4 Diskussion

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Im Fokus dieser Arbeit standen T-Zell spezifische Prozesse, die im Zusammenhang mit den Regulatorproteinen Carma1, Bcl10 und Malt1 die transiente Natur der Antigenrezeptor-vermittelten IKK/NF-κB-Aktivierung begründen. Als Grundlage weiterführender Analysen sollte die Bildung des Carma1/Bcl10/Malt1 (CBM)-Proteinkomplexes unter physiologischen Bedingungen nachgewiesen werden. Die präsentierten Daten belegen, dass Bcl10 und Malt1, die bereits in unstimuliertem Zustand aneinander binden, erst nach T-Zellaktivierung mit Carma1 interagieren. Die Bildung des CBM-Komplexes erfolgt demnach in Abhängigkeit von T-Zell aktivierenden Stimuli. Basierend auf diesen Daten wurde gezeigt, dass CBM-Komplexbildung und simultan auftretende Bcl10-Phosphorylierung von IKKβ, einer der regulatorischen Untereinheiten des IKK-Komplexes, abhängig ist. IKKβ phosphoryliert Bcl10 im C-Terminus, was eine interne Umlagerung der CBM-Komplexkomponenten bewirkt und zur Dämpfung primärer CBM-Komplexaktivität beiträgt. Bei anhaltender Stimulierung der Zellen treten Prozesse in Erscheinung, die verstärkt zur transienten Natur der Antigenrezeptor-induzierten NF-κB-Aktivierung beitragen. Zusätzlich zur Phosphorylierung tritt auch Stimulus-abhängige Bcl10-Ubiquitinierung durch die HECT E3-Ubiquitin-Ligasen Itch und Nedd4 auf. Die Ubiquitinierung dient als Signal für die lysosomale Degradation von Bcl10, wodurch eine wichtige Signalkomponente des CBM-Komplexes der Signalkette funktionell entzogen und eine konstitutive Signalweiterleitung verhindert wird.

4.1  IKKβ Funktion bei der CBM-Komplexbildung

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Die am Besten charakterisierte Funktion des IKK-Komplexes liegt in der Phosphorylierung des NF-κB-Inhibitorproteins IκBα, welches nach anschließender Ubiquitinierung und Degradation transkriptionsaktive NF-κB-Dimere freigibt. Dabei fungiert der IKK-Komplex als zentrale Schaltstelle diverser Rezeptor-initiierter Transduktionskaskaden, die durch unterschiedliche Stimuli aktiviert werden und eintreffende Signale in den Zellkern weiterleiten.

Bisher wurde angenommen, dass in T-Zellen Antigenrezeptor-vermittelte Signale in hierarchischer Weise über den CBM-Komplex an den IKK-Komplex weitergeleitet werden. Die in dieser Arbeit präsentierten Daten modifizieren das gängige Modell. Die Ergebnisse der RNAi-Analysen zeigen, dass IKKβ bereits für die Bildung des CBM-Komplexes benötigt wird. Da unter Verwendung pharmakologischer IKKβ-Inhibitoren die CBM-Komplexbildung ebenfalls unterbunden wurde, übt IKKβ nicht nur eine sterische Funktion bei der Komplexbildung aus, es wird auch die enzymatische Aktivität der Kinase benötigt (s. 3.1.2 und 3.1.3).

Interessanterweise bindet IKKβ konstitutiv an die CBM-Komplexkomponente Malt1
(s. 3.1.2). Malt1 kann daher eine wichtige vernetzende Eigenschaft als Interaktionsschnittstelle zwischen CBM- und IKK-Komplex zugeschrieben werden. Möglicherweise wird die Interaktion beider Komplexe über Malt1 durch Rekrutierung von Casp8 stabilisiert, da gezeigt wurde, dass Casp8 Stimulus-induziert sowohl an den CBM- als auch an den IKK-Komplex bindet [Su et al, 2005]. In einer unabhängigen Studie wird der Kinase PDK1, die simultan den CBM-Komplex, den IKK-Komplex und PKCθ in definierte Mikrodomänen der immunologischen Synapse rekrutiert, eine integrative Funktion bei der Antigenrezeptor-vermittelten Signalweiterleitung zugeschrieben [Lee et al, 2005]. Unter zusätzlicher Berücksichtigung der in dieser Arbeit präsentierten Daten zeichnet sich ein nicht-hierarchisches Modell der Antigenrezeptor-vermittelten Signalweiterleitung ab. Die Gesamtheit der Analysen deutet an, dass nach T-Zell Aktivierung ein Multikomponentenkomplex an der Membran gebildet wird, der für die Weiterleitung NF-κB-spezifischer Signale zuständig ist. Durch funktionelle oder sterische Inaktivierung einer beteiligten Komponente kommt es zu Defekten bei der Bildung des Multikomponentenkomplexes und dadurch zu Defekten bei der Signalweiterleitung.

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Die unerwartete Funktion von IKKβ bei der Bildung des CBM-Komplexes lässt sich am Besten durch Inaktivierungs-bedingte sterische Defekte eines Multikomponentenkomplexes erklären. Über die katalytische Funktion von IKKβ bei der Bildung dieses Komplexes kann zum derzeitigen Zeitpunkt nur spekuliert werden. Möglicherweise findet eine initiale, schwache IKKβ-Aktivierung durch direkte Phosphorylierung einer vorgelagerten, noch unbekannten Kinase statt. Für nachhaltige Signaltransduktion im weiteren Verlauf ist dann die Bildung des Multikomponentenkomplexes Voraussetzung, wobei Signale vom transient aktivierten IKK-Komplex für die Bildung des Multikomponentenkomplexes benötigt werden. Unlängst wurde gezeigt, dass Carma1 nach T-Zell Aktivierung innerhalb einer „Linker“-Region zwischen CC- und PDZ-Domäne phosphoryliert wird [Matsumoto et al, 2005; Sommer et al, 2005]. Weiter wurde postuliert, dass diese Phosphorylierung zu einer Konformationsänderung von Carma1 führt, die die CARD-CARD Interaktion mit Bcl10 erst ermöglicht. Bei einigen dieser Carma1-Phosphoakzeptorstellen handelt es sich um Konsensus-Phosphorylierungssequenzen von PKC, die in vitro von PKCθ phosphoryliert werden. Interessanterweise wurde durch Mutation des Serins 565 zwar die Antigenrezeptor-induzierte NF-κB-Aktivierung beeinträchtigt, allerdings konnte PKCθ in diesem Fall nicht als Kinase identifiziert werden. Es besteht daher die Möglichkeit, dass weitere Kinasen wie IKKβ, die Teil des sich bildenden Multikomponentenkomplexes sind, in die Regulation der phosphorylierungsbasierten Aktivierung von Carma1 eingreifen und dadurch das primär PKCθ–abhängige Signal substanziell verstärken [Rueda und Thome, 2005].

