Das verwendete Blutmaterial stammt von ALS-Patienten mit einer gesicherten Diagnose ALS (Brooks, 1994). Diese Patienten befanden sich in der ALS-Ambulanz in Betreuung und waren mit der Untersuchung einverstanden. Die unterzeichneten Einverständniserklärungen der Patienten, Verwandten und Kontrollpersonen liegen vor. Ebenso liegt ein positives Votum der Ethikkommission der Charité vor. Die Patienten waren bei Beginn der Untersuchung zwischen 37 und 81 Jahre alt, im Durchschnitt 64 Jahre. Von den 45 Patienten litten zwei an fALS, in vier Fällen wurde die ALS von der Frontotemporalen Demenz begleitet. Ein Patient hatte eine progressive Bulbärparalyse, bei einem anderen bestand der Verdacht auf eine spinale Muskelatrophie, drei weitere hatten andere Sonderformen der ALS. In der folgenden Tabelle sind alle Patienten aufgeführt.

Fall-Nr.

w/m

GJ

KB

U

Art

N/B

jw001

w

1928

71

74

ALS

FTD

jw005

w

1934

65

68

ALS

jw007

m

1931

62

71

ALS

monoklonale Gammopathie

jw011

m

1952

50

50

ALS

jw013

m

1937

56

65

ALS

jw016

w

1940

61

62

ALS

jw018

w

1939

61

63

ALS

jw020

m

1922

68

80

ALS

jw021

m

1936

64

65

ALS

jw024

w

1956

37

46

ALS

03P0936

m

1957

45

47

ALS

03P0938

m

1951

44

52

ALS

03P0942

m

1925

68

78

ALS

03P0943

m

1935

68

68

ALS

03P0944

m

1946

56

58

ALS

03P0976

w

1961

38

39

ALS

03P0977

w

1942

58

62

ALS

03P0978

m

1936

67

68

fALS

SOD1-Genmutation

03P1003

m

1967

35

37

ALS

03P1004

w

1933

70

71

ALS

03P1005

m

1934

63

70

ALS

03P1006

m

1938

61

66

ALS

03P1008

w

1930

73

74

ALS

03P1031

m

1944

59

60

ALS

03P1033

m

1936

65

68

fALS

FTD

04P0009

m

1942

61

62

ALS

FTD

04P0010

w

1931

72

73

ALS

monoklonale Gammopathie

04P0011

w

1935

68

69

ALS

04P0022

m

1923

79

81

PMA

04P0023

w

1937

65

66

ALS

04P0024

m

1943

60

61

ALS

04P0025

m

1967

34

37

SMA

V.a. distale SMA

04P0044

w

1938

65

66

ALS

04P0045

m

1935

63

68

ALS

Bernhardt-Vulpian-Variante

04P0046

w

1937

58

67

ALS

Bernhardt-Vulpian-Variante

04P0080

m

1936

65

68

ALS

04P0081

w

1940

62

64

ALS

04P0124

m

1945

51

59

SMA

V.a. radiogene Plexopathie des Plexus lumbosakralis

04P0125

m

1935

68

69

ALS

04P0126

w

1928

75

76

ALS

04P0144

m

1930

72

74

ALS

progrediente Bulbärparalyse

04P0145

m

1946

57

58

ALS

FTD

04P0166

w

1930

72

74

ALS

04P0182

w

1944

59

60

ALS

04P0183

w

1934

69

70

ALS

Mittewert

60,9

64,1

Tabelle 3: Patientendaten: Fall-Nr. zur Anonymisierung, Geschlecht (w/m), Geburtsjahr (GJ), Lebensalter bei Krankheitsbeginn (KB), Lebensalter bei Untersuchung (U), Art der Erkrankung (Art), Nebendiagnosen/Besonderheiten (N/B),. frontotemporale Demenz (FTD), primäre Muskelatrophie (PMA), spinale Muskelatrophie (SMA).

