Die ortsgerichtete Mutagenese der Positionsdeterminanten der Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX in die kleineren Aminosäuren (F353L, I418A, I593A) führt auch bei der (His)₆-15-LOX zu der erwarteten Verschiebung zur 12-Lipoxygenierung durch Vergrößerung der Substratbindungstasche (Abb. 16). Die Verhältnisse der 12/15-Lipoxygenierung entsprechen etwa denen der WT-Mutanten. Die Positionsdeterminanten bleiben also auch bei diesem rekombinanten Enzym erhalten.

Abb. 16 : Positionsspezifität der (His)₆-15-LOX-Mutanten. Dargestellt sind Ausschnitte der RP-HPLC-Chromatogramme. Die Produkte des Arachidonsäureumsatzes entsprechen denen der Wildtyp-Mutanten.

Die zweite Möglichkeit neben Veränderungen am Enzym (Mutagenese) die Positionsspezifität zu beeinflussen, besteht in der Modifizierung des Substrats. Die Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX ist ein Enzym mit dualer Positionsspezifität, d.h. neben der 15-Lipoxygenierung (Wasserstoffabstraktion am C-13) als Hauptreaktion erfolgt zum geringen Teil auch 12-Lipoxygenierung (Wasserstoffabstraktion am C-10). Die Arachidonsäure ist bei diesem Enzym also so positioniert, dass zwei verschiedene Wasserstoffdonoren (bisallylständige Methylene) in der Nähe des Akzeptors des Enzyms (Nichthämeisen) lokalisiert sind. Um diese Anlagerung zu beeinflussen, wurde die Substratfettsäure auf drei verschiedene Arten modifiziert (Tab. 3):

1. I. Einführung großer Gruppen am Methylende der Fettsäure
   Von der Einführung sterisch anspruchsvoller Gruppen wie tert.-Butyl (-(CH₃)₃) oder Iod wurde angenommen, dass dadurch C-10 als Wasserstoffdonor aus der Umgebung des Eisens verdrängt wird, da das Substrat, bei Bindung mit der Methylgruppe in der Enzymtasche, weniger tief in die Bindungstasche eintauchen kann. Folglich sollte der kleine Anteil an 12-Lipoxygenierung noch weiter verringert sein.

1. II. Austausch der ω-terminalen Methylgruppe gegen eine Hydroxygruppe
   Diese Hydroxy-Fettsäure sollte ein schlechteres Substrat darstellen als Arachidonsäure, da eine polare Gruppe in die hydrophobe Bindungstasche eindringen muss. Dies müsste sich vor allem auf die Substrataffinität auswirken. Darüber hinaus ist möglicherweise eine inverse Substratorientierung erleichtert.

2. III. Methylierung der Carboxylgruppe
   Um eine inverse Substratorientierung zu ermöglichen, müsste vermutlich die Energie-Barriere, die mit dem Eintauchen polarer Gruppen in das hydrophobe Milieu der Substratbindungstasche einhergeht, gesenkt werden. Hierzu wurde die Ladung der Fettsäure-Carboxylgruppe durch Veresterung eliminiert.

Tab. 3 : Strukturen der untersuchten synthetischen Substrate. ASR=Arachidonsäure-Rest, der in allen Substraten identische Teil von der Carboxylgruppe bis zum C-18 der Fettsäuren. Für die Berechnung der Abstände wurde das am weitesten entfernte Atom am ω-Terminus verwendet.

Für eine übersichtliche Benennung der Arachidonsäurederivate wird die Bezeichnung Arachidonsäurerest (ASR) für den bei allen Substraten identischen Teil von der Carboxylgruppe bis zum C-18 der Fettsäure eingeführt.

Bei der Umsetzung von Arachidonsäure (ASR-CH₂-CH₃) und der beiden Derivate ASR-CH₂-I (die ω-Methylgruppe wurde gegen Iod ausgetauscht) und ASR-CH₂-C-(CH₃)₃(die ω-Methylgruppe wurde durch eine tert.-Butyl-Gruppe ersetzt) mit der WT-LOX entstand jeweils ein konjugiertes Dien als Hauptprodukt, welches über RP-HPLC und SP-HPLC gereinigt wurde. Gaschromatographie/Massenspektrometrie (GC/MS) ergab, dass es sich jeweils um das 15-Hydro(per)oxy-Produkt handelte (Tab. 4). Mit diesen beiden Arachidonsäurederivaten als Substrat konnten keine enzymatischen 12-Lipoxygenierungs-produkte nachgewiesen werden. Es kann also davon ausgegangen werden, dass der Ort der Wasserstoffabstraktion für 12-Lipoxygenierung, das C-10, zu weit vom Eisen entfernt ist. Dies würde mit einer Substratbindung mit dem Methylende in der Enzymtasche übereinstimmen, da der Abstand von C-10 zum ω-Ende dieser beiden Substrate größer ist als bei Arachidonsäure (Tab. 3). Stattdessen wurde bei der Umsetzung von ASR-CH₂-C-(CH₃)₃ zu einem Anteil von 10% das 5-Lipoxygenierungsprodukt gefunden. Dies spricht dafür, dass die Größe der tert.-Butyl-Gruppe zum geringen Teil eine inverse Substratorientierung erzwingt.