Unter physiologischen Bedingungen wird ein Kostimulationssignal für produktive T-Zell Aktivierung benötigt. Allerdings ist nach wie vor nicht vollständig geklärt, welchen Beitrag das Kostimulationssignal hierbei auf molekularer Ebene leistet [Acuto et al, 2003]. Es könnte daher sein, dass eine schwache transiente IKK/NF-κB-Aktivierung durch TCR Signale ausgelöst wird, die erst in Kombination mit CD28-abhängigen kostimulativen Signalen zur Bildung des CBM/IKK-enthaltenden Multikomponentenkomplexes führt und nachhaltige Signaltransduktion ermöglicht. Diese Theorie wird von der Beobachtung gestützt, dass Antigenrezeptor-vermittelte Signaltransduktion bereits ohne vollständigen Aufbau des Proteinnetzwerks der immunologischen Synapse möglich ist, für nachhaltige Aktivierung jedoch benötigt wird [Lee et al, 2002; Horejsi, 2005].

4.2 Der Zusammenhang zwischen CBM-Komplexbildung und Phosphorylierung von Bcl10

Zeitgleich mit der TCR/CD28-induzierten CBM-Komplexbildung tritt die Phosphorylierung der Komplexkomponente Bcl10 auf (s 3.1.1). In bisherigen Studien konnte zwar eine Phosphorylierung von Bcl10 nach Antigenrezeptor-Aktivierung nachgewiesen werden, sowohl die zugrunde liegenden Mechanismen als auch die physiologische Funktion dieser Modifikation blieben aber unklar. Es wurde vorgeschlagen, dass RIP2 („Receptor Interacting Protein 2“), eine Serin/Threonin Kinase, die über eine N-terminale CARD an Bcl10 bindet, für Bcl10-Phosphorylierung verantwortlich sein könnte [Ruefli-Brasse et al, 2004]. Die stark eingeschränkte Proliferation, IL-2 Produktion und Bcl10-Phosphorylierung in T-Zellen RIP2-defizienter Mäuse unterstützen zwar diese Annahme, der Nachweis direkter Bcl10-Phosphorylierung durch RIP2 konnte jedoch nicht erbracht werden [Chin et al, 2002; Kobayashi et al, 2002].

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Die hier präsentierten Daten legen nahe, dass die Bildung des CBM-Komplexes und die Phosphorylierung von Bcl10 in direktem Zusammenhang stehen. RNAi-vermittelte Inaktivierung von Carma1 und Malt1 führt in beiden Fällen zur Unterdrückung der Antigenrezeptor-induzierten Bcl10 Phosphorylierung. Interessanterweise tritt auch nach Inaktivierung von IKKβ sowohl durch pharmakologische Inhibitoren als auch durch RNAi neben Defekten bei der CBM-Komplex Bildung keine Phosphorylierung von Bcl10 mehr auf (s. 3.1.2 und 3.1.3). Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass entweder als Folge shIKKβ-vermittelter Unterdrückung der CBM-Komplexbildung keine Phosphorylierung von Bcl10 mehr stattfindet oder dass die Kinaseaktivität von IKKβ für die Phosphorylierung von Bcl10 direkt benötigt wird. Es galt daher zu klären, ob die Phosphorylierung von Bcl10 als Signal für die Bildung des CBM-Komplexes fungiert oder ob Bcl10-Phosphorylierung eine Folge der CBM-Komplexbildung ist, vor allem aber inwieweit IKKβ an der Phosphorylierung beteiligt ist.

4.3 IKKβ-Funktion bei der Phosphorylierung von Bcl10

Um die Rolle von IKKβ bei der Phosporylierung von Bcl10 zu beurteilen, wurden Kinasereaktionen mit gereinigtem GSTBcl10 als Substrat durchgeführt (s. 3.1.4). Diese zeigen, dass GSTBcl10 zwar nur sehr schlecht von rekombinantem IKKβ, aber effizient durch IKKβ- und IKKγ-Präzipitat aus aktivierten Jurkat T-Zellen phosphoryliert wird. Im Vergleich dazu wird IκBα sowohl durch rekombinantes IKKβ als auch durch IKK-Präzipitat aus aktivierten Jurkat T-Zellen effizient phosphoryliert. Diese Ergebnisse deuten an, dass für die Phosphorylierung von Bcl10 durch IKKβ die Anwesenheit eines Kofaktors erforderlich ist, der durch IKK-Immunopräzipitation kopräzipitiert, bei der Reinigung des rekombinanten Proteins allerdings abgetrennt wird. Dabei könnte es sich um einen sterisch stabilisierendes Protein ohne eigene enzymatische Aktivität oder aber auch um eine IKKβ-abhängig regulierte, noch unbekannte Kinase handeln. Weiterführende Analysen allerdings stützen die Annahme, dass Bcl10 ein direktes IKKβ-Substrat ist, da ein der Kinasereaktion zugesetzter pharmakologisch wirksamer IKKβ-Inhibitor die Phosphorylierung von Bcl10 verhindert (A. Oeckinghaus, unveröffentlichte Daten).