Fall-Nr.

w/m

GJ

U

jw003

m

1954

48

jw006

m

1934

68

jw010

w

1937

65

jw012

w

1960

42

jw015

w

1939

63

jw030

w

1952

50

jw026

m

1976

26

jw025

w

1980

22

03P0935

w

1960

44

03P0937

w

1952

52

03P0939

w

1937

67

03P0941

w

1959

45

03P1007

w

1969

45

03P1009

w

1954

50

03P1010

w

1980

24

03P1032

w

1937

67

04P0012

m

1947

57

04P0082

m

1936

68

04P0391

m

1966

38

04P0392

w

1978

26

04P0393

w

1979

25

04P0394

w

1976

28

04P0395

w

1971

33

04P0396

m

1978

26

04P0390

m

1977

27

04P0402

w

1979

25

04P0432

w

1968

36

04P0433

m

1969

35

04P0434

m

1981

23

04P0485

w

1957

47

04P0486

m

1951

53

04P0487

w

1954

50

04P0488

w

1975

29

04P0489

m

1932

72

04P0490

w

1954

50

04P0491

m

1957

47

04P0492

m

1966

38

04P0493

m

1957

47

04P0494

m

1943

61

04P0495

w

1960

44

04P0496

m

1944

60

04P0267

w

1942

62

Mittelwert

44,9

Tabelle 4: Probanden, die sich als Kontrollpersonen zur Verfügung stellten. Fall-Nr. zur Anonymisierung, Geschlecht (w/m), Geburtsjahr (GJ), Lebensalter bei Untersuchung (U).

Fall-Nr.

m/w

Grad

GJ

U

jw002

w

Tochter

1956

46

jw004

w

Tochter

1971

31

jw009

w

Tochter

1962

40

jw008

w

Halbschwester

1928

84

jw014

m

Sohn

1962

40

jw017

w

Tochter

1959

43

jw019

w

Tochter

1969

33

jw022

m

Bruder

1940

62

jw023

w

Tochter

1968

34

Mittelwert

45,6

Tabelle 5: Verwandte, die sich für die Untersuchung zur Verfügung stellten: Fall-Nr. zur Anonymisierung, Geschecht (w/m), Verwandtschaftsgrad (Grad), Geburtsjahr (GJ), Lebensalter bei Untersuchung (U).

Gerät

Hersteller

7,5 ml Monovette, heparinisiert

Monovette, Sarstedt

Brutschrank, 37 °C, 5 % CO2

Heraeus B15, Kendro Laboratory

Products, Hanau

Deckgläser, 24x60 mm

Menzel-Gläser

Einmalglaspipetten, Pasteurpipetten, Glaspipetten

Brand

Falconflaschen

Becton Dickinson, USA

Färbeküvetten

Glaswerk, Wertheim

Fluoreszenz-Filter

Zeiss, Jena

Durch-und Auflichtmikroskop,

Zeiss, Jena

10/40/63/100 Objektiv, Axioskop

Multiadapter

Sarstedt, Nürnberg

Objektträger, Superfrost

Menzel-Gläser

Quecksilberdampflampe

mercury short arc photo optic lamp
1xHBO 103W/2, orsam, Berlin

Schnappdeckelröhrchen (round bottom

Becton Dickinson, USA

tube)

Schwarzlichtlampe

Philips 20W/08F20T 12BLB

Trockenschrank, 60 °C, 5 % CO2

Melag

Venenpunktionsbesteck W.I.N. 21 g

Abbot Ireland

Wärmeplatte, 45 °C

Medax Nagel GmbH, Kiel

Wasserbad, 37 °C, 73 °C und 80 °C

GFL1083, Burgwedel

Zentrifuge, Megafuge 2.0

Heraeus Sepatech

Tabelle 6: Die für alle Untersuchungen verwendeten Geräte, alphabetisch.

Chemikalien

Zusammensetzung

Hersteller

0,4 x SSC/0,3 % Igepal

10 ml 20 x SSC ad 500ml aqua bidest./1,5 µl Igepal (Igepal CA-630)

Merck, Darmstadt SIGMA-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

20 x SSC

175,3 g NaCl, 88,2 g tri-Natriumcitrat-Dihydrat ad 1000 ml aqua bidest.

Merck, Darmstadt

2 x SSC

Verdünnung 1:10 von 20 x SSC mit Aqua dest.