Der Austausch der ω-Methylgruppe gegen eine Hydroxygruppe (ASR-CH₂-OH) führte zu einer starken Änderung in der Positionsspezifität: Die Reaktion führte hauptsächlich zum 12-Lipoxygenierungsprodukt (Tab. 5 und Abb. 17 unten). Da hier die Distanz des C-10 zum ω-Ende nur wenig kürzer als bei Arachidonsäure ist (Tab. 3), wurde nur eine leichte Verschiebung zur 12-Lipoxygenierung erwartet. Die starke Änderung zeigt, dass auch andere Faktoren, wie die Polarität des ω-Endes der Substratfettsäure, die Substratbindung beeinflussen können. Da keine 5-Lipoxygenierungsprodukte gefunden wurden, scheint die Einführung einer polaren Gruppe am ω-Ende der Arachidonsäure nicht ausreichend zu sein, um eine inverse Substratorientierung zu erzwingen. Die Umsetzung der C-20 ω-OH-Fettsäure (ASR′-CH₂-CH₂-OH), in der die C5=C6 Doppelbindung fehlt, führte ausschließlich zum 15-Lipoxygenierungsprodukt (Tab. 5). Da bei diesem Substrat der Abstand des
C-10 vom ω-Ende durch eine zusätzliche CH₂-Gruppe größer ist als bei Arachidonsäure, wurde dieses Ergebnis auch erwartet.

Tab. 4 : Gaschromatographie/Massenspektrometrie-Daten der LOX-Produkte aus dem Umsatz von Arachidonsäurederivaten. Hydroxygruppen wurden silyliert und Carboxylgruppen verestert. Die Nummerierung der C-Atome erfolgte jeweils wie für die freie Säure. Weitere Messungen erfolgten nach Hydrierung der Doppelbindungen. In Klammern: relative Häufigkeit des Ions in %. *: CH2-I wurde bei der Hydrierung zu CH3 reduziert. **: Die freie Carboxylgruppe wurde zu Unterscheidungszwecken mit Diazoethan ethyliert.

Rest

R

K _M -Wert

(µM)

V _max

(s ^-1 )

Oxygenierungs- verhältnis
(C ₁₅ / C ₁₂ )

-CH ₂ -CH ₃

6.5

22.8

93/7

-CH ₂ -I

43

22.5

99/1

-CH ₂ -C(CH ₃ ) ₃

41

3.1

99/1*

-CH ₂ -OH

153

3.7

21/79

-COOH

n. d.

<0.1

n. d.

Tab. 5 : Oxidation von Arachidonsäure-Derivaten verändert am Methylterminus durch die Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX. Dargestellt sind die kinetischen Konstanten und die Anteile der Oxygenierungsprodukte. *: Zusätzlich zum 15-OH-Produkt wurden etwa 10% 5-Lipoxygenierung beobachtet.

Die kinetischen Konstanten in Tab. 5 belegen, dass Arachidonsäure bei weitem das Beste der getesteten Substrate ist. Die hohen K_M- und niedrigeren V_max-Werte der anderen Substrate zeigen, dass die Einführung von sterisch anspruchsvollen oder polaren Gruppen am ω-Ende der Fettsäure eine optimale Substratbindung zu verhindern scheinen. Insbesondere der hohe K_M-Wert für die ω-Hydroxy-Fettsäure spiegelt die energetische Barriere wider, die mit dem Eintauchen einer polaren Gruppe in die hydrophobe Bindungstasche einhergeht. Auf die gleichen energetischen Gründe zurückzuführen sein dürfte die Tatsache, dass die Dicarbonsäure nicht oxygeniert wurde.

Die Methylierung der Carboxylgruppe der Arachidonsäure allein führte zu keiner nennenswerten Veränderung der Produktzusammensetzung: 15-H(P)ETE bleibt das Hauptprodukt (Tab. 6). Allerdings ist der Methylester ein deutlich schlechteres Substrat, wie die kinetischen Konstanten belegen (Tab. 6). Die Bindungsaffinität ist um eine Größenordnung geringer und V_max nur etwa halb so hoch wie für die freie Arachidonsäure.

Im Gegensatz dazu führte die Methylierung der ω-Hydroxy-Fettsäure ASR-CH₂-OH zu einer drastischen Änderung der Produktzusammensetzung: Neben dem 12-OH-Produkt (33%) wurde als Hauptreaktion 5-Lipoxygenierung beobachtet (Abb. 17, Tab. 6).

Abb. 17 : Oxygenierungsprodukte des Umsatzes der ω-Hydroxy-Fettsäure ASR-CH₂-OH und des Methylesters mit der 15-LOX. Vor Durchführung der HPLC wurden die Produkte der freien Säure methyliert. Insert: Die Absorptionsspektren der beiden Hauptprodukte sind sehr ähnlich und deuten auf ein konjugiertes Dien hin.

Darüber hinaus sind die Bindungsaffinität des Methylesters und V_max um ein Mehrfaches höher als bei der freien Säure. Es ist also davon auszugehen, dass die Energiebarriere beim Eintauchen des Methylesters in die hydrophobe Bindungstasche geringer ist als die für die Hydroxygruppe. Dadurch scheint eine inverse Substratbindung und damit 5-Lipoxygenierung favorisiert zu sein.

Bei der Umsetzung des Methylesters der C-20-Hydroxy-Fettsäure ohne die C5=C6-Doppelbindung trat keine 5-Lipoxygenierung auf. Da diesem Substrat das bisallylständige C-7 fehlt, war dies zu erwarten. Die Produktzusammensetzung entspricht also der der freien Säure (Tab. 6).

R

Freie Säure

Methylester

Oxygenierung am C-Atom

rel. K _M

rel. V _max

rel. K _M

rel. V _max

Freie Säure

Methylester

-CH ₃

1

100

9.2

52.5

15 (95%)
12 ( 5%)

15 (90%)
12 (10%)

-OH

23.5

16.2

4.2

55.0

15 (20%)
12 (80%)

12 (33%)
5 (67%)

-CH ₂ OH*

28.2

30.6

21.2

25.5

15 (98%)

15 (98%)

-C(CH ₃ ) ₃

6.3

13.4

8.7

23.6

15 (93%)
5 (7%)

5 (>;98%)

Tab. 6 : Auswirkungen der Carboxylgruppen-Veresterung auf die Oxygenierungsverhältnisse von Arachidonsäurederivaten durch die Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX. Für die Berechnung der relativen K_M- und V_max-Werte wurden die für Arachidonsäure ermittelten (6,5 µM bzw. 22,8 s^-1) auf 1 bzw. auf 100 gesetzt. *: Keine C5=C6 Doppelbindung.

