4 Diskussion

4.1  Enzymreinigung

In der gegenwärtigen Literatur werden LOXn mit einer Vielzahl von physiologischen Prozessen (Zellreifung, Biosynthese von Botenstoffen usw.) und der Pathogenese von Krankheiten (z. B. Karzinogenese, Atherosklerose) in Verbindung gebracht. Oftmals sind allerdings die veröffentlichten Ergebnisse widersprüchlich oder zumindest nicht eindeutig. Die im Rahmen dieser Arbeit entwickelte einfache Reinigungsstrategie, die vom Bakterienlysat in zwei Schritten zum elektrophoretisch reinen, rekombinanten Enzym führt (Abb. 13 und Abb. 14), kann dazu beitragen, offene Fragen zu beantworten. Zum einen wird der tierexperimentelle Aufwand zur Gewinnung von LOXn umgangen, der z. B. bei der Reinigung aus Kaninchenblut nötig wäre, zum anderen können Enzymmutanten in größeren Mengen und vor allem als sauberes Protein bereitgestellt werden. Dadurch ist es möglich, durch Fremdproteine verursachte Effekte auszuschließen. Auch für andere LOXn, z. B. die 12R-LOX, wurde diese Reinigungsstrategie inzwischen erfolgreich eingesetzt (Meruvu, unveröffentlichte Ergebnisse). Weitere mögliche Anwendungen für die so gereinigten LOXn sind die Immunisierung von Tieren und nachfolgende Gewinnung von spezifischen Antikörpern, sowie Kristallisationsversuche. Insbesondere bei letzteren werden große Mengen sauberen Proteins benötigt, die über diese Reinigungsstrategie zugänglich sein sollten. Bisher ist von tierischen LOXn nur die Struktur eines Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX-Inhibitor-Komplexes bekannt (2,4 Å Auflösung). Es besteht also großer Bedarf an weiteren Strukturinformationen, die zur Aufklärung von Reaktionsmechanismen und zur Entwicklung von neuen, spezifischen Inhibitoren von großem Nutzen wären. Ein weiteres Problem bei der Kristallisation von LOXn könnte durch Ergebnisse dieser Arbeit möglicherweise gelöst werden. Versuche mit der Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX ergaben, dass dieses Enzym dazu neigt, in konzentrierten Lösungen hochmolekulare Aggregate zu bilden. Dies führt zu Problemen bei der Kristallisation. Erste Versuche mit den Mutanten, bei denen oberflächenexponierte, hydrophobe Aminosäuren in geladene Aminosäuren ausgetauscht wurden, insbesondere mit der vierfach Mutante Y15E,F70H, L71K,L195E, ergaben eine deutlich geringere Tendenz zur Aggregatbildung, was mit Kleinwinkelstreuungsexperimenten nachgewiesen wurde (Prassl, Akademie der Wissenschaften, Graz, unveröffentlichte Ergebnisse).

Gegenwärtig wird die Positionsspezifität von LOXn für eine Einteilung dieser Enzyme verwendet. Hierbei handelt es sich jedoch nicht um eine unveränderbare Enzymeigenschaft. Vielmehr ist die Positionsspezifität abhängig von der Orientierung des Substrats im aktiven Zentrum. Modifizierungen des Substrats (Hamberg und Samuelsson, 1967;Kuhn et al., 1990;Schwarz et al., 1998) und/oder Punktmutationen kritischer Aminosäuren (Borngraber et al., 1999;Gan et al., 1996;Schwarz et al., 2001;Sloane et al., 1991) verändern die Positionsspezifität von LOXn durch die Beeinflussung der Substratbindung.

