Am besten aufgeklärt ist die Funktion der 5-LOX bei der Synthese von bioregulatorischen Verbindungen auf dem Lipoxygenase-Weg der Arachidonsäurekaskade. Dieses Enzym nimmt eine Schlüsselrolle in der Biosynthese der Leukotriene (LT) ein, die als Mediatoren bei inflammatorischen und anaphylaktischen Prozessen beteiligt sind (Lewis et al., 1990;Samuelsson et al., 1987). Damit ist die 5-LOX auch pharmakologisch von großem Inter-esse. Allerdings ist ihre proinflammatorische Rolle nur ein Aspekt, da das Enzym auch in Zellen exprimiert wird, die an entsprechenden Prozessen nicht beteiligt sind, so zum Beispiel in reifenden Keratinozyten (Janssen-Timmen et al., 1995). In ruhenden alveolaren Makrophagen ist die 5-LOX im Nukleus lokalisiert, weswegen eine Beteiligung an der Regulation der Genexpression diskutiert wird (Brock et al., 1994;Woods et al., 1995).

15-LOX Produkte besitzen sowohl pro- als auch antiinflammatorische Wirkung:
15-HPETE bewirkt eine Entzündungsreaktion in der Haut von Kaninchen (Higgs et al., 1981), 13-HODE und 5-Oxo-15-HETE induzieren Chemotaxis (Henricks et al., 1991;Schwenk et al., 1992). Auf der anderen Seite hemmt 15-HETE die Leukotrien B4 Synthese und dessen Chemotaxis (Fischer et al., 1992;Herlin et al., 1990;Vanderhoek et al., 1980). Ein in vivo Nachweis der entzündungshemmenden Aktivität der 15-LOX erfolgte in Ratten. Nieren, in die das 15-LOX Gen transfiziert wurde, sind geschützt gegen experimentelle Glomerulonephritis (Munger et al., 1999).

Ein großer Teil der antiinflammatorischen Eigenschaften der 15-LOX geht möglicherweise auf deren Beteiligung an der Bildung von Lipoxinen (LX) zurück (Übersichtsartikel: (Fierro und Serhan, 2001;Serhan, 2002)). Diese Trihydroxytetraen-Verbindungen (z. B. LXA4: 5S,6R,15S-Trihydroxy-7,9,13-trans-11-cis-eicosatetraensäure, LXB4: 5S,14R,15S-Trihydroxy-6,10,12-trans-8-cis-eicosatetraensäure) werden offensichtlich über einen transzellulären Mechanismus (Edenius et al., 1990;Edenius et al., 1991;Serhan und Sheppard, 1990) unter Beteiligung verschiedener LOX-Isoformen gebildet. Zum einen setzt die 5-LOX das 15-LOX Produkt 15-H(P)ETE zu Lipoxinen um, womit eine Hemmung der eigentlichen 5-LOX-Reaktion einhergeht (Serhan, 1994). Zum anderen kann das über die 5-LOX gebildete LTA4, die Vorstufe des pro-inflammatorischen LTB4, durch die 15-LOX (auch durch 12-LOXn) in Lipoxine umgewandelt werden. Darüber hinaus hemmen Lipoxine die Chemotaxis von polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (Lee et al., 1989) und deren Interaktion mit Endothelzellen (Papayianni et al., 1996), während sie die Chemotaxis und Adhäsion von Monozyten stimulieren (Maddox et al., 1997). Insgesamt sind Lipoxine also lokale, endogene Botenstoffe, die eine Hemmung der Entzündungsreaktion und Stimulation der Wundheilung bewirken können (Fierro und Serhan, 2001).

Eine Reihe von Hinweisen deutet auf eine Beteiligung der 15-LOX an bronchialem Asthma hin. So ist z. B. die 15-LOX Expression und die Zahl der 15-LOX exprimierenden Zellen in Patienten mit Asthma signifikant erhöht (Profita et al., 2000).

Viele Hinweise deuten auf eine Beteiligung der Retikulozyten-Typ 15-LOX an Zellreifungs- und Differenzierungsprozessen hin. Bereits 1975 vermuteten Schewe et al. eine entscheidende Rolle während der Erythropoese, was zunächst vor allem durch zwei experimentelle Ergebnisse gestützt wurde (Schewe et al., 1975):

1. Diese LOX besitzt die Fähigkeit, komplexe Substrate wie veresterte Fettsäuren und biologische Membranen zu oxygenieren (Murray und Brash, 1988;Schewe et al., 1975;Takahashi et al., 1993). Entsprechende Produkte wurden in der Mitochondrienmembran und zu einem geringeren Teil auch in der Plasmamembran nachgewiesen (Kuhn et al., 1990).

2. Die 15-LOX wird in den Retikulozyten des Kaninchens (Rapoport et al., 1979), der Ratte (Kroschwald et al., 1986;Schewe et al., 1990) und des Menschen (Kroschwald et al., 1989) exprimiert. Diese Expression ist zeitlich limitiert und fällt mit dem Abbau der Mitochondrien zusammen (Rapoport und Schewe, 1986). Darüber hinaus ist die ubiquitinabhängige Proteolyse der Mitochondrien in dieser Phase der Retikulozytenreifung durch 15-LOX Inhibitoren hemmbar, was für eine direkte Beteiligung der 15-LOX an diesem Vorgang spricht (Dubiel et al., 1981;Grullich et al., 2001).

Es muss allerdings betont werden, dass die 12/15-LOX nicht essentiell ist für den Mitochondrienabbau in Retikulozyten. So zeigen 12/15-LOX knock-out Mäuse unter Normalbedingungen keine signifikanten Störungen in der Erythropoese (Sun und Funk, 1996).