Die Stimulus-abhängige Phosphorylierung von IκBα und Bcl10 zeigt unterschiedliche in vivo Kinetiken. Während IκBα bereits nach fünf Minuten T-Zell Stimulation fast vollständig degradiert ist, wofür eine noch schnellere Phosphorylierung des Proteins Voraussetzung ist, steigt die Phosphorylierung von Bcl10 innerhalb von 30 Minuten stetig an. Der Grund für die Verzögerung könnte eine geringere Affinität zum Substrat sein, die sich auch in den durchgeführten Kinasereaktionen wiederspiegelt. Während GSTIκBαin vitro bereits von IKK-Präzipitat aus nicht aktivierten Jurkat T-Zellen phosphoryliert wird, tritt eine Phosphorylierung von Bcl10 erst nach Stimulation auf und ist unter Einsatz äquivalenter Mengen an Substrat vergleichsweise schwächer.

4.4 IKKβ phosphoryliert Bcl10 im C-Terminus

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Die Analyse der Bcl10-Proteinsequenz ergab keine offensichtliche Sequenzhomologie zu den Phosphoakzeptorbereichen bekannter IKKβ-Substrate wie den kleinen zytosolischen IκBs oder p105. Eine mögliche Erklärung hierfür ist, dass die Phosphorylierungsstellen aller bisher bekannten IKKβ-Substrate auch als Erkennungssequenzen für den β-TrCP-enthaltenden SCF-Ubiquitin-Ligasekomplex dienen. Da Proteine mit Sequenzhomologie zur IκBα-Phosphorylierungsstelle existieren, die nicht von IKKβ erkannt werden, z.B. β-Catenin oder Vpu, scheint die Aminosäuresequenz der Phosphorylierungsstelle eher durch die Wechselwirkung mit β-TrCP als mit IKKβ bestimmt zu sein. Umgekehrt besteht also durchaus die Möglichkeit, dass IKKβ-Substrate existieren, die zwar phosphoryliert, aber nicht von β-TrCP erkannt werden und daher auch keine direkte Sequenzhomologie zu den erwähnten Substraten aufweisen (Abbildung 4.1).

Bcl10 wird nicht nur durch IKK-Präzipitat aktivierter Jurkat T-Zellen, sondern auch nach Kotransfektion von Bcl10 und IKKβ in HEK293-Zellen effizient phosphoryliert. Dies spricht dafür, dass ein eventuell benötigter Kofaktor in HEK293-Zellen vorhanden ist oder in seiner Funktion durch verstärkte Expression von IKKβ ersetzt werden kann. Daher wurden Koexpressionsstudien zur exakten Bestimmung der IKKβ-abhängigen Phosphoakzeptorstelle von Bcl10 in HEK293-Zellen durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass mehrere Serine im
C-terminalen Bereich von Bcl10 phosphoryliert werden (s. 3.1.4). Erst die Mutation der Serine 134, 136, 138, 141 und 144 zu Alanin unterbindet die Phosphorylierung von Bcl10 (Bcl10 5xA). Die Tatsache, dass mehrere IKKβ-abhängig modifizierbare Phosphoakzeptorserine existieren, spiegelt auch das Migrationsverhalten von phosphoryliertem Bcl10 wieder. Nach IKKβ-Koexpression und T-Zell Aktivierung treten mehrere langsamer migrierende, Phosphatase-sensitive Bcl10-Banden auf, die die Anwesenheit multipler Phosphorylierungsstellen andeuten. Allerdings war es nicht möglich, bestimmten Serinen der relevanten Region einzelne Phospho-Banden zuzuordnen. Es kann daher nicht ausgeschlossen werden, dass die Phosphorylierung einzelner Serine der IKKβ-abhängigen Phosphoakzeptorstelle als Signal für weitere Phosphorylierung an anderen Akzeptorstellen, die nicht im Bereich zwischen Serin 134 und Serin 144 von Bcl10 liegen, dient.

Abbildung 4.1 Sequenzvergleich der Phosphoakzeptorstellen unterschiedlicher IKKβ-Substrate. Die Phosphoakzeptorstellen der IKKβ-Substrate IκBα/ß/γ, p105 und Foxo3a zeigen Sequenzhomologie zur Phosphoakzeptorstelle von β-Catenin und Vpu, die keine IKKβ-Substrate sind, da der relevante Bereich auch als Erkennungssequenz für β-TrCP dient (Konsensus-Sequenz: Ψ = hydophober Rest, X = beliebiger Rest). Die Phosphoakzeptorstelle von Bcl10 zeigt keine Homologie zur einem der anderern Proteine.

4.5 Umbau und negative Regulation des CBM-Komplexes durch Bcl10-Phosphorylierung

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Durch die in dieser Arbeit präsentierten Analysen wird Bcl10 als ein potentielles Substrat von IKKβ identifiziert. Zur Beurteilung der physiologischen Relevanz dieses Prozesses wurden mehrere Beobachtungen herangezogen, die eine duale Funktion von IKKβ in Bezug auf die Wechselwirkung mit dem CBM-Komplex andeuten. Einerseits spielt IKKβ, wie bereits diskutiert, eine essentielle Rolle bei der Bildung des CBM-Komplexes, andererseits sprechen folgende Punkte für eine negativ-regulatorische Wirkung IKKβ-vermittelter Bcl10-Phosphorylierung auf die Aktivität des CBM-Komplexes.