4.2.1  Substratbindung bei 12/15-Lipoxygenasen

Für 12- und 15-LOXn wird allgemein angenommen, dass die Substratfettsäure mit ihrem Methylende in die Substratbindungstasche eintaucht (Abb. 8) (Kuhn et al., 1986;Lehmann, 1994). Obwohl der direkte Beweis dieser Art der Substratbindung noch aussteht, beispielsweise durch Strukturdaten von LOX-Substrat-Komplexen, existiert eine Vielzahl von experimentellen Ergebnissen, die diese Theorie unterstützen. Hierzu zählt u. a. die Änderung der Positionsspezifität der 15-LOX in Richtung 12-Lipoxygenierung durch Verkleinerung der Seitenketten kritischer Aminosäuren. Die hierdurch erreichte Vergrößerung der Substratbindungstasche ermöglicht es der Fettsäure, tiefer einzutauchen, wodurch statt C-13 das Kohlenstoffatom C-10 der Arachidonsäure in die Nähe des Eisens gelangt. Diese Verschiebung der Positionsspezifität wurde hier auch für die His-tag-Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX und deren Mutanten I418A, F353L und I593A bestätigt.

Es wurde bereits beschrieben, dass 15-LOXn in der Lage sind, 5-Lipoxygenierung zu katalysieren, wenn eine 15-Lipoxygenierung aufgrund der strukturellen Eigenschaften des Substrats nicht möglich ist. So katalysieren die Soja-LOX-1 und auch die Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX die Bildung von 5S,15S-diHPETE (Schwarz et al., 1998;Van Os et al., 1981) aus 15S-HETE. In diesem Fall könnte das Substrat invers, d.h. mit der
Carboxylgruppe in der Bindungstasche, gebunden sein. Die gefundenen deutlich höheren K_M-Werte für diese Reaktion spiegeln die schlechtere Substratbindung durch Eintauchen der polaren Carboxylgruppe in die hydrophobe Bindungstasche wider.

In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal gezeigt, dass unter bestimmten Bedingungen
15-LOXn eine 5-Lipoxygenierung katalysieren, obwohl strukturell die 15-Lipoxygenierung möglich wäre. Auch hier wird als mechanistischer Hintergrund eine inverse
Substratbindung vorgeschlagen und die Produkte aus Umsätzen mit der 12-lipoxygenierenden 15-LOX-Mutante I418A (8-Hydroperoxyverbindungen) unterstützen diese Theorie (Abb. 20). Um eine inverse Bindung zu erzwingen, ist es notwendig, gleichzeitig beide Enden der Substratfettsäure zu modifizieren. Weder die Einführung sterisch anspruchsvoller Gruppen am Methylende, noch die Veresterung der Carboxylgruppe allein waren für eine vorrangig inverse Bindung ausreichend. Wurden diese beiden Modifizierungen jedoch gleichzeitig bei einem Substrat durchgeführt, scheint die inverse Substratbindung und damit die 5-Lipoxygenierung durch eine 15-LOX favorisiert zu sein.

Man kann die Bindung eines Substrats als Gleichgewichtsreaktion zwischen den beiden möglichen Anordnungen (Methyl- oder Carboxylende in der Bindungstasche) betrachten. Dieses Gleichgewicht wird durch funktionelle Gruppen an beiden Enden des Substrats beeinflusst. Polare oder sterisch anspruchsvolle Gruppen [-OH, -C(CH₃)₃] am Methylende sollten das Gleichgewicht in Richtung inverse Bindung verschieben. Die relativ hohe Energiebarriere, die mit der Einführung der Carboxylgruppe in die hydrophobe Bindungstasche einhergeht, wirkt dem jedoch entgegen und verhindert möglicherweise eine inverse Bindung. Wird diese Energiebarriere gesenkt, indem z. B. die Carboxylgruppe methyliert und damit ihre Polarität reduziert wird, kann das Gleichgewicht weiter in Richtung inverse Bindung verschoben werden. Der größere Anteil an 5-Lipoxygenierungsprodukten (bzw. 8-Lipoxygenierung im Falle von I418A und F353L), kann als Indiz hierfür angesehen werden. Allerdings muss man betonen, dass die beobachteten Produkte nicht notwendigerweise quantitativ das Bindungsgleichgewicht widerspiegeln müssen. Wird beispielsweise ein invers gebundenes Substrat aus sterischen oder anderen Gründen nicht oder nur sehr schlecht oxygeniert, so entsteht hauptsächlich das Produkt der ’normalen’ Substratbindung (hier 15-Lipoxygenierung), obwohl ein großer Anteil inverser Substratbindung stattgefunden hat.