Eine noch größere Änderung der Positionsspezifität wurde bei der Oxygenierung des Methylesters von ASR-CH₂-C-(CH₃)₃ beobachtet (Abb. 18, Tab. 6). Kam es bei der freien Säure bereits zu etwa 10% zur 5-Lipoxygenierung, so wird mit dem Methylester fast ausschließlich (>; 98%) das 5-OH-Produkt gebildet. Untersuchungen der beiden Hauptprodukte aus der Umsetzung der freien Säure und des Methylesters (15- und 5-Lipoxygenierung) mit CP-HPLC ergaben jeweils nur einen Peak, was auf eine hohe Chiralität und damit ein enzymatisches Produkt hinweist. Diese 5-Lipoxygenierung lässt sich am besten durch eine inverse Bindung des Substrats in der Enzymtasche erklären. Vermutlich ist dies auf die Reduzierung der Polarität der Carboxylgruppe durch Veresterung und auf den sterischen Anspruch der tert.-Butyl-Gruppe am ω-Terminus zurückzuführen. Für eine inverse Substratbindung bei der 15-LOX und damit verbundener 5-Lipoxygenierung müssen also beide Enden der Substratfettsäure modifiziert werden.

Abb. 18 : Oxygenierungsprodukte des Umsatzes von ASR-CH₂-C-(CH₃)₃ (oben) und des Methylesters (unten) mit der Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX. Produkte der freien Säure wurden vor der HPLC-Analyse methyliert.

Zur Bestätigung der möglichen inversen Bindung von synthetischen Fettsäuresubstraten bei der Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX wurden Versuche mit Positionsspezifität verändernden Enzymmutanten durchgeführt. Nach dem Modell ermöglicht die Verkleinerung der am Boden der Substratbindungstasche liegenden Aminosäure Ile418 (Mutation zu Ala) ein tieferes Eintauchen der Arachidonsäure, wodurch eine Verschiebung von 15- zu 12-Lipoxygenierung stattfindet. Bei einer inversen Substratbindung sollte analog eine Verschiebung von 5- zu 8-Lipoxygenierung zu beobachten sein.

Die Umsetzung von Arachidonsäure mit der I418A-Mutante ergab eine Verschiebung der Produktzusammensetzung von hauptsächlich 15- zu hauptsächlich 12-Lipoxygenierung (WT: 12/15=4/96, I418A: 12/15=89/11, Abb. 16). Bei der Umsetzung der freien Säure des Substrats mit der tert.-Butyl-Gruppe am ω-Terminus (ASR-CH₂-C-(CH₃)₃) durch die I418A-Mutante wurde hauptsächlich das 15-OH-Produkt gefunden (42%), das 12-OH-Produkt machte nur etwa 20% des Produktgemisches aus (Tab. 7). Dies lässt sich dadurch begründen, dass die Vertiefung der Substratbindungstasche durch die Mutation zum Teil durch den großen tert.-Butyl-Rest des Substrats kompensiert wurde. Diese Fettsäure gelangt demnach nicht tief genug mit dem Methylende in die Bindungstasche hinein um C-13 (Ort der Wasserstoffabstraktion für 15-Lipoxygenierung) komplett aus der Eisenumgebung zu entfernen. Zusätzlich zu diesen beiden Produkten fand verstärkt 5-Lipoxygenierung statt (36%), was wiederum auf eine inverse Substratbindung zurückgeführt wird.

Bei der Reaktion der I418A-Mutante mit dem Methylester von ASR-CH₂-C-(CH₃)₃ traten im Gegensatz zum WT zwei Produkte auf. Als Hauptprodukt wurde das 5-OH-Derivat gefunden (60%), welches das einzige Produkt des Umsatzes mit dem WT darstellte. Darüber hinaus gab es aber auch zu 40% ein weiteres Produkt, welches durch Elektrospray-MS als 8-OH-Derivat identifiziert wurde (Abb. 19).

Abb. 19 : Produkte der Umsetzung des Methylesters von ASR-CH₂-C-(CH₃)₃ durch den Wildtyp und die I418A-Mutante. Unteres Insert: Fragmentierungsmuster und Schlüsselionen des Hauptproduktes der Wildtyp-Reaktion aus GC/MS. Oberes Insert: Analyse des zweiten Produktes aus der Umsetzung mit I418A mittels Elektrospray MS. Die beobachteten Ionen bestätigen das 8-OH-Produkt.

Ähnliche Ergebnisse ergaben sich für die Hydroxy-Fettsäure ASR-CH₂-OH und deren Methylester. Während der Umsatz der freien Säure mit der I418A-Mutante wiederum das 12-OH-Derivat als Hauptprodukt ergab (85%), war mit dem Methylester 8-Lipoxygenierung die Hauptreaktion (67%) (Tab. 7).

R

Oxygeni e rung am C-Atom

Wild-Typ (%)

I418A (%)

Freie Säure

Methylester

Freie Säure

Methylester

-C(CH ₃ ) ₃

15

84

0

42

0

12

0

0

22

0

8

0

0

0

40

5

16

100

36

60

-OH

15

27

0

15

0

12

73

31

85

11

8

0

0

0

67

5

0

69

0

22

Tab. 7 : Zusammensetzung der Produkte aus der Umsetzung von Arachidonsäurederivaten mit der WT-LOX und der I418A-Mutante.

Analoge Ergebnisse mit weniger signifikanten Änderungen ergaben sich aus gleichen Versuchen mit den ebenfalls positionsbestimmenden Mutanten F353L und I593A (ohne Abbildung). Auch hier wurde mit den beiden veresterten Substraten ein deutlicher Anteil des 8-OH-Produktes gefunden.

