3 Ergebnisse

↓73

Stimulation von Jurkat T-Zellen durch CD3/CD28-Antikörper oder durch direkte Aktivierung von PKCθ durch PMA führt innerhalb weniger Minuten zur Induktion von NF-κB DNA-Bindungsaktivität (Wirkweise CD3/CD28-Antikörper und PMA, s. 2.10.5). Allerdings fällt hierbei auf, dass die NF-κB DNA-Bindung trotz persistenter Stimulation von transienter Natur ist, ganz im Gegensatz zur NF-κB DNA-Bindung nach Stimulation der Zellen durch proinflammatorische Substanzen wie TNFα.

↓74

Abbildung 3.1 Transiente Natur der NF-κB DNA-Bindung nach T-Zell Aktivierung. EMSA-Analyse der NF-κB DNA-Bindungsaktivität nach Stimulation (Stim.) von Jurkat T-Zellen mit PMA, CD3/CD28-Antikörpern und TNFα. T-Zell-aktivierende Agenzien führen zu einer transienten NF-κB-Aktivierung, wobei die beobachtete Resynthese von IκBα allein für die effiziente Repression nicht verantwortlich sein kann.

Die Proteine Carma1, Bcl10 und Malt1 sind durch genetische Studien in Mäusen funktionell mit der IKK/NF-κB-Aktivierung in T-Zellen verknüpft worden. Daher wurde der analytische Fokus in dieser Arbeit auf T-Zell spezifische Mechanismen gerichtet, die mit den essentiellen Regulatoren Carma1, Bcl10 und Malt1 in Verbindung stehen und möglicherweise Einfluss sowohl auf die Aktivierung als auch auf die Deaktivierung der Antigenrezeptor-induzierten IKK/NF-κB-Signalkette nehmen.

3.1  Regulierung der CBM-Komplexaktivität durch IKKβ und Phosphorylierung von Bcl10

3.1.1  CBM-Komplexbildung nach T-Zell Aktivierung

Die Bildung eines Carma/Bcl10/Malt1 (CBM)-Proteinkomplexes gilt als eine der Grundvoraussetzungen für die IKK/NF-κB-Aktivierung in T-Zellen, obwohl ein Nachweis der

↓75

Abbildung 3.2 Bildung des endogenen CBM-Komplexes nach T-Zell Aktivierung. (a) CBM-Komplex in PMA/Iono (P/I)- oder CD3/CD28-stimulierten Jurkat T-Zellen: die Analyse von Bcl10-Immunopräzipitat zeigt, dass Bcl10 und Carma1 Stimulus-induziert interagieren. Nach Aktivierung treten langsamer migrierende Bcl10-Modifikationen in Erscheinung. Malt1 bindet konstitutiv an Bcl10. (b) CBM-Komplex in primären Lymphozyten: Die Analysen von Bcl10-Immunopräzipitat aus PMA/Iono-stimulierten humanen Lymphozyten und aus PMA/Iono- oder CD3/CD28-stimulierten murinen CD4+ T-Zellen bestätigen die Ergebnisse aus Jurkat T-Zellen. (c) Bei der Bcl10-Modifikation handelt es sich um Phosphorylierung. Die langsamer migrierenden Bcl10-Banden sind λ-Phosphatase sensitiv. Behandlung mit Hitze-inaktivierter (H.i.) Phosphatase hat keinen Effekt.

Existenz des Komplexes unter physiologischen Bedingungen noch aussteht. Um zu zeigen, dass der CBM-Komplex in aktivierten T-Zellen vorliegt, wurden Immunopräzipitationsstudien mit endogenen Proteinen durchgeführt (Abbildung 3.2 a und b). Sowohl in der T-Zelllinie Jurkat wie auch in primären humanen Lymphozyten und primären murinen CD4+ T-Zellen bindet Bcl10 im Ruhezustand nicht an Carma1. Erst nach Stimulation der Zellen durch CD3/CD28-Antikörper oder PMA/Ionomycin (Iono), wobei Iono die T-Zell-aktivierende Wirkung von PMA durch Freisetzung von Ca2+ aus intrazellulären Speicherkompartimenten unterstützt, wird Carma1 von Bcl10 kopräzipitiert (Wirkweise Iono, s. 2.10.5). Im Gegensatz dazu binden Bcl10 und Malt1 bereits in unstimulierten Zellen aneinander. Diese Ergebnisse decken auf, dass unter physiologischen Bedingungen die Bildung des CBM-Komplexes zwischen Carma1 und konstitutiv gebundenem Bcl10/Malt1 erst nach T-Zell Aktivierung stattfindet.

Interessanterweise treten nach T-Zell-aktivierender Stimulation auch langsamer migrierende Proteinbanden von Bcl10 in Erscheinung, die eine posttranslationale Modifizierung des Proteins wie z.B. Phosphorylierung andeuten. Durch Behandlung mit λ-Phophatase wird die PMA/Iono-induzierte Modifikation von Bcl10 größtenteils rückgängig gemacht, während die Verwendung von Hitze-inaktivierter λ-Phophatase unter gleichen experimentellen Bedingungen keinen Effekt hat (Abbildung 3.2 c). Dies bestätigt, dass es sich bei der Stimulus-induzierten Bcl10-Modifikation um eine Phosphorylierung handelt.

↓76

Bereits an dieser Stelle soll auf die gegenläufige Kinetik der Bcl10-Phosphorylierung und der CBM-Komplex Bildung besonders unter Verwendung von CD3/CD28-Antikörpern als Stimulationsagens hingewiesen werden. Während die Menge an phosphoryliertem Bcl10 mit zunehmender Stimulationszeit ansteigt, ist eine maximale Assoziation zwischen Carma1 und Bcl10 bereits nach sehr kurzen Stimulationszeitpunkten zu beobachten, was gegen eine initiale Funktion der Bcl10-Phosphorylierung bei der CBM-Komplexbildung spricht.

3.1.2 Die Bildung des CBM-Komplexes ist abhängig von IKKβ-Kinaseaktivität

Um zu ermitteln, welche Kinasen für die Phosphorylierung von Bcl10 verantwortlich sind und inwieweit deren Funktion bei der CBM-Komplex Regulation eine Rolle spielt, wurden Jurkat T-Zellen vor der Aktivierung mit spezifischen Kinase-Inhibitoren behandelt. Genetische Analysen ordnen PKCθ eine dem CBM-Komplex vorgelagerte Funktion bei der Aktivierung von NF-κB in T-Lymphozyten zu. Erwartungsgemäß unterbindet die Inhibierung der PKCθ-Kinaseaktivität durch Rottlerin die Bildung des CBM-Komplexes und auch die Phosphorylierung von Bcl10 (Abbildung 3.3). Überraschenderweise wurde der gleiche Effekt durch Vorbehandlung der Zellen mit zwei verschiedenen IKKβ Inhibitoren, Bay11-7085 und sc-514, erhalten. Dies bedeutet, dass die Kinaseaktivität von IKKβ nicht nur zur nachgelagerten Phosphorylierung von IκBα benötigt wird. Vielmehr scheint IKKβ auch eine vorgelagerte Funktion zu haben, die für die Bildung des CBM-Komplexes essentiell ist. Zur Beurteilung der inhibitorischen Wirkung von Bay11-7085 und sc-514 wurde das Maß der IκBα-Stabilisierung analysiert. Alle Inhibitoren verzögern die Stimulus-abhängige Degradation von IκBα. Da kein Effekt auf die MAP-Kinasen-vermittelte Phosphorylierung von ERK („Extracellular Signal Regulated Kinase“) 1/2 festgestellt wurde, ist TCR-proximale Signaltransduktion von der Inhibitorbehandlung unbeeinflusst, was die Spezifität der Beobachtungen für den NF-κB Signalweg belegt.

Abbildung 3.3 Die Kinaseaktivität von IKKβ wird zur CBM-Komplexbildung benötigt. Pharmakologische Inhibierung der Kinaseaktivität von PKCθ durch Rottlerin und von IKKβ durch Bay11-7085 oder sc-514 verhindert PMA/Iono-induzierte Bcl10-Carma1-Interaktion und Bcl10-Phosphorylierung. Die inhibitorische Wirkung der Substanzen wurde am Maß der Stabilisierung von IκBα abgeschätzt, die Phosphorylierung von ERK1/2 ist nicht beeinflusst.

↓77

Zur genaueren Definition der Rolle von IKKβ beim Prozess der CBM-Komplex Bildung wurde untersucht, ob IKKβ an Komponenten des CBM-Komplexes bindet. Die Analyse von Malt1-Immunopräzipitat aus Jurkat T-Zellen zeigt, dass IKKβ konstitutiv mit Malt1 interagiert (Abbildung 3.4). Nach T-Zell Aktivierung mit PMA/Iono binden sowohl aktiviertes phospho-IKKβ als auch Bcl10/Malt1 und Carma1 aneinander und bilden einen IKKβ-assoziierten CBM-Komplex.

Abbildung 3.4 IKKβ-Assoziation mit dem CBM-Komplex. Analyse der CBM-Komplexinteraktionen in Jurkat T-Zellen durch Immunopräzipitation von Malt1. IKKβ und Malt1 binden konstitutiv aneinander. Nach PMA/Iono-Stimulation bindet verstärkt aktiviertes (phosphoryliertes) IKKβ an den CBM-Komplex .