Im Gegensatz zur 15-LOX, für die bereits viele experimentelle Daten zur Substratanlagerung vorlagen, weiß man über die Verhältnisse bei tierischen 5-LOXn relativ wenig. Zurzeit gibt es zwei alternative Hypothesen zur Substratbindung bei 5-LOXn (Abb. 8). Nach der Orientierungshypothese (Prigge et al., 1996;Prigge et al., 1998) binden 5-LOXn im Gegensatz zu den 12- und 15-LOXn Fettsäuren mit der Carboxylgruppe in der Substratbindungstasche. Diese Anlagerung vermag die Stereochemie der 5-LOX-Reaktion gut zu erklären. Allerdings sollte eine energetische Barriere existieren, die das Eintauchen der polaren Carboxylgruppe in die hydrophobe Bindungstasche stark erschwert.

Die Volumen-Hypothese geht von einer konservierten Substratbindung für alle LOX-Isoformen aus, d.h. die Fettsäure gelangt jeweils mit dem Methylende in die Substratbindungstasche (Browner et al., 1998). Die Positionsspezifität der LOXn wird durch die Größe der Bindungstasche bestimmt. Bei 5-LOXn erlaubt eine größere Tasche ein tieferes Eintauchen der Fettsäure, wodurch eine Oxygenierung in der Nähe der Carboxylgruppe ermöglicht wird. Strukturmodelle basierend auf Sequenzvergleichen ergaben dementsprechend eine um 20% größere Bindungstasche bei 5-LOXn als bei der 15-LOX (Browner et al., 1998;Gillmor et al., 1997). Der größte Nachteil dieser Hypothese besteht darin, dass sie die Stereochemie der 5S-Lipoxygenierung nur schwer erklären kann. Führt man sich jedoch die Flexibilität der Fettsäuren vor Augen, scheint es möglich, dass eine Konformation eingenommen wird, die das pro-S Wasserstoffatom am C-7 in der Nähe des Wasserstoffakzeptors positioniert.

Bisher wurde keine der beiden Theorien experimentell bewiesen. Da der direkte Nachweis über Struktur-Untersuchungen von 5-LOX-Substrat-Komplexen zurzeit nur schwer möglich ist, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Kombination aus ortsgerichteter Mutagenese und gezielter Substratveränderung angewandt. Während die Ergebnisse der 15-LOX katalysierten 5-Lipoxygenierung eine inverse Substratbindung bei diesem Enzym befürworten, deuten die Daten, die für die humane 5-LOX ermittelt wurden, auf eine konservierte Substratbindung hin und würden damit die Volumen-Hypothese bestätigen. So konnte gezeigt werden, dass die Verkleinerung der Substratbindungstasche durch ortsgerichtete Mutagenese die 5-LOX in ein 15-lipoxygenierendes Enzym umwandelt. Darüber hinaus müsste für eine Substratbindung nach der Orientierungstheorie eine Carboxylgruppe in die Enzymtasche eintauchen. Versuche mit der Dicarbonsäure ASR-COOH, einem symmetrischen Molekül dessen Enden beide für eine entsprechende Anlagerung nach der Orientierungstheorie optimal sein sollten, zeigten jedoch, dass sie kein geeignetes Substrat für die 5-LOX ist. Wird hingegen eine der beiden Carboxylgruppen methyliert, erfolgt eine Umsetzung und zwar analog einer konservierten Substratorientierung mit dem weniger polaren Methylester in der Bindungstasche (5-OH-Produkt).

