Acrylamid/Bisacrylamid

Roth, Karlsruhe

Agarose

Promega, Mannheim

Ampicillin Natriumsalz

Roth, Karlsruhe

Antikörper: RGS-His (Maus)

Qiagen, Hilden

Antikörper: anti Kaninchen-IgG Peroxidasekonjugat

Sigma, Deisenhofen

Antikörper: anti Maus-IgG Peroxidasekonjugat

Sigma, Deisenhofen

Antikörper: PDI (Kaninchen)

Stressgen Biotechnol., Kanada

ATP

Roche, Mannheim

ATP-Agarose

Sigma, Deisenhofen

Bis(Trimethylsilyl)trifluorazetamid

Sigma, Deisenhofen

BSA, Fraktion V

Serva, Heidelberg

dNTP-Lösung

Roth, Karlsruhe

Ebselen

Daiichi Pharmaceuticals Co. Japan

U-¹⁴C-Ebselen (Spez. Radioaktivität 8 Ci/mol)

Dr. A. Wendel, Univ. Konstanz

5,8,11,14-Eicosatetrainsäure (ETYA)

Sigma, Deisenhofen

HPLC-Standards 5, 12, 15-HETE, 9, 13 HODE, jeweils R- und S-Isomer

Cayman Chem., Vertrieb: Alexis Deutschland GmbH, Grünberg

Imidazol

Serva, Heidelberg

IPTG, Dioxanfrei

Roth, Karlsruhe

Kanamycin

Sigma, Deisenhofen

Linolsäure

Serva, Heidelberg

Methoxyethanol

Serva, Heidelberg

Nickelagarose (Ni-Agarose)

Qiagen, Hilden

4-Nitrocatechol

Sigma, Deisenhofen

Nitrosomethylharnstoff

Sigma, Deisenhofen

Nordihydroguaiaretsäure

Sigma, Deisenhofen

PD 146 176

Parke-Davis Pharm. Res., USA

Phosphatidylcholin

Sigma, Deisenhofen

Q-Sepharose

Amersham Biosciences, Freiburg

Sacharose

Sigma, Deisenhofen

Salicylhydroxamsäure

Sigma, Deisenhofen

TEMED

Serva, Heidelberg

tert-Butylhydroxyanisol

Serva, Heidelberg

Tris

Merck, Darmstadt

Tween 20

Roth, Karlsruhe

Wenn nicht anders angegeben, ist der Reinheitsgrad der Chemikalien p. a., der der Lösungsmittel HPLC-grade. Gebräuchliche Chemikalien stammen von den Firmen Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) und Sigma (Deisenhofen) und sind nicht gesondert aufgeführt. HPLC-Laufmittel wurden bei Baker (Deventer, Niederlande) erworben.

Die verwendeten Substrat-Fettsäuren

• cis-11,14-Eicosadiensäure

• cis-5,8,11-Eicosatriensäure

• cis-8,11,14-Eicosatriensäure

• cis-11,14,17-Eicosatriensäure

• cis-5,8,11,14-Eicosatetraensäure (Arachidonsäure)

• cis-9,12-Octadecadiensäure (Linolsäure)

• cis-6,9,12-Octadecatriensäure (γ-Linolensäure) und

• cis-9,12,15-Octadecatriensäure (α-Linolensäure)

stammen von Sigma, Deisenhofen.

Ungewöhnliche Arachidonsäure-Derivate (siehe 3.2.1) wurden von I. Ivanov (Lomonosov State Academy of Fine Chemical Technology, Moskau, Russland) synthetisiert (Ivanov et al., 2000).

In dieser Arbeit wurden zwei Modellbiomembranen verwendet:

Submitochondriale Partikel (SMPs) wurden von Dr. Kerstin Schnurr, Deutsches Institut für Ernährungsforschung, Bergholz-Rehbrücke, zur Verfügung gestellt und wurden aus Rinderherzen präpariert (Crane et al., 1956).

Eine Präparation von Endoplasmatischem Retikulum (EKRM, EDTA-high-salt-stripped rough microsomes) erfolgte aus Hunde Pankreas und wurde von Dr. Martin Wiedmann, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, zur Verfügung gestellt.

Bacto-Agar

Difco, Detroit, USA

Bacto-Trypton

Difco, Detroit, USA

Hefe-Extrakt

Difco, Detroit, USA

LB-Medium:

• 1% Bacto-Trypton

• 0,5% Hefe-Extrakt

• 0,5% NaCl

• 1 mM NaOH

LB-Agar:

LB-Medium + 1,5% Bacto-Agar

Die Antibiotikakonzentrationen in den Medien betrugen 100 mg/l Ampicillin (Amp) und für Bakterienklone, die das Prep4-Plasmid enthielten zusätzlich 25 mg/l Kanamycin (Kan).

