2  Material und Methoden

2.1  Patienten, Verwandte und Kontrollpersonen

Das verwendete Blutmaterial stammt von ALS-Patienten mit einer gesicherten Diagnose ALS (Brooks, 1994). Diese Patienten befanden sich in der ALS-Ambulanz in Betreuung und waren mit der Untersuchung einverstanden. Die unterzeichneten Einverständniserklärungen der Patienten, Verwandten und Kontrollpersonen liegen vor. Ebenso liegt ein positives Votum der Ethikkommission der Charité vor. Die Patienten waren bei Beginn der Untersuchung zwischen 37 und 81 Jahre alt, im Durchschnitt 64 Jahre. Von den 45 Patienten litten zwei an fALS, in vier Fällen wurde die ALS von der Frontotemporalen Demenz begleitet. Ein Patient hatte eine progressive Bulbärparalyse, bei einem anderen bestand der Verdacht auf eine spinale Muskelatrophie, drei weitere hatten andere Sonderformen der ALS. In der folgenden Tabelle sind alle Patienten aufgeführt.

Tabelle 3: Patientendaten: Fall-Nr. zur Anonymisierung, Geschlecht (w/m), Geburtsjahr (GJ), Lebensalter bei Krankheitsbeginn (KB), Lebensalter bei Untersuchung (U), Art der Erkrankung (Art), Nebendiagnosen/Besonderheiten (N/B),. frontotemporale Demenz (FTD), primäre Muskelatrophie (PMA), spinale Muskelatrophie (SMA).

Tabelle 4: Probanden, die sich als Kontrollpersonen zur Verfügung stellten. Fall-Nr. zur Anonymisierung, Geschlecht (w/m), Geburtsjahr (GJ), Lebensalter bei Untersuchung (U).

Tabelle 5: Verwandte, die sich für die Untersuchung zur Verfügung stellten: Fall-Nr. zur Anonymisierung, Geschecht (w/m), Verwandtschaftsgrad (Grad), Geburtsjahr (GJ), Lebensalter bei Untersuchung (U).

Tabelle 6: Die für alle Untersuchungen verwendeten Geräte, alphabetisch.

Tabelle 7: Die für alle Untersuchungen verwendeten Chemikalien, alphabetisch.

Mittels Venenpunktionsbesteck wird aus einer oberflächlichen Armvene 5 ml Vollblut in eine heparinisierte Monovette entnommen. Für den Blutkulturansatz werden 5 ml Blutkulturmedium und 0,3 ml heparinisiertes Vollblut in eine Falconflasche pipettiert und bei 37 °C und 5 % CO2 im Brutschrank 72 h kultiviert. Durch die Zugabe von Colcemid 1,5 h vor der Aufarbeitung werden die Zellen in der Metaphase der Mitose arretiert. Colcemid inaktiviert die Spindelfasern, die Aufteilung der Chromosomen auf die Tochterzellen wird so verhindert. Nach 72 h wird die Kultur bei 1000 U/min 10 min zentrifugiert, der Überstand abgenommen und die Zellen in 5 ml hypotoner Kochsalzlösung (KCl) bei 37 °C 10 min zum Anschwellen gebracht, um die Chromosomenspreitung zu verbessern. Nach 10-minütigem Zentrifugieren bei 1000 U/min wird der Überstand abgenommen und verworfen. Die nachfolgende Fixierung mit 5 ml Fixativ hat die Aufgabe, das Gewebe zu konservieren und den Verlust von Nukleinsäure zu verhindern. Durch die Denaturierung wird die Aktivität endogener Nukleasen und anderer gewebsabbauender Enzyme gering gehalten. Die Zellmembran wird elastisch fixiert. Das aus den Erythrozyten freigesetzte Hämoglobin wird auch denaturiert, zu erkennen an dem Farbumschlag in der Suspenion von rot zu braun (www.uni-kl.de/FB-Biologie/AG-Zankl/chrab.html). Die Suspension wird für 10 min bei 1000 U/min zentrifugiert, der Überstand abgenommen und verworfen. Fixativzugabe und Zentrifugieren werden zweimal wiederholt. Die Suspension ist nun milchig weiß und kann aufgetropft werden.

Ein Tropfen der Suspension wird mit 20-30 cm Abstand auf den gekühlten und mit 80 % Ethanol gereinigten Objektträger gegeben und unter einer Wärmelampe getrocknet. Nach erster Beurteilung unter dem Phasenmikroskop werden die Nichthistonproteine der Chromosomen mit Trypsin denaturiert. Die Bindung der Giemsafarbe ist abhängig von der Verteilung der Nichthistonproteine auf dem Chromosom. So werden Areale mit wenigen Proteinen schwächer gefärbt als solche mit vielen. Die Behandlung mit Trypsin für die GTG-Bänderung dauert 35-45 s. Der Objektträger wird nun 10 s unter fließendem Leitungswasser abgespült und die Chromosomen werden 6-8 min mit 2 %iger Giemsalösung gefärbt. Das Präparat wird mit destilliertem Wasser abgespült und getrocknet. Ist die Färbung ausreichend, wird der Objektträger mit einem Deckglas eingedeckt.