4.2.3  Möglicher Einfluss einer positiv geladenen Aminosäure in der Substratbindungstasche auf die Substratorientierung

Eine inverse Substratorientierung könnte favorisiert sein, wenn sich am Fuß der Bindungstasche eine positiv geladene Aminosäure befände, die mit der negativ geladenen Carboxylgruppe der Fettsäure wechselwirken könnte. Entsprechende Beobachtungen wurden bei der Gurken-Linolsäure-13-LOX gemacht. Im Gegensatz zu den tierischen LOXn, die nach der Arachidonsäureoxygenierungsstelle eingeteilt werden, unterteilt man die pflanzlichen LOXn zumeist analog ihrer Linolsäureoxygenierungsstelle, da Arachidonsäure in Pflanzen praktisch nicht vorkommt. Bei einem Sequenzvergleich von pflanzlichen LOXn zeigte sich, dass der Aminosäurerest, der der Positionsdeterminante 418 der humanen Retikulozyten 15-LOX entspricht, auch bei pflanzlichen Enzymen einen Einfluss auf die Positionsspezifität haben könnte. Bei den pflanzlichen LOXn, die Linolsäure am C-13 oxygenieren, befindet sich dort eine sterisch anspruchsvolle Aminosäure (Phe, His), bei den
9-lipoxygenierenden Enzymen ein kleineres Val. Eine Mutation des entsprechenden His608 der Gurken-Linolsäure-13-LOX in das bei den 9-LOXn an dieser Stelle vorhandene Val führte zu einer Änderung der Positionsspezifität von 13- zu fast ausschließlich
9-Lipoxygenierung (Hornung et al., 1999).

	Abb. 42 : Linolsäure modelliert in die Bindungstasche der Gurken-13-LOX nach (Hornung et al., 1999). a) His608 schirmt die positiv geladene Aminosäure Arg758 von der Bindungstasche ab und verhindert eine Wechselwirkung mit der Carboxylgruppe der Linolsäure. b) Der Austausch His608Val lässt eine Wechselwirkung zwischen der Carboxylgruppe und Arg758 zu.

Ein Erklärungsansatz hierfür ist eine inverse Substratbindung. In einem Sequenzvergleich wurde bei allen pflanzlichen LOXn ein konserviertes Arg gefunden, welches sich, basierend auf der Soja-LOX-1 Struktur, in der Nähe des Fußes der Substratbindungstasche befindet. In einem Strukturmodell der Gurken-Linolsäure-13-LOX basierend auf der Soja-LOX-1-Struktur ist dieses Arg758 hinter dem verhältnismäßig großen His608 lokalisiert und wird so von der Substratbindungstasche abgeschirmt. Durch die Mutation His608Val wird das positiv geladene Arg möglicherweise von der Substratbindungstasche aus zugänglich und könnte nun mit der negativ geladenen Carboxylgruppe der Linolsäure in Wechselwirkung treten (Abb. 42). Dies müsste die mit dem Eintauchen der Carboxylgruppe in die ansonsten hydrophobe Bindungstasche verbundene Energiebarriere deutlich senken, was zu einer inversen Substratbindung führen könnte (Hornung et al., 1999).

Auch in diesem Fall könnte die veränderte Positionsspezifität durch eine konservierte Substratbindung erklärt werden. Bei der 13-Lipoxygenierung der Linolsäure findet eine [+2] Radikalverschiebung statt (Wasserstoffabstraktion am C-11), bei der 9-Lipoxygenierung eine [-2]-Verschiebung (Wasserstoffabstraktion ebenfalls am C-11). Die Richtung der Radikalverschiebung könnte auf unterschiedlichen Konformationen von Fettsäure und/oder Aminosäureseitenketten im aktiven Zentrum beruhen. Für eine inverse Substratbindung bei der His608Val-Mutante sprechen aber noch zwei weitere Ergebnisse: Substrate mit veresterter Linolsäure, die also keine freie Carboxylgruppe besaßen, wurden auch von dieser Mutante am C-13 oxygeniert, und der zusätzliche Austausch des Arg758 in ein ungeladenes Leu (His608Val,Arg758Leu-Doppelmutante) führte zu einer stark reduzierten Umsatzrate mit nur noch racemischen Oxygenierungsprodukten (Hornung et al., 1999). Diese Ergebnisse unterstützen die Wichtigkeit des Vorhandenseins einer geladenen Gruppe am Fuß der Substratbindungstasche bei dieser Enzymmutante. Weitere Versuche wären nötig, um die Substratbindung bei den pflanzlichen Linolsäure-9-LOXn detaillierter zu untersuchen und eine mögliche inverse Substratbindung bei diesen Enzymen zu bestätigen.