Merck, Darmstadt

2 x SSC/0,1 % Igepal

50 ml 20 x SSC ad 500 ml auqa bidest. 0,5 µl Igepal

Merck, Darmstadt, SIGMA-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

70 % Formamid/2 x SSC

24,5 ml Formamid, 3,5 ml 20 x SSC, 7 ml aqua bidest. autoklaviert. 17 µl 37 % HCl (pH 7,0)

Merck, Darmstadt

aqua bidestillata

nalgene

aqua destillata

Aqua ad iniectabilia

Braun, Melsungen

Bleomycin Stammlösung 5

Bleomycinsulfat rein (biol.

SERVA electrophoresis,

mg/ml

Aktivität: 1,4-2,1 U/mg)

Heidelberg

Blutkulturmedium

100 ml RPMI 1640

GIBCO, Auckland N.Z.

Medium+GlutaMAX. 20 ml fetal bovine serum

BIOCHROM KG, Berlin

(tested for Mycoplasma). 2,5 ml PHA-L

(Phytohemagglutinin). 1,2 mg Protein/5 ml. 1 ml Penicillin/ Streptomycin (10000 U/10000 µg/ml)

Bromodesoxyuridin, 10 mM

5-Bromo-2’-Deoxyuridine Ultra 99 % 15,35 mg/50 ml aqua dest.

SIGMA-AldrichChemie GmbH, Steinheim

Colcemid

10 µg/ml KaryoMAX

GIBCO, Auckland N.Z.

Colcemid

Dapi 0,5µg/ml

150 µl stock 200 µg/ml 12 ml 20 x SSC

SIGMA-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

48 ml aqua bidest. 150 µl Tween20

Eindeckmittel

Vitro-Clud

R.Langenbrinck, Emmendingen

Ethanol 100 Vol.-%

Ethanol 100 Vol.-% denaturiert mit MEK (Ethylmethylketon)

Herbeta-Arzneimittel, Berlin

Ethanol 70 Vol.-%

70ml Ethanol 100 Vol.-% ad 100 ml aqua bidest.

Herbeta-Arzneimittel, Berlin

Ethanol 85 Vol.-%

85 ml Ethanol 100 Vol.-% ad 100 ml aqua bidest.

Herbeta-Arzneimittel, Berlin

Fixativ

25 ml Essigsäure (Eisessig), 100 % wasserfrei, 75 ml

Merck, Darmstadt J.T. Baker, Deventer, Holland

Methanol, „baker

analyzed“

Fixierungsleim

Fixogum

marabuwerke GmbH&Co.KG, Tamm

Giemsa-Färbung

6 ml Giemsa-Hollborn-

Dr.K.Hollborn&Söhne,

(Azur-Eosin-Methylenblau)

Original-Stammlösung

Leipzig

(0,5 ml zu 10 ml Aqua

Merck, Darmstadt

dest.)

70 ml Phosphatpuffer

(0,025 M, pH 6,88)

Hoechst 33258 Gebrauchslösung

1 ml Hoechst 100 µg/ml Stammlösung (10 mg Bisbenzimide H 33258 ad

SERVA electrophoresis, Heidelberg

100 ml aqua dest.) 75 ml aqua dest

Hybridisierungsgel

Hybrisol VI

oncor, Gaithersburg

KCl-Lösung, 0,4 %ig

Merck, Darmstadt

NaCl-Lösung (0,9 %ig)

Merck, Darmstadt

PBS Puffer

PBS dulbecco w/o Ca²+ , Mg²+

BIOCHROM AG, Berlin

Total Chromosome DNA, Chr3/red, Chr5/red, Chr7/green

Qbiogene

Trypsin

5 ml Trypsin, 2,5 %

GIBCO, Auckland, N.Z.

15 ml NaCl

Merck, Darmstadt

Vectashield Antifading

Vectashield mounting medium for fluorescence

Vector Laboratories, Burlingame

Tabelle 7: Die für alle Untersuchungen verwendeten Chemikalien, alphabetisch.