PBS (phosphate buffered saline):

• 150 mM NaCl

• 3 mM KCl

• 8 mM Na₂HPO₄

• 1,5 mM KH₂PO₄

• pH 7,4

TAE-Puffer (Tris/Acetat/Essigsäure-Puffer) :

• 40 mM Tris

• 20 mM Natriumacetat

• 29,6 mM Essigsäure

• 2 mM EDTA

• pH 7,8

Weitere Puffer für spezielle Methoden werden in den entsprechenden Abschnitten beschrieben.

Alkalische Phosphatase

Roche, Mannheim

DNA Ligase, Bacteriophage T4

Roche, Mannheim

DNA Polymerase, Pyrococcus woesei (PWO)

Roche, Mannheim

DNA Polymerase Thermus aquaticus (Taq)

Promega, Mannheim

Miniprep Spin und Plasmid-Midi-Kit

Qiagen, Hilden

native Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX

Frau C. Gerth, AG Kühn

Qiaquick Gelextraktionskit

Qiagen, Hilden

QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit

Stratagene, La Jolla (USA)

Restriktionsendonukleasen

New England Biolabs, Schwalbach

Western Lightning Chemilumineszenz plus

Perkin Elmer, Boston (USA)

pBluescript

Stratagene, La Jolla (USA)

pgem-T

Promega, Mannheim

pkk15LOX (15-LOX-cDNA in pkk233)

(Kuhn et al., 1993)

pkk5LOX (5-LOX-cDNA in pkk233)

(Schwarz, 2000)

pkk5LOX F359W,A424I,N425M,A603I

(Schwarz, 2000)

pQE-9

Qiagen, Hilden

Es wurden folgende Primer für die Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX verwendet, deren Synthese von der Firma TIB MOLBIOL, Berlin, durchgeführt wurde:

Einführung der Sal I-Schnittstelle am N-Terminus:

Agg AAA CAg gTC gAC ggT gTC TAT CgC gTC

Trunkationsexperimente:

C-term.Domäne

gTC CAg AgC TTg CCA gTg ggC gTC gAC TgC ACC ACg

15-LOX-Gly155

TTA ATC CTg AAC gTC gAC ggg TCC AAg TTA

15-LOX-Glu165

ACT gAC CTC CCT gTC gAC gAg CgA TTT CTg

15-LOX-Phe175

gAg gAC AAg AAA gTC gAC TTC gAg gCT TCg

15-LOX-Pro197

TCg CTC AAT gTT gTC gAC CCC Tgg AAA ACT

Mutanten für Versuche zur Membranbindungsfähigkeit der 15-LOX:

Y15E

ggg gCC TCg ATC gAA gCg ggC TCC AAA

F70H

CgC AAA AAA CAC CAT CTC AAg gAA gAC gCC

L71K

CgC AAA AAA CAC TTT AAg AAg gAA gAC gCC

F,L70,71,HK

CTg CgC AAA AAA CAC CAT AAg AAg gAA gAC gCC Tgg

W181A

TCg CTg gCC gCg ggg CTg gCA gAg CTC

W181E

TCg CTg gCC gAg ggg CTg gCA gAg CTC

W181K

TCg CTg gCC AAg ggg CTg gCA gAg CTC

L195E

TCg CTC AAT gTT gAg gCT CCC Tgg AAA

Y292E

AAC gTC ATC CTG gAA TgC CAg CAg TAC

F412E

CTg gTC TCT gAc gAA ggC ATT TTT gAC

Primer für die humane 5-LOX:

Einführung der Sal I-Schnittstelle am N-Terminus:

Agg AAA CAg gTC gAC CCC TC TAC ACg gTC

Als zweiter Primer bei Mutagenesen diente jeweils die komplementäre Sequenz.

M15[prep4]

Qiagen, Hilden

Top10

Invitrogen, Karlsruhe

XL-1 Blue

Stratagene, La Jolla (USA)

Für die Umklonierung der rekombinanten Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX und der humanen 5-LOX, sowie für die Erzeugung von Punktmutationen (s. u.) kam die Polymerasekettenreaktion (PCR) zum Einsatz.