Die Modellierung der Struktur der humanen 5-LOX ergab keinerlei Hinweise auf geladene Gruppen im Bereich der Bindungstasche (Browner et al., 1998). Demzufolge wäre das Eintauchen der Carboxylgruppe in die hydrophobe Tasche wie oben bereits diskutiert nur durch Überwindung einer Energiebarriere möglich, was zu einer stark reduzierten Substrataffinität führen müsste. Die kinetischen Konstanten K_M und V_max der 5- bzw. 15-LOX katalysierten Arachidonsäureoxygenierung sind jedoch vergleichbar (Aharony und Stein, 1986).

Zusammenfassend lässt sich aus den experimentellen Ergebnissen folgendes über die Substratbindung bei LOXn ableiten:

Die Orientierung der Arachidonsäure im aktiven Zentrum ist für die untersuchten Enzyme (Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX, humane 5-LOX) konserviert, das heißt die Fettsäure wird mit dem Methylende in der Enzymtasche gebunden. Die humane 5-LOX ist nicht in der Lage, Substrate invers zu binden, bzw. invers gebundene Substrate zu oxygenieren. Diese Ergebnisse unterstützen die Volumen-Hypothese (Abb. 8a). Demgegenüber kann bei der Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX eine inverse Substratbindung erzwungen werden. Hierzu ist aber eine gleichzeitige Modifizierung beider Enden der Substratfettsäure nötig, also die Methylierung der Carboxylgruppe und die Einführung polarer oder sterisch anspruchsvoller Gruppen am Methylende. Die dann durch das Enzym katalysierte Reaktion ist eine 5-Lipoxygenierung, obwohl strukturell auch 15-Lipoxygenierung möglich wäre.

Die hier ermittelten Versuchsergebnisse liefern indirekte Hinweise auf die Substratbindung. Der letztendliche Beweis kann nur über die direkte Untersuchung der Struktur von Enzym-Substrat-Komplexen erfolgen. Da hierfür strikt anaerobe Bedingungen notwendig sind, um eine Reaktion zu verhindern, ist ein solches Experiment nur schwer durchzuführen. Am ehesten könnte dies durch Versuche im Weltraum geschehen. Alternativ könnten inaktive Enzymmutanten untersucht werden. Allerdings kann man bei inaktiven Enzymspezies nie mit Sicherheit sagen, dass keine strukturellen Veränderungen stattgefunden haben. Deshalb wäre der Schluß auf die Verhältnisse bei nativen Enzymen nur bedingt zulässig.

Es ist zu betonen, dass diese Ergebnisse nicht ohne weiteres auf andere LOX-Isoformen übertragbar sind. Es ist durchaus denkbar, dass die Bindungsverhältnisse bei anderen LOXn, insbesondere bei den pflanzlichen Enzymen, unterschiedlich sind. Für die Aufklärung der Substratbindung bei diesen Enzymen wären analoge Experimente notwendig.

4.3  Hemmung durch Ebselen und pharmakologische Relevanz

Die selenoorganische Verbindung Ebselen ist ein starker Inhibitor von tierischen LOXn. Für die katalytisch inaktive Fe[II]-LOX wurde eine annähernd vollständige Hemmung bereits im submikromolaren Bereich gefunden. Demgegenüber waren weitere häufig genutzte LOX-Inhibitoren, darunter der anti-atherosklerotisch wirkende LOX-Hemmstoff PD 146 176 (Sendobry et al., 1997), unter identischen experimentellen Bedingungen weit weniger effektiv.