  1. Da Bcl10 nach RNAi-vermittelter Inaktivierung von Carma1 nicht mehr Stimulus-induziert phosphoryliert wird, übernimmt die Phosphorylierung von Bcl10 offensichtlich keine aktivierende Funktion bei der CBM-Komplexbildung (s. 3.1.3). Wäre die Phosphorylierung das Signal für die Bildung des Komplexes, so müsste Bcl10 auch in Abwesenheit von Carma1 phosphoryliert werden, es sei denn, Carma1 rekrutiert die für die Phosphorylierung verantwortliche Kinase. Die Daten sprechen aber eher dafür, dass Malt1 diese Brückenfunktion übernimmt, da IKKβ konstitutiv an Malt1 bindet. Eine derartige vernetzende Rolle von Malt1 wird durch die Beobachtung unterstützt, dass Malt1-Inaktivierung sowohl die Stimulus-induzierte Carma1-Bcl10-Interaktion als auch die Bcl10-Phosphorylierung unterbindet.
  2. Die Bcl10-CARD allein reicht für die Vermittlung der Stimulus-abhängigen Carma1-Bcl10 Interaktion aus (s. 3.1.5). Daher wird der C-terminale Teil des Proteins, der die potentiell relevante Phosphorylierungsstelle enthält, für primäre CBM-Komplexbildung nicht benötigt.
  3. Bcl10 WT und die phospho-defiziente Bcl10-Mutante 5xA besitzen die gleiche Effizienz zur primären Aktivierung von NF-κB, wie durch Analyse rekonstituierter Jurkat T-Zellen nach RNAi-vermittelter Inaktivierung von endogenem Bcl10 gezeigt wurde (s. 3.1.5).
  4. Koexpressionsstudien in HEK293-Zellen ergeben, dass IKKβ-vermittelte Bcl10-Phosphorylierung die Bindungsaffinitäten der CBM-Komplexkomponenten beeinflusst
    (s. 3.1.6). Im Gegensatz zur Bcl10-Carma1-Bindung, die durch Bcl10-Phosphorylierung eher verstärkt wird, führt die Phosphorylierung von Bcl10 zur Schwächung der Bcl10-Malt1-Interaktion. Interessanterweise wurde Malt1 als eine essentielle Komponente bei der Aktivierung des IKK-Komplexes beschrieben [Sun et al, 2004; Zhou et al, 2004]. Eine substantielle Schwächung der Bcl10-Malt1-Bindung zugunsten der Bcl10-Carma1-Bindung könnte daher zu einer Ummodellierung des Komplexes führen, die eine effektive Signalweiterleitung nicht weiter unterstützt. Bcl10-abhängige Oligomerisierung von Malt1 gilt als Voraussetzung für die Aktivierung der Traf6 E3-Ubiquitin Ligase, die wiederum zur Aktivierung des IKK-Komplexes benötigt wird [Sun et al, 2004]. Im Gegensatz dazu wird in einer anderen Studie der CLD von Malt1 eigenständige Ubiquitin-Ligaseaktivität bei der IKK-Aktivierung zugeschrieben [Zhou et al, 2004]. Unabhängig davon, ob Malt1 selbst eine enzymatische Funktion besitzt, ist es denkbar, dass die Schwächung der Bcl10-Malt1-Affinität weitreichende Folgen auf die Oligomerisierungsfähigkeiten der Proteine hat und damit reprimierenden Einfluss auf die IKK/NF-κB-Aktivierung nimmt.
  5. Die Analyse von T-Zellen Bcl10-defizienter Mäuse, die retroviral mit Bcl10 WT oder der phosphorylierungsdefekten Mutante Bcl10 5xA rekonstituiert wurden, unterstützt die

Abbildung 4.2 Mögliche physiologische Funktion der Bcl10-Phosphorylierung. Die kostimulativ-induzierte Bildung des CBM-Komplexes ermöglicht IKK/NF-κB- und T-Zell Aktivierung. Durch simultan auftretende IKKβ-abhängige Phosphorylierung von Bcl10 wird eine Umordnung des CBM-Komplexes eingeleitet, die zur Dämpfung des ursprünglichen Signals führt.

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Hypothese, dass C-terminale Bcl10-Phosphorylierung einen negativ-regulatorischen Einfluss auf die Weiterleitung T-Zell aktivierender Signale hat (s. 3.1.7). Die Rekonstitution der Zellen mit Bcl10 WT gibt einem signifikanten Teil der infizierten Zellen die Fähigkeit zur Antigenrezeptor-induzierten Zytokinproduktion zurück. Da die IL-2/TNFα-produzierende Population der Bcl10 5xA exprimierenden Zellen vergleichsweise größer ist als bei Bcl10 WT exprimierenden Zellen, konnte gezeigt werden, dass die C-terminalen Serine 134/136/138/141/144 von Bcl10 eine wichtige reprimierende Funktion bei der Modulierung der T-Zellantwort spielen.

Zusammengefasst legen diese Beobachtungen folgenden Mechanismus für die Antigenrezeptor-induzierte IKK/NF-κB-Aktivierung nahe (Abbildung 4.2): T-Zell Kostimulation führt zur Phosphorylierung einer Vielzahl Rezeptor-proximaler Signalproteine, wodurch die Aktivierung der Kinasen PDK1, PKCθ und IKKβ eingeleitet wird. Diese Prozesse führen zur Bildung eines Multikomponentenkomplexes an der Membran, der u.a die CBM- und IKK-Subkomplexe beinhaltet. Die Bildung des CBM-Komplexes ermöglicht die nachhaltige Aktivierung des IKK-Komplexes über einen noch unbekannten Mechanismus, der aber wahrscheinlich über Bcl10-abhängige Oligomerisierung von Malt1 verläuft. Um bereits in der Frühphase der T-Zell Aktivierung eine Überreaktion zu vermeiden, werden autoregulative Mechanismen aktiviert. IKKβ ist nicht nur in der Lage, die Signalweiterleitung durch Phosphorylierung von IκBα voranzutreiben. Neben IκBα ist auch die CBM-Komplexkomponente Bcl10 ein Substrat von IKKβ. IKKβ-vermittelte Phosphorylierung von Bcl10 induziert eine Umlagerung innerhalb des CBM-Komplexes, der die Affinität von Bcl10 und Malt1 reduziert und eine Abschwächung der Signalweiterleitung möglicherweise durch verminderte Oligomerisierungstendenz nach sich zieht. Ein derartiger Mechanismus würde auch der beobachteten Kinetik der Bcl10-Phosphorylierung Rechnung tragen, die in den ersten 30 Minuten nach T-Zell Aktivierung kontinuierlich stärker wird.

4.6 Bcl10-Degradation durch HECT E3-Ligasen

Die kostimulativ-induzierte NF-κB-Aktivierung in T-Zellen ist von vergleichsweise transienter Natur. Zusätzlich zur reprimierend wirkenden Phosphorylierung von Bcl10 treten bei nachhaltiger Aktivierung Mechanismen in Erscheinung, die trotz anhaltender Stimulation zur völligen Inhibierung der IKK/NF-κB-Aktivität führen. Dabei stellt sich heraus, dass erneut die CBM-Komplexkomponente Bcl10 als Regulatorelement genutzt wird.

