Untersuchung somatischer Chromosomenveränderungen bei amyotropher Lateralsklerose Juliane Christin Wappler WidmungVorwort 111231.1451.2621#328678910111.31222.112132.2142.32.4152.5624#5492.616624#1782.717617#3861833.1181920620#502620#474213.222624#48523621#37824625#4063.325622#58926618#34227625#50828618#33029618#4093.43031622#464431324.14.23334354.3364.44.53738394041 Abkürzungsverzeichnis Literaturverzeichnis Danksagung Eidesstattliche Erklärung deInhaltsverzeichnisHilfeAus der Klinik für Neurologie und dem Institut für Humangenetik der Medizinischen Fakultät der Charité - Universitätsmedizin Berlin DISSERTATION
Untersuchung somatischer<br/>Chromosomenveränderungen bei<br/>amyotropher Lateralsklerose<br/>zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr.med.)vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité –
Universitätsmedizin BerlinVon Juliane Christin Wappler
aus Bautzen

PD Dr. med. Th. Meyer Prof. Dr. rer. nat. B. Royer-Pokora PD Dr. med. Chr. Münch Datum der Promotion: 08.06.2006

Zusammenfassung

Die amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine fortschreitende neurodegenerative Erkrankung, deren Symptome durch den Untergang der Motoneuronen bedingt sind. Neueste zytogenetische Untersuchungen zeigen ein vermehrtes Auftreten konstitutioneller Chromosomenveränderungen in Form von Translokationen und Inversionen bei ALS-Patienten. Dies lässt eine Verbindung zwischen dem Ausbruch der Erkrankung und der auffälligen Zytogenetik vermuten. Das Auftreten spontaner, nicht konstitutioneller Chromosomenveränderungen als Zeichen einer chromosomalen Instabilität wurde in der vorliegenden Arbeit an ALS-Patienten untersucht. METHODE: Neben der konventionellen Karyotypisierung nach GTG-Bänderung, der Bestimmung der SCE-Rate und der Bruchrate nach Behandlung mit Bleomycin kam die Fluoreszenz in situ Hybridisierung zum Einsatz. Die Untersuchungen wurden an Patienten mit sporadischer ALS (45), an Kontrollpersonen (38) und Verwandten (9) durchgeführt. ERGEBNISSE: Die Karyotypisierung ergab bei den Patienten eine spontane Translokationsrate von 0,02 Translokationen/Zelle, bei den Kontrollen 0,04 Translokationen/Zelle. Weitere numerische oder strukturelle Auffälligkeiten waren nicht signifikant verschieden. Es wurden keine konstitutionellen Chromosomenaberrationen gefunden. Die Häufigkeit der Schwesterchromatidaustausche (SCE-Rate) bewegte sich mit 7-8 SCE/Zelle in der Patientengruppe sowie in der Kontrollgruppe innerhalb der Normwerte. Durch die Zugabe von Bleomycin in die Zellkultur stieg die Zahl der Chromatidbrüche von 0,0 auf 0,8 Brüche/Zelle an. Dabei zeigten die untersuchten Gruppen ähnliche Progredienzen in den Bruchraten. Mit der Fluoreszenz in situ Hybridisierung werden quantitative Aussagen über spontane Translokationsraten gemacht. Sie betrug in der Kontroll-und Patientengruppe 0,03 bis 0,04 Translokationen/Zelle. DISKUSSION: Die vorliegenden Ergebnisse liefern keinen Anhalt für eine chromosomale Instabilität als Risikofaktor für die Entstehung der sporadischen ALS. Indizien für eine chromosomale Instabilität wie erhöhte Raten induzierter Chromatidbrüche und

Schwesterchromatidaustausche als auch vermehrtes Auftreten somatischer Translokationen und anderer struktureller Aberrationen konnten bei den ALS-Patienten nicht nachgewiesen werden. Über mögliche Auffälligkeiten in den Motoneuronen lässt sich allerdings mit den Untersuchungen an Blutlymphozyten keine hinreichend sichere Aussage machen.