Mittels Venenpunktionsbesteck wird aus einer oberflächlichen Armvene 5 ml Vollblut in eine heparinisierte Monovette entnommen. Für den Blutkulturansatz werden 5 ml Blutkulturmedium und 0,3 ml heparinisiertes Vollblut in eine Falconflasche pipettiert und bei 37 °C und 5 % CO2 im Brutschrank 72 h kultiviert. Durch die Zugabe von Colcemid 1,5 h vor der Aufarbeitung werden die Zellen in der Metaphase der Mitose arretiert. Colcemid inaktiviert die Spindelfasern, die Aufteilung der Chromosomen auf die Tochterzellen wird so verhindert. Nach 72 h wird die Kultur bei 1000 U/min 10 min zentrifugiert, der Überstand abgenommen und die Zellen in 5 ml hypotoner Kochsalzlösung (KCl) bei 37 °C 10 min zum Anschwellen gebracht, um die Chromosomenspreitung zu verbessern. Nach 10-minütigem Zentrifugieren bei 1000 U/min wird der Überstand abgenommen und verworfen. Die nachfolgende Fixierung mit 5 ml Fixativ hat die Aufgabe, das Gewebe zu konservieren und den Verlust von Nukleinsäure zu verhindern. Durch die Denaturierung wird die Aktivität endogener Nukleasen und anderer gewebsabbauender Enzyme gering gehalten. Die Zellmembran wird elastisch fixiert. Das aus den Erythrozyten freigesetzte Hämoglobin wird auch denaturiert, zu erkennen an dem Farbumschlag in der Suspenion von rot zu braun (www.uni-kl.de/FB-Biologie/AG-Zankl/chrab.html). Die Suspension wird für 10 min bei 1000 U/min zentrifugiert, der Überstand abgenommen und verworfen. Fixativzugabe und Zentrifugieren werden zweimal wiederholt. Die Suspension ist nun milchig weiß und kann aufgetropft werden.

Ein Tropfen der Suspension wird mit 20-30 cm Abstand auf den gekühlten und mit 80 % Ethanol gereinigten Objektträger gegeben und unter einer Wärmelampe getrocknet. Nach erster Beurteilung unter dem Phasenmikroskop werden die Nichthistonproteine der Chromosomen mit Trypsin denaturiert. Die Bindung der Giemsafarbe ist abhängig von der Verteilung der Nichthistonproteine auf dem Chromosom. So werden Areale mit wenigen Proteinen schwächer gefärbt als solche mit vielen. Die Behandlung mit Trypsin für die GTG-Bänderung dauert 35-45 s. Der Objektträger wird nun 10 s unter fließendem Leitungswasser abgespült und die Chromosomen werden 6-8 min mit 2 %iger Giemsalösung gefärbt. Das Präparat wird mit destilliertem Wasser abgespült und getrocknet. Ist die Färbung ausreichend, wird der Objektträger mit einem Deckglas eingedeckt.

Die Kultivierung und Aufarbeitung entspricht der Normalpräparation, allerdings wird dem Blutkulturansatz 250 µl 10mM Bromodesoxyuridin (BrdU) zugegeben. BrdU ist ein Thymidinbasenanalogon und wird in der Synthesephase in die DNA eingebaut. Im neu synthetisierten Tochterstrang ist Thymidin nun durch BrdU substituiert. Kommt es während der Kultivierung zu einem zweiten Zellzyklus, so wird BrdU nun auch in den anderen Tochterstrang eingebaut, das Chromatid ist bifilar mit BrdU substituiert. Das andere Chromatid ist immer noch unifilar substituiert, denn es enthält den Matrizenstrang, in den noch kein BrdU eingebaut wurde. Nach der zweiten Synthesephase besteht also ein Chromosom aus einem uni-und einem bifilar substituierten Chromatid. Die aufgetropfte Zellsuspension wird nach der Aufarbeitung des Blutkulturansatzes mit Hoechst 33258 Gebrauchslösung 15-20 min gefärbt. Der Objektträger wird mit aqua dest. abgespült und mit 3-5 Tropfen PBS Puffer und einem Deckglas versehen. So wird er 10 min auf eine Wärmeplatte (60 °C) gelegt und mit einem Abstand von 15 cm mit einer Schwarzlichtlampe bestrahlt. Das Schwarzlicht photolysiert die DNA, die mit BrdU substituiert wurde. Die photolysierte DNA wird abgebaut und mit dem warmen Puffer abgewaschen. Nach dieser Behandlung wird das Deckglas mit aqua dest. abgespült und das Präparat 4 min in einer 2 %igen Giemsalösung gefärbt. Das bifilar substituierte Schwesterchromatid wird nun nicht so stark mit Giemsa gefärbt, weil es durch die Degradierung weniger DNA und färbbare Proteine hat als das nur unifilar substituierte Chromatid. Die Färbung mit Hoechst scheint die Giemsafärbung positiv zu beeinflussen. Sie wird deshalb beibehalten, obwohl die Präparate am normalen Lichtmikroskop und nicht am Floureszenzmikroskop betrachtet werden (www.uni-kl.de/FB-Biologie/AG-Zankl/chrab.html).