Ebenfalls könnten LOXn beim Abbau der Organellen während der Reifung von Fiber-Zellen in der Augenlinse eine Rolle spielen. Dies wurde aus dem Vorhandensein von LOX-Signalen in immunohistochemischen Untersuchungen der Maus-Augenlinse geschlossen (van Leyen et al., 1998). Miller et al. berichteten von einer Beteiligung der 12/15-LOX an der Interaktion von Makrophagen mit apoptotischen Zellen und an deren Phagozytose (Miller et al., 2001). Es muss allerdings betont werden, dass in vielen Phagozyten keine Expression der 12/15-LOX nachgewiesen werden konnte, weshalb das Enzym kaum als für den Prozess der Phagozytose essentiell angesehen werden kann.

Ein Schlüsselereignis in der Entstehung von atherosklerotischen Plaques ist die Bildung von lipidbeladenen Schaumzellen. Diese entstehen aus Makrophagen oder glatten Muskelzellen durch die unkontrollierte Aufnahme von modifiziertem LDL über Scavenger-Rezeptoren, welche, im Gegensatz zur LDL-Aufnahme über den LDL-Rezeptor, nicht rückkopplungshemmbar ist (Henriksen et al., 1981). Die Ablagerung dieser Schaumzellen im subendothelialen Raum der Arterien ist der erste Schritt bei der Ausbildung atherosklerotischer Läsionen.

Bereits 1985 wurde 15-HETE in der atherosklerotischen Gefäßwand nachgewiesen (Henriksson et al., 1985). Der erste direkte Hinweis auf eine Beteiligung der 15-LOX an der Entstehung atherosklerotischer Läsionen in vivo stammt von Ylä-Herttuala et al. aus dem Jahr 1990. Sie fanden 15-LOX-1 mRNA und Protein zusammen mit oxidiertem LDL in Makrophagen-reichen Regionen von atherosklerotischen Läsionen, während die normalen Gefäßwände keine LOX enthielten (Yla-Herttuala et al., 1990). Lipidextrakte von atherosklerotischen Läsionen aus Kaninchen enthielten spezifische 15-LOX-Produkte, die zeitlich mit der Lipidablagerung in der Aortenwand zusammentrafen (Kuhn et al., 1994). Ähnliche Ergebnisse ergaben sich für entsprechende menschliche Läsionen. Während Folcik et al. in allen Läsionen über einen spezifischen Anteil an 15-LOX-Produkten berichteten (Folcik et al., 1995), wurde dieser von Kühn et al. nur in den frühen Läsionen gefunden (Kuhn et al., 1997). Obwohl der Anteil der spezifischen 15-LOX Produkte relativ klein war, deutet deren Nachweis auf eine in vivo abgelaufene LOX-Reaktion hin, ohne sie jedoch zu beweisen.

Die in Endothelzellen, aktivierten menschlichen Monozyten und Maus-Makrophagen exprimierte LOX oxidiert LDL und diese Reaktion kann in vitro durch LOX-Inhibitoren gehemmt werden (McNally et al., 1990;Parthasarathy et al., 1989;Rankin et al., 1991). Genauer untersucht wurde die Reaktion der 15-LOX mit LDL im isolierten Zustand (Belkner et al., 1998) und im menschlichen Plasma (Yamashita et al., 1999). Neben der direkten Oxygenierung von LDL-Lipidestern kann die LOX auch die zuvor aus den Lipidestern enzymatisch freigesetzten Fettsäuren oxygenieren (Neuzil et al., 1998).

Weitere Hinweise auf eine proatherosklerotische Wirkung der LOX ergeben sich aus folgenden Studien: Makrophagen, bei denen das Gen für die 12/15-LOX zerstört ist, sind weniger in der Lage, LDL zu oxygenieren (Sun und Funk, 1996), während 15-LOX überexprimierende Fibroblasten und Monozyten dies verstärkt tun (Benz et al., 1995). Allerdings gilt dies nicht für alle Transfektanten, was darauf hinweist, dass die Expression der 12/15-LOX allein für ein erhöhtes zelluläres Potential zur LDL-Oxidation nicht ausreicht. Die Überexpression der 15-LOX im vaskulären Endothel führte bei transgenen Mäusen, denen der LDL-Rezeptor fehlt, zu einer Beschleunigung der Entstehung von Atherosklerose (Harats et al., 2000). Die funktionelle Zerstörung der Maus-Makrophagen-12-LOX in Apolipoprotein-E- oder LDL-Rezeptor-knock-out Mäusen führte zu einer signifikanten Verringerung der atherosklerotischen Ablagerungen (Cyrus et al., 1999;George et al., 2001). Des Weiteren hemmen 15-LOX-Inhibitoren die Entwicklung von atherosklerotischen Läsionen in Kaninchen, die mit einer cholesterolreichen Nahrung gefüttert wurden (Bocan et al., 1998;Sendobry et al., 1997).

Im Gegensatz zu den o. g. Ergebnissen gibt es aber auch einige Untersuchungen, die eine anti-atherosklerotische Wirkung der LOX nahe legen. So sind transgene Kaninchen, die die menschliche Retikulozyten-Typ-15-LOX makrophagenspezifisch überexprimieren, gegen Atherosklerose geschützt. Bei ihnen ist die Menge der Lipidablagerungen in der Aorta signifikant geringer als bei Kontrolltieren (Shen et al., 1996). Auch die durch eine experimentelle Anämie induzierte Expression der 12/15-LOX in Kaninchen und Mäusen führte zu einer verringerten Entwicklung von atherosklerotischen Plaques (Paul et al., 1999;Trebus et al., 2002).