Die Vertiefung der Bindungstasche durch die Mutation I418A konnte also durch Einführung einer sterisch anspruchsvollen Gruppe (tert.-Butyl) am Methylende des Substrats kompensiert werden. Dies deutet darauf hin, dass freie Säuren mit dem Methylterminus in der Bindungstasche gebunden werden. Bei den getesteten Methylestern führte die Vergrößerung der Substratbindungstasche zu einer Verschiebung von 5- zu 8-Lipoxygenierung was einem tieferen Eintauchen des Methylesters in die Bindungstasche entspricht. Damit wurde die inverse Bindung dieser Substrate bei der 15-LOX bestätigt (Abb. 20).

Abb. 20 : Modelle der inversen Substratbindung bei der 15-LOX und der I418A-Mutante. Inverse Substratbindung tritt auf bei veresterter Carboxylgruppe und gleichzeitigem Vorhandensein großer oder polarer Reste am Methylterminus (R). Bei Vergrößerung der Bindungstasche durch Mutation von Ile418 zu dem kleineren Ala gelangt die Fettsäure tiefer hinein, so dass Wasserstoffabstraktion am C-10 statt am C-7 erfolgen kann. Daraus folgt statt 5-Lipoxygenierung die Bildung des
8-Lipoxygenierungsproduktes.

Aus diesen Ergebnissen lässt sich aber noch keine Aussage über die Substratbindung bei
5-LOXn ableiten. Die Frage der Substratbindung bei diesen Enzymen wird im Folgenden untersucht.

Vor kurzem wurde berichtet, dass die humane 5-LOX durch Mutation der Positionsdeterminanten in größere Aminosäuren (F359W,A424I,N425M,A603I) in ein 15-lipoxygenierendes Enzym umgewandelt werden kann (Schwarz et al., 2001). Dies würde die Volumenhypothese unterstützen, nach der auch bei der 5-LOX die Größe der Substratbindungstasche für die Positionsspezifität entscheidend ist. Für die folgenden Versuche wurden die humane 5-LOX sowie die vierfach Mutante F359W,A424I,N425M,A603I in E. coli exprimiert und über ATP-Sepharose aufgereinigt. In Abb. 21 ist die Produktverteilung des Umsatzes von Arachidonsäure mit den beiden Enzymspezies dargestellt.

Abb. 21 : HPLC-Chromatogramme der Produkte aus der Umsetzung von Arachidonsäure mit der rekombinanten humanen 5-LOX und deren vierfach Mutante F359W,A424I,N425M,A603I.

Für eine genauere Untersuchung der Substratbindungsverhältnisse wurden zunächst verschiedene natürliche Fettsäuren auf ihre Oxidierbarkeit untersucht (Tab. 8).

Wie sich zeigte, akzeptiert die humane 5-LOX nur Fettsäuren der Kettenlänge C-20 mit zumindest C5=C6 und C8=C9 Doppelbindungen (Wasserstoffabstraktion am doppelallylständigen C7). Im Gegensatz dazu oxygeniert die vierfach Mutante Fettsäuren der Kettenlängen C-18 und C-20, die zumindest die Doppelbindungen C11=C12 und C14=C15 enthalten (Wasserstoffabstraktion am doppelallylständigen C13). Auch diese Ergebnisse deuten auf einen entscheidenden Einfluss des Abstands des doppelallylständigen
Methylens vom ω-Terminus der Fettsäure hin und unterstützen somit das Modell der Substratanlagerung mit dem ω-Terminus in der Bindungstasche (Volumenhypothese).

Substrat

5-LOX

F359W+A424I+N425M+A603I

C20:Δ5,8,11,14

100

100

C20:Δ5,8,11

132

0

C20:Δ11,14,17

0

90

C20:Δ11,14

0

106

C18:Δ9,12

3

142

C18:Δ6,9,12

0

144

C18:Δ9,12,15

0

576

Tab. 8 : Oxygenierung verschiedener Fettsäuren durch die rekombinante humane 5-LOX und deren vierfach-MutanteF359W,A424I,N425M,A603I. Die jeweilige Oxygenierungsgeschwindigkeit von Arachidonsäure (C20:Δ5,8,11,14) wurde 100% gesetzt.

Um zu überprüfen, ob die inverse Bindung einer Fettsäure mit der Carboxylgruppe in der Bindungstasche der 5-LOX überhaupt möglich ist, wurde die Dicarbonsäure ASR-COOH (Tab. 3) als Substrat angeboten. Diese Dicarbonsäure ist ein symmetrisches Molekül und der Abstand des bisallylständigen Methylens C-7 von beiden Carboxylgruppen sollte für eine 5-Lipoxygenierung optimal sein. Bei möglicher inverser Bindung müsste dieses Substrat also schnell umgesetzt werden. Dies war aber weder für den Wildtyp noch für die vierfach-Mutante der Fall, beide Enzyme oxygenierten, wie auch schon die Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX, dieses Substrat nicht.

Um mögliche Energiebarrieren, die mit dem Eintauchen der Carboxylgruppe in die Bindungstasche der LOX einhergehen, zu senken, wurde die Dicarbonsäure monomethyliert und der 5-LOX sowie der WT-15-LOX als Substrat angeboten. Wie sich zeigte, wurde der Monomethylester von beiden Enzymen schnell umgesetzt (Abb. 22, Insert). Aus der RP-HPLC wurde jeweils ein einzelnes Oxygenierungsprodukt ermittelt, dessen Untersuchung durch MS ergab, dass die Oxygenierung in der Nähe des Monomethylesters stattfand (Tab. 4 und Tab. 9). Bei Nummerierung der C–Atome mit der freien Carboxylgruppe als C1 war das Hauptprodukt der 5-LOX-katalysierten Lipoxygenierung das 5-OH-Derivat, während die WT-15-LOX das 15-OH Produkt bildete (Abb. 22). Daraus folgt, dass sich bei der Umsetzung dieses Substrats jeweils die methylierte Carboxylgruppe in der Substratbindungstasche befand.