3.1.3 IKKβ-Inaktivierung durch RNAi blockiert die Bildung des CBM-Komplexes

Zur weiterführenden Analyse der Faktoren, die für die signalinduzierte Bcl10-Carma1-Interaktion und Bcl10-Phosphorylierung verantwortlich sind, wurden RNA-Interferenz (RNAi) Experimente mit Malt1, Carma1 und IKKβ durchgeführt, die alle durch
„Knock Out“-Studien in Mäusen als essentielle Regulatoren des Antigenrezeptor-induzierten NF-κB-Signalweges identifiziert werden konnten. Die Effizienz der verwendeten shRNA-Konstrukte wurde vorab über ihre Fähigkeit, PMA/Iono-induzierte IκBα-Degradation zu blockieren, beurteilt. Jurkat T-Zellen, die 72 Stunden vor Aktivierung durch PMA/Iono mit den entsprechenden shRNAs gegen Malt1, Carma1 und IKKβ transfiziert wurden, zeigen wie erwartet signifikant reduzierte IκBα-Degradation im Vergleich mit Referenzzellen, die mit pmU6-Leervektor transfizierte wurden (Abbildung 3.5). Um die Spezifität der Beobachtungen zu beurteilen, wurde in Jurkat T-Zellen eine shRNA gegen die E3-Ubiquitin-Ligase Itch (shKontrolle) exprimiert. Zellen, die zuvor mit shKontr-RNA behandelt wurden, zeigen wie pmU6-transfizierte Zellen keine Verzögerung der stimulusinduzierten IκBα-Degradation. Dies bestätigt, dass die shCarma1-, shMalt1- und shIKKβ-abhängige Blockade des NF-κB Signalwegs nicht auf unspezifische Effekte der shRNA Expression an sich zurück zu führen ist, sondern in spezifischer Weise von der Inaktivierung der entsprechenden Zielproteine abhängt. Im direkten Vergleich ist der stabilisierende Effekt von shIKKβ auf den IκBα-Proteinlevel geringer als der von shCarma1 oder shMalt1. Dies deckt sich mit den Beobachtungen aus anderen Zellsystemen (M. Hinz, nicht veröffentlichte Daten) und ist möglicherweise auf die kompensatorische Funktion von IKKα zurückzuführen (Schmidt-Supprian et al, 2003].

↓78

Abbildung 3.5 Malt1, Carma1 und IKKβ sind wichtige Regulatoren der NF-κB Signalkaskade in aktivierten T-Zellen. In shMalt1-, shCarma1- und shIKKβ-behandelten Jurkat T-Zellen ist die PMA/Iono-induzierte IκBα-Degradation verzögert, was die Inhibierung des NF-κB-Signalweges nach Inaktivierung der Proteine belegt. shKontr-Behandlung zeigt Effekt.

Um zu klären, ob Carma1 für die Phosphorylierung von Bcl10 benötigt wird, wurden Jurkat T-Zellen nach Carma1-Inaktivierung untersucht (Abbildung 3.6). Die Analyse von Bcl10-Immunopräzipitat aus shCarma1-behandelten Jurkat T-Zellen ergibt, dass Bcl10 bei Abwesenheit von Carma1 nicht mehr Stimulus-induziert phosphoryliert wird. Im Gegensatz dazu ist die Phosphorylierung von ERK1/2 nicht beeinflusst, was bestätigt, dass andere Signalwege von der Inaktivierung nicht betroffen sind. Diese Ergebnisse wurde durch die Analyse Carma1-defizienter Jurkat T-Zellen (JPM 50.6) bestätigt, in denen ebenfalls keine PMA/Iono-induzierte Bcl10-Phosphorylierung mehr auftritt.

Abbildung 3.6 Die Carma1-Funktion wird für die Phosphorylierung von Bcl10 benötigt. Sowohl in shCarma1-behandelten Jurkat T-Zellen (a) wie auch in Carma1-defizienten Jurkat T-Zellen (b, JPM50.6) wird Bcl10 nach T-Zell Aktivierung durch PMA/Iono-Stimulation nicht mehr phosphoryliert.

↓79

Auch die Expression einer shRNA gegen die CBM-Komplex Komponente Malt1 unterbindet in Jurkat T-Zellen die Stimulus-induzierbare Phosphorylierung von Bcl10 (Abbildung 3.7). Dies steht im Einklang mit dem Befund, dass Malt1 die Interaktionsschnittstelle zwischen CBM-Komplex und IKKβ bildet. Zusätzlich interagiert Bcl10 nach Inaktivierung von Malt1 deutlich schwächer mit Carma1. Die Daten deuten an, dass für die Phosphorylierung von Bcl10 die Bildung eines funktionsfähigen CBM-Komplexes Voraussetzung ist.

Abbildung 3.7 Die Malt1 Funktion wird für die Phosphorylierung von Bcl10 benötigt. Die Inaktivierung von Malt1 mittels shRNA in Jurkat T-Zellen schwächt die Bcl10 Phosphorylierung und unterbindet die Bildung des CBM-Komplexes.

Unter Abschnitt 1.1.2 wurde gezeigt, dass pharmakologische Inhibierung der Kinaseaktivität von IKKβ die Bildung des CBM-Komplexes verhindert. Im Einklang mit diesem Ergebnis führt die Inaktivierung von IKKβ durch RNAi ebenfalls zur Unterdrückung der PMA/Iono- oder CD3/CD28-induzierten Bcl10-Carma1-Interaktion und Bcl10 Phosphorylierung in Jurkat T-Zellen (Abbildung 3.8 a).

↓80

Abbildung 3.8 Inaktivierung von IKKβ mittels RNAi verhindert Bildung des CBM-Komplexes. (a) Die Analyse von Bcl10-Immunopräzipitat aus Jurkat T-Zellen zeigt, dass die Inaktivierung von IKKβ mittels zweier unterschiedlicher shRNA-kodierender Vektoren in beiden Fällen zu abgeschwächter Bcl10-Carma1-Interaktion und Bcl10-Phosphorylierung nach PMA/Iono Stimulation führt. Auch die CD3/CD28-induzierte CBM-Komplexbildung ist durch IKKβ-Inaktivierung unterbunden. (b) Die Analyse von Malt1-Immunopräzipitat zeigt, dass die Rekrutierung von Malt1 zu Carma1 in shIKKβ-vorbehandelten Jurkat T-Zellen defekt ist. In allen Experimenten ist die ERK1/2-Phosphorylierung durch shRNA-Behandlung unbeeinflusst.

Für die Inaktivierung von IKKβ wurden zwei unterschiedliche shRNA Sequenzen verwendet (shIKKβ-1 und shIKKβ-2), die beide in gleichem Maße mit der Bildung des CBM-Komplexes interferieren. Zur Bestätigung dieser Daten wurde zusätzlich untersucht, ob nach Inaktivierung von IKKβ auch die Malt1-Carma1 Interaktion gestört ist (Abbildung 3.8 b). Wie erwartet wird Carma1 nach shIKKβ-Behandlung der Zellen nicht mehr von Malt1 präzipitiert. Diese Ergebnisse belegen, dass die Bildung des CBM-Komplexes nach Inaktivierung von IKKβ sowohl durch pharmakologische Inhibition als auch durch RNAi unterbunden ist. Als Kontrolle wurden Jurkat T-Zellen mit pmU6-Leervektor oder shKontr-kodierendem Vektor transfiziert. Im Gegensatz zu shIKKβ-behandelten Zellen zeigen diese normale CBM-Komplex Bildung und Bcl10-Phosphorylierung.

IKKγ ist die regulatorische Untereinheit des IKK-Komplexes und wie IKKβ für die Funktion des Komplexes in Lymphozyten essentiell. Um die Frage zu beantworten, ob IKKβ allein oder ob ein funktionsfähiger IKK-Holokomplex für die Bildung des CBM-Komplexes und für die Phosphorylierung von Bcl10 benötigt wird, wurden Jurkat T-Zellen mit inaktiviertem IKKγ untersucht. Trotz signifikanter Reduktion des IKKγ-Proteinlevels durch shRNA-Behandlung zeigt die Analyse von Bcl10-Immunopräzipitat normale CBM-Komplexbildung und Bcl10-Phosphorylierung nach Aktivierung von Jurkat T-Zellen (Abbildung 3.9 a). Die Analyse einer IKKγ-defizienten Jurkat T-Zelllinie (JM 4.5.2) deckt auf, dass auch genetische Inaktivierung von IKKγ keinen Einfluss auf die PMA/Iono-induzierte Bcl10-Carma1-Interaktion hat (Abbildung 3.9 b). Interessanterweise ist die Stimulus-abhängige Bcl10-Phosphorylierung in JM 4.5.2 Zellen um ein Vielfaches schwächer als in der bisher verwendeten Jurkat T-Zelllinie. Da trotz IKKγ-Defizienz und schwacher Bcl10-Phosphorylierung die CBM-Komplex Bildung in JM 4.5.2 Zellen nicht beeinträchtigt ist, scheinen IKKγ und die Bcl10-Phosphorylierung keine Rolle bei der primären Komplex Bildung zu spielen. Zur Kontrolle wurde die Stimulus-induzierte NF-κB DNA-Bindung in
JM 4.5.2 Zellen analysiert. Während bei IKKγ-defizienten Zellen keine NF-κB-Aktivierung detektierbar ist, zeigen IKKγ-rekonstituierte JM 4.5.2 Zellen die erwartete PMA/Iono-abhängige, transiente NF-κB DNA-Bindung.

↓81

Abbildung 3.9 IKKγ ist nicht an der Regulation der CBM-Komplexbildung beteiligt. (a) IKKγ Inaktivierung in Jurkat T-Zellen durch RNAi hat keinen Effekt auf PMA/Iono-induzierte Bcl10-Carma1 Interaktion und Bcl10-Phosphorylierung. (b) Vergleichende Analyse von JM 4.5.2 Zellen, die kein IKKγ exprimieren und JM 4.5.2, die mit Epitop-markiertem IKKγ rekonstituiert wurden, zeigt, dass auch genetische Inaktivierung von IKKγ die PMA/Iono-induzierbare Bcl10-Carma1 Interaktion nicht beeinflusst.