4.3.1  Hemmmechanismen von Ebselen für die Lipoxygenase im Grundzustand und für die katalytisch aktive Form

Durch Untersuchung des Hemmmechanismus konnte gezeigt werden, dass die Fe[II]-LOX durch Ebselen irreversibel gehemmt wird und diese Hemmung einem nicht-kompetitiven Mechanismus folgt. Dem liegen folgende zwei Vorgänge zu Grunde: Ebselen bindet kovalent an das Enzym. Diese Bindung wurde bei nachträglicher Zugabe von SH-Komponenten wie Glutathion oder Merkaptoethanol aufgehoben, jedoch nur unvollständig und ohne Wiederherstellung der LOX-Aktivität. Darüber hinaus wurde die Eisenligandensphäre verändert, was durch Röntgenabsorptionsspektroskopie gezeigt wurde. Dies könnte durch eine Komplexierung des katalytisch aktiven Eisens erklärt werden, wobei Ebselen ein Wassermolekül als sechsten Eisenliganden verdrängt. Die Auswertung der EXAFS-Spektren unterstützt diese Annahme. Es wurde eine gute Übereinstimmung von experimentellem und theoretischem Kurvenverlauf für den LOX-Ebselen-Komplex erzielt
(Abb. 27). Für einen solchen Ebselen-Eisen-Komplex ist es notwendig, dass Ebselen in die Substratbindungstasche gelangt. Da es sterisch anspruchsvoller und weniger flexibel ist als die Substrat-Fettsäuren, wurde untersucht, ob es in die Bindungstasche passt, ohne dass größere Veränderungen in der Enzymstruktur notwendig sind. Die durchgeführten molekularen Modellierungen des Enzym-Ebselen-Komplexes basierend auf der Raumstruktur der Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX ergaben keine sterischen Hindernisse, die eine Bindung des Ebselens in der Nähe des Eisens verhindert hätten.

Leider ist es nicht möglich, aus den experimentellen Daten zu schließen, welcher Teil der Hemmung durch Ebselen auf die kovalente Bindung bzw. auf die Eisenkomplexierung zurückgeht. Ein Ansatz, um dieses Problem zu untersuchen, wäre der Austausch aller in der LOX enthaltenen Cysteine in Aminosäuren, an die Ebselen nicht binden kann. Der experimentelle Aufwand hierfür wäre aber sehr hoch und die Wahrscheinlichkeit, dass eine solche Enzymmutante katalytisch nicht mehr aktiv ist, groß.

Im Gegensatz zur Fe[II]-LOX ist die aktive Form (Fe[III]-LOX) weniger gut durch Ebselen hemmbar. Die benötigten Konzentrationen sind deutlich höher und die Hemmung folgt nur einem kompetitiven Mechanismus. Für beide Formen der Inhibition wurde keine Zeitabhängigkeit festgestellt. Die Hemmung erfolgte sofort, allerdings wurden keine stop-flow-Experimente durchgeführt, um den Millisekunden-Bereich zu untersuchen.

Um die Möglichkeiten des Ebselens als LOX-Hemmstoff in vivo abschätzen zu können, gilt es folgendes zu bedenken. Die in vitro Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, dass die Hemmpotentiale von Ebselen für die Fe[II]-LOX und die aktive Fe[III]-LOX
unterschiedlich sind (nM gegenüber unterer µM Bereich). Demzufolge hängt auch die Hemmbarkeit der LOX in vivo vom Aktivitätszustand des Enzyms ab. Für die humane
5-LOX wurde beispielsweise berichtet, dass dieses Enzym erst nach Zellaktivierung katalytisch aktiv wird (Murakami et al., 1995). Studien mit Ratten, die 30 mg Ebselen pro kg Körpergewicht verabreicht bekamen, zeigten, dass die Plasma-Selen-Konzentration um
4 µM anstieg (Takasago et al., 1997). Diese Konzentration liegt im Bereich von K_i der aktiven Fe[III]-LOX und somit weit oberhalb der benötigten Hemmstoffkonzentration für die Fe[II]-LOX, so dass beide Enzymzustände hemmbar wären. Aus diesen Daten würde sich also ergeben, dass Ebselen auch in vivo als potenter LOX-Hemmstoff einsetzbar ist. Sogar die aktive Fe[III]-LOX ist durch die erreichbaren Plasmakonentrationen hemmbar.

Darüber hinaus gilt es jedoch einen weiteren Punkt zu beachten. Tierische Zellen enthalten normalerweise hohe Konzentrationen an reduziertem Glutathion. Die Gegenwart von SH-Reagenzien verhindert jedoch eine effektive LOX-Hemmung durch Ebselen. So sinkt der IC₅₀-Wert in Gegenwart von 1 mM Glutathion von 200 nM auf 300 µM (Schewe et al., 1994). Demgegenüber gibt es kaum Glutathion im extrazellulären Bereich, wodurch eine LOX-Hemmung nicht beeinflusst würde. Unter normalen Bedingungen sind LOXn intrazelluläre Enzyme, im Bereich von Entzündungen oder fortschreitenden atherosklerotischen Läsionen tritt jedoch verstärkt eine Zellzerstörung auf. Dadurch können LOXn in den extrazellulären Bereich gelangen, wo sie durch Lipidperoxidation zum Voranschreiten von Krankheiten beitragen können. Die selektive Hemmung dieser extrazellulären LOXn ohne die wesentliche Beeinflussung der intrazellulären LOX-Aktivität könnte eine pharmakologisch interessante Wirkung darstellen.