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Die in dieser Arbeit präsentierten Daten zeigen, dass Bcl10 nach T-Zell Aktivierung nicht nur phosphoryliert, sondern auch degradiert wird (s. 3.2.1). Die Kinetik der Bcl10-Degradation ist dabei deutlich langsamer als die der Bcl10-Phosphorylierung. Die Degradation führt zu einer wirksamen Reduktion des zytoplasmatischen Proteinlevels von Bcl10 innerhalb der ersten 45 Minuten nach T-Zell Aktivierung, wodurch das Protein der Signaltransduktionskette als funktioneller Baustein entzogen wird. Dies hat zur Folge, dass eine effiziente Bildung des CBM-Komplexes unterbunden und die Aktivierung der IKK/NF-κB-Signalkette selektiv blockiert wird.

Weiterführende Analysen zeigen, dass Bcl10 vor der Degradation Antigenrezeptor-induziert ubiquitiniert wird, wobei Bcl10 als Substrat der Ubiquitin-Ligasen Itch und Nedd4 identifiziert werden konnte (s. 3.2.3). Beide Enzyme gehören der Familie der Nedd4-ähnlichen HECT E3-Ubiquitin-Ligasen an, die mit der Degradation einer Reihe von Substraten in unterschiedlichen Geweben, aber auch mit T-Zell spezifischen Funktionen in Verbindung gebracht wurden [Ingham et al, 2004; Liu, 2004]. Itch-defiziente Mäuse zeigen massive immunologische Störungen, u.a ausgelöst durch hyperproliferierende T-Zellen. Andere Studien zeigen, dass die Nedd4- und Itch-abhängige Degradation von PKCθ und PLCγ1 zur Auslösung von Anergie beiträgt [Hustad et al, 1995; Fang et al, 2002; Mueller, 2004].

Da Bcl10-Phosphorylierung und Bcl10-Ubiquitinierung simultan auftreten, wurde untersucht, ob IKKβ-vermittelte Phosphorylierung von Bcl10 in Anlehnung an den Mechanismus der Stimulus-induzierten Degradation von IκBα als Signal für anschließende Ubiquitinierung dient. Durch pharmakologische Inhibition der IKKβ-Kinaseaktivität wird zwar die Degradation von IκBα, aber nicht die von Bcl10 verzögert (s. 3.2.2). Dieses Ergebnis belegt, dass Bcl10-Degradation und Bcl10-Phosphorylierung mechanistisch unabhängig voneinander ablaufen. Da die Inaktivierung von IKKβ die Bildung des CBM-Komplexes ebenfalls verhindert, kann vermutet werden, dass Bcl10-Degradation auch unabhängig von der CBM-Komplexbildung stattfindet. Allerdings wird die Degradation von Bcl10 durch Inhibition der PKCθ-Kinaseaktivität verhindert. Zusätzlich besitzt rekombinant exprimiertes PKCθ die Fähigkeit, Bcl10 in Kinasereaktionen mit gereinigten Proteinen effizient zu phosphorylieren (D. Krappmann, unveröffentlichte Beobachtungen). Da jedoch die Koexpression von PKCθ und Bcl10 nicht zur Destabilisierung von Bcl10 führt und Bcl10-Ubiquitinierung nach PKCθ-Koexpression aufgrund von technischen Problemen nicht analysiert werden konnte, ist zum derzeitigen Augenblick keine Aussage über eventuell PKCθ-gesteuerte Bcl10-Phosphorylierung als Signal für Bcl10-Degradation möglich.

4.7 Der lysosomale Abbauweg

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Signal-induzierte Ubiquitinierung von Proteinen kann in unterschiedlichen Varianten auftreten und eine Vielzahl zellulärer Funktionen steuern. Der Ubiquitinrest wird in einem dreistufigen Mechanismus auf ein Lysin des Zielproteins übertragen [Wilkinson, 2000; Pickart, 2001]. Unter physiologischen Bedingungen tritt allerdings nicht nur Mono-, sondern auch Multi- (bis zu vier Ubiquitinreste) und Polyubiquitinierung (ab fünf Ubiquitinresten) auf, deren Verknüpfung über bestimmte Lysine (K29, K48 und K63) von Ubiquitin selbst erfolgt [Pickart, 2000]. Mono- und Multiubiquitinierung werden u.a mit ortsspezifischem intrazellulären Proteintransport und Signal-induzierter Rezeptorendozytose in Verbindung gebracht [Hicke L, 2001]. Weitere Information über das Schicksal eines polyubiquitinierten Proteins ist in der Art der Verknüpfung der Ubiquitinketten gespeichert. Dabei sind K48-Verknüpfungen, die in der Regel zur Degradation des Zielproteins durch das Proteasom führen, und K63-Verknüpfungen, die anstatt Proteindegradation Protein-Protein-Interaktionen und Enzymaktivitäten regulieren, am Besten charakerisiert. Mitglieder der Familie Nedd4-ähnlicher E3-Ubiquitin Ligasen katalysieren sowohl die Übertragung von Monoubiquitin als auch die Bildung K29-, K48- und K63-verknüpfter Polyubiquitinketten, was die Substrate
u. a. für den proteosomalen oder den lysosomalen Abbauweg markiert [Ingham et al, 2004; Moren et al, 2005; Wang und Pickart, 2005].

Zum Nachweis der physiologischen Relevanz der Wechselwirkung zwischen Bcl10 und Itch/Nedd4 wurden die E3-Ligasen mittels RNAi inaktiviert (s. 3.2.5). Dies führt zur Hemmung des Antigenrezeptor-induzierten Bcl10-Proteinabbaus. Weiterführend wurde unter Verwendung pharmakologischer Inhibitoren gezeigt, dass die Stimulus-abhängige Ubiquitinierung von Bcl10 zum lysosomalen Abbau des Proteins führt (s. 3.2.1). Demnach kann davon ausgegangen werden, dass Stimulus-induzierte Degradation von Bcl10 durch Itch- und Nedd4-abhängige Ubiquitinierung in direktem Zusammenhang stehen.