Grundsätzlich ist die Rolle der 12/15-LOX in der Atherosklerose noch nicht ausreichend geklärt und es bedarf weiterer Studien. Vorstellbar sind z. B. Unterschiede zwischen den Ergebnissen aus Tiermodellen (Maus, Kaninchen) und den Gegebenheiten beim Menschen. Möglicherweise ist die Expression der 12/15-LOX in atherosklerotischen Läsionen auch ein Schutzmechanismus (Simon et al., 1990). Demnach könnte die Wirkung der LOX zunächst, d.h. im frühen Stadium der Entwicklung von atherosklerotischen Plaques, eine antiatherogene Funktion haben, die im späteren Verlauf aber in eine proatherogene Wirkung umschlagen kann (Kuhn und Chan, 1997).

Kürzlich wurde auch über eine mögliche Beteiligung der 5-LOX an der Atherosklerose bei Mäusen berichtet (Mehrabian et al., 2002). Mäuse, bei denen die Expression der 5-LOX nur etwa 1/5 des normalen Levels beträgt (CON6-Mäuse), sind trotz LDL-Rezeptor knock outs gegen Atherosklerose geschützt. Die Züchtung heterozygoter 5-LOX-knock-out Mäuse, die auch LDL-Rezeptor defizient waren (5-LOX^+/-/LDL-Rezeptor^-/-), bestätigten diesen Zusammenhang. In diesen Tieren entsprach die 5-LOX-Expression etwa dem Level der CON6-Mäuse, auch sie zeigten drastisch verringerte atherosklerotische Läsionen gegenüber LDL-Rezeptor-defizienten Mäusen (5-LOX^+/+/LDL-Rezeptor^-/-).

Die Beteiligung von Lipoxygenasen an der Entstehung bzw. Metastasierung von Karzinomen ist zurzeit ein weit verbreitetes Thema in der Forschung, wobei zum Teil widersprüchliche Ergebnisse existieren. Während Gupta et al. über eine verstärkte Expression und Aktivität der 5-LOX in menschlichen Prostata-Tumoren berichteten (Gupta et al., 2001), fanden Shappell et al. keinerlei 5-LOX-Aktivität in dem Tumorgewebe, d.h. sie konnten kein 5-HETE nachweisen (Shappell et al., 1999). 5-LOX Inhibitoren (z. B. MK886) leiteten Apoptose in Prostatakrebszellen ein (Anderson et al., 1998;Ghosh und Myers, 1998). Ob dies auf die Hemmung der 5-LOX zurückzuführen ist, bleibt allerdings noch unklar, da die benötigte Hemmstoff-Konzentration den IC50-Wert um ein Vielfaches übersteigt (Dixon et al., 1990). Darüber hinaus leitete MK886 auch in Zellen, die keine 5-LOX exprimieren, Apoptose ein (Datta et al., 1999).

Viele Ergebnisse zeigen eine pro-karzinogene Wirkung der Plättchen-Typ-12-LOX (Übersichtsartikel: (Honn et al., 1994)). Diese wird u. a. exprimiert im Prostatakarzinom (Gao et al., 1995), Pankreaskarzinom (Ding et al., 1999), Mammakarzinom (Connolly und Rose, 1998;Natarajan et al., 1997;Natarajan und Nadler, 1998) und Bronchialkarzinom (Chen et al., 1994). 12(S)-HETE bewirkt eine Reihe von Effekten, die die Metastasierung von Tumoren beeinflussen, darunter die Verstärkung der Mobilität (Liu et al., 1994;Timar et al., 1993) und des Adhäsionsvermögens von Tumorzellen an das Epithel und die Ausbreitung in der Subepithel-Matrix (Honn et al., 1989), sowie die Sekretion von lysosomalen Proteinasen (Ulbricht et al., 1996). Die Bedeutung von 12-HETE für die Tumor-Metastasierung wurde auch in vivo nachgewiesen (Chen et al., 1994;Connolly und Rose, 1998;Liu et al., 1994;Nie et al., 1998). Bisher ließ sich jedoch aus den Daten noch kein Therapiekonzept ableiten.

Auch die 15-LOXn werden mit der Karzinogenese in Verbindung gebracht, allerdings ist ihre Rolle weniger klar als die der 12-LOX. Während Ikawa et al. eine erhöhte Expression der 15-LOX-1 in Dickdarmkrebszellen beobachteten (Ikawa et al., 1999), berichteten Shureiqi et al. eine signifikant geringere Expression und geringere Konzentration von
13-HODE in Tumorzellen im Vergleich zu normalem Gewebe (Shureiqi et al., 1999). Sie folgerten daraus eine Herunterregulation der 15-LOX-1 Expression in Dickdarmtumorgewebe und eine anti-Tumor-Wirkung von 13(S)-HODE durch Hemmung der Zellteilung und Einleitung der Apoptose.

Eine Beteiligung der 15-LOXn in Prostatakarzinomen wird ebenfalls diskutiert. Spindler et al. fanden 13(S)-HODE im Tumorgewebe, jedoch nicht im benachbarten gesunden Gewebe (Spindler et al., 1997). Kelavkar et al. zeigten einen signifikanten Zusammenhang zwischen der Expression der 15-LOX-1 und einer mutierten Form des Tumor-Suppressor-Gens p53 (Kelavkar und Badr, 1999). Darüber hinaus fanden sie eine Korrelation zwischen der Expression und der Malignität des Tumors (nach ‚Gleason staging’), was eine Rolle der 15-LOX-1 in der Tumorentwicklung nahe legt (Kelavkar et al., 2000). Überexpression von 15-LOX-1 in PC-3 Zellen bewirkte eine verstärkte Zellteilung, die durch einen 15-LOX-1-Inhibitor dosisabhängig gehemmt werden konnte (Kelavkar et al., 2001). Während des Fortschreitens von Prostatakarzinomen werden die Expression der 15-LOX-2 und die Bildung von 15-HETE immer mehr reduziert (Shappell et al., 1999), was indirekt zu einer verstärkten Zellteilung und reduzierten Differenzierung in Prostatakarzinomzellen führen kann (Shappell et al., 2001). Auch Tang et al. wiesen den Verlust der 15-LOX-2 Expression in allen getesteten Prostatakarzinom-Zelllinien nach und schlussfolgerten eine hemmende Wirkung der 15-LOX-2 auf die Entwicklung von Prostatakarzinomen (Tang et al., 2002). Demgegenüber ist allerdings die Rolle von 15-HETE, dem Produkt der 15-LOX-2 und auch der 15-LOX-1, noch umstritten. So gibt es Studien, aus denen geschlossen wurde, dass 15S-HETE die Apoptose unterdrückt (Herrmann et al., 1997;Tang et al., 1996) oder keinen Einfluss auf die Apoptose in Tumorzellen hat (Bortuzzo et al., 1996;Desplat et al., 1999), bzw. dass 15S-HPETE Apoptose in Lymphozyten einleitet (Sandstrom et al., 1994).

