Ergebnisse

3.1  Karyotypisierung und Chromosomenanalyse

↓18

Bei der Karyotypisierung werden die Chromosomen nicht nur nach ihrer Größe sortiert, sondern auch nach der Lage des Zentromers. So kann man ungebänderte Chromosomen in 7 Gruppen unterteilen:

↓19

G-Gruppe: Chromosomen 21, 22 und Y A-Gruppe-Chromosomen (1-3) sind große meta-und submetazentrische Chromosomen, B-Gruppe-Chromsomen (4, 5) sind groß und submetazentrisch, C-Gruppe-Chromosomen (6-12) sind mittelgroße submetazentrische Chromosomen, unter denen das X-Chromosom das größte ist. Die D-Gruppe besteht aus akrozentrischen Chromosomen mittlerer Größe mit Satelliten (13-15). Es folgen die E-Gruppe-Chromosomen (16-18), die klein und submetazentrisch sind, die F-Gruppe-Chromosomen (19,20) sind sehr kleine metazentrische Chromosomen. Die G-Gruppe beinhaltet azkrozentrische Chromosomen mit Satelliten (21, 22 und Y). Anhand dieser Einteilung lässt sich jedes Chromosom einer Gruppe zuordnen (Mitelman, 1995). Mittels Giemsa, einem spezifischen Farbstoff, der sich an Nichthistonproteine im Chromosom bindet, kann man die Chromosomen nach vorheriger Trypsinierung in einem für sie spezifischen Muster aus hellen und dunklen Querbanden darstellen. Damit sind die Chromosomen unterscheidbar. Wie stark Giemsa in die DNA eingebaut wird, hängt unter anderem von der Basenzusammensetzung (AT-reiche Regionen werden stärker gefärbt als GC-reiche Regionen), von der Chromatinkonformation, der Dichte an Genen und repetitiven Sequenzen und vom Zeitpunkt der Replikation ab. So werden spät replizierende Abschnitte stärker als früh replizierende Chromosomenabschnitte gefärbt (Barch, 1991). Mit der Bänderung können strukturelle Aberrationen sehr genau lokalisiert werden, indem man die Chromosomen mit dem „International System for Human Cytogenetic Numenclature“ von 1995 vergleicht.

In den folgenden Abbildungen ist ein weiblicher Chromosomensatz nach GTG-Bänderung als Metaphase und als Karyogramm dargestellt.

↓20

Abbildung 5: Metaphase nach GTG-Bänderung

Abbildung 6: Karyogramm eines weiblichen Chromosomensatzes.

Die Kennzeichnung einer Aberration ist genau festgelegt: Chomosomennummer, kurzer oder langer Arm (p bzw. q), Regionnummer und die Bandennummer in dieser Region. Kann man auch eine Aussage über die Unterbande machen, so wird diese durch einen Punkt getrennt anschließend an die Bandennummer aufgeführt. Die Regionen sind ausgehend vom Zentromer zu den Telomeren hin aufsteigend nummeriert. Ebenso sind die Banden innerhalb einer Region vom Zentromer zu den Telomeren hin aufsteigend nummeriert. Eine Translokation zwischen Chromosom 11 auf dem kurzen und Chromosom 22 auf dem langen Arm wird durch t(11;22)(p13.2;q12.1) präzise beschrieben. Die Auflösung einer Karyotypisierung wird durch die Anzahl der Farbwechsel in je einem Chromosom aller 23 Chromosomenpaare beschrieben. Je nach Qualität und Zweck der Aufarbeitung sind insgesamt zwischen 300 und 800 Banden zu sehen. Die Zellen werden ohne Zugabe von Methotrexat aufgearbeitet, da dieses Zellgift Chromosomenaberrationen verursachen kann und damit die Bestimmung der spontanen Translokationsrate verfälscht würde.