Es wurde folgendes Standardprotokoll verwendet:

PCR-Ansatz:

• 25 ng Template DANN

• 5 µl Puffer (10x)

• 3 µl Mg SO4 (25 mM)

• 5 µl 5’-Primer (5µM)

• 5 µl 3’-Primer (5µM)

• 1 µl dNTP-Mix (je 10 mM)

• 0.5 µl Polymerase (5 U/µl)

• mit bidest auf 50 µl

Zeitprogramm:

1. 1. 94°C 4 min

2. 94°C 40 s

3. 3. 65°C 1 min

4. 4. 72°C 2 min (Schleife an 2., 29 Zyklen)

5. 5. 72°C 10 min

Zur Erzeugung von Punktmutationen wurde die Überlappungs-Verlängerungs-Technik (overlap-extension) verwendet. Hierzu wurde zunächst für jeden der beiden DNA-Stränge eine PCR mit dem entsprechenden Mutagenese-Primer und einem stromauf- bzw. stromabwärtsliegenden Primer durchgeführt, so dass man zwei sich überlappende DNA-Fragmente jeweils mit der Punktmutation erhielt. In einer anschließenden dritten PCR wurden diese DNA-Fragmente als Template und die beiden außen liegenden Primer aus den PCRs 1 und 2 eingesetzt, so dass ein einzelnes DNA-Produkt mit der entsprechenden Punktmutation synthetisiert wurde. Nach Spaltung mit Restriktionsenzymen erfolgte dann abschließend die Ligation in den entsprechend gespaltenen Wildtyp-Expressionsvektor.

Einige der Mutanten zur Untersuchung der Membranbindungsfähigkeit sowie die Mehrfachmutanten wurden mit dem QuikChange Site-directed-Mutagenesis-Kit der Firma Stratagene unter Verwendung des Standardprotokolls erzeugt.

Um die 15-LOX in das pQE-9 Plasmid ligieren zu können, musste zunächst eine Sal I Schnittstelle unter Mutation des Start-Methionins eingeführt werden. Dazu wurde eine add-on PCR mit Taq-Polymerase durchgeführt, wobei der 3’-Primer hinter einer unikalen Sfi I Schnittstelle innerhalb der kodierenden Region der cDNA liegend gewählt wurde. Das Produkt wurde über ein Agarose-Gel gereinigt und in den pgem-T Vektor ligiert, aus dem das gewünschte DNA-Fragment dann mit den Restriktionsenzymen Sal I und Sfi I herausgeschnitten wurde. Das zweite benötigte Fragment wurde aus der 15-LOX cDNA mit Sfi I und Hind III herausgeschnitten. Da die direkte Ligation der beiden Fragmente in das Expressionsplasmid pQE-9 nicht gelang, wurde zunächst in den mit Sal I und Hind III geschnittenen und dephosphorilierten pBluescript-Vektor ligiert. Nach Transformation in Top10-Zellen wurde aus dem präparierten Plasmid die komplette 15-LOX cDNA dann wieder mit Sal I und Hind III herausgeschnitten und in den mit den gleichen Restriktionsenzymen behandelten und dephosphorilierten pQE-9 Vektor ligiert. Dies führte zu einer Änderung des Enzym-N-Terminus (Met-Arg-Gly-Ser-(His) ₆ -Gly-Ser-Val-Asp-LOX-(Gly-Val...)).

Das 15-LOX-pQE-9 Plasmid wurde in M15[prep4]-Zellen transformiert, diese auf LB_Amp/Kan-Platten ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden verschiedene Klone auf ihre 15-LOX-Aktivität überprüft (2.4.1.2). Der Klon mit der höchsten Enzymaktivität wurde zur Kontrolle durchsequenziert und für eine Vorkultur verwendet (15 ml LB_Amp/Kan), die bei 37°C und 200 UpM über Nacht inkubiert wurde. 4 ml der Vorkultur wurden verwendet, um jeweils 1 l Hauptkultur (LB_Amp/Kan) zu inokulieren. Diese Kultur wuchs bei 37°C und 200 UpM bis zu einer optischen Dichte (OD_600nm) von ca. 1,0 (ungefähr 16 h), bevor die Enzymexpression durch Zusatz von 1 mM IPTG (Endkonzentration) induziert wurde. Nach einer Inkubation bei 30°C für 2 h wurden die Zellen abzentrifugiert (4000 g, 4°C, 15 min), mit PBS gewaschen und bis zur weiteren Verwendung bei –80°C gelagert. Diese Vorgehensweise ergab sich aus einer Optimierung der Expressionsbedingungen. Es konnte keine 15-LOX-Aktivität gemessen werden, wenn nach Zugabe von IPTG eine Inkubation bei 37°C erfolgte. Ebenso führte eine längere Expression, sowie eine IPTG-Zugabe bei geringerer optischer Dichte zu einem Verlust von Enzymaktivität.