Zusammenfassend muss man sagen, dass weitere Forschung nötig ist, um die Rollen der verschiedenen LOXn bei der Karzinogenese eindeutig zu bestimmen und Widersprüche aufzuklären.

Neben den bereits genannten Leukotrienen (u. a. Entzündungsreaktion) und 12-HETE
[u. a. Beteiligung an der Proliferation verschiedener Zellen wie epidermale Keratinozyten (Chan et al., 1985) und vaskulären Endothelzellen (Tang et al., 1995) sowie Tumormetastase (s. o.)] spielen weitere LOX-Produkte eine Rolle als bioaktive Botenstoffe. So ist die
15-LOX an der Synthese von Lipoxinen (Serhan et al., 1984) und Hepoxilinen (Anton und Vila, 2000) beteiligt, und deren Produkte 15-HETE, 13-HODE und 12-HETE regulieren
u. a. Wechselwirkungen zwischen Endothelzellen und Thrombozyten (Buchanan et al., 1998). Verschiedene Studien deuten auf eine Beteiligung von LOXn an der Apoptose hin. Allerdings gibt es sowohl Ergebnisse, die für eine pro-apoptotische Rolle der LOX sprechen (Gu et al., 2001;Maccarrone et al., 2000;O'Donnell et al., 1995), als auch Versuche, bei denen Apoptose nach Hemmung von LOXn eingeleitet wurde (Avis et al., 2001;Ding et al., 1999;Tang et al., 1996;Tang und Honn, 1997). Zurzeit ist noch unklar, inwieweit ein direkter Zusammenhang zwischen LOXn und Apoptose besteht. Denkbar ist auch, dass die beobachteten Effekte auf unspezifische Hemmstoffe, sehr hohe (physiologisch irrelevante) Konzentrationen von Hemmstoffen, Arachidonsäure oder LOX-Produk-ten, oder nur auf eine Störung des zellulären Redox-Gleichgewichtes zurückzuführen sind.

Ein weiterer nicht zu vernachlässigender Effekt beruht auf dem Vermögen von
12/15-LOXn, in Membranen oder Lipoproteinen veresterte mehrfachungesättigte Fettsäuren zu oxygenieren. Da einige Phospholipasen (Chaitidis et al., 1998) und neutrale Cholesterolesterhydrolasen (Belkner et al., 2000) oxidierte Esterlipide als Substrat bevorzugen, kann die LOX so, unabhängig von der konventionellen Arachidonsäure-Kaskade, zu einer Erhöhung der zellulären Konzentration an freien Hydro(pero)xyfett-säuren beitragen. Kürzlich wurde auch gefunden, dass erhöhte Konzentrationen an unveresterter Arachidonsäure, möglicherweise auch deren oxygenierte Formen, in Zellen Apoptose auslösen können (Cao et al., 2000).

Alle LOXn bestehen aus einer einzelnen Polypeptid-Kette. Die bisher identifizierten tierischen LOXn setzen sich aus 662 bis 711 Aminosäuren zusammen und sind damit ca. 200 Aminosäuren kürzer als die meisten pflanzlichen Enzyme. Zum Beispiel besitzen die Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX und die Schweine 12-LOX vom Leukozyten-Typ 663 Aminosäuren (Fleming et al., 1989;Yoshimoto et al., 1990), die humane 15-LOX vom Retikulozyten-Typ 662 (Sigal et al., 1988) und die humane 5-LOX 674 Aminosäuren (Matsumoto et al., 1988), während die beiden 12R-LOXn vom Epidermis-Typ 711 Aminosäuren besitzen (Boeglin et al., 1998;Sun et al., 1998). Die Sequenzhomologie der tierischen LOXn variiert sehr stark und liegt zwischen 28 und 99% (Kuhn und Thiele, 1999), wobei wiederum die 12R-LOXn die größten Unterschiede zu den anderen LOXn aufweisen. Allerdings unterscheiden sich einzelne Bereiche der Primärstruktur hinsichtlich ihrer Homologie. So gibt es beispielsweise hochkonservierte Bereiche im Zentrum und am C-Terminus, während die N-terminalen Bereiche nur relativ geringe Sequenzhomologie aufweisen. Innerhalb der zentralen konservierten Region konnten bereits vor der Aufklärung von Kristallstrukturen mehrere Histidinreste als Eisenliganden durch ortsgerichtete Mutagenese bei verschiedenen LOXn identifiziert werden (Chen und Funk, 1993;Ishii et al., 1992;Nguyen et al., 1991;Zhang et al., 1992).

Die erste komplette Kristallstruktur einer LOX konnte im Jahr 1993 für die Sojabohnen-LOX-1 aufgeklärt werden (Boyington et al., 1993), deren Auflösung später auf 1,4 Å verbessert wurde (Minor et al., 1996). In jüngerer Zeit folgte die Aufklärung der Strukturen der Sojabohnen-LOX-3 (Skrzypczak-Jankun et al., 1997) und von Sojabohnen-LOX-3-Liganden-Komplexen (Pham et al., 1998;Skrzypczak-Jankun et al., 2001).