Die in dieser Arbeit durchgeführten Mutationsanalysen deuten an, dass die Nedd4-vermittelte Ubiquitinierung von Bcl10 nicht nur an einem Lysin des Proteins stattfindet (s. 3.2.4). Vielmehr scheinen mehrere Lysine als Ubiquitinakzeptoren in Frage zu kommen. Dabei ist derzeit nicht klar, ob die Akzeptorposition in Abhängigkeit von den eingeführten Mutationen variieren kann oder ob Bcl10 an mehreren Positionen gleichzeitig ubiquitiniert wird. Letztere Variante würde die Möglichkeit einer multiplen Monoubiquitinierung eröffnen, was bei anderen Substraten ebenfalls als Signal für lysosomale Degradation nachgewiesen wurde [Hicke, 2001].

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Hefen exprimieren das Nedd4-Homolog Rsp5p, welches für die Ubiquitinierung, Internalisierung und lysosomale Degradation einer Reihe membranständiger Proteine wie Fur4p verantwortlich ist [Hicke und Riezman, 1996; Fisk und Yaffe, 1999; Rotin et al, 2000; Dunn und Hicke, 2001]. Monoubiquitinierung von Fur4p ist bereits ausreichend für die Internalisierung und Degradation des Proteins. Trotzdem wird Fur4p zeitgleich auch K63-polyubiquitiniert [Galan und Haguenauer-Tsapis, 1997; Springael et al, 1999]. In Anlehnung hieran kann ein ähnliches Szenario für die Ubiquitinierungsprozesse von Bcl10 diskutiert werden. Da nach Itch/Nedd4-Koexpression oder T-Zellaktivierung neben Bcl10-Polyubiquitinierung auch kurzkettige Bcl10-Ubiquitinierung detektiert wird, besteht die Möglichkeit, dass zwischenzeitlich synthetisiertes mono- oder multiubiquitiniertes Bcl10, zumindest teilweise, durch den lysosomalen Abbauweg degradiert wird. Der Grund für eine derartige Regulation könnte sein, dass nach der Aktivierung auftretende Bcl10-Polyubiquitinierung nicht für Protein-Degradation, sondern zur Steuerung von Proteinaffinitäten innerhalb der sich bildenden Proteinkomplexe benötigt wird, monoubiquitiniertes Bcl10 allerdings teilweise degradiert wird, um einen transienten Prozess zu ermöglichen.

Interessanterweise zeigt die Analyse Nedd4-vermittelter Bcl10-Polyubiquitinierung, dass die Verknüpfung der Ubiquitinkette weder über K48 noch über K63 erfolgt (s. 3.2.4). Daher könnte die Bcl10-Polyubiquitinkette auch unter physiologischen Bedingungen über eines der anderen Lysine von Ubiquitin verknüpft sein. Wie bereits erwähnt, sind HECT E3-Ligasen bekannt, die die Bildung K29-verknüpfter Polyubiquitinketten katalysieren, allerdings ist die physiologische Bedeutung dieser Kettenvariante noch nicht eingehend charakerisiert [Mastrandrea et al, 1999; Russell und Wilkinson, 2004]. Diese Beobachtung unterstützt die Annahme, dass Bcl10-Polyubiquitinierung kein degradatives Signal ist.

Eine physische Interaktion zwischen Bcl10 und Itch oder Nedd4 konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht nachgewiesen werden. Dies spricht einerseits für ein Bcl10-assoziiertes Protein wie z.B. Malt1 oder Carma1 als Interaktionsplattform der E3-Ligasen oder andererseits für eine transiente Wechselwirkung, die möglicherweise ausschließlich durch die Aktivität der beteiligten Ligase reguliert wird und keine hohe Affinität zwischen Substrat und Enzym benötigt. In der Regel sind WW-Domänen von Nedd4-ähnlichen E3-Ubiquitin-Ligasen für die Substratinteraktion verantwortlich, die im Fall von Itch und Nedd4 bevorzugt Prolin-enthaltende Motive der Form PPXY oder (phospho-S/phospho-T)P erkennen [Chen und Sudol, 1995; Sudol et al, 1995; Murillas et al, 2002; Ingham et al, 2005]. Allerdings kann nicht ausgeschlossen werden, dass auch Substrate mit anderen Erkennungssequenzen existieren [Ingham et al, 2004]. Bcl10 besitzt im C-Terminus eine Prolin-reiche Region mit zwei kurzen Sequenzmotiven, PR und PPLP, die bereits im Zusammenhang mit anderen Proteinen als WW-Interaktionsmotif genannt wurden [Bedford et al, 1997; Bedford et al, 2000; Sudol und Hunter, 2000]. Die physiologische Relevanz dieser potentiellen WW-Interaktionsstellen von Bcl10 gilt es noch zu untersuchen.

4.8 Der Einfluss von Jnk auf die Stabilität von Bcl10

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T-Zell Kostimulation führt neben den bereits beschrieben Effekten auch zur Aktivierung der MAP-Kinasen Jnk1 und Jnk2, die an der Regulation des Transkriptionsfaktors AP-1 beteiligt sind. Allerdings zeigen Jnk1- oder Jnk2-defiziente Mäuse keine Defekte bei der Aktivierung von T-Zellen aufgrund möglicher funktioneller Redundanzen [Dong et al, 1998; Yang et al, 1998]. T-Zellen aus Jnk1/2–defizienten Mäuse dagegen sind hyperproliferativ und produzieren vergleichsweise mehr IL-2 als WT-Zellen, was auf einen negativen Regulationsmechanismus von Jnk-Kinasen bei der Aktivierung von T-Zellen hinweist [Dong et al, 2000]. Als Erklärung dieser Effekte wurde ein reprimierender Einfluss von Jnk auf die NF-κB-regulierte Aktivität des IL-2 Gens postuliert [Altman et al, 2000]. Interessanterweise könnte die molekulare Verbindung dieser Prozesse über Bcl10 stattfinden. Kürzlich wurde gezeigt, dass die E3-Ligase Itch nach T-Zell Kostimulation durch Phosphorylierung von Jnk aktiviert wird [Gao et al, 2004]. Daraufhin ubiquitiniert Itch die zur AP-1-Familie gehörenden Transkriptionsfaktoren c-Jun und JunB, was deren Degradation zur Folge hat und übermäßige IL-4-Produktion verhindert. Die in dieser Arbeit präsentierten Daten identifizieren Bcl10
als Substrat von Itch und decken zudem eine stabilisierende Wirkung pharmakologischer
Jnk-Inhibitoren auf den Bcl10-Proteinlevel durch Hemmung Stimulus-
induzierter Ubiquitinierung von Bcl10 auf (s. 3.2.7). Es besteht daher die Möglichkeit,
dass Jnk über die Aktivierung von Itch die Stabilität von Bcl10 kontrolliert (Abbildung 4.3).