↓21

Die Karyotypisierung und Chromosomenanalyse von ALS-Patienten dient dazu, konstitutionelle und spontane Chromosomenaberrationen und deren Häufigkeit im Vergleich zu Kontrollpersonen zu bestimmen. Die Karyotypisierung und Chromosomenanalyse wurde bei zehn Patienten und sechs Kontrollen durchgeführt. Pro Fall wurden 19 Karyogramme ausgewertet. Es zeigte sich bei den Patienten eine Rate von 0,02 spontanen Translokationen/Zelle und von 0,03 anderen strukturellen Aberrationen/Zelle. Bei den Kontrollpersonen wurden 0,04 Translokationen/Zelle und 0,02 andere strukturelle Aberrationen/Zelle analysiert. Deletionen, Inversionen und Duplikationen werden in der Gruppe der anderen strukturellen Aberrationen zusammengefasst. Der U-Test zeigt keinen signifikanten Unterschied (p = 0,35 bzw. p = 0,23) zwischen Patienten und Kontrollen im Hinblick auf Translokationen, Deletionen, Inversionen und Duplikationen.

Tabelle 9: strukturelle Aberrationen nach GTG-Bänderung bei Kontrollen (K) und Patienten (P): untersuchte Mitosen (M), Translokation (t), Deletion (del), Inversion (inv), Duplikation (dup). Der Mittelwert (MW) ist die Summe der Beobachtungen/Anzahl der Beobachtungen.

K

M

t

del/inv/dup

P

M

t

del/inv/dup

jw003 K

18

0

0

jw001 P

16

0

0

jw006 K

16

1

0

jw005 P

22

2

1

jw010 K

19

0

0

jw007 P

19

1

0

jw012 K

20

0

2

jw011 P

17

0

1

jw015 K

20

1

0

jw013 P

19

0

1

jw025 K

19

3

0

jw016 P

22

0

1

jw018 P

20

0

1

jw020 P

21

1

0

jw021 P

16

0

1

jw024 P

19

0

0

MW: K

18,7

0,83

0,33

MW: P

19,1

0,4

0,6

MW/Zelle

0,045

0,02

MW/Zelle

0,02

0,03

3.2 Analyse der SCE-Rate

Der Schwesterchromatidaustausch (SCE) spiegelt die DNA-Reparaturaktivität der Chromosomen wider und ist damit ein indirekter Marker für chromosomale Instabilität.

↓22

Durch den Einbau des Thymidinbasenanalogons Bromodesoxyuridin (BrdU) in der Synthesephase und durch die anschließende Photolyse werden BrdUsubstituierte DNA-Regionen abgebaut und mit dem Puffer abgewaschen. Mit der degradierten DNA gehen auch die Proteine verloren, an die Giemsa gebunden werden kann. Der substituierte DNA-Strang ist dadurch schwächer gefärbt als der unsubstituierte. Nach der ersten Replikation sind die Schwesterchromatiden aller Chromosomen gleichmäßig dunkel gefärbt, weil in jedem Schwesterchromatid der neue Tochterstrang durch BrdU ersetzt wurde (unifilar), der andere ist unverändert geblieben. Hat die Mitose schon eine zweite Synthesephase durchlaufen, so ist ein Chromatid schwächer gefärbt, weil es nun vollständig mit BrdU substituiert wurde (bifilar) (s. Abb. 2 S. 35). Jetzt wird ein Austausch zwischen den verschieden stark gefärbten Schwesterchromatiden sichtbar. Chromosomen in dieser Phase werden auch „Harlekin-Chromosom“ genannt. Bei drei und mehr durchlaufenen Synthesephasen ist das Chromosom dann im Ganzen schwächer gefärbt, was die Auswertung der SCE-Raten unmöglich macht (www.uni-kl.de/FB-Biologie/AG-Zankl/chrab.html).