2.5  SCE-Färbung

Die Kultivierung und Aufarbeitung entspricht der Normalpräparation, allerdings wird dem Blutkulturansatz 250 µl 10mM Bromodesoxyuridin (BrdU) zugegeben. BrdU ist ein Thymidinbasenanalogon und wird in der Synthesephase in die DNA eingebaut. Im neu synthetisierten Tochterstrang ist Thymidin nun durch BrdU substituiert. Kommt es während der Kultivierung zu einem zweiten Zellzyklus, so wird BrdU nun auch in den anderen Tochterstrang eingebaut, das Chromatid ist bifilar mit BrdU substituiert. Das andere Chromatid ist immer noch unifilar substituiert, denn es enthält den Matrizenstrang, in den noch kein BrdU eingebaut wurde. Nach der zweiten Synthesephase besteht also ein Chromosom aus einem uni-und einem bifilar substituierten Chromatid. Die aufgetropfte Zellsuspension wird nach der Aufarbeitung des Blutkulturansatzes mit Hoechst 33258 Gebrauchslösung 15-20 min gefärbt. Der Objektträger wird mit aqua dest. abgespült und mit 3-5 Tropfen PBS Puffer und einem Deckglas versehen. So wird er 10 min auf eine Wärmeplatte (60 °C) gelegt und mit einem Abstand von 15 cm mit einer Schwarzlichtlampe bestrahlt. Das Schwarzlicht photolysiert die DNA, die mit BrdU substituiert wurde. Die photolysierte DNA wird abgebaut und mit dem warmen Puffer abgewaschen. Nach dieser Behandlung wird das Deckglas mit aqua dest. abgespült und das Präparat 4 min in einer 2 %igen Giemsalösung gefärbt. Das bifilar substituierte Schwesterchromatid wird nun nicht so stark mit Giemsa gefärbt, weil es durch die Degradierung weniger DNA und färbbare Proteine hat als das nur unifilar substituierte Chromatid. Die Färbung mit Hoechst scheint die Giemsafärbung positiv zu beeinflussen. Sie wird deshalb beibehalten, obwohl die Präparate am normalen Lichtmikroskop und nicht am Floureszenzmikroskop betrachtet werden (www.uni-kl.de/FB-Biologie/AG-Zankl/chrab.html).

	Abbildung 2: Einbau von BrdU in der S-Phase (S), Färbeverhalten der Chromatide in den folgenden Mitosen (M1-M3); substituierter Einzelstrang in grau.

2.6  Induzierte Chromosomenbruchrate nach Bleomycinbehandlung

Die Kultivierung erfolgt wie bei der Normalpräparation. Man setzt von jeder Blutprobe drei Blutkulturen mit je 0,3 ml Vollblut und 5 ml Blutkulturmedium an. Nach 68 h Kultivierung wird das Medium gewechselt. Das neue Medium ist mit Bleomycin in verschiedenen Konzentrationen versetzt. Der erste Blutkulturansatz dient als Leerwert, da in diesem Medium kein Bleomycin enthalten ist. Im zweiten sind 1 µg/ml Bleomycin und im dritten 10 µg/ml Bleomycin enthalten. Die zytostatische Behandlung mit Bleomycin wird 2 h im Brutschrank bei 37 °C durchgeführt, nach der Zugabe von 25-30 µl Colcemid für weitere 2 h fortgeführt. Danach erfolgt die Aufarbeitung wie bei der Normalpräparation. Da Bleomycin ein Zytostatikum ist, muss bei der Aufarbeitung mit einer Atemschutzmaske gearbeitet werden. Sind die Chromosomen auf den Objektträgern, werden sie ohne vorherige Trypsinierung für 15 Minuten in 2 %iger Giemsafärbelösung gefärbt. Die Chromosomen lassen sich nun unter dem Lichtmikroskop bei 1000facher Vergrößerung gut erkennen. Chromatid-und Chromosomenbrüche stellen sich in der Diskontinuität der Färbung dar. Ist die Färbelücke schmaler als der Durchmesser des Chromatids, spricht man von einem chromatidgap. Diese Diskontinuität wird nicht als Bruch gewertet, weil nicht auszuschließen ist, dass es sich dabei lediglich um einen Färbeartefakt handelt.