Abbildung 4.3 Degradation von Bcl10 verhindert konstitutive Signalweiterleitung. Durch Stimulus-induzierte lysosomale Degradation wird die für NF-κB-Signaltransduktion essentielle CBM-Komplexkomponente Bcl10 aus der Signalkette entfernt, woraufhin die Signaltransduktion trotz anhaltender Stimulation zum Erliegen kommt. Zur besseren Übersicht wurde die zeitgleich auftretende Phosphorylierung von Bcl10 nicht eingezeichnet.

Der negativ-regulatorische Effekt von Jnk auf die Antigenrezeptor-induzierte T-Zell Antwort könnte demzufolge molekular neben Itch-abhängiger Degradation von c-Jun und JunB auch auf Itch-abhängiger Degradation von Bcl10 basieren, die zur Reprimierung der IKK/NF-κB-Aktivität und damit auch zur Reduktion der IL-2-Expression führt.

4.9 Reprimierende Regulationsmechanismen nach T-Zell Aktivierung

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Prozesse, die reprimierend auf T-Zell Signaltransduktion wirken, sind von immenser Bedeutung für die T-Zell Homöostase im Körper. Durch die Regulation der Dauer und Intensität der Antigenrezeptor-vermittelten Signale wird eine übermäßige T-Zell Aktivierung und damit schädliche Fehlregulationen der adaptiven Immunantwort vermieden. Erst die Summe vieler einzelner aktivierend und deaktivierend wirkender Regulationsprozesse ermöglicht eine den unterschiedlichsten Bedingungen angepasste T-Zell Antwort [Healy und Goodnow, 1998; Singer und Koretzky, 2002]. In Abbildung 4.4 sind die wichtigsten der bereits bekannten, für die Antigenrezeptor-vermittelte NF-κB-Aktivierung relevanten und reprimierend wirksamen Mechanismen mit denen in dieser Arbeit präsentierten Ergebnissen im Zusammenhang dargestellt.

Ein allgemein beobachteter Mechanismus zur Reprimierung Stimulus-abhängiger NF-κB-Aktivität ist die Induktion des Zielgens IκBα. Verstärkt synthetisiertes IκBα-Protein bewirkt in erster Linie die Dissoziation transkriptionsaktiver NF-κB-Dimere von der DNA, die daraufhin zurück ins Zytoplasma translozieren und für die Zielgen-Aktivierung im Zellkern nicht mehr zur Verfügung stehen [Arenzana-Seisdedos et al, .1995]. Dieser Mechanismus allein scheint bei anhaltender Stimulation allerdings nicht zur Reprimierung der NF-κB-Aktivität auszureichen.

In T-Zellen wurden mehrere Prozesse mit der Reprimierung Rezeptor-proximaler Signalübertragung in Verbindung gebracht. Die Expression des Oberflächenrezeptors
CTLA-4 („Cytotoxic T-Lymphocyte Associated Protein 4“), der wie CD28 an B7-Moleküle auf der APC bindet, wird durch TCR/CD28-Stimulation induziert. Dabei ist die Affinität von CTLA-4 zu den B7-Liganden zehn- bis zwanzigfach höher als die von CD28, allerdings wirken CTLA-4 vermittelte Signale der zuvor durch TCR/CD28-Stimulation eingeleiteten T-Zell Aktivierung entgegen [Walunas et al, 1994; Greenwald et al, 2002]. CTLA-4 defiziente Mäuse sterben daher wenige Wochen nach der Geburt aufgrund massiver Lymphozytenproliferation und Organinfiltration durch aktivierte T-Zellen [Waterhouse et al, 1995; Tivol et al, 1995, Waterhouse et al, 1996]. Mechanistisch ist die inhibierende Wirkung durch CTLA-4 noch nicht aufgeklärt. Es wird angenommen, dass diese einerseits auf einer Kompetition zwischen CD28 und CTLA-4 um kostimulatorische Signale der B7-Proteinfamilie auf der APC beruht, andererseits scheinen aber auch Zell-autonome Prozesse eine Rolle zu spielen, da die Wechselwirkungen zwischen CTLA-4 und Tyrosin-spezifischen Phosphatasen der TCR/CD28-induzierten Welle Rezeptor-proximaler Tyrosinphosphorylierung entgegenwirken [Marengere et al, 1996; Chuang et al, 2000].

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Reprimierende Mechanismen der Antigenrezeptor-induzierten Signaltransduktion setzen auch am TCR direkt an. Kostimulation führt neben T-Zell-aktivierenden Prozessen zur Ubiquitinierung des TCRs, was als Degradationssignal für den lysosomalen Abbauweg dient und die Anzahl aktivierbarer TCRs auf der T-Zell Oberfläche schnell reduziert [Cenciarelli et al, 1992; Valitutti et al, 1997]. Für die Ubiquitinierung des TCRs werden die RING E3-Ubiquitin Ligasen c-Cbl und Cbl-b verantwortlich gemacht. T-Zellen c-Cbl/Cbl-b-defizienter Mäuse zeigen eine ausgeprägte Hypersensitivität gegenüber TCR-Stimulation. Biochemische Analysen ergaben, dass bei diesen Tieren die Aussortierung des TCRs in den lysosomalen Abbauweg gestört ist, wodurch alle internalisierten Rezeptoren zurück an die Membran transportiert werden [Chiang et al, 2000; Bachmaier et al, 2000; Naramura et al, 2002; Duan et al, 2004].