Abbildung 2: Einbau von BrdU in der S-Phase (S), Färbeverhalten der Chromatide in den folgenden Mitosen (M1-M3); substituierter Einzelstrang in grau.

Die Kultivierung erfolgt wie bei der Normalpräparation. Man setzt von jeder Blutprobe drei Blutkulturen mit je 0,3 ml Vollblut und 5 ml Blutkulturmedium an. Nach 68 h Kultivierung wird das Medium gewechselt. Das neue Medium ist mit Bleomycin in verschiedenen Konzentrationen versetzt. Der erste Blutkulturansatz dient als Leerwert, da in diesem Medium kein Bleomycin enthalten ist. Im zweiten sind 1 µg/ml Bleomycin und im dritten 10 µg/ml Bleomycin enthalten. Die zytostatische Behandlung mit Bleomycin wird 2 h im Brutschrank bei 37 °C durchgeführt, nach der Zugabe von 25-30 µl Colcemid für weitere 2 h fortgeführt. Danach erfolgt die Aufarbeitung wie bei der Normalpräparation. Da Bleomycin ein Zytostatikum ist, muss bei der Aufarbeitung mit einer Atemschutzmaske gearbeitet werden. Sind die Chromosomen auf den Objektträgern, werden sie ohne vorherige Trypsinierung für 15 Minuten in 2 %iger Giemsafärbelösung gefärbt. Die Chromosomen lassen sich nun unter dem Lichtmikroskop bei 1000facher Vergrößerung gut erkennen. Chromatid-und Chromosomenbrüche stellen sich in der Diskontinuität der Färbung dar. Ist die Färbelücke schmaler als der Durchmesser des Chromatids, spricht man von einem chromatidgap. Diese Diskontinuität wird nicht als Bruch gewertet, weil nicht auszuschließen ist, dass es sich dabei lediglich um einen Färbeartefakt handelt.

Abbildung 3: Definition von chromatidgaps, Chromatidbrüchen und Chromosomenbrüchen

Die Kultivierung und Aufarbeitung erfolgt wie bei der Normalpräparation. Nach der Aufarbeitung muss das Präparat über Nacht trocknen. Ist das Präparat schon älter als einen Tag, so wird es vor der Hybridisierung 30 min in 2 x SSC inkubiert, um die Denaturierung und Hybridisierung zu verbessern. Die ungefärbten Chromosomen werden in einer aufsteigenden Alkoholreihe (70 %, 85 % und 100 % Ethanol) jeweils 2 min dehydriert und anschließend in 70 % Formamid/2 x SSC im Wasserbad (73 °C) denaturiert. Bei der Denaturierung wird die doppelsträngige DNA in zwei Einzelstränge getrennt, weil die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Nukleinsäurebasen der hohen Temperatur nicht standhalten können. Adenin bildet mit Thymin zwei Wasserstoffbrückenbindungen aus, während Guanin mit Cytosin drei Wasserstoffbrückenbindungen ausbildet. Der Objektträger wird kurz in 2 x SSC gewaschen und erneut durch die Alkoholreihe geführt. Bei der Hybridisierung macht man sich zu Nutze, dass denaturierte Einzelstränge wieder mit dem Einzelstrang, der die komplementäre Nukleinsäureabfolge hat, renaturieren bzw. hybridisieren. Es entsteht so ein neuer Doppelstrang der aus einem Einzelstang mit Sonden-DNA und einem Einzelstrang mit der Ziel-DNA besteht. Bei der Hybridisierung wählt man eine Temperatur unterhalb des Schmelzpunktes der Doppelhelix. Dieser Temperatur können falsch gepaarte Sequenzen auf Grund ihrer schwachen Bindungskräfte nicht standhalten, die Bindungen zwischen richtig gepaarten Sequenzen bleiben stabil. Diese Prozesse nennt man annealing (Therman/Susman, 1993).