Die Zellen der Expressionskultur wurden in PBS resuspendiert (10 ml pro l Ausgangskultur) und entweder mit Ultraschall lysiert (5 mal 10 s 300 W Impulse, 0°C) oder mit einem Zellhomogenisator (Emulsiflex C5, Avestin) aufgeschlossen. Letzteres führte zu einer deutlich höheren Ausbeute an aktivem Enzym. Zelltrümmer wurden abzentrifugiert (14000 UpM im SS34 Rotor, 4°C, 30 min) und der Überstand mit Nickel-Agarose (200 µl pro l Ausgangskultur) bei 4°C für 30 min im Überkopf-Schüttler inkubiert. Die Ni-Agarose wurde niedertourig abzentrifugiert (2 min 1000 UpM), in eine Leersäule überführt und zweimal mit dem fünffachen Säulenvolumen Waschpuffer gewaschen. Das Enzym wurde anschließend in halbsäulenvolumen-Fraktionen mit dem Elutionspuffer eluiert und entweder mit 10% Glyzerin versetzt, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80°C bis zur Verwendung gelagert oder über Q-Sepharose weiter gereinigt.

Waschpuffer:

50 mM NaH₂PO₄

Elutionspuffer:

50 mM NaH₂PO₄

300 mM NaCl

300 mM NaCl

10 mM Imidazol

200 mM Imidazol

pH 8,0

pH 8,0

Eine höhere Imidazolkonzentration im Waschpuffer führte bereits zur teilweisen Elution des Enzyms und konnte daher nicht verwendet werden.

Um eine Bindung des Enzyms an Q-Sepharose zu ermöglichen, musste die Imidazol- und Salzkonzentration der Enzymlösung nach der Ni-Agarose Reinigung verringert werden. Als am effektivsten wurde eine 1:50 Verdünnung mit 10 mM Tris/HCl-Puffer pH 7,4 mit 10% Glyzerin ermittelt. Eine Dialyse war weniger geeignet, da zum einen das Enzym längere Zeit 4°C ausgesetzt gewesen wäre (Verlust der Aktivität), zum anderen es bei konzentrierten Proben zu Proteinpräzipitation kam. Die verdünnte Enzymlösung wurde über 200 µl Q-Sepharose pro Liter Ausgangskultur in einer Polypropylensäule gegeben, mit dem fünffachen Säulenvolumen Tris/Glyzerin-Puffer gewaschen und das Enzym in Halbsäulen-Fraktionen mit 120 mM KCl in Tris/Glyzerin-Puffer eluiert. Weitere gebundene Proteine wurden mit vier Säulenvolumen 1 M KCl in Tris/Glyzerin-Puffer eluiert. Die Enzymfraktionen wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80°C gelagert.

Die cDNA der positionsspezifitätverändernden Mutanten lag in dem Arbeitskreis bereits vor. Die relevanten LOX-Fragmente konnten daher mit geeigneten Restriktionsenzymen herausgeschnitten und in den analog behandelten 15-LOX-pQE-9 Vektor ligiert werden.

F353L mit Kpn I und Dra III ♢ ca. 1300 bp
I418A mit Kpn I und Dra III ♢ ca. 1300 bp
I593A mit Dra III und Hind III ♢ ca. 400 bp

Eine Transformation dieser Konstrukte und der Mutanten, die über die Überlappungs-Verlängerungs-Technik erzeugt wurden, erfolgte analog zum Wildtyp in M15[prep4]-Zellen. Ebenso entspricht das weitere Vorgehen zur Enzympräparation dem der (His)₆-15-LOX.

Bei Mutanten, für deren Erzeugung das QuikChange Site-Directed-Mutagenesis-Kit verwendet wurde, erfolgte eine Transformation in XL-1 Blue-Zellen. Da aus diesen Zellen eine vergleichbare Enzymmenge gewonnen werden konnte, wie aus den M15[prep4]-Zellen, wurde auf eine Umklonierung verzichtet. Die Expression des Enzyms erfolgte analog mit Medien, die nur Ampicillin als Antibiotikum enthielten.

Eine zur Expression der 15-LOX analoge Strategie für die humane 5-LOX gelang nicht, da das entsprechende His-tag-5-LOX-Fusionsprotein katalytisch inaktiv war. Die 5-LOX wurde daher über das Expressionsplasmid pkk5LOX in Top10 Zellen gewonnen:

Die Expression der 5-LOX erfolgte analog zur 15-LOX, jedoch wurde bereits bei einer optischen Dichte von OD₆₀₀=0,6-0,8 die Enzymexpression durch Zusatz von 1 mM IPTG induziert. Die weitere Inkubation erfolgte bei 30°C über Nacht. Die Bakterien wurden abzentrifugiert und nach Waschen mit PBS in 2 ml Puffer A pro Liter Ausgangskultur aufgenommen. Nach Zelllyse durch Ultraschall wurden die Zelltrümmer abzentrifugiert und der Überstand entweder als Enzympräparation eingesetzt oder über ATP-Sepharose gereinigt. Hierzu wurde die Sepharose zunächst mit Puffer C beladen und mit Puffer A gewaschen, um ungebundenes ATP zu entfernen. Anschließend wurde das Bakterienlysat auf die Säule gegeben, mit 10 ml Puffer B gewaschen und die 5-LOX mit 12 ml Puffer C in 2 ml Fraktionen eluiert. Analog wurde die 5-LOX-vierfach-Mutante F359W,A424I, N425M,A603I gereinigt.