	Abbildung 3: Definition von chromatidgaps, Chromatidbrüchen und Chromosomenbrüchen

2.7  Fluoreszenz in situ Hybridisierung

Die Kultivierung und Aufarbeitung erfolgt wie bei der Normalpräparation. Nach der Aufarbeitung muss das Präparat über Nacht trocknen. Ist das Präparat schon älter als einen Tag, so wird es vor der Hybridisierung 30 min in 2 x SSC inkubiert, um die Denaturierung und Hybridisierung zu verbessern. Die ungefärbten Chromosomen werden in einer aufsteigenden Alkoholreihe (70 %, 85 % und 100 % Ethanol) jeweils 2 min dehydriert und anschließend in 70 % Formamid/2 x SSC im Wasserbad (73 °C) denaturiert. Bei der Denaturierung wird die doppelsträngige DNA in zwei Einzelstränge getrennt, weil die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Nukleinsäurebasen der hohen Temperatur nicht standhalten können. Adenin bildet mit Thymin zwei Wasserstoffbrückenbindungen aus, während Guanin mit Cytosin drei Wasserstoffbrückenbindungen ausbildet. Der Objektträger wird kurz in 2 x SSC gewaschen und erneut durch die Alkoholreihe geführt. Bei der Hybridisierung macht man sich zu Nutze, dass denaturierte Einzelstränge wieder mit dem Einzelstrang, der die komplementäre Nukleinsäureabfolge hat, renaturieren bzw. hybridisieren. Es entsteht so ein neuer Doppelstrang der aus einem Einzelstang mit Sonden-DNA und einem Einzelstrang mit der Ziel-DNA besteht. Bei der Hybridisierung wählt man eine Temperatur unterhalb des Schmelzpunktes der Doppelhelix. Dieser Temperatur können falsch gepaarte Sequenzen auf Grund ihrer schwachen Bindungskräfte nicht standhalten, die Bindungen zwischen richtig gepaarten Sequenzen bleiben stabil. Diese Prozesse nennt man annealing (Therman/Susman, 1993).

In der vorliegenden Untersuchung werden Sonden der Chromosomen 3, 5 und 7, die mit rotem bzw. grünem Fluoreszenzfarbstoff direkt markiert waren, eingesetzt. Pro Objektträger werden 4 µl Sonden der Chromosomen 3, 5 und 7 und 13 µl Hybrisol VI gemischt und bei 73 °C im Wasserbad 5 min denaturiert. Die denaturierte Sonde wird auf den Objektträger pipettiert, auf dem sich schon die denaturierte DNA befindet. Mit einem Deckglas und Fixogum wird der Objektträger versiegelt und bei 37 °C über Nacht inkubiert. In dieser Zeit findet die Hybridisierung statt. Die Entfernung der nicht spezifisch gebundenen Sonden erfolgt am nächsten Tag durch Waschen mit 0,4 x SSC/0,3 % Igepal bei 73 °C für 2 min und anschließend für 30 s mit 2 x SSC/0,1 % Igepal bei Raumtemperatur. Danach werden die Chromosomen mit DAPI-Lösung 14 min unter Lichtausschluss gefärbt, mit VE-Wasser (vollentsalztes Wasser, entspricht Aqua demineralisata) gewaschen und mit Vectashield Antifading eingedeckt.

	Abbildung 4: Denaturierung und Hybridisierung der Sonden- und Ziel-DNA

Das Präparat wird an einem Fluoreszenzmikroskop mit der Quecksilberdampflampe und dem DAPI-Filter (4’,6-Diamidin-2’-Phenylindol-Dihydrochlorid) ausgewertet. Die verwendeten Objektive bieten eine 400fache bzw. 630fache Vergrößerung. Unter dem DAPI-Filter kann die Vollständigkeit der Mitosen beurteilt werden. Mit dem TRITC-Filter (Tetramethylrhodamin-Isothiocyanat) sind die Chromosomen 3 und 5 rot und mit dem FITC-Filter (Fluorescein-5-Isothiocynat) die Chromosomen 7 grün sichtbar. Die Chromosomen 3 und 5 sind trotz gleicher Fluoreszenzfarbe auf Grund ihrer verschiedenen Größe und einer unterschiedlichen Intensität der Färbung voneinander zu unterscheiden. Translokationen zwischen dem hybridisierten Chromosom und einem anderen werden durch einen Farbwechsel im Chromosom sichtbar. Die Hintergrundfärbung ist bei der Fluoreszenz in situ Hybridisierung gering. Auffällige Mitosen werden mit der Mikroskopkamera aufgenommen und im ISIS-Programm von Metasystems digitalisiert und gespeichert.

Tabelle 8: Spezifikation der verwendeten Filterkombinationen

Als unauffällig wird eine Metaphase gewertet, wenn vollständig fluoreszierende Chromosomenpaare der Chromosomen 3, 5 und 7 zu sehen sind. Als ein Ereignis wird ein Farbwechsel innerhalb eines Chromosoms von rot bzw. grün zu blau gewertet. Besitzen beide entstandenen Derivativchromosomen ein Zentromer, so hat eine reziproke Translokation stattgefunden. Ist der Farbwechsel innerhalb eines Chromosoms von rot zu grün erfolgt, so wird dies als zwei Ereignisse gewertet. Als ein Ereignis ist die Beteiligung eines hybridisierten Chromosoms an einer reziproken Translokation zu werten. Mit der Anzahl der gezählten Ereignisse wird die Translokationsfrequenz der Chromosomen 3, 5 und 7 beschrieben. Um eine Aussage über die Translokationsrate des Gesamtgenoms machen zu können, wird ausgehend von den 18,2 % Genomanteil der untersuchten Chromosomen 3, 5 und 7 auf 100 % Gesamtgenom umgerechnet.