In der vorliegenden Untersuchung werden Sonden der Chromosomen 3, 5 und 7, die mit rotem bzw. grünem Fluoreszenzfarbstoff direkt markiert waren, eingesetzt. Pro Objektträger werden 4 µl Sonden der Chromosomen 3, 5 und 7 und 13 µl Hybrisol VI gemischt und bei 73 °C im Wasserbad 5 min denaturiert. Die denaturierte Sonde wird auf den Objektträger pipettiert, auf dem sich schon die denaturierte DNA befindet. Mit einem Deckglas und Fixogum wird der Objektträger versiegelt und bei 37 °C über Nacht inkubiert. In dieser Zeit findet die Hybridisierung statt. Die Entfernung der nicht spezifisch gebundenen Sonden erfolgt am nächsten Tag durch Waschen mit 0,4 x SSC/0,3 % Igepal bei 73 °C für 2 min und anschließend für 30 s mit 2 x SSC/0,1 % Igepal bei Raumtemperatur. Danach werden die Chromosomen mit DAPI-Lösung 14 min unter Lichtausschluss gefärbt, mit VE-Wasser (vollentsalztes Wasser, entspricht Aqua demineralisata) gewaschen und mit Vectashield Antifading eingedeckt.

Abbildung 4: Denaturierung und Hybridisierung der Sonden- und Ziel-DNA

Das Präparat wird an einem Fluoreszenzmikroskop mit der Quecksilberdampflampe und dem DAPI-Filter (4’,6-Diamidin-2’-Phenylindol-Dihydrochlorid) ausgewertet. Die verwendeten Objektive bieten eine 400fache bzw. 630fache Vergrößerung. Unter dem DAPI-Filter kann die Vollständigkeit der Mitosen beurteilt werden. Mit dem TRITC-Filter (Tetramethylrhodamin-Isothiocyanat) sind die Chromosomen 3 und 5 rot und mit dem FITC-Filter (Fluorescein-5-Isothiocynat) die Chromosomen 7 grün sichtbar. Die Chromosomen 3 und 5 sind trotz gleicher Fluoreszenzfarbe auf Grund ihrer verschiedenen Größe und einer unterschiedlichen Intensität der Färbung voneinander zu unterscheiden. Translokationen zwischen dem hybridisierten Chromosom und einem anderen werden durch einen Farbwechsel im Chromosom sichtbar. Die Hintergrundfärbung ist bei der Fluoreszenz in situ Hybridisierung gering. Auffällige Mitosen werden mit der Mikroskopkamera aufgenommen und im ISIS-Programm von Metasystems digitalisiert und gespeichert.

Fluoreszenz farbstoff

DAPI

FITC/Sp. Green

TRITC/Sp. Orange

Filter-Nr.

01

10

15

Anregungslicht

UV

Blau

Grün

Anregungsfilter

365 nm

450-490 nm

546 nm

Farbteiler

395 nm

510 nm

580 nm

Sperrfilter

397 nm

515-555 nm

590 nm

Farbe der Fluoreszenz

Blau

Grün

Rot

Tabelle 8: Spezifikation der verwendeten Filterkombinationen

Als unauffällig wird eine Metaphase gewertet, wenn vollständig fluoreszierende Chromosomenpaare der Chromosomen 3, 5 und 7 zu sehen sind. Als ein Ereignis wird ein Farbwechsel innerhalb eines Chromosoms von rot bzw. grün zu blau gewertet. Besitzen beide entstandenen Derivativchromosomen ein Zentromer, so hat eine reziproke Translokation stattgefunden. Ist der Farbwechsel innerhalb eines Chromosoms von rot zu grün erfolgt, so wird dies als zwei Ereignisse gewertet. Als ein Ereignis ist die Beteiligung eines hybridisierten Chromosoms an einer reziproken Translokation zu werten. Mit der Anzahl der gezählten Ereignisse wird die Translokationsfrequenz der Chromosomen 3, 5 und 7 beschrieben. Um eine Aussage über die Translokationsrate des Gesamtgenoms machen zu können, wird ausgehend von den 18,2 % Genomanteil der untersuchten Chromosomen 3, 5 und 7 auf 100 % Gesamtgenom umgerechnet.