Puffer A:

Puffer B:

Puffer C:

50 mM Tra/HCl pH 7,3

Puffer A

Puffer A

2 mM EDTA

+ 1 M NaCl

+ 100 mM NaCl

10 mM Merkaptoethanol

+ 15 mM ATP

Zur Sicherung der Lipoxygenase-exprimierenden bakteriellen Klone wurden jeweils Glyzerinkulturen angelegt. Hierzu wurde 1 ml einer Übernacht-Schüttelkultur mit 1 ml Glyzerinkultur-Lösung gemischt und zu 250 µl Portionen in flüssigem Stickstoff eingefroren und gelagert.

Glyzerinkultur-Lösung:

65% Glyzerin

0,1 M MgSO₄

0,025 M Tris-HCl pH 8,0

Lösung autoklavieren

LOX-Produkte konnten häufig bereits in der RP-HPLC über den Vergleich der Retentionszeiten und der Absorptionsspektren mit denen von authentischen Standardsubstanzen identifiziert werden. Über Eichkurven erstellt mit Standardsubstanzen konnten die entsprechenden Verbindungen über die Flächen der detektierten Peaks quantifiziert werden.

Zur weiteren Analyse wurden einzelne Produkte aufgefangen und, nachdem das Laufmittel unter Vakuum verdampft wurde, der Normalphasen-HPLC (SP-HPLC), Chiralphasen-HPLC (CP-HPLC) oder der Massenspektrometrie (MS) zugeführt.

Zur Bestimmung der Proteinkonzentration wurde das Roti-Quant System (Roth, Karlsruhe), basierend auf der Methode nach Bradford, verwendet. Für die Eichung wurden verschiedene BSA-Konzentrationen im Bereich von 1 mg/ml bis 8 mg/ml verwendet.

Für SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophoresen (SDS-PAGE) wurde die Methode nach Laemmli angewandt (Laemmli, 1970). Es wurden 10% Mini-Gele verwendet und die Elektrophorese bei 27-30 mA durchgeführt. Anschließend erfolgte die Färbung der Proteine mit Coomassie und Trocknung des Gels oder ein Western Blot.

Proteine wurden nach Auftrennung über die SDS-PAGE auf eine Nitrozellulose-Membran nach der semi-dry Methode geblottet (1 h, 10 V). Der Blot wurde mit 5% Magermilch in PBS/0,1% TWEEN-20 blockiert und mit dem ersten Antikörper inkubiert (1 h). Nach intensivem Waschen mit PBS/TWEEN kam als zweiter Antikörper ein Peroxidase-Konjugat zum Einsatz (Inkubationszeit 1 h). Der Blot wurde nach erneutem intensiven Waschen mit PBS/TWEEN mit dem Western-Lightning Chemilumineszenz Plus Reagenz behandelt und zwischen 1 s und 20 s auf einen Röntgenfilm (Kodak) gelegt. Für eine quantitative Auswertung wurde die Intensität der Banden auf dem Röntgenfilm unter Verwendung des Programms Phoretix 1D (Phoretix International, Newcastle, Großbritannien) densitometrisch bestimmt.

Die Bestimmung der kinetischen Konstanten K_M und V_Max erfolgte über ein Lineweaver-Burk-Diagramm. Hierzu wurde für verschiedene Substratkonzentrationen zwischen 5 und 150 µM ein photometrischer Aktivitätsassay durchgeführt und die linearen Anfangsgeschwindigkeiten des Substratumsatzes gemessen. Für jede Substratkonzentration wurden mindestens drei Messungen durchgeführt und die Standardabweichungen bestimmt. Aus der doppelt reziproken Auftragung von Substratkonzentration und Reaktionsgeschwindigkeit (Lineweaver-Burk-Diagramm) wurden die kinetischen Konstanten durch Extrapolation ermittelt.

Es wurde jeweils ein Standard-Aktivitätsassay bei verschiedenen pH-Werten zwischen 6 und 11 durchgeführt und Produkte über die RP-HPLC quantifiziert. Als Puffer wurden für pH-Werte zwischen 6 und 9 Phosphat-Borat-Puffer nach Kolthoff eingesetzt, für höhere pH-Werte Borat-Puffer nach Sörensen.