Abstract

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a progressive neurodegenerative disease which is characterized by the degeneration of motor neurons. Recently, a high rate of constitutional structural chromosomal rearrangements has been reported in apparently sporadic ALS patients. It remains questionable whether or not these genomic rearrangements are caused by a chromosomal instability involved in the pathogenesis of the disease. Therefore, we performed different cytogenetic studies on chromosomal instability. METHOD: We performed chromosome analyses from patients (N=45), control subjects (N=38), and relatives (N=9) after culturing blood lymphocytes. Conventional chromosome analysis after GTG-banding, chromosomal breakage test after Bleomycin treatment, the rate of sister chromatid exchange (SCE), and whole chromosome painting were used for these analyses. RESULTS: Neither karyotyping nor whole chromosome painting revealed higher levels of structural or numerical aberrations in lymphocytes of patients with sALS. After karyotyping we found

0.02 t/cell in patients and 0.04 t/cell in controls. Whole chromosome painting revealed 0.04 t/cell in patients and 0.03 t/cell in controls. The chromosomal breaks increased likewise after Bleomycin treatment in the control group and the patient group as well. Cell cultures without Bleomycin did not show any breaks while the highest Bleomycin concentration induced up to 0.08 breaks/cell. The SCE rate in patients which corresponds to the chromatid repair activity did not rise to a higher level than in the control individuals. Both groups were in the normal range of 7 to 8 SCE/cell. DISCUSSION: The pathomechanism of neurodegeneration in ALS patients is still unknown. We tried to find a cytogenetic correlative being a risk factor for the development of ALS. However, so far there is no clue for chromosomal instability being involved in the neurodegenerative process.

Widmung

Diese Arbeit ist von ganzem Herzen meinen lieben Eltern gewidmet.

Inhaltsverzeichnis

  • Vorwort

  • 1  Einleitung

    • 1.1  Pathogenese und Ätiologie der ALS

    • 1.2 Chromosomenaberrationen

    • 1.3  Fragestellung

  • 2  Material und Methoden

    • 2.1  Patienten, Verwandte und Kontrollpersonen

    • 2.2 Geräte

    • 2.3 Chemikalien

    • 2.4 Lymphozytenkultur, Aufarbeitung und GTG-Bänderung

    • 2.5  SCE-Färbung

    • 2.6  Induzierte Chromosomenbruchrate nach Bleomycinbehandlung

    • 2.7  Fluoreszenz in situ Hybridisierung

  • 3  Ergebnisse

    • 3.1  Karyotypisierung und Chromosomenanalyse

    • 3.2 Analyse der SCE-Rate

    • 3.3  Bestimmung der spontanen und induzierten Bruchrate mit Bleomycin

    • 3.4  Bestimmung der Translokationsrate mittels Fluoreszenz in situ Hybridisierung

  • 4  Diskussion

    • 4.1  Material: Lymphozyten statt Motoneuronen

    • 4.2  Methodenwahl: Bänderung versus FISH

    • 4.3 Induzierte Chromatidbrüche

    • 4.4 Schwesterchromatidaustausch (SCE)

    • 4.5  Oxidativer Stress, DNA-Schädigung und Neurodegeneration

  • Abkürzungsverzeichnis 

  • Literaturverzeichnis

  • Danksagung

  • Eidesstattliche Erklärung

Tabellen

  • Tabelle 1: fALS Genloci. Erbmodus autosomal-dominant (AD) bzw. autosomalrezessiv (AR)

  • Tabelle 2: Karyogramm einer sALS-Patientin.

  • Tabelle 3: Patientendaten: Fall-Nr. zur Anonymisierung, Geschlecht (w/m), Geburtsjahr (GJ), Lebensalter bei Krankheitsbeginn (KB), Lebensalter bei Untersuchung (U), Art der Erkrankung (Art), Nebendiagnosen/Besonderheiten (N/B),. frontotemporale Demenz (FTD), primäre Muskelatrophie (PMA), spinale Muskelatrophie (SMA).

  • Tabelle 4: Probanden, die sich als Kontrollpersonen zur Verfügung stellten. Fall-Nr. zur Anonymisierung, Geschlecht (w/m), Geburtsjahr (GJ), Lebensalter bei Untersuchung (U).