Abb. 22 : HPLC-Chromatogramm der Umsetzung des Dicarbonsäure-Monomethylesters ASR-COOMe mit der rekombinanten humanen 5-LOX und der rekombinanten WT-15-LOX. Insert: Oxygenierungsgeschwindigkeiten des Substrats im Vergleich zu Arachidonsäure.

M-
m/z

M^- - H2O
m/z

M- - MeOH
m/z

α-Spaltung
m/z

5-LOX-Produkt

349,4 (3%)

330,9 (82%)

317,1 (100%)

114,7 (16%)

15-LOX-Produkt

349,7 (2%)

317,0 (100%)

218,7 (3%)

Tab. 9 : Negative-Ionen-Massenspektrometrie-Daten der beiden Hauptprodukte aus der Umsetzung des Dicarbonsäure-Monomethylesters ASR-COOMe mit humaner 5-LOX und der WT-15-LOX nach Elektrospray-Ionisation. In Klammern: Relative Häufigkeit des Ions.

Diese Ergebnisse stimmen mit der Annahme überein, dass bei beiden Enzymen, 5-LOX und 15-LOX, aus energetischen Gründen der Methylester in die hydrophobe Bindungstasche gelangt und nicht die polarere Carboxylgruppe. Die Veresterung der Säuregruppe senkt deren Polarität also ausreichend, um ein Eindringen in die Bindungstasche zu ermöglichen. Analog kann geschlossen werden, dass die Verhältnisse für die freie Arachidonsäure identisch sind, d. h. das Methylende der Arachidonsäure gelangt auch bei der
5-LOX in die Bindungstasche.

Im Gegensatz zu der 15-LOX akzeptiert die 5-LOX jedoch keine Methylester von Monocarbonsäuren als Substrat. So wurde z. B. der Arachidonsäure-Methylester durch die
5-LOX nicht umgesetzt. Daraus kann abgeleitet werden, dass die freie Carboxylgruppe des Substrats bei der 5-LOX einen größeren Einfluss auf die Substratanlagerung hat als bei der 15-LOX.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Fettsäuren normalerweise mit dem Methylterminus in der Substratbindungstasche der 12/15-LOXn gebunden werden. Eine inverse Substratbindung kann jedoch bei diesen Enzymen durch gleichzeitige Modifikation beider Enden der Fettsäure (Methylierung der Carboxylgruppe, sterisch anspruchsvolles oder polares Methylende) erzwungen werden. Bei der 5-LOX war keine inverse Substratbidung nachweisbar. Aus den Ergebnissen lässt sich ableiten, dass Fettsäuren auch bei der 5-LOX mit dem Methylende in der Substratbindungstasche gebunden werden (konservierte Substratorientierung). Somit wurde die Volumenhypothese, nach der das Volumen der Bindungstasche auch bei der 5-LOX für die Positionsspezifität verantwortlich ist, bestätigt.

Man unterscheidet bei LOXn den katalytisch inaktiven Grundzustand, bei dem das Nichthämeisen in seiner reduzierten Form vorliegt (Fe[II]-LOX), und den katalytisch aktiven Zustand, der dreiwertiges Eisen enthält(Fe[III]-LOX). Nach Inkubation der Fe[II]-LOX mit Ebselen für 30 s bei Raumtemperatur und anschließender Messung der Enzymaktivität ergibt sich für die Hemmung ein IC₅₀-Wert von 65 nM (LOX-Konzentration 32 nM). Dieser Wert ist deutlich geringer als der anderer in der Literatur häufig verwendeter LOX-Inhibitoren (Tab. 10), was die äußerst starke Hemmwirkung des Ebselens unterstreicht.

Inhibitor

Inhibierung [%]

IC ₅₀ -Wert [µM]

50 nM

500 nM

Ebselen

16

90

0,06

PD 146 176

12

59

0,38

Eicosatetrainsäure

7

73

0,12^*

Nordihydroguaiaretsäure

9

56

0,5^*

4-Nitrocatechol

0

54

4,6^*

tert.-Butylhydroxyanisol

4

2

160^*

Salicylhydroxamsäure

6

6

57^*

Tab. 10 : Übersicht der Hemmwirkungen verschiedener gängiger LOX-Inhibitoren. Die 15-LOX (29 nM) und die jeweiligen Inhibitoren wurden in 1 ml Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,4) für 30 s vorinkubiert. Anschließend erfolgte eine spektrometrische Messung der Enzymaktivität mit
260 µM Linolsäure als Substrat. Die Zahlen entsprechen dem Mittelwert von mindestens zwei Messungen. ^*Der IC₅₀-Wert wurde übernommen aus (Schewe et al., 1986).

Genauere Untersuchungen ergaben, dass die Hemmung der Fe[II]-LOX durch Ebselen unmittelbar auftritt und nicht von der Dauer der Vorinkubation abhängt (kürzeste gemessene Vorinkubationszeit: 5 s). Darüber hinaus ist sie irreversibel, da Gelfiltration, Dialyse und der Zusatz eines Überschusses an Substrat die Enzymaktivität nicht wieder herstellen konnten (ohne Abbildung). Dies stimmt mit dem aus einem Lineweaver-Burk-Diagramm ermittelten Hemmmechanismus überein. Der Schnittpunkt der extrapolierten Geraden auf der Abszisse deutet auf eine nicht-kompetitive Hemmung hin (Abb. 23).

Abb. 23 : Lineweaver-Burk-Diagramm der Hemmung der Fe[II]-LOX durch Ebselen nach Vorinkubation. Aufgetragen sind jeweils die Mittelwerte ± Standardabweichung dreier unabhängiger Messungen. Die Ebselen-Konzentration betrug 0-1 µM. Der gemeinsame Schnittpunkt der Geraden auf der Abszisse deutet auf eine nicht-kompetitive Hemmung hin.