Abbildung 7: Mitose in der 2. Synthesephase nach BrdU-Zugabe: nicht gewertete Farbwechsel (*), gewertete Farbwechsel (**)

Farbintensitätswechsel, die am Zentromer beginnen, werden nicht gewertet, da sie nicht nur durch ein Chromatidaustausch, sondern auch durch eine Verdrehung des Chromosoms zustande kommen können. Außerdem wird ein SCE nur gewertet, wenn sich das Gegenstück auf dem gegenüberliegenden Chromatid an der gleichen Stelle befindet. Jeder gewertete Farbwechsel entspricht einem SCE. Normalwerte der SCE-Raten liegen zwischen 2-10 SCE/Mitose, meist 5-8 SCE/Mitose (www.uni-kl.de/FB-Biologie/AG-Zankl/chrab.html).

↓23

In der vorliegenden Arbeit wurden SCE-Raten bei zehn ALS-Patienten bestimmt. Da BrdU mutagene Eigenschaften hat und somit einen Chromatidaustausch stimulieren kann, wurden neben den Patienten auch Verwandte und Kontrollpersonen untersucht. In den jeweiligen Gruppen befanden sich sieben Kontrollen und neun Verwandte. Wie der folgenden Tabelle zu entnehmen ist, liegen die SCE-Raten bei 25 ausgewerteten Mitosen je Fall in allen drei Gruppen im Rahmen der Normalwerte. Die Mittelwerte und Standardabweichungen (STABW) der drei Gruppen wurden berechnet. Zwischen der Patienten-und der Kontrollgruppe besteht im U-Test kein signifikanter Unterschied (p = 0,43).

Tabelle 10: SCE-Rate der Kontrollen, Verwandten und Patienten und ihr Mittelwert (MW) mit Standardabweichung (STABW).

Kontrollen

SCE/Zelle

Verwandte

SCE/Zelle

Patient

SCE/Zelle

jw003

6,9

jw002/Tochter

7,2

jw001

7,8

jw006

6,4

jw004/Tochter

6,6

jw005

6,5

jw010

8,4

jw009/Tochter

7,0

jw007

9,5

jw012

8,4

jw008/Schwester

8,0

jw011

9,0

jw015

5,6

jw014/Sohn

5,1

jw013

5,8

jw025

8,6

jw017/Tochter

10,4

jw016

7,9

jw028

6,9

jw019/Tochter

7,0

jw018

8,4

jw022/Bruder

6,1

jw020

6,6

jw023/Tochter

6,9

jw021

8,2

jw024

9,2

MW

7,31

MW

7,14

MW

7,89

STABW

1,078

STABW

1,375

STABW

1,178

Abbildung 8: SCE-Raten der drei Gruppen.

↓24

Summiert man die Zellen mit einer bestimmten SCE-Häufigkeit in einem Diagramm auf, so ergibt sich in allen drei Gruppen eine Normalverteilung mit einem Maximum bei 6-7 Austauschen/Zelle. Es sind vereinzelte Zellen mit mehr als 14 und weniger als 4 Austauschen nachweisbar. Wie dem folgenden Diagramm zu entnehmen ist, ist der Kurvenverlauf in der Kontroll-, Verwandtenund Patientengruppe annähernd gleich.

Abbildung 9: Verteilung der SCEs in den Zellen der Patienten-, Kontroll-und Verwandtengruppe.

3.3  Bestimmung der spontanen und induzierten Bruchrate mit Bleomycin

Die Induktion von Brüchen durch Bleomycin wurde an einer Auswahl von sechs Patienten, fünf Blutsverwandten und vier Kontrollen durchgeführt. Es wurden pro Fall 25 Mitosen auf Chromatid-und Chromosomenbrüche und azentrische Fragmente untersucht. Jeder Chromatid-und Chromosomenbruch und jedes azentrische Fragment wird als ein Bruchereignis gewertet. Färbelücken (chromatidgaps) werden zwar erfasst, aber nicht als Bruch gewertet.

↓25

Abbildung 10: Mitose mit 43 Chromosomen (unvollständig) nach Zugabe von 10 µg/ml Bleomycin: Chromtidbruch (*).