4.4.1  Trunkation der Lipoxygenase

Aus den bekannten LOX-Kristallstrukturen geht hervor, dass sowohl pflanzliche als auch tierische LOXn aus zwei Domänen bestehen. Es existiert eine kleinere β-Faltblatt-Domäne am N-Terminus und eine große, helikal aufgebaute C-terminale Domäne. Letztere enthält das aktive Zentrum des Enzyms mit der Substratbindungstasche und dem katalytisch aktiven Nichthämeisen. Sie kann daher als katalytische Untereinheit angesehen werden. Obwohl der N-Terminus keinen bekannten Einfluss auf die Enzymaktivität hat, scheiterten frühere Versuche, eine katalytisch aktive Trunkationsmutante (ohne die N-terminale Domäne) zu exprimieren. Allerdings muss man bedenken, dass eine N-terminale Trunkation immer mit einem hohen Risiko der falschen Faltung von Proteinen einhergeht, da Proteine ausgehend vom N-Terminus synthetisiert werden. In dieser Arbeit wurde ein erneuter Versuch unternommen, eine aktive Trunkationsmutante herzustellen. Dabei wurde in Betracht gezogen, dass die für den His-tag angehängten Aminosäuren das Risiko der Misfaltung möglicherweise verringern. Es stellte sich heraus, dass die so exprimierte Trunkationsmutante, die in der LOX-Sequenz mit Gly115 startete, enzymatisch aktiv ist. Außer einer etwa sechsfach geringeren Aktivität weist sie ähnliche enzymatische Eigenschaften auf, wie das WT-Enzym. Dies ist das erste Mal, dass gezeigt wurde, dass die
N-terminale β-Faltblatt-Domäne für die Enzymaktivität tierischer LOXn nicht essentiell ist und dass die meisten wichtigen enzymatischen Eigenschaften in der Trunkationsmutante erhalten bleiben. Ähnliche Ergebnisse ergaben kürzlich Studien an der Soja-LOX-1 (Maccarrone et al., 2001). Hier lieferte ein anderer Ansatz, nämlich proteolytischer Verdau des Enzyms, eine katalytisch aktive ’Mini-LOX’, die ebenfalls nur die C-terminale Domäne enthielt.

Strukturvergleiche zeigten eine Ähnlichkeit der N-terminalen LOX-β-Faltblatt-Domäne mit der C-terminalen Domäne der humanen Pankreas-Lipase (Gillmor et al., 1997). Da für dieses Enzym gezeigt wurde, dass die β-Faltblatt-Domäne für die Bindung an Membranen verantwortlich ist, wurde die gleiche Funktion für die 15-LOX postuliert, jedoch nicht experimentell untersucht. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Membranbindungsstudien und –oxygenierungsversuche mit der Trunkationsmutante zeigten zwar eine deutlich geringere aber nach wie vor vorhandene Membranbindungsfähigkeit. Die N-terminale β-Faltblatt-Domäne ist also nicht essentiell für die Membranbindung der 15-LOX, sie scheint jedoch eine wesentliche Rolle zu spielen. Um diesen Prozess genauer zu untersuchen, wurden Punktmutationen eingeführt, wobei oberflächenexponierte, hydrophobe Aminosäuren in geladene Reste ausgetauscht wurden. Zunächst wurden Phe70 und Leu71 der N-terminalen Domäne untersucht. Diese beiden Aminosäuren wurden ausgehend von einem Sequenzvergleich als die den Bindungsdeterminanten der Lipase entsprechenden vorgeschlagen (Gillmor et al., 1997). Die Mutation in geladene Aminosäuren mit ähnlichen sterischen Eigenschaften verringerte die Membranbindungsfähigkeit der 15-LOX, was für eine Beteiligung an diesem Vorgang spricht. Darüber hinaus konnte eine weitere Bindungsdeterminante in der N-terminalen Domäne identifiziert werden, das Tyr15.