Die ermittelten kinetischen Konstanten lauten K_M=38,7 µM und V_max=31 s^-1 für das ungehemmte Enzym sowie V_max=13,3, 6,8 und 5,5 s^-1 für 0,06, 0,2 und 1 µM Ebselen.

In Übereinstimmung mit vorherigen Beobachtungen (Schewe et al., 1994), schützte das Vorhandensein von Reagenzien mit SH-Gruppen im Vorinkubationsansatz (Glutathion, Merkaptoethanol) die LOX vor Inaktivierung.

Es ist bekannt, dass Ebselen mit SH-Gruppen reagiert (Ullrich et al., 1996) und die Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX enthält 15 freie Cysteine (Rapoport et al., 1979). Um herauszufinden, inwieweit die LOX durch Ebselen kovalent verändert wird, wurden Versuche mit radioaktiv markiertem Ebselen durchgeführt. Bei der SDS-PAGE mit LOX-Proben, die mit unterschiedlichen Konzentrationen ¹⁴C-Ebselen inkubiert wurden, konnte bei Abwesenheit von Merkaptoethanol im Probenpuffer eine radioaktiv markierte Hauptbande identifiziert werden, die mit einem authentischen LOX-Standard komigrierte. Die Intensität des Labelings hängt von der eingesetzten ¹⁴C-Ebselen-Konzentration ab
(Abb. 24).

Abb. 24 : SDS-PAGE von LOX-Proben, die mit verschiedenen Mengen ¹⁴C-Ebselen inkubiert wurden (Coomassie-Färbung und Autoradiographie). Die Elektrophorese wurde in Abwesenheit von Merkaptoethanol durchgeführt. Die Radioaktivität komigriert zusammen mit der 15-LOX.

Bei Vorhandensein von Merkaptoethanol im Probenpuffer konnte keine Radioaktivität mehr nachgewiesen werden. Dies deutet darauf hin, dass die kovalente Bindung des Ebselens an der LOX durch SH-Reagenzien aufgehoben werden kann. Um dies zu bestätigen und um die Stöchiometrie der LOX-Ebselen-Wechselwirkung zu untersuchen, wurden Dialyse-Experimente durchgeführt:

Hierzu wurde die LOX mit einem Überschuss ¹⁴C-Ebselen inaktiviert und dieser Ansatz anschließend einer Langzeit-Dialyse unterzogen (30 h). Freies Ebselen konnte durch die Dialyse-Membran gelangen, während diese für die LOX undurchlässig war. Zu
verschiedenen Zeitpunkten wurden Aliquots aus dem Dialyseschlauch entnommen und die Radioaktivität durch Flüssig-Szintillationszählung bestimmt. In Abb. 25 ist der Dialyse-Verlauf aufgetragen. Zunächst sinkt die gemessene Radioaktivität während der ersten 2 h, bleibt dann aber nahezu konstant. Quantifizierung ergab, dass etwa 10-12 nmol Ebselen pro nmol LOX gebunden bleiben. Der Großteil der 15 in der LOX vorhandenen freien Cysteine muss für Ebselen also zugänglich sein. Übereinstimmend konnten in der
Untersuchung der Enzymoberfläche der Kristallstruktur zehn sichtbare Cysteinreste ermittelt werden.

Führt man die Dialyse in Gegenwart von 1 mM Glutathion durch, so wird wesentlich mehr Radioaktivität aus dem Dialyseschlauch entfernt (Abb. 25). Nach 8 h beträgt das Ebselen/ LOX-Verhältnis nur noch 2,7:1, nach 30 h sinkt dieser Wert auf 1,6:1. Dies bestätigt das Ergebnis aus der Elektrophorese, wonach der Großteil des enzymgebundenen Ebselens durch SH-Reagenzien entfernt werden kann.

Abb. 25 :Verlauf der Dialyse von LOX-Proben, die mit einem Überschuss an ¹⁴C-Ebselen inkubiert wurden, mit und ohne Glutathion im Dialysepuffer. Aufgetragen ist das Mengenverhältnis von Ebselen zu LOX in Abhängigkeit von der Dialysedauer.

Leider konnte dieses Experiment nicht Auskunft darüber geben, ob das Entfernen des enzymgebundenen Ebselens die LOX-Aktivität wieder herstellt, da die LOX bei Langzeit-Dialyse inaktiviert wird. Um dies zu umgehen, wurde eine konzentrierte LOX-Probe durch Ebselen inaktiviert und anschließend unterschiedliche Konzentrationen Glutathion zugesetzt. Nach Entfernen der Komponenten mit geringem Molekulargewicht (freies Ebselen, freies Glutathion, Ebselen-Glutathion-Komplex) durch Gelfiltration, wurde die Enzymaktivität bestimmt. Im Gegensatz zu einer Probe ohne Ebselen-Zusatz, bei der 80% der Reaktivität nach dieser Behandlung erhalten blieben, konnte keine Wiederherstellung der LOX-Aktivität nach Entfernen des Ebselens beobachtet werden. Möglicherweise ist also die Bindung an freie SH-Gruppen des Enzyms nicht die einzige Ursache für die Hemmwirkung des Ebselens.

Es wurde bereits beschrieben, dass Selen-Verbindungen in der Lage sind, Enzym-gebundenes Eisen zu komplexieren (Conradson et al., 1994). Da LOXn ein Nichthämeisen im aktiven Zentrum enthalten, könnte also dessen Komplexierung durch Ebselen zu der Hemmung beitragen. Die hiermit einhergehende Veränderung der Eisenligandensphäre kann durch Röntgen-Absorptionsspektroskopie untersucht werden. Nachdem die Struktur-Modellierung des Ebselens in die Bindungstasche der Kaninchen-Retikulozyten-15-LOX mit Hilfe des Programms Hyperchem keine größeren sterischen Hinderungen ergab, wurden EXAFS-Spektren der nativen LOX und des Ebselen-behandelten Enzyms aufgenommen und ausgewertet.