Die gemittelten spontanen Bruchraten (arithmetischer Mittelwert) der Kontrollgruppe mit 0,00 Brüche/Zelle (B/Z), der Verwandtengruppe mit 0,02 B/Z und der Patientengruppe mit 0,01 B/Z liegen im unteren Bereich bzw. sogar unter den Durchschnittswerten von 0,02-0,04 B/Z. Bei Zugabe von 1 µg/ml Bleomycin liegt die Patientengruppe mit 0,15 B/Z unter der Kontrollgruppe mit 0,17 B/Z. Die Verwandten reagieren mit 0,1 B/Z am wenigsten sensitiv auf Bleomycin. Bei der höchsten Bleomycinkonzentration (10 µg/ml) liegt die Patientengruppe mit 0,7 B/Z unter der Verwandten-und Kontrollgruppe mit 0,71 bzw. 0,87 B/Z. Der U-Test liefert keinen Anhalt für eine Signifikanz hinsichtlich erhöhter Bruchraten unter steigenden Bleomycinkonzentrationen in der Patientengruppe (p = 0,4; 0,6; 0,8).

Tabelle 11: Zahl der Brüche/Zelle bei 0 µg/ml, 1 µg/ml bzw. 10 µg/ml Bleomycinkonzentration in den Kontrollen (K), Verwandten und Patienten (P).

Personen

Bleo 0 µg/ml

Bleo 1 µg/ml

Bleo 10 µg/ml

jw012/K

0

0,12

1,28

jw015/K

0

0,12

0,4

jw030/K

0

0,44

0,48

jw026/K

0

0

1,32

jw014/Sohn

0,08

0,16

0,44

jw017/Tochter

0,04

0

0,72

jw019/Tochter

0

0,24

0,48

jw022/Bruder

0

0,12

1,28

jw023/Tochter

0

0

0,64

jw011/P

0

0,12

0,84

jw013/P

0

0,04

0,76

jw016/P

0

0,12

0,08

jw018/P

0

0,16

0,72

jw020/P

0

0,2

1,32

jw021/P

0,04

0,24

0,48

↓26

Mit folgendem Diagramm wird noch einmal der Anstieg der Brüche/Zelle mit steigender Bleomycinkonzentration in den drei Gruppen (Mittelwerte) deutlich.

Abbildung 11: Zahl der Brüche/Zelle bei 0 µg/ml, 1 µg/ml bzw. 10 µg/ml Bleomycinkonzentration in der Kontroll-, Verwandten- und Patientengruppe.

Betrachtet man die Verteilung der Bruchereignisse, so sind in allen drei Gruppen und den verschiedenen Bleomycinkonzentrationen die Chromatidbrüche (ctb) mit Abstand am häufigsten vertreten.

↓27

Tabelle 12: Anzahl der Chromatidbrüche (ctb), Chromosomenbrüche (csb) und chromatidgaps (ctg) in der Kontroll-, Verwandten- und Patientengruppe

. Gruppen

ctb

csb

ctg

Kontrollen 0 µg/ml

0

0

0,07

Verwandte 0 µg/ml

0,08

0,02

0

Patienten 0 µg/ml

0,01

0

0

Kontrollen 1 µg/ml

0,15

0

0,1

Verwandte 1 µg/ml

0,07

0,01

0,04

Patienten 1 µg/ml

0,14

0

0,05

Kontrollen 10 µg/ml

0,80

0,03

0,30

Verwandte 10 µg/ml

0,66

0,04

0,21

Patienten 10 µg/ml

0,79

0,03

0,30

Abbildung 12: Anzahl der Defekte in den Kontroll-, Verwandten-und Patientengruppen bei entsprechender Bleomycinkonzentration: Chromatidbruch (ctb), Chromosomenbruch (csb), chromatidgap (ctgap).