  • Tabelle 5: Verwandte, die sich für die Untersuchung zur Verfügung stellten: Fall-Nr. zur Anonymisierung, Geschecht (w/m), Verwandtschaftsgrad (Grad), Geburtsjahr (GJ), Lebensalter bei Untersuchung (U).

  • Tabelle 6: Die für alle Untersuchungen verwendeten Geräte, alphabetisch.

  • Tabelle 7: Die für alle Untersuchungen verwendeten Chemikalien, alphabetisch.

  • Tabelle 8: Spezifikation der verwendeten Filterkombinationen

  • Tabelle 9: strukturelle Aberrationen nach GTG-Bänderung bei Kontrollen (K) und Patienten (P): untersuchte Mitosen (M), Translokation (t), Deletion (del), Inversion (inv), Duplikation (dup). Der Mittelwert (MW) ist die Summe der Beobachtungen/Anzahl der Beobachtungen.

  • Tabelle 10: SCE-Rate der Kontrollen, Verwandten und Patienten und ihr Mittelwert (MW) mit Standardabweichung (STABW).

  • Tabelle 11: Zahl der Brüche/Zelle bei 0 µg/ml, 1 µg/ml bzw. 10 µg/ml Bleomycinkonzentration in den Kontrollen (K), Verwandten und Patienten (P).

  • Tabelle 12: Anzahl der Chromatidbrüche (ctb), Chromosomenbrüche (csb) und chromatidgaps (ctg) in der Kontroll-, Verwandten- und Patientengruppe

  • Tabelle 13: Anzahl der Brüche/Einzelzelle in den Kontroll-, Verwandten-und Patientengruppen bei 0 µg/ml, 1 µg/ml und 10 µg/ml Bleomycin.

  • Tabelle 14: prozentuale Häufigkeit aberranter Zellen (% aZ) unter Bleomycinzugabe.

  • Tabelle 15: Häufigkeit von Translokationen/Zelle (t/Z) in der Patienten-und Kontrollgruppe: Mittelwert (MW) mit Standardabweichung (STABW).

Bilder

  • Abbildung 1: Chromosomennomenklatur.

  • Abbildung 2: Einbau von BrdU in der S-Phase (S), Färbeverhalten der Chromatide in den folgenden Mitosen (M1-M3); substituierter Einzelstrang in grau.

  • Abbildung 3: Definition von chromatidgaps, Chromatidbrüchen und Chromosomenbrüchen

  • Abbildung 4: Denaturierung und Hybridisierung der Sonden- und Ziel-DNA

  • Abbildung 5: Metaphase nach GTG-Bänderung

  • Abbildung 6: Karyogramm eines weiblichen Chromosomensatzes. 

  • Abbildung 7: Mitose in der 2. Synthesephase nach BrdU-Zugabe: nicht gewertete Farbwechsel (*), gewertete Farbwechsel (**)

  • Abbildung 8: SCE-Raten der drei Gruppen.

  • Abbildung 9: Verteilung der SCEs in den Zellen der Patienten-, Kontroll-und Verwandtengruppe.

  • Abbildung 10: Mitose mit 43 Chromosomen (unvollständig) nach Zugabe von 10 µg/ml Bleomycin: Chromtidbruch (*).

  • Abbildung 11: Zahl der Brüche/Zelle bei 0 µg/ml, 1 µg/ml bzw. 10 µg/ml Bleomycinkonzentration in der Kontroll-, Verwandten- und Patientengruppe.

  • Abbildung 12: Anzahl der Defekte in den Kontroll-, Verwandten-und Patientengruppen bei entsprechender Bleomycinkonzentration: Chromatidbruch (ctb), Chromosomenbruch (csb), chromatidgap (ctgap).

  • Abbildung 13: Brüche/Einzelzelle (B/EZ) in der Kontroll-, Verwandten-und Patientengruppe.

  • Abbildung 14: Prozent der aberranten Zellen unter Bleomycinbelastung.

  • Abbildung 15: WCP #3, #5, #7 mit t(5;7) und t(5;?).