Biochemische und genetische Analysen haben gezeigt, dass es sich bei der CBM-Komplexkomponente Bcl10 um einen spezifischen Regulator der NF-κB-aktivierenden Signalkaskade in T-Zellen handelt. Die in dieser Arbeit präsentierten Daten legen nahe, dass die CBM-Komplexbildung im Zusammenhang mit der Bildung eines Multikomponentenkomplexes, der auch den IKK-Komplex enthält, essentiell für die Aktivierung von NF-κB ist. Daher stellt Bcl10 als Komponente des CBM-Komplexes eine ideale Plattform für die spezifische Regulation der Antigenrezeptor-induzierten NF-κB-Aktivierung dar. Um eine übermäßige Aktivierung von T-Zellen zu verhindern, wird durch IKKβ-abhängige Phosphorylierung von Bcl10 bereits in den ersten Minuten nach Beginn der T-Zell Kostimulation Einfluss auf die Zusammensetzung des CBM-Komplexes genommen. Diese Umordnung scheint eine limitierende Wirkung auf die Signalintensität zu haben. Im weiteren Verlauf anhaltender Stimulation wird Bcl10 durch Itch/Nedd4-vermittelte Degradation aus der Signalkette entfernt, wodurch die CBM-abhängige Signalweiterleitung zusammenbricht. Unter Berücksichtigung der oben erwähnten, bekanntermaßen reprimierend wirkenden Mechanismen liefern diese Erkenntnisse einen weiteren wichtigen Beitrag zum Verständnis der transienten Natur Antigenrezeptor-induzierter NF-κB-Aktivierung in
T-Zellen.

Abbildung 4.4 Reprimierend wirkende Regulationsmechanismen in der Antigenrezeptor-abhängigen
NF-κB-Signalkette. Schematische Darstellung der in dieser Arbeit identifizierten Regulationsmechanismen im Zusammenhang mit bereits bekannten Prozessen. Bcl10 dient als zentraler Regulator der CBM-Komplexaktivität. Kostimulativ induzierte Bcl10-Phosphorylierung hat reprimierenden Einfluss auf die CBM-Komplexaktivität, Ubiquitin-abhängige Bcl10-Degradation trägt zur Abschaltung der NF-κB-Aktivität trotz anhaltender Stimulation bei. Weitere reprimierend wirkende Mechanismen involvieren zytosolisches IκB, Cbl und CTLA-4 (Erläuterungen im Text).

4.10 Ausblick

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Die in dieser Arbeit präsentierten Daten erweitern maßgeblich das Verständnis bezüglich der intrazellulären Prozesse, die zur Steuerung der T-Zell Antwort beitragen. Von großem Interesse wird in Zukunft die Analyse des komplexen Netzwerks an Proteininteraktionen sein, in welches sich der Signal-induziert gebildete CBM-Komplex einfügt. Die Bildung eines Multikomponentenkomplexes an der Membran scheint auch von Proteinen wie IKKβ, denen ursprünglich eine nachgelagerte Funktion in der Signaltransduktionskaskade zugedacht war, abhängig zu sein. Dies wirft die Frage auf, ob bestehende Vorstellungen stufenweiser Signalübertragung in aktivierten T-Zellen neu überdacht werden müssen. Die dynamische Natur dieser Proteinkomplexe lässt weiterhin vermuten, dass noch unbekannte Bindungspartner der bereits identifizierten Komponenten existieren, die Signal-abhängig rekrutiert werden und eine vergleichbar essentielle Rolle bei der Signal-Weiterleitung spielen.

Am Beispiel von Bcl10 wurde gezeigt, dass postranslationale Modifikationen einer einzelnen Netzwerks-Komponente wesentlichen Einfluss auf die Signalübertragung haben können. Dabei wird die Bedeutung negativ wirksamer Regulationsmechanismen für die Steuerung physiolgischer Prozesse zunehmend deutlich. Die Beteiligung von Jnk an der Regulation des CBM-Komplexes unterstreicht, dass einzelne Signalwege nicht mehr getrennt betrachtet werden können. Ein weites Feld für zukünftige Analysen wird daher die Untersuchung der molekularen Kommunikation zwischen ursprünglich separat betrachteten Proteinkaskaden wie den NF-κB-, AP-1- und NF-AT-aktivierenden Signalketten sein.

NF-κB-abhängige Zielgene spielen nicht nur bei der Steuerung der Immunantwort, sondern auch bei einer Vielzahl von anderen Prozessen wie z. B. Apoptose, zellulärer Stress-Antwort oder Zellzyklusregulation eine Rolle und sind mit der Entwicklung von Autoimmunkrankheiten und Tumoren in Verbindung gebracht worden. Dies begründet gegenwärtige Anstrengungen, aufgrund weitgreifender mechanistischer Vernetzung von
NF-κB selektive Ansatzpunkte für therapeutische Strategien zu finden. Die Funktionsaufklärung hochspezifischer Regulatorproteine wie Carma1, Malt1 und Bcl10 eröffnet daher ein breites Spektrum an therapeutischen Interventionsmöglichkeiten. Ein besonderer Aspekt bei der Modulierung definierter Signalwege könnte hierbei den negativ-regulatorischen Schaltkreisen zukommen. So wäre es denkbar, auf Basis der Untersuchungen dieser Arbeit durch pharmakologische Verstärkung Bcl10-degradativer Prozesse den NF-κB-Signalweg in aktivierten T-Zellen selektiv zu hemmen sowie im Gegenzug durch Inhibierung des Bcl10-Proteinabbaus oder der Bcl10-Kinasereaktion die NF-κB-Signaltransduktion nach T-Zell Aktivierung nachhaltig zu verlängern und auf diese Weise die Immunantwort in vivo je nach Bedarf zu beeinflussen. Die Kenntnis der in dieser Arbeit identifizierten Mechanismen könnte daher die Grundlage für die Entwicklung spezifischer Medikamente zur Behandlung von Erkrankungen bilden, die im Zusammenhang mit Fehlregulationen der T-Zell Antwort wie beispielsweise chronischen Entzündungen oder Immunschwäche stehen.


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09.07.2007