3.1.4 IKKβ phosphoryliert Bcl10 im C-Terminus

In den Abschnitten 3.1.2 und 3.1.3 dieser Arbeit wurde gezeigt, dass Inaktivierung von IKKβ die Bildung des CBM-Komplexes und die Phosphorylierung von Bcl10 verhindert. Zum besseren Verständnis der molekularen Mechanismen, die zur Phosphorylierung von Bcl10 führen, wurde daher untersucht, ob Bcl10 ein direktes Substrat von IKKβ ist. Hierzu wurden Studien in HEK293-Zellen unter Verwendung ektopisch exprimierter und Epitop-markierter Proteine durchgeführt. Die Analyse von flagBcl10-Immunopräzipitat zeigt, dass der größte Teil des Proteins in einer unmodifizierten Form vorliegt. Bei Koexpression von IKKβ und Bcl10 verändert sich das Laufverhalten von Bcl10 allerdings deutlich. Es treten mehrere langsamer migrierende Banden auf (Abbildung 3.10 a). Im Vergleich mit dem Bcl10 Phosphorylierungsmuster aus aktivierten Jurkat T-Zellen fällt auf, dass sich das Laufverhalten von Bcl10 nach PMA/Iono-Stimulation und bei IKKβ-Koexpression stark ähnelt. Um zu untersuchen, ob die Koexpression von IKKβ die Phosphorylierung von Bcl10 induziert, wurde flagBcl10-Immunopräzipitat mit Phosphatase behandelt (Abbildung 3.10 b). Die Analyse zeigt, dass die nach Kotransfektion von IKKβ in Erscheinung tretenden, langsamer migrierenden Banden von Bcl10 Phosphatase sensitiv sind. Dieses Ergebnis lässt den Schluss zu, dass IKKβ- und Bcl10-Koexpression in HEK293-Zellen die Phosphorylierung von Bcl10 induziert.

Abbildung 3.10 Bcl10-Phosphorylierung durch IKKβ. (a) Bcl10-Migrationsverhalten aus PMA/Iono-aktivierten Jurkat T-Zellen sowie HEK293-Zellen, die Epitop-markiertes Bcl10 und IKKβ koexprimieren. Das Muster der langsamer migrierenden Banden ähnelt sich stark. (b) Langsamer migrierende Bcl10-Banden, die nach Koexpression von IKKβ in HEK293-Zellen auftreten, sind Phosphatase sensitiv. Behandlung mit Hitze-inaktivierter (H.i.) Phosphatase hat keinen Effekt.

↓82

Zur Beurteilung der Spezifität IKKβ-vermittelter Bcl10-Phosphorylierung, wurden HEK293-Zellen mit Epitop-markiertem Bcl10 und weiteren Kinasen, die mit NF-κB-Aktivierung in Verbindung stehen, kotransfiziert (Abbildung 3.11). Neben IKKβ wurden IKKα, die zweite katalytische und zu IKKβ homologe Untereinheit des IKK-Komplexes sowie konstitutiv aktive PKCθ (PKCθ A/E) eingesetzt. Zusätzlich wurde ermittelt, ob IKKα und IKKβ Mutanten, die durch Punktmutation in der Aktivierungsschleife eine inaktive Kinase-Domäne besitzen (IKKα K/A, IKKβ K/A), die Fähigkeit verlieren, Bcl10 zu phosphorylieren. Die Analysen ergaben, dass weder koexprimiertes IKKα noch PKCθ in vergleichbarer Weise wie IKKβ die Phosphorylierung von Bcl10 auslösen. Auch die Kinase-inaktive Mutante von IKKβ induziert nicht die Phosphorylierung von Bcl10. Diese Ergebnisse zeigen, dass die alleinige Koexpression einer Kinase nicht zur Phosphorylierung von Bcl10 ausreicht und die Beobachtungen in spezifischer Weise von der Funktionalität der IKKβ-Kinase-Domäne abhängig sind.

Abbildung 3.11 Spezifität der Bcl10 Phosphorylierung durch IKKβ. Koexpression der entsprechenden Epitop-markierten Proteine in HEK293-Zellen zeigt, dass neben IKKβ weder IKKα noch PKCθ die Phosphorylierung von Bcl10 induzieren. Die Bcl10-Phosphorylierung durch IKKβ ist abhängig von der Funktionalität der IKKβ-Kinase-Domäne.

Um zu analysieren, ob IKKβ Bcl10 direkt phosphoryliert, wurden in vitro Kinasereaktionen mit rekombinantem IKKβ-Protein durchgeführt. Dabei wurde die Phosphoakzeptor-Fähigkeit von GSTIκBα, welches ein gut charakterisiertes Substrat von IKKβ ist, mit der von GSTBcl10 verglichen. Bakteriell exprimiertes und gereinigtes GSTIκBα 1-53, welches die
N-terminalen IKKβ-Phosphorylierungsstellen (Serin 32 und Serin 36) beinhaltet, lässt sich in vitro direkt von rekombinantem IKKβ phosphorylieren (Abbildung 3.12 a). Im Vergleich mit GSTIκBα ist bakteriell exprimiertes GSTBcl10 ein sehr viel schlechteres Substrat von rekombinantem IKKβ und zeigt in der Kinasereaktion mit gereinigten Proteinen keine signifikante Phosphorylierung. Im Gegensatz dazu wird GSTBcl10 unter Verwendung von IKK-Präzipitat aus aktivierten Jurkat T-Zellen effizient phosphoryliert (Abbildung 3.12 b). Die Intensität des Bcl10-Phosphorylierungssignals ist zwar vergleichsweise schwächer als bei GSTIκBα, aber spezifisch abhängig von der Aktivierung der Zellen durch PMA/Iono. Dies deutet an, dass für die IKKβ-vermittelte Bcl10-Phosphorylierung ein weiterer, noch unbekannter Kofaktor benötigt wird, der unter Verwendung gereinigter Proteine in der Kinasereaktion fehlt, aber bei der Immunopräzipitation von endogenem IKK kopräzipitiert wird. Bei Durchführung der Kinasereaktion in Gegenwart eines IKKβ-Inhibitors tritt eine starke Reduktion der Phosphorylierung von Bcl10 auf, was wiederum IKKβ als direkte Bcl10-Kinase nahe legt (A. Oeckinghaus, unveröffentlichte Beobachtungen)

↓83

Abbildung 3.12 Phosphorylierung von Bcl10 durch den aktivierten IKK-Komplex. (a) In vitro Kinasereaktion mit gereinigten Proteinen: GSTBcl10 ist im Vergleich mit GSTIκBα 1-53 ein schlechtes Subtrat von rekombinantem IKKβ. (b) In vitro Kinasereaktion mit IKK-Präzipitat aus PMA/Iono-aktivierten Jurkat
T-Zellen: GSTBcl10 wird zwar schwächer als GSTIκBα, aber spezifisch in Abhängigkeit vom Stimulus phosphoryliert. Die Coomassie-Färbungen bestätigen ausgeglichen eingesetzte Proteinmengen.

Im Folgenden wurde die Bestimmung der Phosphoakzeptor-Region von Bcl10 durch Koexpressionsstudien in HEK293-Zellen unter Verwendung von IKKβ und verschiedener Epitop-markierter, C-terminal trunkierter Bcl10-Mutanten durchgeführt (Abbildung 3.13). Während flagBcl10 1-140 nach Koexpression von IKKβ nicht phosphoryliert wird, zeigen die Mutanten flagBcl10 1-149 und flagBcl10 1-159 zwar eine schwächere, aber deutlich erkennbare IKKβ-abhängige Phosphorylierung im Vergleich mit flagBcl10 WT. Diese Beobachtungen grenzen den IKKβ-abhängigen Phosphoakzeptorbereich auf die C-terminale Region von Bcl10 ein.

Abbildung 3.13 Eingrenzung der Phosphoakzeptor-Region von Bcl10. Koexpressionsstudien in HEK293-Zellen mit C-terminal deletierten Bcl10-Mutanten ergeben, dass die IKKβ-abhängige Phosphorylierung von Bcl10 im C-terminalen Bereich stattfindet, da Bcl10 1-140 nicht, Bcl10 1-149 und Bcl10 1-159 aber wieder phosphoryliert werden. Zur Verdeutlichung dient die schematische Angabe der verwendeten Bcl10-Deletionsmutanten.

↓84

In vitro Kinasereaktionen bestätigen die Ergebnisse der HEK293-Koexpressionsstudien, da sich die C-terminale GSTBcl10 Deletionsmutante 1-140 im Gegensatz zu GSTBcl10 WT unter Verwendung von IKK-Präzipitat aus aktivierten Jurkat T-Zellen nicht phosphorylieren lässt. (Abbildung 3.14). GSTBcl10 WT wird wie erwartet nicht nur von aktiviertem IKKγ-, sondern auch von aktiviertem IKKβ-Präzipitat phosphoryliert.

Abbildung 3.14 IKK-Präzipitat phosphoryliert Bcl10 im C-Terminus. In in vitro Kinasereaktionen mit IKKγ- und IKKβ-Präzipitat aus aktivierten Jurkat T-Zellen wird GSTBcl10 WT, aber nicht die C-terminale Deletionsmutante GSTBcl10 1-140 phosphoryliert. Die Coomassie-Färbung dokumentiert die Mengenverhältnisse der eingesetzten Proteine.