Die erste Kristallisation einer tierischen LOX wurde bereits 1990 beschrieben (Sloane et al., 1990), die Struktur konnte jedoch erst 7 Jahre später aufgeklärt werden (Gillmor et al., 1997). Dabei handelt es sich um einen Enzym-Inhibitor-Komplex mit einer Auflösung von 2,4 Å. Obwohl die Kristallstrukturdaten nicht ganz komplett sind, geben sie einen guten Einblick in die strukturellen Gegebenheiten bei tierischen LOXn und zeigen eine deutliche strukturelle Verwandtschaft zu der Sojabohnen-LOX-1 (Abb. 3).

Abb. 3 : Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX- (oben) und Sojabohnen-LOX-1-Struktur (unten) in der Backbone-Darstellung. Helix: rot, β-Faltblatt: gelb. Trotz des Größenunterschieds ist eine deutliche strukturelle Verwandtschaft zu erkennen.

Wie in Abb. 3 deutlich zu erkennen, besitzen LOXn zwei Domänen: Eine kleinere N-terminale β-Faltblatt-Domäne und eine größere C-terminale helikale Domäne. Bei der Kaninchen-Retikulozyten LOX besteht die N-terminale Domäne aus einem 8-strängigen
β-Faltblatt und reicht von Aminosäure 1 bis etwa 115. Sie ist sehr ähnlich zu der
C-terminalen β-Faltblatt-Domäne in tierischen Lipasen und könnte somit analog dieser eine Rolle bei der Anlagerung des Enzyms an Lipoproteine bzw. Biomembranen spielen (Gillmor et al., 1997). Diese Annahme wird unterstützt durch zwei oberflächenexponierte hydrophobe Aminosäuren in der 15-LOX, Phe70 und Leu71, die im Sequenzvergleich mit der humanen Lipoprotein Lipase mit zwei Tryptophanen übereinstimmen, die als Bindungsdeterminanten an Lipoproteine identifiziert wurden (Williams et al., 1994).

Die größere C-terminale Domäne ist über eine 1600 Ų große Kontaktfläche mit der
N-terminalen Domäne assoziiert. Sie besteht aus 18 Helices unterbrochen von einer β-Faltblatt-Subdomäne und drei weiteren kleinen β-Faltblatt-Strukturen in loops an der Proteinoberfläche. Sie enthält das katalytisch aktive Nichthämeisen.

Zwei der zentralen Helices nehmen über eine Länge von jeweils sieben Aminosäuren eine π-Helix-Konformation ein (Aminosäurereste 360 bis 366 und 537 bis 543), wodurch eine zur Eisenkomplexierung nötige Anordnung der in diesem Bereich liegenden vier Protein-Eisen-Liganden (His 361, His 366, His 541 und His 545) ermöglicht wird. Den fünften Eisenliganden bildet das in fast allen LOXn konservierte C-terminale Isoleucin (Ile 663 bei der Kaninchen-Retikulozyten LOX). Eine Veränderung des C-Terminus, z. B. durch Deletion oder Verknüpfung mit Proteinen wie GFP (Green Fluorescence Protein), sollte daher zu einem Verlust des Eisens und somit zu einer inaktiven Enzymspezies führen (Borngraber, 1996;Zhang et al., 1992). Die Kristallstruktur der Soja-LOX-1 zeigte ein Wassermolekül als sechsten Eisenliganden (Minor et al., 1996) trans zu His 691 (entspricht His 541 in der Kaninchen-Retikulozyten LOX), was aus Röntgenabsorptionsspektroskopie auch für die Kaninchen-Retikulozyten LOX geschlossen wurde (Kuban et al., 1998). Diese Position liegt an einem großen Hohlraum, der Substratbindungstasche, so dass das Wasser durch Substrate oder kompetitive Inhibitoren verdrängt werden könnte. Es ist auch möglich, dass dieser sechste Eisenligand ein OH^- ist und als starke Base für die Wasserstoff-Abstraktion Bedeutung hat (Minor et al., 1996). Die sechs Eisenliganden sind in der Kristallstruktur in einem annähernd regelmäßigen Oktaeder angeordnet (Abb. 4).

Abb. 4 : Die Eisenligandensphäre der Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX gebildet aus vier Histidinen und dem C-terminalen Isoleucin. Der sechste Ligand ist vermutlich ein Wasser (nicht dargestellt).

Bevor und auch nachdem die Kristallstrukturen der Soja-LOX und des Kaninchen Retikulozyten 15-LOX-Inhibitor-Komplexes bekannt waren, wurden diverse spektroskopische Methoden angewandt, um die Eisenumgebung näher zu charakterisieren (Dunham et al., 1990;Kuban et al., 1998;Pavlosky et al., 1995;Scarrow et al., 1994;Solomon et al., 1997). Insbesondere durch Röntgenabsorptionsspektroskopie und Interpretation der Feinstruktur der Spektren konnte die Eisenligandensphäre genauer beschrieben werden. Dabei wurden die Anzahl und der jeweilige Abstand der Eisenliganden bestimmt, wobei sich eine Verzerrung des Oktaeders in der Lösungsstruktur sowohl bei der Soja-LOX-1 als auch bei der Kaninchen Retikulozyten 15-LOX nachweisen ließ (Kuban et al., 1998;Scarrow et al., 1994). Auch hier wurden sechs Eisenliganden für die aktiven Enzymzustände ermittelt, deren Abstände zwischen 0,188 nm und etwa 0,3 nm liegen. Eine detaillierte Beschreibung der Röntgenabsorptionsspektroskopie, die auch Gegenstand dieser Arbeit ist, erfolgt in Abschnitt 2.6.5.1.

