LOX-Mutanten gewählt. Die Inkubation von EKRM mit der 15-LOX führt zu einer Durchlässigkeit der Membran, so dass luminale Proteine freigesetzt werden. Dadurch sind sie im Überstand eines Sedimentationsversuchs nachweisbar, wohingegen sie bei intakten Membranen nur im Pellet zu finden sind. Für die Messung der Membranoxygenaseaktivität wird die Quantifizierung der Freisetzung des luminalen Enzyms Protein-Disulfid-Isomerase (PDI) aus EKRM herangezogen.

Da viele der Mutanten eine veränderte Fettsäureoxygenaseaktivität im Vergleich zum Wildtyp besaßen, wurde als Normierung die Linolsäureoxygenierung verwendet. Hierzu wurden die Linolsäureumsätze mit dem entsprechenden Enzym nach einer Minute am Photometer bestimmt (2.4.1.1) und für die nachfolgenden Experimente die gleiche Linolsäureoxygenaseaktivität eingesetzt. Die jeweilige LOX-Spezies wurde mit EKRM bei 26°C unter leichtem Schütteln in 50 mM HEPES Puffer pH 7,4 mit 150 mM NaCl, 5 mM MgCl₂ und 1 mM DTT inkubiert (Gesamtvolumen 100 µl). Als Kontrolle diente ein analoger Ansatz ohne Enzymzugabe. Aliquots (25 µl) wurden nach 30 min, 120 min und 240 min entnommen und wie unter 2.7.1 für den Membranbindungsassay beschrieben weiter verfahren (Ultrazentrifugation, TCA-Fällung, SDS-Gel, Western Blot). Im Western Blot wurde zunächst ein anti-PDI-Antikörper aus Kaninchen in der Verdünnung 1:4000 verwendet, als zweiter Antikörper diente ein Peroxidase gekoppelter anti-Kaninchen-IgG Antikörper, ebenfalls in der Verdünnung 1:4000. Die Quantifizierung der Banden erfolgte analog zu 2.7.1 über Chemilumineszenz und densitometrische Messung.

2.8.1  Modellierung der Struktur der Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX

Zur Erstellung von Modellen der Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX und der Sojabohnen LOX-1 mit gebundener Arachidonsäure bzw. Ebselen im aktiven Zentrum wurde das Programm Hyperchem 4.0 für SGI bzw. 5.0 für Windows verwendet. Nachdem die Arachidonsäure bzw. das Ebselen in die Bindungstasche hineinmodelliert wurde, erfolgte eine Energieminimierung des Moleküls und der umliegenden Aminosäureseitenketten.

Für die Vervollständigung der Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX-Kristallstruktur, d.h. die Hineinmodellierung der fehlenden Aminosäuren, wurde das Programm Swiss-PdbViewer 3.7 (Guex und Peitsch, 1997) verwendet. Für die eingefügten Aminosäuren wurde eine Energieminimierung (conjugate gradients) durchgeführt. Die Abbildungen 37 und 39 wurden mit dem Programm VMD (Humphrey et al., 1996) erstellt.

Sequenzvergleiche (Alignments) auf Protein- und DNA-Ebene wurden mit dem Programm ClustalW des European Bioinformatics Institute (EBI) unter Verwendung der Standardeinstellungen durchgeführt. Dieses Programm ist auch in der Lage, einen Vergleich mehrerer Sequenzen, beispielsweise aller tierischen LOXn, zu erzeugen (multiple alignment).

Restriktionskarten der Expressionsplasmide wurden mit den Programmen DNA-Strider, Version 1.0, und DNAssist, Version 1.03, erstellt.

Alle Arbeiten wurden unter einem Abzug durchgeführt. 100 ml Diethylether wurden mit 35 ml gekühlter 40%iger Kalilauge unterschichtet. In einem Eisbad wurden unter Schwenken in kleinen Portionen 0,1 mol Nitrosomethylharnstoff eingebracht und anschließend, 10 min nach der letzten Zugabe, die etherische Diazomethanlösung abgegossen. Nach Trocknung über festem Kaliumhydroxid für ca. 3 h wurde die Lösung bei -20°C gelagert.

Für die Veresterung von Carboxylgruppen wurde zu einer methanolischen Fettsäure- bzw. Hydro(pero)xyfettsäurelösung unter einem Abzug auf Eis etherische Diazomethanlösung gegeben, bis die Gelbfärbung über mehrere Minuten konstant blieb. Anschließend wurde der Diethylether mit Stickstoff verblasen. Auf diese Weise veresterte Fettsäuren wurden für den Einsatz als Substrat über HPLC gereinigt. Die nach dem LOX-Umsatz methylierten Hydro(pero)xyverbindungen wurden über HPLC bzw. MS identifiziert bzw. für den Vergleich von Produkten aus dem Umsatz mit LOXn herangezogen.