Zur Bestimmung der Substratspezifität der 15-LOX und deren Mutanten wurden photometrische Aktivitätsassays (2.4.1.1) mit verschiedenen Substratfettsäuren (100 µM) durchgeführt. Aus dem linearen Abschnitt des Absorptionsverlaufs bei 235 nm wurde die jeweilige Umsatzrate bestimmt. Zur Ermittlung der Positionsspezifität wurden Produkte über RP-HPLC aufgetrennt (2.4.1.2).

Die Substratspezifität der 5-LOX und deren Mutanten wurde ausschließlich über die HPLC ermittelt (2.4.1.2). Auch hier wurden die verschiedenen Fettsäuren jeweils in einer Konzentration von 100 µM eingesetzt.

Eine Größe für die Messung der inhibitorischen Wirkung eines Stoffes ist der sogenannte IC₅₀-Wert. Dieser Wert gibt die Hemmstoffkonzentration an, bei der nur noch 50% der ursprünglichen Enzymaktivität vorhanden sind. Für die Ermittlung ist also immer die Bestimmung der ungehemmten Enzymaktivität zur Normierung notwendig. Darüber hinaus werden verschiedene Hemmstoffkonzentrationen eingesetzt, aus denen sich die Halbhemmungskonzentration inter- bzw. extrapolieren lässt. Hier wurde für die Bestimmung der Enzymaktivität der photometrische Aktivitätsassay eingesetzt (2.4.1.1), wobei Enzym (29 nM native 15-LOX) und Hemmstoff für 30 s vorinkubiert wurden und der Reaktionsstart durch Zugabe von Substrat (260 µM Linolsäure) erfolgte.

Zur Bestimmung des Hemmmechanismus von Ebselen wurden Kinetiken bei unterschiedlichen Hemmstoffkonzentrationen am Photometer aufgenommen (2.5.1). Dabei erfolgte die Zugabe des Ebselens als konzentrierte Lösung in Methoxyethanol, so dass die Lösungsmittelkonzentration immer unter 2% blieb, wodurch die LOX-Reaktion nicht beeinflusst wurde. Es erfolgte entweder eine Inkubation der Grundzustands-Fe[II]-LOX (29 nM) mit Ebselen (0-1 µM) für 30 s vor dem Reaktionsstart durch Zugabe des Substrats, oder es wurden Substrat und Ebselen (0-10 µM) vorgelegt und durch LOX-Zugabe (29 nM) gestartet (keine Vorinkubation). Die für beide Varianten aufgenommenen Kinetiken wurden jeweils in einem Lineweaver-Burk-Diagramm aufgetragen, aus dem über den Schnittpunkt der Grafen die Art der Hemmung, kompetitiv oder nicht-kompetitiv, ermittelt wurde.

Darüber hinaus wurde der Einfluss von Glutathion auf die Hemmung der Fe[II]-LOX untersucht, indem ein 300facher molarer Überschuss Glutathion entweder vor oder nach der Vorinkubation von Ebselen und LOX zugesetzt wurde.

Die Untersuchung einer möglichen Modifizierung von Ebselen erfolgte über RP-HPLC. Ebselen und dessen Metabolite wurden über eine Nucleosil C-18-Säule (KS-System, 250 x 4 mm, Partikelgröße 5 µm, Machery-Nagel GmbH, Düren, Deutschland) mit einem Laufmittel bestehend aus Methanol/Wasser/Essigsäure im Verhältnis 55/45/0,1 und einer Flussrate von 1 ml/min aufgetrennt. Die Absorption bei 325 nm wurde gemessen.

Zur Überprüfung, ob Ebselen kovalent an die 15-LOX bindet, wurden Versuche mit ¹⁴C-Ebselen durchgeführt. Dazu wurde die native 15-LOX (32 nM) mit 0, 0,5 und 2 nmol ¹⁴C-Ebselen für 5 min in 1 ml 10 mM Ammoniumhydrogencarbonatpuffer pH 7,0 inkubiert. Anschließend wurde der Puffer unter Vakuum verdampft und der Rückstand in Elektrophorese-Probenpuffer ohne Merkaptoethanol aufgenommen. Aliquots wurden für die SDS-PAGE eingesetzt (2.4.4). Das Gel wurde mit Coomassie gefärbt, getrocknet und für die Exposition eines Röntgenfilms verwendet. Ein Kontrollexperiment wurde mit Merkaptoethanol im Probenpuffer durchgeführt.

Um die Stöchiometrie der 15-LOX-Ebselen-Wechselwirkung zu bestimmen, wurden Dialyseexperimente durchgeführt. Hierzu wurde die native 15-LOX (380 nM) mit ¹⁴C-Ebselen (8 µM) in 1 ml 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,4 für 2 min inkubiert. Anschließend wurde dieser Ansatz gegen 2 l des gleichen Puffers dialysiert und zu verschiedenen Zeitpunkten (0-30 h) Aliquots aus dem Dialyseschlauch entnommen. Die Radioaktivität in diesen Aliquots wurde durch Flüssig-Szintillationszählung bestimmt und das Verhältnis von Ebselen zu LOX ermittelt (spezifische Radioaktivität des ¹⁴C-Ebselens: 8 Ci/mol). In einem zweiten Dialyseexperiment wurde dem Dialysepuffer 1 mM Glutathion zugesetzt.