Die Berechnung der Brüche/Einzelzelle (B/EZ) spiegelt wider, wie viele Brüche in jeder betroffenen Zelle, also in einer Zelle mit mindestens einem Bruchereignis, zu finden sind. Wächst die Zahl der B/EZ mit steigender Bleomycinkonzentration, so sind trotz steigender Bruchrate nicht mehr Zellen betroffen. Während mit steigender Bleomycinkonzentration bei den Kontrollen und Verwandten die Zahl der Brüche in den betroffenen Zellen steigt, also wenige Zellen stärker betroffen sind, bleibt diese in der Patientengruppe fast gleich (von 1,66 auf 1,68 B/EZ in der Patientengruppe, von 1,32 auf 1,76 B/EZ in der Kontrollgruppe). Das heißt, dass mit steigender Bleomycinkonzentration die Zahl der Brüche in den Zellen der Patienten mit mindestens einem Bruchereignis nicht zunimmt, demzufolge die Zahl der betroffenen Zellen ansteigt. Die Rate an Zellen mit mindestens einem Bruchereignis scheint in der Patientengruppe erhöht, zeigt jedoch im U-Test keinen signifikanten Unterschied zur Kontrollgruppe (p = 0,4; 0,5; 0,8).

↓28

Tabelle 13: Anzahl der Brüche/Einzelzelle in den Kontroll-, Verwandten-und Patientengruppen bei 0 µg/ml, 1 µg/ml und 10 µg/ml Bleomycin.

Gruppen

B/EZ Bleo 0 µg/ml

B/EZ Bleo 1 µg/ml

B/EZ Bleo 10 µg/ml

Kontrollen

0

1,32

1,76

Verwandte

0,4

0,87

1,99

Patienten

0,17

1,66

1,68

Abbildung 13: Brüche/Einzelzelle (B/EZ) in der Kontroll-, Verwandten-und Patientengruppe.

Betrachtet man die Zahl der aberranten Zellen, so sind in der Patientengruppe bei 0 µg/ml Bleomycin weniger Zellen betroffen. Dieser Unterschied ist jedoch nicht signifikant (p=0,2; 0,5; 0,6).

↓29

Tabelle 14: prozentuale Häufigkeit aberranter Zellen (% aZ) unter Bleomycinzugabe.

Bleomycin konzentration

Kontrollen % aZ

Verwandte % aZ

Patienten % aZ

Bleo 0 µg/ml

6

3

1

Bleo 1 µg/ml

14

7

11

Bleo 10 µg/ml

43

37

45

Abbildung 14: Prozent der aberranten Zellen unter Bleomycinbelastung.

3.4  Bestimmung der Translokationsrate mittels Fluoreszenz in situ Hybridisierung

Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) dient dem Nachweis struktureller Chromosomenaberrationen. Beim whole chromosome painiting wird das gesamte Chromosom hybridisiert, um die Zahl der Translokationen dieses Chromosoms zu bestimmen. Für die Hybridisierung werden fluoreszenzmarkierte Sonden für die Chromosomen 3, 5 und 7 verwendet. Jede Mitose wird im Fluoreszenzmikroskop mit drei verschiedenen Filtern betrachtet. Nach DAPI-Färbung stellen sich hybridisierte als auch nicht hybridisierte Chromosomen unter dem DAPI-Filter blau dar. Der TRITC-Filter macht den roten Fluoreszenzfarbstoff sichtbar und mit ihm die beiden Chromosomenpaare 3 und 5. Unter dem FITC-Filter ist das Chromosomenpaar 7 grün zu sehen. Hat eine Translokation zwischen nicht homologen Chromosomen stattgefunden, so wird ein Farbwechsel innerhalb eines Chromosoms sichtbar. Ein Farbwechsel zwischen einem hybridisierten und einem nicht hybridisierten Chromosom wird als Ereignis als Folge einer stattgefundenen Translokation gewertet. Sind an einer Translokation zwei hybridisierte Chromosomen beteiligt, so werden sie als zwei Ereignisse gewertet. Translokationen zwischen den Chromosomen 3 und 5 sind auf Grund unterschiedlicher Farbintensität, Größe und Zentromerlage der Chromosomen zu erkennen.