Wie bereits erwähnt, existiert in LOXn ein großer Hohlraum, an dessen einer Seite das katalytisch aktive Eisen lokalisiert ist. Dieser Hohlraum hat eine trichterförmige Öffnung an der Proteinoberfläche und macht etwa in Höhe des Eisens eine Krümmung, so dass eine stiefelähnliche Form entsteht. Die diese Tasche begrenzenden Aminosäuren sind bis auf zwei Ausnahmen hydrophob und hochkonserviert. Am Eingang der Tasche liegt eine positiv geladene Aminosäure, Arg 403, die mit der Carboxylgruppe der Substratfettsäure eine Wechselwirkung eingehen könnte. Die Mutagenese der äquivalenten Position in der humanen 15-LOX zu einem Leucin führte zu einer starken Verringerung von Substrataffinität und Reaktivität (Gan et al., 1996).

Die Existenz eines weiteren Kanals, der Sauerstoff den Zugang zum aktiven Zentrum ermöglichen soll, wird gegenwärtig noch diskutiert. Ein solcher Kanal könnte die Stereospezifität der LOX-Reaktion erklären, da der Sauerstoff kontrolliert nur von einer Seite herangeführt würde. In der ersten Kristallstruktur der Soja-LOX-1 wurde ein entsprechender 18 Å langer Kanal vorgeschlagen (Boyington et al., 1993), der jedoch in der Struktur mit verbesserter 1,4 Å Auflösung nicht bestätigt werden konnte (Minor et al., 1996). Jüngste experimentelle Ergebnisse mit der Soja-LOX-1 (Knapp et al., 2001) und mit modifizierten Substratfettsäuren und Enzymmutanten der Kaninchen-Retikulozyten
15-LOX (Ivanov et al., unveröffentlichte Daten) deuten jedoch auf die Existenz eines Sauerstoffkanals sowohl bei der pflanzlichen Soja-LOX-1 als auch bei der Kaninchen-LOX hin.

Aufgrund des hydrophoben Charakters der Substratbindungstasche liegt es nahe, dass die Fettsäure mit dem hydrophoben Methylende ins Innere der Substratbindungstasche eintaucht, während das hydrophile Carboxylende an der Enzymoberfläche bleibt. Diese Hypothese wurde durch verschiedene experimentelle Ergebnisse für die 12- und 15-LOXn bestätigt. So zeigten Versuche mit Arachidonsäure-Isomeren, in denen die Position der Doppelbindungen variiert wurde, dass der Abstand des doppelallylständigen Methylens vom Methylende der Fettsäure entscheidend für die Reaktivität und Positionsspezifität ist (Kuhn et al., 1990). Durch ortsgerichtete Mutagenese der Aminosäuren Ile418 und Met419 der humanen 15-LOX gegen die entsprechenden Aminosäuren der humanen
12-LOX (Ala418, Val419) (Sloane et al., 1991) bzw. der Schweine 12-LOX (Val418, Val419) (Sloane et al., 1995) konnten 15-LOX-Enzymmutanten mit 12-LOX-Aktivität hergestellt werden. Entsprechende Untersuchungen an 12-LOXn führten zu 15-lipoxygenierenden Enzymspezies (Chen und Funk, 1993;Suzuki et al., 1994). Hieraus wurde gefolgert, dass die Größe und Geometrie der Seitenketten der Aminosäuren 418 und 419 die Position der Arachidonsäureoxygenierung durch 12- bzw. 15-LOXn entscheidend beeinflussen. Da es nicht gelang, die Ratten 12-LOX durch entsprechende Mutationen in eine 15-LOX umzuwandeln (Hada et al., 1994;Watanabe und Haeggstrom, 1993), wurden weitere Positionsdeterminanten vermutet. Durch Konstruktion von Enzymchimären aus 15- und verschiedenen 12-LOXn sowie ortsgerichteter Mutagenese kritischer Aminosäuren in der Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX konnten zwei weitere wichtige Aminosäuren für die Positionsspezifität der 15- bzw. 12-Lipoxygenierung ermittelt werden: Phe353 (Borngraber et al., 1996) und Ile593 (Borngraber et al., 1999). Eine Übersicht der Lage der identifizierten Positionsdeterminanten der Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX mit der hineinmodellierten Arachidonsäure zeigt Abb. 5. Die primären Positionsdeterminanten sind in violett dargestellt, Aminosäuren mit geringerem Einfluss in grau.

Es ist deutlich zu erkennen, dass die entsprechenden Aminosäuren den Boden der Substratbindungstasche bilden und damit durch ihre Größe die mögliche Tiefe des Eindringens des Substrats in die Tasche beeinflussen. Das an der Enzymoberfläche liegende Arg403, welches möglicherweise mit der Carboxylgruppe des Substrats wechselwirkt, besitzt eine sehr bewegliche Seitenkette und könnte somit ein unterschiedlich tiefes Eintauchen der Fettsäure tolerieren.

Abb. 5 : Darstellung der Positionsdeterminanten der Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX (violett) mit dem katalytisch aktiven Eisen und der hineinmodellierten Arachidonsäure, aus (Borngraber et al., 1999).

Führt man mehrere Mutationen an den entsprechenden kritischen Aminosäuren durch, zeigt sich ein funktionelles Zusammenspiel, d.h. die Verkleinerung der Seitenkette an der einen Position kann durch entsprechende Vergrößerung an einer anderen ausgeglichen werden (Abb. 6). All diesen Positionsdeterminanten gemein ist, dass der Austausch von großen Seitenketten der 15-LOX in kleinere die Spezifität von 15- zu 12-Lipoxygenierung verschob.