Um die exakte IKKβ-abhängige Phosphoakzeptor-Position von Bcl10 zu erhalten, wurden
C-terminale Bcl10-Punktmutanten mit IKKβ in HEK293 koexprimiert. In der relevanten Region von Bcl10 zwischen Aminosäure 140 und 149 liegen zwei potentielle Phosphoakzeptor-Serine auf Position 141 und 144. Die Mutation dieser Serine zu Alanin (Bcl10 2xA) führt zu einer starken Reduktion der IKKβ-vermittelten Phosphorylierung, allerdings ist noch restliche Phosphorylierung zu erkennen. Erst zusätzlicher Austausch der Serine an den Positionen 134, 136 und 138 (Bcl10 5xA) unterdrückt die IKKβ-vermittelte Bcl10-Phosphorylierung (Abbildung 3.15 a). Da alleinige Mutation der Serine 134, 136 und 138 (Bcl10 3xA) ebenfalls nur zu einer moderaten Reduktion der Bcl10-Phosphorylierung führt, sind Phosphoakzeptor-Serine in beiden Abschnitten Ziel IKKβ-abhängiger Phosphorylierung. Im Einklang mit diesem Ergebnis zeigt gereinigtes GSTBcl10 5xA in einer Kinasereaktion mit IKKγ—Präzipitat aus PMA/Iono-aktivierten Jurkat T-Zellen stark reduzierte Phosphorylierung im Vergleich zu GSTBcl10 WT (Abbildung 3.15 b).

↓85

Abbildung 3.15 IKKβ-vermittelte Phosphorylierung von Bcl10 findet an mehreren C-terminalen Serinen statt. (a) Bcl10 5xA wird bei Koexpression von IKKβ nicht mehr phosphoryliert, wobei Bcl10 2xA und Bcl10 3xA jeweils noch restliche Phosphorylierung zeigen. Zur besseren Übersicht dient die schematische Angabe der verschiedenen Bcl10-Punktmutationen. (b) In einer Kinasereaktion unter Verwendung von IKKγ-Präzipitat wird GSTBcl10 5xA signifikant schwächer phosphoryliert als GSTBcl10 WT. Die Coomassie-Färbung bestätigt den Einsatz äquivalenter Proteinmengen in der Kinasereaktion.

3.1.5 C-terminale Bcl10-Phosphorylierung ist keine Voraussetzung für primäre NF-κB-Aktivierung

Die in dieser Arbeit präsentierten Daten zeigen, dass Phosphorylierung von Bcl10 direkt oder indirekt von IKKβ katalysiert wird und Inaktivierung von IKKβ die CBM-Komplexbildung verhindert. Allerdings sprechen u.a. die gegenläufige Kinetik von CBM-Komplexbildung und Bcl10-Phosphorylierung gegen eine aktivierende Funktion der Bcl10-Phosphorylierung. Um auszuschließen, dass C-terminale Phosphorylierung von Bcl10 zur IKK/NF-κB-Aktivierung benötigt wird, wurde die Fähigkeit der phosphorylierungs-defekten Mutante Bcl10 5xA im Vergleich mit verschiedenen Epitop-markierten Bcl10-Konstrukten zur Stimulus-induzierten Interaktion mit Carma1 in transfizierten Jurkat T-Zellen getestet (Abbildung 3.16). Sowohl Bcl10 5xA, wie auch Bcl10 1-140 und Bcl10 1-116 zeigen trotz mutierter oder deletierter Phosphoakzeptorregion mit Bcl10 WT vergleichbare Affinität zu endogenem Carma1 nach
T-Zell Aktivierung mit PMA/Iono. Im Gegensatz dazu interagiert die Bcl10-Mutante L41Q, deren Aminosäureaustausch die Funktionalität der CARD zerstört, nicht mehr mit Carma1. Demnach ist unter den gegebenen experimentellen Voraussetzungen die funktionale CARD zur Bildung des CBM-Komplexes ausreichend und eine potentielle C-terminale Phosphorylierung von Bcl10 für die primäre Bildung des Komplexes keine Voraussetzung.

Abbildung 3.16 Die Bcl10-CARD vermittelt Stimulus-induzierte Bcl10-Carma1-Interaktion. Jurkat T-Zellen wurden mit verschiedenen Epitop-markierten Bcl10-Konstrukten transfiziert und hinsichtlich der PMA/Iono-induzierbaren Bcl10-Carma1-Interaktion untersucht. Mutation oder Deletion der C-terminalen Phosphoakzeptor-Region von Bcl10 hat keinen Einfluss auf die primäre CBM-Komplexbildung. Eine funktionale CARD ist dafür unter den beschriebenen experimentellen Bedingungen ausreichend.

↓86

Weiterführend sollte festgestellt werden, ob Mutation der C-terminalen Bcl10 Phosphoakzeptor-Region eine Rolle auf NF-B-aktivierende Mechanismen hat, die möglicherweise CBM-Komplex unabhängig sind. Hierzu wurden RNAi-kombinierte Rekonstitutionsexperimente in Jurkat T-Zellen durchgeführt (Abbildung 3.17). Als Maß für die NF-B-Aktivierung wurde die Stimulus-abhängige Degradation von I B herangezogen. Durch Behandlung der Zellen mit shRNA gegen Bcl10 wird die PMA/Iono-induzierte Degradation von I B stark verzögert. Rekonstitution shBcl10-vorbehandelter Zellen mit flag-markiertem Bcl10 WT oder Bcl10 5xA, deren shBcl10-Hybridisierungssequenz durch Einführung stiller Mutationen zerstört wurde, führt in beiden Fällen zur Wiederherstellung der Stimulus-abhängigen I B -Degradation auf das Niveau Leervektor-transfizierter Kontrollzellen.

Abbildung 3.17 C-terminale Phosphorylierung von Bcl10 spielt keine Rolle bei primärer NF- B-Aktivierung. shBcl10-Behandlung von Jurkat T-Zellen verursacht die Verzögerung PMA/Iono-induzierter Degradation von I B. Sowohl durch Expression von flagBcl10 WT wie auch durch Expression von flagBcl10 5xA wird die I B -Stabilisierung rückgängig gemacht.

Zusammengefasst belegen diese Experimente, dass Mutation der C-terminalen Phosphorylierungsstellen von Bcl10 im Bereich zwischen Serin 134 und Serin 144 nicht die primäre Aktivierung von NF-B beeinflusst.

3.1.6  C-terminale Phosphorylierung von Bcl10 reguliert Bindungsaffinitäten innerhalb des CBM-Komplexes

↓87

Unter 3.1.5 wurde gezeigt, dass die N-terminale CARD von Bcl10 zur Vermittlung der Bcl10-Carma-Interaktion ausreicht. Zur Charakterisierung möglicher Funktionen der C-terminalen Region von Bcl10 in Bezug auf die Bcl10-Malt1-Bindung wurde die Interaktionsoberfläche von Bcl10 und Malt1 durch Kotransfektionsstudien in HEK293-Zellen ermittelt (Abbildung 3.18). Aus der Analyse flag-markierter Bcl10-Präzipitate geht hervor, dass die Bcl10-Malt1-Interaktion nicht an die Funktionalität der CARD geknüpft ist, vielmehr führt eine stufenweise Deletion des C-terminalen Bereichs von Bcl10 zu einer substantiellen Schwächung der Interaktion. Diese Daten zeigen, dass die C-terminale Region von Bcl10, welche die IKKβ-abhängige Phosphorylierungsstelle beinhaltet, eine wichtige Funktion bei der Bcl10-Malt1-Interaktion übernimmt.

Abbildung 3.18 Bestimmung der Malt1-Bindungsstelle von Bcl10. Stufenweise Deletion des C-terminalen Bereichs von Bcl10 führt zu einer sukzessiven Schwächung der Bcl10-Malt1-Interaktion. Inaktivierung der CARD von Bcl10 hat keinen Einfluss auf die Bindungsstärke. Zur besseren Übersicht sind die verwendeten Bcl10-Mutanten schematisch mit Kennzeichnung der Carma1- und Malt1-Interaktionsoberflächen angegeben.

Weiterhin wurde im vorhergehenden Abschnitt aufgedeckt, dass der C-Terminus von Bcl10 offenbar nicht in die primäre CBM-Komplexbildung involviert ist. Um eventuelle Einflüsse C-terminaler Bcl10-Phosphorylierung auf sekundäre Regulationsmechanismen zu untersuchen, wurden die Proteinaffinitäten von Bcl10 zu Carma1 und Malt1 mit und ohne Phosphoinduktion durch IKKβ in kotransfizierten HEK293-Zellen genauer untersucht. Die Untersuchung von tapCarma1-Präzipitat zeigt, dass phosphoryliertes Bcl10 über die Immunopräzipitation vom Carma1 angereichert wird. Durch IKKβ-Kotransfektion zusätzlich induzierte Bcl10-Phosphorylierung verstärkt diesen Effekt, es bindet fast ausschließlich
C-terminal phosphoryliertes Bcl10 an Carma1 (Abbildung 3.19 a). Die CARD-vermittelte Bcl10-Carma1-Bindung erscheint daher durch IKKβ-abhängige C-terminale Phosphorylierung von Bcl10 verstärkt.

↓88

Interessanterweise führt eine vergleichbar angelegte Analyse der Bcl10-Malt1-Interaktion
zu konträren Effekten. Die Analyse von tapMalt1-Immunopräzipitat ergibt, dass
ausschließlich unphosphoryliertes Bcl10 mit Malt1 kopräzipitiert. (Abbildung 3.19 b).

Abbildung 3.19 C-terminale Phosphorylierung von Bcl10 durch IKKβ beeinflusst die Bcl10-Bindungsaffinitäten zu Carma1 und Malt1. (a) Die Phosphorylierung von Bcl10 verstärkt die Bcl10-Carma1-Interaktion. Nach IKKβ-Kotransfektion bindet hauptsächlich C-terminal phosphoryliertes Bcl10 an Carma1. (b) Im Gegensatz dazu schwächt IKKβ-vermittelte Phosphorylierung von Bcl10 die Bcl10-Malt1-Interaktion, da
C-terminal phosphoryliertes Bcl10 nicht mit Malt1 kopräzipitiert und (c) Malt1 deutlich schwächer an
C-terminal phosphoryliertes Bcl10 bindet.