Das Modell für die Kinetik der Hemmung der LOX durch Ebselen wurde in Kooperation mit Dr. Holzhütter, Institut für Biochemie, Charité, Humboldt-Universität zu Berlin, erstellt. Für den Fit der beiden Gleichungen (1) und (2) (3.2.2.5)an die experimentellen Daten wurde das SIMFIT Software-Paket verwendet.

Die eingesetzten gereinigten Enzyme wurden zur Abtrennung von Präzipitationen 10 min bei 4°C und 20000 g zentrifugiert. Es folgte eine 5 minütige Inkubation bei Raumtemperatur von 1 µg (bzw. 2,5 µg) LOX mit 200 µg SMP als Modellmembranen in 50 mM HEPES Puffer pH 7,4 mit 150 mM NaCl, 5 mM MgCl₂ und 1 mM DTT. Das Gesamtvolumen betrug 25 µl. Anschließend wurden die Proben auf 100 µl eines Sacharose-Kissens
(500 mM Sacharose in dem gleichen Puffer) gegeben und in einer Beckmann Tabletop Ultrazentrifuge für 15 min bei 100000 g und 4°C zentrifugiert. Das Pellet beinhaltet den membrangebundenen Teil der LOX und wurde in 25 µl zweifach Probenpuffer (Roti Load, Roth, Karlsruhe) aufgenommen. Der zuvor vorsichtig abgenommene Überstand wurde zur besseren Handhabung mit einer Ovalbumin-Lösung versetzt (Endkonzentration 60 µg/ml) und Proteine mit Trichloressigsäure (Endkonzentration 10%) gefällt. Nach Zentrifugation (20000 g, 20 min, 4°C) wurde das Pellet ebenfalls in 25 µl zweifach Probenpuffer aufgenommen und Aliquots (10 µl) der 20000g und 100000 g Pellets in einer SDS-PAGE aufgetrennt (2.4.4). Als Kontrolle erfolgten analoge Versuche ohne Membranzugabe. Anschließend wurde ein Western Blot durchgeführt (2.4.5). Als erster Antikörper wurde ein RGS-His-Antikörper in der Verdünnung 1:4000 verwendet, als zweiter kam ein Peroxidase gekoppelter anti-Maus-IgG Antikörper, ebenfalls in der Verdünnung 1:4000, zum Einsatz. Nach Behandlung mit dem Western-Lightning Chemilumineszenz Plus Reagenz und Exposition eines Röntgenfilms wurden die Anteile der 15-LOX in Pellet und Überstand densitometrisch bestimmt (2.4.5) und miteinander verglichen.

Zur Bestimmung der Zeitabhängigkeit der Membranbindung wurde die LOX mit SMP inkubiert und zu verschiedenen Zeitpunkten (5 min bis 2 h) jeweils der membrangebundene Enzymanteil bestimmt.

Die jeweilige LOX-Spezies wurde mit 0,5 mg SMP in PBS für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert, das Gesamtvolumen des Ansatzes betrug 500 µl. Zur Kontrolle erfolgte eine Inkubation ohne Enzym. Die Reaktion wurde mit Methanol gestoppt, Peroxide mit Natriumborhydrid reduziert und nach Einstellung eines sauren pH-Wertes mit Essigsäure, die Lipide nach der Methode von Bligh-Dyer (Bligh und Dyer, 1959) extrahiert. Anschließend erfolgte eine alkalische Hydrolyse der extrahierten Lipide mit 6% methanolischer KOH unter Argon-Atmosphäre bei 60°C für 30 min. Nachdem mit konzentrierter Essigsäure ein saurer pH-Wert eingestellt und Präzipitate abzentrifugiert wurden (10 min, 20000 g, 4°C), konnten Aliquots der Probe direkt in der RP-HPLC verwendet werden. Zur besseren Quantifizierbarkeit und Vergleichbarkeit verschiedener Proben wurde in einigen Fällen das Hydroxyfettsäure/Fettsäure-Verhältnis für Linolsäure und Arachidonsäure und deren Derivate bestimmt.