Abb. 6 : Produktverhältnisse der verschiedenen Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX-Mutanten (HPLC-Chromatogramme) aus (Borngraber et al., 1999). Die jeweiligen Produkte verdeutlichen ein funktionelles Zusammenspiel der Positionsdeterminanten.

Auch bei der Maus 8S-LOX und der humanen 15-LOX-2 (Epidermis-Typ), die trotz unterschiedlicher Positionsspezifitäten eine hohe Homologie aufweisen, konnten Positionsdeterminanten identifiziert werden. Die Mutation von Tyr603 und His604 des Maus-Enzyms in die entsprechenden Reste der humanen 15-LOX-2 führte zu einer Verschiebung von
8- zu vollständiger 15-Lipoxygenaseaktivität, die umgekehrte Strategie zu einer partiellen Änderung der Positionsspezifität der humanen 15-LOX-2 (Jisaka et al., 2000).

Die Umwandlung einer 15- in eine 12-LOX und umgekehrt ist also relativ leicht und kann bereits durch den Austausch einer Aminosäure erreicht werden. Frühere Versuche, eine
15-LOX in eine 5-LOX umzuwandeln, führten allerdings zu inaktiven Enzymspezies. Kürzlich ist es jedoch gelungen, durch den Austausch von vier Aminosäuren (F359W, A424I, N425M, A603I) die humane 5-LOX über eine 8-lipoxygenierende Spezies in eine 15-LOX umzuwandeln (Schwarz et al., 2001).

Es existieren zurzeit zwei verschiedene Hypothesen, um die Positionsspezifität der
15- bzw. 12-LOXn und der 5-LOX auf Basis der Substratbindung zu erklären (Funk und Loll, 1997).

Volumen-Hypothese:

Die Ergebnisse der Mutageneseversuche, in denen eine 15-LOX durch Verkleinerung von voluminösen Aminosäuren in eine 12-LOX umgewandelt werden konnte, sowie die Versuche mit artifiziellen Fettsäuren und nicht zuletzt die Kristallstrukturen der Sojabohnen- und der Kaninchen-Retikulozyten LOX sind Ausgangspunkt der Volumen-Hypothese. Nach dieser Hypothese wird die Größe der Substratbindungstasche für die unterschiedliche Positionsspezifität verantwortlich gemacht (Browner et al., 1998;Gillmor et al., 1997) (Abb. 8a). Das Substrat wird bei allen Isoformen mit dem Methylende in der Bindungstasche gebunden. Demzufolge besitzen 15-LOXn eine sehr kleine Bindungstasche, das Substrat kann nicht besonders tief eindringen, so dass C-13 der Arachidonsäure an das katalytisch aktive Eisen kommt. Bei 12-LOXn ist der Hohlraum ein wenig größer, das Substrat kann tiefer in die Bindungstasche gelangen und C-10 ist am Eisen lokalisiert. Bei LOXn mit dualer Positionsspezifität befinden sich zwei doppelallylständige Methylene in Reichweite des aktiven Zentrums, so dass Wasserstoffabstraktion von zwei unterschiedlichen C-Atomen erfolgen kann (z. B. C-13 und C-10 bei 12/15-LOXn). Die Tiefe dieser Substratbindungstasche liegt demzufolge zwischen denen der 15- und 12-LOXn.

Auch für die 5-LOXn wird eine solche konservierte Substratorientierung postuliert. Die Bindungstasche wird als noch voluminöser angenommen, wodurch C-7 der Arachidonsäure an das Eisen gelangt. Computermodelle des aktiven Zentrums der 5-LOX ausgehend von der Kaninchen 15-LOX-Struktur ergaben eine 20% größere Bindungstasche, was für eine entsprechende Substratorientierung ausreichen würde (Browner et al., 1998). Zusätzlich wird möglicherweise das Substrat am Eingang der Bindungstasche durch Wechselwirkung der negativ geladenen Carboxylgruppe mit einer positiv geladenen Aminosäure (z. B. Arg 403 bei der Kaninchen-Retikulozyten LOX) fixiert (Gan et al., 1996;Gillmor et al., 1997).

Während diese Theorie für 12- und 15-LOXn weitgehend akzeptiert ist, vermag sie nicht ohne weiteres die beobachtete Stereospezifität bei 5-LOXn zu erklären (Prigge et al., 1996;Prigge et al., 1998). Obwohl 5-LOXn den Sauerstoff in der S-Konfiguration einfügen, erfolgen Wasserstoffabstraktion und auch die Sauerstoffinsertion im Vergleich zu 12S- und 15S-LOXn von der gegenüberliegenden Seite. Demzufolge zeigt die Hydroperoxygruppe des 5S-HPETE in die entgegengesetzte Richtung zu der von 12S- oder 15S-HPETE. Die gleiche Benennung des Isomers (S) ergibt aus der unterschiedlichen Lage der benachbarten Doppelbindung an dem jeweiligen chiralen Zentrum (Prioritätenregeln nach Cahn-Ingold-Prelog) (Abb. 7). Führt man sich die hohe Flexibilität der Arachidonsäure vor Augen, scheint es jedoch möglich, sowohl das pro-S-Wasserstoffatom des C-7 bei 5-LOXn als auch das pro-S-Wasserstoffatom von C-10 bzw. C-13 bei 12- und 15-LOXn am aktiven Zentrum zu positionieren (Browner et al., 1998).

5S-HPETE

15S-HPETE

Abb. 7 : Strukturen von 5S- und 15S-HPETE. Obwohl beide Produkte jeweils in der S-Konfigu-ration vorliegen, zeigen die Hydroperoxygruppen in entgegengesetzte Richtungen.