Umgekehrt führt die Phosphorylierung von Bcl10 durch IKKβ zur Reduktion der Bcl10-Malt1 Affinität, es wird deutlich weniger Malt1 mit phosphoryliertem als mit unphosphoryliertem flagBcl10 kopräzipitiert (Abbildung 3.19 c). Diese Ergebnisse deuten an, dass IKKβ-vermittelte Phosphorylierung von Bcl10 im C-terminlen Bereich, der zuvor als essentiell für die Bcl10-Malt1 Bindung identifiziert wurde, einen negativ-regulatorischen Einfluss auf die Bcl10-Malt1 Bindung hat, da phospho-Bcl10 schwächer oder gar nicht an Malt1 bindet.

↓89

Unter Berücksichtigung der Daten aus 3.1.5 ergibt sich hieraus die Möglichkeit, dass die Phosphorylierung von Bcl10 zwar nicht Voraussetzung für primäre Komplex Bildung ist, aber dennoch Einfluss auf die Komplexaffinitäten innerhalb des CBM-Komplexes als Teil eines sekundären Regulationssystems nimmt.

3.1.7 C-terminale Phosphorylierung von Bcl10 schwächt T-Zell Aktivierung

Um zu überprüfen, ob C-terminale Phosphorylierung von Bcl10 bei der Aktivierung von T-Zellen unter physiologischen Bedingungen in Form eines sekundären Regulationsmechanismus’ eine Rolle spielt, wurden Rekonstitutionsexperimente in primären Bcl10-defizienten T-Zellen durchgeführt. T-Zellen aus Bcl10 „Knock Out“-Mäusen sind aufgrund einer selektiven Blockade des NF-κB Signalweges nicht mehr in der Lage, nach Inkubation mit T-Zell aktivierenden Stimuli proliferationsfördernde oder proinflammatorische Zytokine wie IL-2 und TNFα zu produzieren [Ruland et al, 2001]. Zur Untersuchung des Einflusses C-terminaler Bcl10-Phosphorylierung auf die Fähigkeit primärer T-Zellen, Stimulus-induziert IL-2 und TNFα zu produzieren, wurden CD4+ T-Zellen aus Bcl10 defizienten-Mäusen retroviral mit flagBcl10 WT, flagBcl10 5xA und flagBcl10 L41Q rekonstituiert.

Die T-Zellen Bcl10-defizienter Mäuse exprimieren aufgrund des genetischen Hintergrunds der Tiere ausschließlich eine Isoform des Oberflächenproteins Thy1 („Thymus Cell Antigen 1“), Thy1.2. Da die Möglichkeit besteht, Thy1.1, eine weitere Thy1-Isoform neben Thy1.2 selektiv mittels FACS-basierter Analyse zu detektieren, konnten erfolgreich infizierte T-Zellen aufgrund der Expressionskopplung von Bcl10 und Thy1.1 über eine IRES („Internal Ribosome Entry Segment“)-Sequenz des retroviralen Vektors anhand der Thy1.1-Oberflächenexpression identifiziert werden (Abbildung 3.20).

↓90

Abbildung 3.20 Schematische Verdeutlichung der Identifizierung retroviral rekonstituierter, Bcl10-defizienter CD4+ T-Zellen. T-Zellen der Bcl10-defizienten Mäuse exprimieren aufgrund des genetischen Hintergrunds der Tiere ausschließlich Thy1.2. Da die erfolgreiche Infektion zur simultanen ektopischen Expression von Bcl10 und Thy1.1 führt, konnten infizierte Zellen anhand von Thy1.1-Oberflächenexpression identifiziert werden. Die Fähigkeit zur Rekonstitution der Antigenrezeptor-vermittelten Zytokinproduktion durch Bcl10-Expression wurde weiterführend analysiert.

Die Fähigkeit zur Wiederherstellung der Antigenrezeptor-induzierten Zytokinproduktion von Bcl10 WT, Bcl10 5xA und Bcl10 L41Q wurde nach sechsstündiger Aktivierung der infizierten Zellen durch FACS-basierte Analyse der intrazellulären IL-2- und TNFα-Produktion bestimmt. Wie erwartet zeigen Thy1.1-negative und damit auch Bcl10-negative Zellen keine CD3/CD28-Antikörper- oder PMA/Iono-induzierbare Zunahme der intrazellulären Zytokinproduktion. Auch die mit der CARD-defekten Mutante Bcl10 L41Q rekonstituierten Zellen sind nicht in der Lage, auf T-Zell aktivierende Stimuli zu reagieren. Allerdings ergaben die Untersuchungen, dass ein signifikanter Anteil der retroviral infizierten „Knock Out“- T-Zellen nach Rekonstitution mit Bcl10 WT wieder auf T-Zell-aktivierende Stimuli reagiert, gekennzeichnet durch den deutlichen Anstieg der intrazellulären Produktion von IL-2 und TNF-α. Darüber hinaus ist die Fähigkeit der phosphorylierungs-defekten
C-terminalen Mutante Bcl10 5xA zur Wiederherstellung der Zytokinproduktion im Vergleich mit Bcl10 WT noch einmal deutlich höher (Abbildung 3.21). Die Mutation der Phosphoakzeptor-Serine von Bcl10 führt demnach zu einer Verstärkung der T-Zell Antwort auf CD3/CD28- oder PMA/Iono-Stimulation.

Abbildung 3.21 Mutation der C-terminalen Phosphorylierungsstelle von Bcl10 verstärkt Zytokin-Produktion in primären T-Zellen. CD4+ T-Zellen wurden retroviral mit Bcl10 WT, Bcl10 5xA und Bcl10 L41Q rekonstituiert und die intrazelluläre Zytokinproduktion per FACS analysiert. Koexpression von Bcl10 mit dem Oberflächenmarker Thy1.1 ermöglicht die Identifizierung infizierter Zellen. Die Expression von Bcl10 WT und Bcl10 5xA, aber nicht die Expression von L41Q stellt die Fähigkeit der Zellen zur CD3/CD28- oder PMA/Iono-induzierten IL-2- und TNFα-Produktion wieder her. Im Vergleich mit Bcl10 WT ist die Wiederherstellung der Antigenrezeptor-induzierten Zytokinproduktion durch Bcl10 5xA deutlich effektiver. Dies deutet auf eine negativ-regulatorische Funktion der C-terminalen Bcl10-Phosphorylierungsstelle hin. Zur Kontrolle der Spezifität wurden auch nicht infizierte Zellen analysiert, die keine induzierbare Zykokinproduktion zeigen.

↓91

Diese Ergebnisse zeigen, dass die Funktionalität der CARD von Bcl10 im Einklang mit den Ergebnissen aus 3.1.5 auch in vivo für die Aktivierung von primären T-Zellen essentiell ist. Zusätzlich deuten die Beobachtungen eine negativ-regulatorische Funktion der C-terminalen Serine 134, 136, 138, 141 und 144 von Bcl10 bei der Aktivierung von T-Zellen an, da deren Mutation in verstärkter Zytokinproduktion resultiert. Interessanterweise wurden diese Serine in den Abschnitten 3.1.4 und 3.1.5 mit CBM-Komplex-interner Modulierung der Bindungsaffinitäten durch IKKβ-abhängige Phosphorylierung in Verbindung gebracht. Die Analyse der Thy1.1 negativen, nicht infizierten Zellen belegt, dass die beobachteten Effekte nach Rekonstitution in spezifischer Weise von der Bcl10-Expression abhängen.

3.2 Regulierung der CBM-Komplexaktivität durch Degradation von Bcl10

3.2.1  Lysosomale Degradation von Bcl10 nach T-Zell Aktivierung

In Kapitel 3.1 dieser Arbeit werden Daten präsentiert, die andeuten, dass C-terminale Phosphorylierung von Bcl10 interne CBM-Komplexaffinitäten reguliert und dadurch zur Modulierung der Zellantwort nach Aktivierung der Antigenrezeptor-vermittelten Signalwege beiträgt. Dabei handelt es sich um Prozesse, die bereits in den ersten Minuten nach Beginn der Stimulation beobachtet werden konnten. Nach längerer Stimulationszeit treten augenscheinlich andere Prozesse in den Vordergrund, wie die Analyse der Bcl10-Carma1-Interaktion in Jurkat T-Zellen nach 90-minütiger Stimulation durch PMA/Iono zeigt. Es fällt auf, dass die Menge an präzipitiertem Bcl10-Protein mit zunehmender Stimulationsdauer stark abnimmt und im Zuge dessen auch die Menge an kopräzipitiertem Carma1 reduziert ist (Abbildung 3.22).

Abbildung 3.22 Die Bcl10 Proteinmenge nimmt bei längerer Stimulationszeit stark ab. Die Analyse der Bcl10-Carma1-Interaktion in Jurkat T-Zellen zeigt, dass nach 90-minütiger PMA/Iono-Stimulation die Menge an direkt präzipitiertem Bcl10-Protein und im Zuge dessen auch die Menge an kopräzipitiertem Carma1-Protein stark abnimmt.

↓92

Weiterhin ist zu erwähnen, dass unter den gegebenen experimentellen Bedingungen die Phosphorylierung von Bcl10 nicht detektierbar ist. Da für die Experimente in Kapitel 3.2 ein anderer Zelllyse-Puffer zur Herstellung zytoplasmatischer Extrakte als unter 3.1 verwendet wurde, könnte mögliche Instabilität der Bcl10-Phosphoformen im veränderten Milieu eine Erklärung für die Beobachtung sein.