↓30

Es wurden die spontanen Translokationsraten von 37 Patienten und 26 Kontrollen mittels FISH bestimmt. Unter den Patienten sind 32 mit sporadischer ALS (sALS), 2 mit familiärer ALS (fALS), 1 Patient mit ALS-assoziierter frontotemporaler Demenz (ALS-FTD) und 2 Patienten mit progressiver Muskelatrophie (PMA), einer Unterform der ALS. Die Kontrollen sind Ehepartner der Patienten oder andere asymptomatische Personen.

Die Beteiligung der Chromosomen an somatischen Translokationen ist vor allem von ihrer Größe abhängig (Bickmore/Teague, 2002). Die Größe der Chromosomen wird in der Anzahl der Basenpaare angegeben. Die Gesamtgröße des Genoms beträgt 2907 Megabasenpaare (Mbp). Chromosom 3 mit 200 Mbp, Chromosom 5 mit 186 Mbp und Chromosom 7 mit 146 Mbp entsprechen zusammen 18,2 % des Genoms (Venter et al., 2001). Ausgehend von diesen 18,2 % wurde ihre Translokationsrate auf das Gesamtgenom umgerechnet. Die in der folgenden Tabelle angegebenen Translokationsraten der Kontrollpersonen und Patienten beziehen sich auf das Gesamtgenom einer Zelle.

Tabelle 15: Häufigkeit von Translokationen/Zelle (t/Z) in der Patienten-und Kontrollgruppe: Mittelwert (MW) mit Standardabweichung (STABW).

Status

Mitosen

t/Z

Status

Mitosen

t/Z

Kontrolle

524

0,032

ALS

528

0,042

Kontrolle

518

0,054

ALS

527

0,074

Kontrolle

502

0,044

ALS

516

0,011

Kontrolle

540

0,072

ALS

0

0

Kontrolle

509

0,011

ALS

469

0,036

Kontrolle

528

0,158

ALS

512

0,033

Kontrolle

240

0,093

ALS

503

0,011

Kontrolle

218

0,025

ALS

260

0,043

Kontrolle

504

0,033

ALS

480

0,093

Kontrolle

566

0,029

fALS

319

0,017

Kontrolle

211

0

ALS

502

0,011

Kontrolle

490

0

ALS

507

0,077

Kontrolle

395

0

ALS

502

0,055

Kontrolle

388

0,014

ALS

259

0,150

Kontrolle

488

0

ALS

510

0,044

Kontrolle

483

0,012

ALS

513

0,087

Kontrolle

500

0,022

ALS-FTD

527

0,021

Kontrolle

292

0,019

ALS

499

0,022

Kontrolle

501

0,033

fALS

196

0,142

Kontrolle

300

0,055

ALS

244

0,023

Kontrolle

503

0

ALS-PMA

516

0,043

Kontrolle

185

0

ALS

447

0

Kontrolle

522

0,01

ALS-PMA

510

0,044

Kontrolle

380

0,058

ALS

517

0,054

Kontrolle

203

0,081

ALS

503

0,011

Kontrolle

206

0,027

ALS

526

0,074

ALS

522

0,032

ALS

516

0,043

ALS

229

0

ALS

535

0,073

ALS

499

0,022

ALS

511

0,054

ALS

241

0,023

ALS

500

0,067

ALS

503

0,099

ALS

545

0,031

ALS

522

0,085

MW

0,034

MW

0,047

STABW

0,039

STABW

0,036

↓31

Das durchschnittliche Auftreten spontaner Translokationen in einer Zelle beträgt in der Patientengruppe 0,047 t/Z und in der Kontrollgruppe 0,034 t/Z. Dies ist im U-Test kein signifikanter Unterschied (p = 0,08).

Abbildung 15: WCP #3, #5, #7 mit t(5;7) und t(5;?).


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HTML-Version erstellt am:
07.11.2006