Auch die Radikalverschiebung bei der 5-LOX-Reaktion unterscheidet sich von der der anderen LOX-Isoformen. Während bei 12- und 15-LOXn eine [+2] Verschiebung auftritt, findet man bei der 5-LOX eine [-2] Verschiebung, d.h. das Radikal wandert in Richtung Carboxylende der Fettsäure.

Orientierungs-Hypothese:

Auch die Orientierungs-Hypothese geht für 12- und 15-LOXn von einer Bindung der Fettsäure mit dem Methylende in der Substratbindungstasche aus. Im Gegensatz dazu binden 5-LOXn nach dieser Hypothese das Substrat in inverser Orientierung, d.h. das Carboxylende der Fettsäure gelangt in die Bindungstasche (Prigge et al., 1998)
(Abb. 8b). Diese Orientierung könnte sehr gut die Stereochemie der 5-LOX-Reaktion erklären, da, unter der Voraussetzung, dass das aktive Zentrum analog zu den 12- und 15-LOXn aufgebaut ist, Wasserstoffabstraktion und Oxygenierung von der Seite der Fettsäure stattfänden, die den beobachteten Produkten entspricht. Das Scheitern der Versuche, eine 15-LOX durch Mutagenese in eine 5-LOX umzuwandeln, unterstützten diese Theorie. Das Einführen der geladenen Carboxylgruppe in die hydrophobe Bindungstasche sollte jedoch zu energetischen Problemen führen (Browner et al., 1998).

Es ist davon auszugehen, dass sich die beiden Theorien nicht zwangsläufig gegenseitig ausschließen. So wurde beispielsweise für die Umsetzung von 15S-HPETE mit der Soja-LOX-1 eine 5S-Lipoxygenierung nachgewiesen (Produkt 5S,15S-DiHPETE) (Van Os et al., 1981). Wird die Carboxylgruppe von 15-HETE methyliert, ist 5-Lipoxygenierung sogar die Hauptreaktion mit der Soja-LOX-1 und der Kaninchen 15-LOX (Schwarz et al., 1998). Nach Mutation von Ile418 zu einem kleineren Ala wurde hauptsächlich 8S-Lipoxy-genierung beobachtet (Produkt 8S,15S-DiHPETE). Diese Ergebnisse unterstützen eine inverse Orientierung des 15-HETE-Methylesters bei der 5-Lipoxygenierung durch
15-LOXn. Bei den 5-LOXn mag die Substratorientierung aber wiederum anders sein. So gibt es kinetische und experimentelle Hinweise, dass die 5-Lipoxygenierung, katalysiert durch 15- bzw. 5-LOXn, nach unterschiedlichen Mechanismen abläuft. Substrate mit veresterter Carboxylgruppe, die von der 15-LOX verstärkt an der Position C-5 oxygeniert wurden, werden von der 5-LOX nicht umgesetzt. Des Weiteren konnte die 5-LOX durch Austausch kleiner Aminosäuren gegen die bei der 15-LOX als Positionsdeterminanten identifizierten voluminöseren Reste in eine 15-LOX umgewandelt werden (Schwarz et al., 2001). Die hier zu Grunde liegende Verkleinerung der Bindungstasche würde die Volumen-Hypothese unterstützen.

Abb. 8 : Modelle der Substratbindung bei verschiedenen LOXn nach a) der Volumen-Hypothese und b) der Substrat-Orientierungs-Hypothese. Nach Wasserstoffabstraktion vom am Eisen lokalisierten doppelallylständigen C-Atom und Verschiebung des Radikals erfolgt Sauerstoffinsertion an den Pfeilen. Nach der Orientierungs-Hypothese wird das Substrat bei 5-LOXn invers, d.h. mit der Carboxylgruppe in der Bindungstasche, gebunden.

Ebselen (2-Phenyl-1,2-benzisoselenazol-3(2H)-on) (Abb. 9) ist eine selenoorganische Verbindung. Es besitzt nur geringe Toxizität und entwickelt ein breites Spektrum an pharmakologisch interessanten Wirkungen (Übersichtsartikel (Schewe, 1995)).

Abb. 9 : Struktur von Ebselen

Ursprünglich wurde Ebselen als antiinflammatorischer Wirkstoff entwickelt (Cotgreave et al., 1989;Cotgreave et al., 1988;Gao und Issekutz, 1993). Es ist in der Lage, viele am Entzündungsprozess beteiligte Enzyme zu hemmen, darunter die NADPH-Oxidase (Cotgreave et al., 1989), die NO-Synthase (Hattori et al., 1994) und die 5-LOX (Schewe et al., 1994). Darüber hinaus hemmt es die Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX (Schewe et al., 1994) und besitzt unter anderem antiatherosklerotische (Thomas und Jackson, 1991;Thomas et al., 1993) und zellschützende Eigenschaften (Li et al., 1994;Lin und Girotti, 1994).

Ebselen reduziert effektiv Hydroperoxide, darunter auch die in Biomembranen und Lipoproteinen. In Gegenwart von SH-Reagenzien wie Glutathion ist Ebselen in der Lage, eine katalytische Wirkung analog der PHGPx zu entwickeln (Sies, 1994). Viele der beobachteten Effekte werden auf diese Eigenschaft zurückgeführt, der Hemmmechanismus der meisten Enzyme wurde jedoch bisher nicht näher untersucht.

Für die Hemmung der LOXn wurde eine duale Wirkung des Ebselens vorgeschlagen (Schewe et al., 1994). Zum einen wird der Hydroperoxidtonus der Zellen durch die Glutathion-Peroxidase-Aktivität des Ebselens gesenkt und LOXn benötigen Hydroperoxide zur Aktivierung. Zum anderen erfolgt eine direkte Hemmung durch die Bildung eines LOX-Ebselen-Komplexes. Die genaue Untersuchung der Hemmung der Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX durch Ebselen ist Gegenstand dieser Arbeit.