Neben der Quantifizierung der gebildeten Hydroxyfettsäuren aus Biomembranen als Substrat wurde noch ein weiteres Experiment zur Untersuchung der Membranoxygenaseaktivität von LOX-Mutanten gewählt. Die Inkubation von EKRM mit der 15-LOX führt zu einer Durchlässigkeit der Membran, so dass luminale Proteine freigesetzt werden. Dadurch sind sie im Überstand eines Sedimentationsversuchs nachweisbar, wohingegen sie bei intakten Membranen nur im Pellet zu finden sind. Für die Messung der Membranoxygenaseaktivität wird die Quantifizierung der Freisetzung des luminalen Enzyms Protein-Disulfid-Isomerase (PDI) aus EKRM herangezogen.

Da viele der Mutanten eine veränderte Fettsäureoxygenaseaktivität im Vergleich zum Wildtyp besaßen, wurde als Normierung die Linolsäureoxygenierung verwendet. Hierzu wurden die Linolsäureumsätze mit dem entsprechenden Enzym nach einer Minute am Photometer bestimmt (2.4.1.1) und für die nachfolgenden Experimente die gleiche Linolsäureoxygenaseaktivität eingesetzt. Die jeweilige LOX-Spezies wurde mit EKRM bei 26°C unter leichtem Schütteln in 50 mM HEPES Puffer pH 7,4 mit 150 mM NaCl, 5 mM MgCl₂ und 1 mM DTT inkubiert (Gesamtvolumen 100 µl). Als Kontrolle diente ein analoger Ansatz ohne Enzymzugabe. Aliquots (25 µl) wurden nach 30 min, 120 min und 240 min entnommen und wie unter 2.7.1 für den Membranbindungsassay beschrieben weiter verfahren (Ultrazentrifugation, TCA-Fällung, SDS-Gel, Western Blot). Im Western Blot wurde zunächst ein anti-PDI-Antikörper aus Kaninchen in der Verdünnung 1:4000 verwendet, als zweiter Antikörper diente ein Peroxidase gekoppelter anti-Kaninchen-IgG Antikörper, ebenfalls in der Verdünnung 1:4000. Die Quantifizierung der Banden erfolgte analog zu 2.7.1 über Chemilumineszenz und densitometrische Messung.

Zur Erstellung von Modellen der Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX und der Sojabohnen LOX-1 mit gebundener Arachidonsäure bzw. Ebselen im aktiven Zentrum wurde das Programm Hyperchem 4.0 für SGI bzw. 5.0 für Windows verwendet. Nachdem die Arachidonsäure bzw. das Ebselen in die Bindungstasche hineinmodelliert wurde, erfolgte eine Energieminimierung des Moleküls und der umliegenden Aminosäureseitenketten.

Für die Vervollständigung der Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX-Kristallstruktur, d.h. die Hineinmodellierung der fehlenden Aminosäuren, wurde das Programm Swiss-PdbViewer 3.7 (Guex und Peitsch, 1997) verwendet. Für die eingefügten Aminosäuren wurde eine Energieminimierung (conjugate gradients) durchgeführt. Die Abbildungen 37 und 39 wurden mit dem Programm VMD (Humphrey et al., 1996) erstellt.

Sequenzvergleiche (Alignments) auf Protein- und DNA-Ebene wurden mit dem Programm ClustalW des European Bioinformatics Institute (EBI) unter Verwendung der Standardeinstellungen durchgeführt. Dieses Programm ist auch in der Lage, einen Vergleich mehrerer Sequenzen, beispielsweise aller tierischen LOXn, zu erzeugen (multiple alignment).

Restriktionskarten der Expressionsplasmide wurden mit den Programmen DNA-Strider, Version 1.0, und DNAssist, Version 1.03, erstellt.

Alle Arbeiten wurden unter einem Abzug durchgeführt. 100 ml Diethylether wurden mit 35 ml gekühlter 40%iger Kalilauge unterschichtet. In einem Eisbad wurden unter Schwenken in kleinen Portionen 0,1 mol Nitrosomethylharnstoff eingebracht und anschließend, 10 min nach der letzten Zugabe, die etherische Diazomethanlösung abgegossen. Nach Trocknung über festem Kaliumhydroxid für ca. 3 h wurde die Lösung bei -20°C gelagert.

Für die Veresterung von Carboxylgruppen wurde zu einer methanolischen Fettsäure- bzw. Hydro(pero)xyfettsäurelösung unter einem Abzug auf Eis etherische Diazomethanlösung gegeben, bis die Gelbfärbung über mehrere Minuten konstant blieb. Anschließend wurde der Diethylether mit Stickstoff verblasen. Auf diese Weise veresterte Fettsäuren wurden für den Einsatz als Substrat über HPLC gereinigt. Die nach dem LOX-Umsatz methylierten Hydro(pero)xyverbindungen wurden über HPLC bzw. MS identifiziert bzw. für den Vergleich von Produkten aus dem Umsatz mit LOXn herangezogen.