Die nach der Datenreduktion erhaltenen energienormierten Feinstrukturen des EXAFS-Bereichs zeigten deutliche Unterschiede zwischen der nativen LOX und der Ebselen-behandelten Probe (Abb. 26). Bereits aus diesen Spektren kann gefolgert werden, dass durch die Inkubation mit Ebselen die Eisenligandensphäre der LOX verändert wird.

Abb. 26 : EXAFS-Spektren der nativen 15-LOX und des Ebselen-behandelten Enzyms. Es sind deutliche Unterschiede zwischen den beiden Spektren zu erkennen.

Zur Untersuchung der Ligandengeometrie der LOX und des LOX-Ebselen-Komplexes wurde das EXAFS-Signal mit dem Programm Excurve 92 ausgewertet. Hierzu wurden die Spektren von Modellen der Eisenligandensphäre ausgehend von der LOX-Kristallstruktur mit hineinmodelliertem Wasser bzw. Ebselen berechnet und an die experimentellen Daten schrittweise angepasst. Für beide Varianten konnte eine gute Übereinstimmung zwischen theoretischem und experimentellem Spektrum erzielt werden (Abb. 27). Hierdurch wurde in beiden Fällen ein sechsfach koordiniertes Eisen bestätigt.

Abb. 27 : Auswertung der EXAFS-Spektren der nativen LOX (a) und des LOX-Ebselen-Komplexes (b) mit dem Programm Excurve 92. Dargestellt ist jeweils die gewichtete Feinstruktur k und die entsprechende phasenkorrigierte Fourier-Transformation, aus der sich die Abstände ermitteln lassen. Rot: theoretisches Spektrum; gelb: experimentelle Daten

In Abb. 28 sind die Eisenligandensphären mit den aus den EXAFS-Untersuchungen ermittelten Abständen in Å dargestellt, wie sie sich aus der Verfeinerung der Modelle ergaben. Die Ergebnisse sprechen dafür, dass Ebselen das Wasser als sechsten Eisenliganden unter Ausbildung einer Eisen-Selen-Wechselwirkung verdrängt. Es muss betont werden, dass aus den EXAFS-Signalen nur die allgemeinen Abstände ermittelt werden können, die Zuordnung eines bestimmten Abstandes zu einem Liganden erfolgte nur aus dem Modell.

Abb. 28 : Modelle der Eisenligandensphäre der nativen LOX (a) und des LOX-Ebselen-Komplex (b). Die Abstände in Å wurden aus den EXAFS-Messungen ermittelt. Für beide Modelle ergibt sich ein sechsfach koordiniertes Eisen mit leicht verzerrter oktaedrischer Anordnung. Das Wasser wurde durch Ebselen als sechsten Liganden ersetzt.

Wird die 15-LOX nicht mit Ebselen vorinkubiert sondern zu einem Ansatz aus Substrat und Ebselen gegeben, so tritt eine starke Verminderung der Hemmwirkung des Ebselens ein. Unter identischen Bedingungen stieg der IC₅₀-Wert von 65 nM mit Vorinkubation auf 7 µM ohne Vorinkubation. Diese Veränderung beruht nicht auf einer chemischen Modifizierung des Ebselens, wie durch HPLC-Analyse gezeigt wurde (ohne Abbildung). Detaillierte Untersuchung des Hemmmechanismus ergab, dass die katalytisch aktive Eisen[III]-LOX reversibel durch Ebselen inhibiert wird. Das Lineweaver-Burk-Diagramm deutet in diesem Fall auf eine kompetitive Hemmung der LOX durch Ebselen hin (Abb. 29). Daraus lässt sich schließen, dass Ebselen mit dem Substrat um die Bindung am aktiven Zentrum konkurriert.

Abb. 29 : Lineweaver-Burk-Diagramm der Hemmung der aktiven Fe[III]-LOX durch Ebselen. Die 15-LOX wurde zu einem Ansatz aus Substrat und Ebselen (verschiedene Konzentrationen) gegeben und die Enzymaktivität photometrisch bestimmt. Aufgetragen sind jeweils die Mittelwerte ± Standardabweichung dreier unabhängiger Messungen. Der Schnittpunkt der Geraden auf der Ordinate deutet auf eine kompetitive Hemmung hin.

Wie aus Abb. 23 ersichtlich, wird die katalytisch inaktive Fe[II]-LOX durch Ebselen irreversibel gehemmt. Trägt man die Restaktivitäten des Enzyms nach Inkubation mit unterschiedlichen Ebselen-Konzentrationen semilogarithmisch auf, ergibt sich für diese Art der Hemmung typischerweise ein sigmoider Kurvenverlauf der Dosis-Wirkungs-Beziehung. Wie Abb. 30 zeigt, weicht jedoch der Verlauf oberhalb Konzentrationen von 0,2 µM Ebselen signifikant von einer sigmoiden Kurve (Hill-Modell) ab, was auf einen biphasischen Mechanismus schließen lässt. Möglicherweise überlappen sich also zwei oder auch mehr Hemmmechanismen. Die Punkte in Abb. 30 entsprechen den experimentell ermittelten Werten, die Kurven wurden nach Gleichung (2) (s. u.) ermittelt.

Die experimentellen Werte der LOX-Hemmung durch Ebselen ließen vermuten, dass die irreversible Hemmung der LOX nur bis zu einem gewissen Grad erfolgt. Die Ebselen-modifizierte LOX scheint noch eine Restaktivität zu entwickeln (Abb. 31). Diese Restaktivität könnte möglicherweise nur noch kompetitiv hemmbar sein. Der Kurvenverlauf wurde nach Gleichung (2) (s. u.) ermittelt. Die gute Übereinstimmung von experimentellen Daten und theoretisch berechnetem Kurvenverlauf bestätigt das Modell.