Die Untersuchung zytoplasmatischer Extrakte aus aktivierten Jurkat T-Zellen ergibt, dass die Stimulation mit PMA zu einer stetigen Reduzierung des Bcl10-Proteinlevels führt (Abbildung 3.23). Im Gegensatz dazu führt TNFα-Stimulation der Zellen zwar zur Aktivierung von
NF-κB, angezeigt durch die Stimulations-abhängige Degradation von IκBα, der Level an Bcl10-Protein bleibt in diesem Fall allerdings unverändert. Es handelt sich hier also um eine Beobachtung, die spezifisch mit T-Zell Aktivierung in Zusammenhang steht. Um zu überprüfen, ob die beschriebenen Effekte auch in primären Zellen zu beobachten sind, wurden humane Lymphozyten und murine CD4+ T-Zellen mit T-Zell aktivierenden Stimuli behandelt. Sowohl die Stimulation mit PMA/Iono als auch mit CD3/CD28-Antikörpern führt zu einer Reduktion der zytoplasmatischen Bcl10-Proteinmenge in primären Zellen.

Abbildung 3.23 T-Zellaktivierung zieht Reduktion der zytoplasmatischen Bcl10-Proteinkonzentration nach sich. (a) Die Analyse von zytoplasmatischen Jurkat T-Zell Extrakten zeigt, dass PMA Stimulation, aber nicht TNFα-Stimulation zur Reduktion der Bcl10-Proteinmenge führt. Die Degradation von IκBα bestätigt die Aktivierung der NF-κB-Signalkette, p65 Proteinlevel dokumentiert ausgeglichene Proteinladung. (b) Auch in primären humanen Lymphozyten und murinen CD4+ T-Zellen induziert T-Zellaktivierung durch PMA/Iono oder CD3/CD28-Antikörper die Reduktion der Bcl10-Proteinmenge.

↓93

Weiterführende Analysen konnten eindeutig zeigen, dass die Abnahme der Bcl10-Konzentration nicht auf den Transport des Proteins in unlösliche Zellkompartimente, sondern auf Stimulus-induzierte Proteindegradation zurückzuführen ist [Scharschmidt et al, 2004].

Die Stimulus-induzierte Degradation von IκBα durch das 26S-Proteasom spielt bei der Aktivierung von NF-κB eine zentrale Rolle. Um zu untersuchen, ob Bcl10 ebenfalls proteosomal degradiert wird, wurden Jurkat T-Zellen vor der Aktivierung durch PMA mit den Inhibitoren ALLN und MG132 vorbehandelt. Diese hemmen spezifisch die Funktion des Proteasoms und stabilisieren Zielproteine des proteosomalen Abbauweges. Allerdings führt weder ALLN- noch MG132-Vorbehandlung zur Stabilisierung des Bcl10-Proteinlevels (Abbildung 3.24). Im Gegensatz dazu ist die IκBα-Degradation durch Vorbehandlung von ALLN deutlich verzögert und durch MG132 nahezu blockiert, was die grundsätzliche Wirkung der Substanzen belegt.

Abbildung 3.24 Bcl10 wird nicht durch das Proteasom abgebaut. Die Analyse von Jurkat T-Zellextrakt zeigt, dass Vorbehandlung der Zellen mit den proteosomalen Inhibitoren ALLN oder MG132 zwar die PMA-induzierte Degradation von IκBα verhindert, aber keinen Einfluss auf die Stabilität von Bcl10 hat.

↓94

Es ist bekannt, dass membranständige Rezeptoren wie der TCR Signal-abhängig internalisiert, in lysosomale Vesikel rekrutiert und degradiert werden, allerdings wurde bis heute kein derartiger Regulationsmechanismus für zytoplasmatische Proteine aufgedeckt. Zur Analyse der intrazellulären Proteinlokalisation von Bcl10 wurden daher aktivierte Jurkat T-Zellen konfokalmikroskopisch untersucht. Stimulation der Zellen durch PMA führt zur Akkumulation von Bcl10 in Vesikel-ähnlichen Strukturen (Abbildung 3.25 a). In weiterführenden Immunofluoreszenzmikroskopie-Analysen wurde eine partielle Kolokalisation von Bcl10 mit den lysosomalen Markerproteinen LAMP1 („Lysosomal Associated Membrane Protein 1“) und Cathepsin B in den Stimulus-induziert gebildeten Strukturen festgestellt [Scharschmidt et al, 2004]. Daraufhin wurde unter Verwendung pharmakologisch wirksamer Substanzen die Auswirkung lysosomaler Inhibitoren auf die Proteinstabilität von Bcl10 untersucht. Inkubation von Jurkat T-Zellen mit einer Kombination der Inhibitoren Pepstatin A und Leupeptin, die Lysosomen-assozierte Proteasen hemmen, führt zu einer deutlichen Stabilisierung des Bcl10-Proteins nach T-Zell Aktivierung durch PMA (Abbildung 3.25 b). Gleichzeitig ist die Stimulus-induzierte Degradation von IκBα nicht beeinflusst. Zusammengefasst deuten diese Ergebnisse an, dass zytoplasmatisches Bcl10 nach der Aktivierung von T-Zellen in lysosomale Vesikel rekrutiert wird und anschließend durch den lysosomalen Abbauweg degradiert wird.

Abbildung 3.25 Lysosomen-Inhibition stabilisiert Bcl10 nach T-Zellaktivierung. (a) Analyse der intrazellulären Proteinlokalisation von Bcl10 in Jurkat T-Zellen. Nach PMA-Stimulation akkumuliert Bcl10 in Lysosomen-ähnlichen Strukturen. (b) Vorbehandlung von Jurkat T-Zellen mit den Protease-Inhibitoren Pepstatin A und Leupeptin verzögert die PMA/Iono-induzierte Reduzierung des Bcl10-Proteinlevels. Dies deutet einen Lysosomen-abhängigen Degradationsmechanismus für Bcl10 an.

3.2.2 Bcl10-Phosphorylierung ist kein Signal für anschließende Bcl10-Degradation

Zur Aufdeckung eines mechanistischen Zusammenhangs zwischen Bcl10-Phosphorylierung und Bcl10-Degradation wurde die Stabilität von unphosphoryliertem Bcl10 im Vergleich zu IKKβ-abhängig phosphoryliertem Bcl10 analysiert (Abbildung 3.26). Hierfür wurden HEK293-Zellen mit Epitop-markiertem Bcl10 und IKKβ kotransfiziert und mit Cycloheximide (CHX), einem Inhibitor der de novo Proteinbiosynthese, inkubiert, um eventuelle Stabilitätsunterschiede der unterschiedlich schnell migrierenden Bcl10-Modifikationsformen zu identifizieren. Allerdings nimmt die Proteinmenge von unphosphoryliertem und phosphoryliertem Bcl10 ohne de novo Synthese über die Zeit gleichmäßig ab. Dies deutet an, dass die Phosphorylierung von Bcl10 nicht zur Stabilisierung oder Destabilisierung des Proteins beiträgt.

↓95

Abbildung 3.26 Phosphorylierung von Bcl10 hat keinen Einfluss auf Proteinstabilität. Die Analyse von Kotransfektionsstudien in CHX-behandelten HEK293-Zellen ergibt, dass die Proteinmengen von C-terminal phosphoryliertem und nicht-phosphoryliertem Bcl10 gleichmäßig abnehmen. Dies bedeutet, dass die Phosphorylierung weder Proteinabbau noch Proteinstabilisierung von Bcl10 begünstigt.

Im Einklang mit diesem Ergebnis steht die Beobachtung, dass Inhibition der IKKβ-Kinaseaktivität durch Bay 11-7085 in PMA/Iono-stimulierten Jurkat T-Zellen zwar die Stabilisierung von IκBα, nicht aber die Stabilisierung von Bcl10 nach sich zieht (Abbildung 3.27). Im Gegensatz dazu verzögert die Inhibition der Kinaseaktivität von PKCθ durch Rottlerin sowohl die Degradation von IκBα als auch die von Bcl10. Diese Beobachtung belegt, dass die Degradation von Bcl10 nach T-Zellaktivierung zwar von PKCθ abhängig ist, nicht aber durch IKKβ-induzierte Phosphorylierung vermittelt wird.

Abbildung 3.27 Bcl10-Degradation ist nicht abhängig von IKKβ-Kinaseaktivität. Die Analyse von Rottlerin oder Bay 11-7085 vorbehandelten Jurkat T-Zellen zeigt, dass die PMA/Iono-induzierte Bcl10-Degradation von PKCθ-, aber nicht von IKKβ-Kinaseaktivität abhängt. Die unspezifische Bande (*) dokumentiert ausgeglichen geladene Proteinmengen.

3.2.3 Bcl10-Ubiquitinierung durch die HECT E3-Ubiquitin-Ligasen Itch und Nedd4

↓96

In einer Vielzahl von Fällen stellt Ubiquitinierung das Signal für den Transport von Proteinen in lysosomale Vesikel dar [Hicke und Dunn, 2003]. Zur Beantwortung der Frage, ob die Stimulus-induzierte Degradation von Bcl10 auf Ubiquitin-vermittelte Prozesse zurück zu führen ist, wurde der Ubiquitinierungsstatus von Bcl10 in ruhenden und aktivierten Jurkat
T-Zellen miteinander verglichen (Abbildung 3.28). Die Analyse von Bcl10-Präzipitat zeigt, dass PMA- oder CD3/CD28-Stimulation die Polyubiquitinierung von Bcl10 induziert. Längere Belichtungszeiten decken auch die Anwesenheit kurzkettiger Ubiquitinmodifikationen auf, die im Allgemeinen mit lysosomaler Degradation in Verbindung gebracht werden. Um auszuschließen, dass ein mit Bcl10-assoziiertes Protein ubiquitiniert wird, wurde die Bcl10-Ubiquitinierung unter Verwendung eines Zelllyse Puffers mit 1%iger SDS-Konzentration durchgeführt. Die hohe Detergenz-Konzentration hat die Dissoziation nicht-kovalent gebundener Proteine zur Folge, wobei kovalente Protein-Modifikationen wie Ubiquitinierung bestehen bleiben. Auch unter derart stringenten Lyse-Bedingungen bleibt die Stimulus-abhängige Bcl10-Ubiquitinierung detektierbar. Das schwächere Ubiquitin-Signal kann dadurch erklärt werden, dass die Immunopräzipitation von Bcl10 im Lyse-Puffer mit hoher Detergenz-Konzentration deutlich weniger effizient ist.