Da die Trunkationsmutante noch an Membranen zu binden vermochte, wurden auch in der C-terminalen Domäne Bindungsdeterminanten vermutet. Die Suche nach entsprechenden oberflächenexponierten, hydrophoben Aminosäuren, die in der Nähe des Eingangs zum aktiven Zentrum liegen, wurde durch die Unvollständigkeit der Kristallstruktur der
15-LOX erschwert. Nach dem Hineinmodellieren fehlender Reste konnten verschiedene Aminosäuren mit den entsprechenden Eigenschaften identifiziert werden. Einige hiervon wurden in ein geladenes Glutamat ausgetauscht und die verbliebene Membranbindungsfähigkeit untersucht. So konnten auch in der C-terminalen Domäne Aminosäuren identifiziert werden, die einen starken Einfluss auf die Membranbindung haben (W181, L195).

Versuche zur Oxygenierung von Biomembranen durch diese LOX-Mutanten zeigten, dass auch die Membranoxygenaseaktivität abnimmt. Darüber hinaus waren Mehrfachmutanten mit nur noch geringer Membranbindungsfähigkeit kaum noch in der Lage, entsprechend dem Wildtyp Modellmembranen (EKRM) zu permeabilisieren und luminale Proteine freizusetzen, wie am Beispiel der PDI untersucht wurde.

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX durch hydrophobe Wechselwirkungen an Biomembranen bindet. Dieser Prozess wird vermittelt durch oberflächenexponierte, hydrophobe Aminosäuren, die sowohl in der N-terminalen, als auch in der C-terminalen Domäne lokalisiert sind. Einhergehend mit der verringerten Membranbindungsfähigkeit nach einem Austausch kritischer Aminosäuren ist eine verminderte Membranoxygenaseaktivität. Dies ist übereinstimmend mit der Tatsache, dass ein Umsatz von in Biomembranen veresterten Substrat-Fettsäuren die Bindung des Enzyms an die Membran erfordert.

Andere LOX-Isoformen sind ebenfalls in der Lage, an Membranen zu binden. Für die humane 5-LOX wurde die N-terminale Domäne als verantwortlich für die Membranbindung vorgeschlagen (Kulkarni et al., 2002). Versuche mit nur dieser Domäne deuteten auf drei Tryptophane als Bindungsdeterminanten hin: Trp13, Trp75 und Trp102 (Kulkarni et al., 2002). Leider wurden keine Versuche mit dem vollständigen Enzym durchgeführt. Vergleicht man die identifizierten Tryptophane mit den entsprechenden Resten der Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX (Ile14, Leu71, Trp100), so kann man schließen, dass zwei der drei Reste (Trp13 und Trp102) in dem Bereich zwischen den beiden Domänen liegen und somit zumindest beim Kaninchen-Enzym keine Rolle bei Membranwechselwirkungen spielen sollten. Allerdings wurde beim Kaninchen-Enzym das dem Ile14 direkt benachbarte Tyr15 als Bindungsdeterminante identifiziert. Das dritte Tryptophan (Trp75) entspricht dem bei der Kaninchen-LOX hier als Membranbindungsdeterminante bestimmten Leu71.

Auch für die Gurken-Linolsäure-13-LOX gilt die N-terminale Domäne als verantwortlich für die Membranbindung (May et al., 2000). Demgegenüber führte die proteolytische Trunkation der N-terminalen Domäne bei der Soja-LOX-1 zu einer erhöhten Membranbindungsfähigkeit (Maccarrone et al., 2001), d.h. diese Domäne kann auch zu einer verminderten Membranbindungskapazität führen. Aus den Ergebnissen dieser Arbeit ergibt sich, dass für eine optimale Membranbindung bei der Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX beide, die N-terminale β-Faltblatt-Domäne und die C-terminale katalytische Domäne, verantwortlich sind. Demzufolge kann der Beitrag der N-terminalen Domäne an der Membranbindung variieren und scheint von der LOX-Isoform abzuhängen.