Abb. 30 : Semilogarithmische Darstellung der Hemmung der LOX durch unterschiedliche Ebselen-Konzentrationen. Aufgetragen sind die Restaktivitäten dreier LOX-Konzentrationen nach Vorinkubation mit Ebselen (Punkte: Mittelwerte dreier unabhängiger Messungen ± Standardabweichung, Kurven: Verlauf berechnet nach Gleichung (2))

Abb. 31 : Restaktivitäten in Abhängigkeit vom Ebselen/LOX-Verhältnis. Ebselen und LOX wurden vorinkubiert und anschließend die spez. Aktivität der LOX anhand der Linolsäureoxygenierung photometrisch bestimmt. Die Punkte entsprechen den experimentellen Werten, der Kurvenverlauf wurde nach Gleichung (2) berechnet.

Aus den experimentellen Ergebnissen lässt sich ein kinetisches Modell für die möglichen LOX-Ebselen-Wechselwirkungen erstellen (Abb. 32). Wird das Grundzustandsenzym Fe[II]-LOX (E₀) durch Substrat (S) bzw. das Enzymprodukt (P) in die aktive Form E_a (Fe[III]-LOX) überführt, so konkurrieren Ebselen (ebs) und Substrat (S) um die Bindung am aktiven Zentrum (kompetitive Hemmung). Die zugehörigen Affinitäten werden durch die Konstanten K_i für das Ebselen und K_Ma für das Substrat beschrieben. Die Fe[II]-LOX (E₀) wird darüber hinaus durch Ebselen kovalent modifiziert (E^*). Dieses modifizierte Enzym besitzt eine Restaktivität, auch hier konkurrieren wieder Substrat und Ebselen um das aktive Zentrum. Die zugehörigen Affinitätskonstanten unterscheiden sich von denen des aktiven Enzyms und werden mit K_M ^* für das Substrat und K_i ^* für Ebselen bezeichnet. Aus den Komplexen E_a-S und E^*-S entsteht jeweils das LOX-Produkt, die Enzym-Ebselen-Komplexe E_a-ebs und E^*-ebs sind katalytisch inaktiv.

Abb. 32 : Kinetisches Modell für die Hemmung der 15-LOX durch Ebselen. E₀: Grundzustandsenzym Fe[II]-LOX, E_a: katalytisch aktive Fe[III]-LOX, E^*: Ebselen-modifizierte LOX, K_i und K_Ma: Affinitätskonstanten der aktiven LOX für Ebselen und Substrat, K_i ^* und K_M ^*: Affinitätskonstanten der Ebselen-modifizierten LOX für Ebselen und Substrat, S: Substrat, P: LOX-Produkt, ebs: Ebselen, E_a-S und E^*-S: Enzym-Substrat-Komplexe (bilden das LOX-Produkt), E_a-ebs und E^*-ebs: Enzym-Ebselen-Komplexe (katalytisch inaktiv)

Nach diesem Modell lässt sich die Hemmung der LOX durch Ebselen durch zwei Gleichungen beschreiben:

(1) Aktivität [%] =

(2) Aktivität [%] =

Für die Beschreibung der Symbole vergleiche Abb. 32 und Tab. 11.

Gleichung (1) beschreibt die kompetitive Hemmung der katalytisch aktiven Fe[III]-LOX. Gleichung (2) beschreibt die biphasiche Hemmung ausgehend von der Grundzustands-Fe[II]-LOX: Der erste Term beinhaltet die irreversible Hemmung der Fe[II]-LOX, welche noch eine Restaktivität entwickelt, während der zweite Term die kompetitive Hemmung der durch Ebselen modifizierten LOX beschreibt. In Gleichung (2) gibt n die Zahl der für eine maximale irreversible Hemmung nötigen Ebselen-Moleküle pro LOX-Molekül an.

Für die Hemmung der LOX durch Ebselen wurden folgende Konstanten aus den experimentellen Ergebnissen bzw. aus dem Fit der beiden Gleichungen an die Ergebnisse ermittelt (Tab. 11):

Parameter

Bedeutung

ermittelter Wert

K_i

Kompetitive Hemmung der katalytisch aktiven LOX

4,1 µM

K_i ^*

Kompetitive Hemmung der Ebselen-modifizierten LOX

0,03 µM

E^*

Restaktivität der Ebselen-modifizierten LOX

17%

n

Zahl der Ebselen-Moleküle für max. irrevers. Hemmung

3,3

K_Ma

Substrataffinität der katalytisch aktiven LOX

38,7 µM

K_M ^*

Substrataffinität der Ebselen-modifizierten LOX

10,7 µM

Tab. 11 : Kinetische Parameter der LOX-Hemmung durch Ebselen ermittelt aus experimentellen Ergebnissen und dem Fit der Gleichungen (1) und (2) mit dem SIMFIT Software-Paket

Der Vergleich der ermittelten Konstanten zeigt, dass die Affinität der aktiven Fe[III]-LOX für Ebselen um fast eine Größenordnung höher zu sein scheint als die für Linolsäure (K_i=4,1 µM gegenüber K_Ma=38,7 µM). Die Modifizierung der LOX durch Ebselen erhöht sowohl die Substrataffinität (K_M ^*=10,7 µM) als auch die Affinität für Ebselen
(K_i ^*=0,03 µM). Durch die Wechselwirkung mit Ebselen in Abwesenheit von Substrat wird die Fe[II]-LOX zu maximal 83% durch chemische Modifizierung gehemmt (kovalente Bindung an SH-Gruppen und/oder Eisenkomplexierung). Dazu sind 3-4 Ebselen-Moleküle pro LOX notwendig.