Abbildung 3.28 T-Zell Aktivierung induziert die Ubiquitinierung von Bcl10. Die Analyse von Bcl10-Präzipitat aus PMA- oder CD3/CD28-stimulierten Jurkat T-Zellen ergibt, dass Bcl10 Signal-induziert auch unter stringenten Zelllyse-Bedingungen (1% SDS) ubiquitiniert wird. Dadurch wird die Möglichkeit einer indirekten Ubiquitinierung assoziierter Proteine ausgeschlossen. Längere Belichtungszeit ermöglicht auch die Detektion kurzkettiger Ubiquitinmodifikationen von Bcl10.

Die Verknüpfung zwischen Ubiquitin und einem Akzeptor-Lysin des Substrats wird von E3-Ubiquitin Ligasen katalysiert. Einige dieser Enzyme wie die HECT („Homology To The E6-Associated Protein Carboxyl Terminus“) E3-Ligasen Itch und Nedd4 („Neural Precursor Cell Expressed Developmentally Down-regulated 4“) oder die RING („Really Interesting New Gene“) E3-Ligase Cbl-b („Casitas B-Lineage Lymphoma b“) sind durch biochemische Analysen oder genetische Inaktivierung in Mäusen mit der Regulation von T-Zell spezifischen Mechanismen in Verbindung gebracht worden [Liu, 2004]. Während Ubiquitin von HECT E3-Ligasen erst gebunden und dann auf das Substrat übertragen wird, unterstützen RING E3-Ligasen den direkten Ubiquitin-Transfer vom E2-Enzym auf das Zielprotein. Hierbei nehmen sowohl Ligasen des HECT-Typs als auch Ligasen des RING-Typs entscheidend Einfluss auf die Substratspezifität [Liu, 2004]. Um zu untersuchen, ob Itch, Nedd4 oder Cbl-b die Ubiquitinierung von Bcl10 vermitteln, wurden Kotransfektionsstudien in HEK293-Zellen durchgeführt. Hierfür wurden Epitop-markiertes Bcl10, Ubiquitin und die unterschiedlichen Ligasen koexprimiert und deren Einfluss auf die Bcl10-Ubiquitinierung untersucht. Die Analyse von flagBcl10-Präzipitat zeigt, dass die HECT E3-Ligasen Itch und Nedd4 massiv verstärken (Abbildung 3.29 a). Im Gegensatz dazu ist die RING E3-Ligase Cbl-b nicht in der Lage, die Ubiquitinierung von Bcl10 zu induzieren (Abbildung 3.29 b).

↓97

Abbildung 3.29 Bcl10-Ubiquitinierung durch Itch und Nedd4. Koexpression von Itch oder Nedd4 mit
Bcl10 in HEK293-Zellen induziert Bcl10-Ubiquitinierung (a), während Koexpression von Cbl-b keinen
Effekt zeigt (b).

3.2.4 Charakterisierung der Bcl10-Ubiquitinierung

Zur Beurteilung der Spezifität der Bcl10-Ubiquitinierung durch HECT E3-Ligasen wurden die Grundlagen der Nedd4- und Itch-katalysierten Reaktion durch Koexpressionsstudien in HEK293-Zellen und in Jurkat T-Zellen genauer untersucht (Abbildung 3.30). Die Aktivität von Nedd4 kann durch Mutation eines Cysteins der enzymatisch aktiven Domäne zu Alanin (Nedd4 C/A) zerstört werden. Im Vergleich zu Nedd4 WT katalysiert Nedd4 C/A die Bcl10-Ubiquitinierung um ein Vielfaches schwächer. Zusätzlich ist die Nedd4-abhängige Bcl10-Ubiquitinierung unterbunden, wenn anstatt Bcl10 WT die Bcl10-Punktmutante L41Q koexprimiert wird. Diese Ergebnisse belegen, dass in HEK293-Zellen

Abbildung 3.30 Charakterisierung der Bcl10-Ubiquitinierung durch Nedd4 und Itch. Die Analyse von Koexpressionsstudien in (a) HEK293-Zellen und (b) Jurkat T-Zellen zeigt, dass für Bcl10-Ubiquitinierung durch Nedd4 und Itch die E3-Ligaseaktivität und eine funktionale CARD von Bcl10 benötigt werden.

↓98

und in Jurkat T-Zellen für die Ubiquitinierung von Bcl10 durch die HECT E3-Ligasen Itch oder Nedd4 einerseits die katalytische Funktion der Enzyme und andererseits die Adapterfunktion der CARD von Bcl10 benötigt wird.

Die Proteinsequenz von Bcl10 beinhaltet fünfzehn potentielle Ubiquitin-Akzeptorlysine. Ein Großteil davon befindet sich innerhalb der N-terminalen CARD. Um die genaue Verknüpfungsstelle der Nedd4-abhängigen Bcl10-Ubiquitinierung zu ermitteln, wurde der Ubiquitinierungsstatus von verschiedenen Bcl10-Lysinmutanten durch Koexpressionsanalysen in HEK293-Zellen bestimmt (Abbildung 3.31). Interessanterweise ist es nicht möglich, durch Mutation einzelner Lysine zu Arginin die Ubiquitinierung von Bcl10 zu verhindern. Vielmehr entsteht der Eindruck, das sukzessiver Austausch der Akzeptor-Lysine die Gesamtubiquitinierung stetig drückt. Da die Bcl10-Mutante K0, bei der alle Lysine durch Arginin ersetzt wurden, keine restliche Ubiquitinierung mehr zeigt, kann ein Lysin-unabhängiger Verknüpfungsmechanismus allerdings ausgeschlossen werden.

Abbildung 3.31 Eingrenzung der Bcl10-Ubiquitinierungsstelle. Koexpressionsanalysen von verschiedenen Bcl10-Lysinmutanten und Nedd4 in HEK293-Zellen deuten an, dass die Nedd4-abhängige Ubiquitinierung nicht an einem bestimmten Lysin von Bcl10 stattfindet, sondern der Bcl10 Ubiquitinierungsstatus von der Gesamtzahl verfügbarer Lysine abhängt. Die Lysinmutante Bcl10 K0 wird wie Bcl10 L41Q nicht mehr ubiquitiniert. Zur besseren Übersicht sind die unterschiedlichen Bcl10-Lysinmutanten schematisch, zu Argenin mutierte Lysine in rot (unterstrichen) dargestellt.

↓99

Die Verknüpfung der einzelnen Ubiquitinreste untereinander zu einer Polyubiquitinkette wiederum kann an unterschiedlichen Lysinen von Ubiquitin erfolgen. Da die Art der Verknüpfung Auskunft über das Schicksal des ubiquitinierten Substrats gibt, sollte durch Kotransfektionsstudien in HEK293-Zellen unter Verwendung von Ubiquitinmutanten herausgefunden werden, welche Art der Verknüpfung in der durch Nedd4 synthetisierten Polyubiquitinkette von Bcl10 vorliegt. Die am Besten charakterisierten Verknüpfungsarten erfolgen über die Lysine K48 oder K63. Daher wurden für die Analyse einerseits Ubiquitinmutanten verwendet, die an Position K48 oder K63 anstatt eines Lysins ein Arginin besitzen (K48R, K63R), andererseits wurden Mutanten eingesetzt, bei denen alle Lysine außer K48 oder K63 zu Arginin mutiert sind (K48, K63). Die Analyse von flagBcl10-Präzipitat nach Koexpression von Epitop-markiertem Bcl10 und Nedd4 mit Ubiquitin WT oder Mutanten zeigt, dass unter Verwendung von Ubiquitin K48 oder K63 die Bcl10 Polyubiquitinierung vollständig unterdrückt wird (Abbildung 3.32). Im Gegensatz dazu führt die Koexpression der Mutanten K48R und K63R zu ähnlich starker Polyubiquitinierung wie mit Ubiquitin WT. Dieses Ergebnis deutet an, dass die Verknüpfungsart der Nedd4-abhängigen Bcl10-Ubiquitinierung weder K48 oder K63 basiert ist. Vielmehr besteht die Möglichkeit, dass Nedd4 die Bildung von Polyubiquitinketten katalysiert, die über eines der anderen Lysine in Ubiquitin, z.B. K29, verknüpft sind.

Abbildung 3.32 Polyubiquitinverknüpfung bei Nedd4-abhängiger Bcl10-Ubiquitinierung. Die Koexpressionsanalyse von Bcl10 und Nedd4 mit unterschiedlichen Ubiquitinmutanten in HEK293-Zellen deutet an, dass Nedd4 weder die Bildung von K48- noch von K63-polyubiquitiniertem Bcl10 katalysiert. Zur besseren Übersicht sind die unterschiedlichen Bcl10-Lysinmutanten schematisch dargestellt und zu Argenin mutierte Lysine rot (unterstrichen) markiert.

3.2.5 Inaktivierung von Nedd4 und Itch durch RNAi stabilisiert Bcl10

Zur Beurteilung der physiologischen Bedeutung der HECT E3-Ligasen Itch und Nedd4 beim Prozess Stimulus-induzierter Degradation von Bcl10 wurden RNAi-Experimente in Jurkat T-Zellen durchgeführt. Dabei wurde der Effekt shRNA-vermittelter Inaktivierung von Itch und Nedd4 auf die Stabilisierung des Bcl10-Proteinlevels PMA/Iono-aktivierter Zellen durch FACS-basierte Analyse untersucht. Grundlage hierfür war die Visualisierung der Stimulus-induzierten Degradation von Bcl10 durch einen Bcl10-spezifischen Fluorophor-gekoppelten Antikörper. Die FACS-Analyse ruhender und PMA-aktivierter Jurkat T-Zellen ergibt, dass sich bei histographischer Auftragung die Bcl10-spezifische Gesamtfluoreszenz Stimulus-induziert zu niedrigeren Werten verschiebt (Abbildung 3.33). Dies entspricht einer Fluoreszenz-Abschwächung, die durch die Degradation von Bcl10 hervorgerufen wird. Als Kontrolle wurde parallel die intrazelluläre Färbung von Itch analysiert. Erwartungsgemäß findet hier keine Fluoreszenz-Verschiebung statt, da für Itch keine Stimulus-induzierte Degradation beobachtet wurde.

↓100

Abbildung 3.33 FACS Analyse des PMA-induzierten Bcl10-Proteinabbaus. Intrazelluläre Färbung von Bcl10 und Itch in Jurkat T-Zellen: PMA-Stimulation ruft bei Bcl10 eine Verschiebung der Fluoreszenzintensität zu niedrigeren Werten hervor, die den Proteinabbau von Bcl10 anzeigt. Im Gegensatz dazu verschiebt sich die Fluoreszenz-Intensität für Itch nicht.

Um die Inaktivierungseffizienz abzuschätzen, wurden Itch- und Nedd4-Proteinlevel shRNA-behandelter Zellen mit pmU6-Kontrollzellen verglichen. In beiden Fällen wurde restliches Protein detektiert. Dies kann durch die Anwesenheit toter Zellen nach der Elektroporation oder eine nicht optimale Transfektionsrate erklärt werden (Abbildung 3.34 a). Der
wesentliche Vorteil der FACS-basierten Untersuchung liegt darin, dass durch selektive

Abbildung 3.34 Inaktivierung von Itch und Nedd4 stabilisiert Bcl10 nach T-Zell Aktivierung. Jurkat T-Zellen wurden mit shRNA-kodierenden Vektoren gegen Itch und Nedd4 transfiziert und die Effekte auf PMA-induzierten Bcl10-Proteinabbau analysiert. (a) Überprüfung der Inaktivierung von Itch und Nedd4 durch shRNA-Transfektion. (b) Einteilung der Hauptpopulation 72 Std. nach Elektroporation: durch Kotransfektion eines EGFP-kodierenden Vektors wurden maximal transfizierte Zellen (Region R1) anhand der Intensität grüner Fluoreszenz identifiziert und von schwach transfizierten Zellen (Region R2) unterschieden. (c) Separate Populationsanalyse Bcl10-gefärbter Zellen aus Region R1 und Region R2: in stark EGFP-positiven Zellen ist die PMA-induzierte Fluoreszenzverschiebung im Vergleich zu pmU6 Leervektor-transfizierten Zellen durch shItch- oder shNedd4-Expression deutlich abgeschwächt. Dies entspricht einer Stabilisierung von Bcl10 nach T-Zell Aktivierung. In schwach EGFP-positiven Zellen dagegen hat die Kotransfektion von shRNAs keinen stabilisierenden Effekt.

↓101

Populationsanalyse tote und ineffizient transfizierte Zellen ausgeschlossen werden können. Daher wurde zur Bestimmung der Transfektionsrate der Zellen ein EGFP-kodierender Vektor neben den shRNA-kodierenden Vektoren kotransfiziert. Auf diese Weise war es möglich, den Stimulus-induzierten Proteinabbau von Bcl10 in stark transfizierten Zellen (Region R1) im Vergleich mit gering oder nicht transfizierten Zellen (Region R2) zu beurteilen (Abbildung 3.34 b). Während EGFP-positive und EGFP-negative pmU6-Leervektor transfizierte Referenzzellen eine ähnliche Abnahme der Bcl10-Proteinmenge nach PMA-Stimulation aufweisen, ist in shItch- und shNedd4-exprimierenden Zellen der stark EGFP-positiven Population eine deutliche Stabilisierung von Bcl10 zu beobachten (Abbildung 3.34 c). Im Gegensatz dazu findet keine Stabilisierung von Bcl10 in der schwach EGFP-exprimierenden Population nach T-Zell Aktivierung statt. Die stabilisierende Wirkung der shRNAs gegen Itch und Nedd4 ist somit auf Zellen mit einer hohen Transfektionsrate beschränkt. Dieses Ergebnis belegt die physiologische Bedeutung von Itch und Nedd4 beim Stimulus-abhängigen Proteinabbau von Bcl10, da durch effektive RNAi-vermittelte Inaktivierung der Ligasen die PMA-induzierbare Degradation von Bcl10 in Jurkat T-Zellen inhibiert wird.

3.2.6 Die Degradation von Bcl10 dient der Deaktivierung TCR-vermittelter NF-κB-Signaltransduktion

Bcl10-defiziente Mäuse zeigen massive Defekte bei der TCR-vermittelten IKK/NF-κB-Aktivierung [Ruland et al, 2001]. Es bestand daher die Möglichkeit, dass die Degradation von Bcl10 einen inhibitorischen Einfluss auf die Antigenrezeptor-induzierte NF-κB-Signalübertragung in aktivierten T-Zellen hat. Um mögliche Zusammenhänge zu untersuchen wurden Jurkat T-Zellen mit PMA vorbehandelt, was zu einer nahezu vollständigen Degradation von Bcl10 führt (Abbildung 3.35). Nach anschließender Restimulation durch CD3- oder CD3/CD28-Antikörper wurde die NF-κB-Aktivierung anhand der Stimulus-abhängigen IκBα-Degradation analysiert. Es zeigt sich, dass die durch Restimulation induzierte NF-κB-Aktivierung in PMA-vorbehandelten Zellen im Vergleich zu Referenz-Zellen deutlich verzögert ist. Dies deutet eine Inhibierung Antigenrezeptor-spezifischer Signalübertragung durch den Verlust von Bcl10 an. Da TNFα-induzierte NF-κB-Aktivierung nicht beeinflusst wird, kann eine allgemeine Desensibilisierung der Zellen nach PMA-Vorbehandlung ausgeschlossen werden. Detaillierte Analysen der Antigenrezeptor-abhängigen Signalwege ergaben, dass auch die kostimulativ–induzierte Aktivierung von MAP-Kinasen in PMA-vorbehandelten Jurkat T-Zellen nicht beeinträchtigt ist. Dadurch wurden mögliche Antigenrezeptor-proximale Effekte, die zur Bcl10-unabhängigen Desensibilisierung der Zellen führen könnten, ebenfalls ausgeschlossen [Scharschmidt et al, 2004]. Unter Berücksichtigung der Ergebnisse aus T-Zellen Bcl10-defizienter Mäuse kann daher der Schluss gezogen werden, dass Bcl10-Degradation zur selektiven Deaktivierung des Antigenrezeptor-abhängigen NF-κB Signalweges führt.

Abbildung 3.35 Bcl10-Degradation führt zur Beendigung der Antigenrezeptor-induzierten NF-κB-Aktivierung. Der Bcl10-Proteinlevel in PMA-vorbehandelten Jurkat T-Zellen ist stark reduziert. Restimulation durch CD3- oder CD3/CD28-Antikörper deckt stark verzögerte IκBα-Degradation im Vergleich zu Referenzzellen auf, was für eine Inhibierung des Antigenrezeptor-vermittelten NF-κB Signalweges steht. Im Gegensatz dazu ist TNFα-induzierte NF-κB-Aktivierung durch PMA-Vorbehandlung nicht beeinflusst.

3.2.7 Jnk induziert Bcl10-Degradation

↓102

Die MAP-Kinase Jnk wurde bis jetzt vor allem mit der Regulation des Transkriptionsfaktors AP-1 in Verbindung gebracht, allerdings ist die genaue Funktion dieses Enzyms in Lymphozyten noch nicht geklärt. Unlängst konnte gezeigt werden, dass Itch in T-Zellen durch Jnk-abhängige Phosphorylierung aktiviert wird und daraufhin die Ubiquitinierung und Degradation der AP-1-Untereinheiten c-Jun und JunB vermittelt [Altman et al, 2000; Gao et al, 2004]. Um zu untersuchen, ob Jnk eventuell über Itch auch in die Regulation der Signal-abhängigen Bcl10-Degradation involviert ist, wurde der Effekt des spezifischen Jnk-Inhibitors SP600125 in PMA/Iono-aktivierten Jurkat T-Zellen analysiert. Die Behandlung der Zellen mit SP600125 führt zu einer deutlichen Stabilisierung von Bcl10 nach T-Zell Aktivierung im Vergleich zu Referenzzellen, die mit equivalenten Mengen an Lösungsmittel inkubiert wurden (Abbildung 3.36 a). Auch die Analyse von Bcl10-Präzipitat im Hinblick auf das Maß an PMA/Iono-induzierter Bcl10-Ubiquitinierung ergibt eine Reduktion des Bcl10-Ubiquitinsignals in SP600125 behandelten Zellen (Abbildung 3.36 b). Diese Ergebnisse deuten an, dass Jnk-vermittelte Prozesse die Ubiquitinierung von Bcl10 beeinflussen. Unter Berücksichtigung der Daten in Bezug auf Itch- und Nedd4-vermittelte Degradation von Bcl10 besteht Anlass zur Annahme, dass Jnk über die Regulation von Itch oder möglicherweise weiterer Ubiquitin-Ligasen die Stabilität von Bcl10 steuert.

Abbildung 3.36 Jnk-Inhibition stabilisiert Bcl10. (a) Inkubation von Jurkat T-Zellen mit dem spezifischen Jnk-Inhibitor SP600125 vor Aktivierung durch PMA/Iono verzögert die Degradation von Bcl10 und (b) verringert das Maß an Bcl10-Ubiquitinierung.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
09.07.2007