HEK293 Zellen wurden auf 60mm oder 100mm Zellkulturschalen unter Verwendung von Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, komplementiert mit 10% fötalem Kälber-Serum („Fetal Calf Serum“, FCS), 1% Penicillin/Streptomycin und 1% Glutamin) kultiviert. Durch Passagieren im Abstand von zwei bis drei Tagen wurden die Zellen in einem Konfluenzbereich zwischen 30% und 80% gehalten. Vor dem Passagieren wurden die Zellen mit PBS gewaschen, durch 3-minütige Inkubation in 1ml Trypsin/EDTA (0,5% Trypsin/0,5% EDTA in PBS) von der Platte abgelöst und in 10ml frischem Kulturmedium aufgenommen, um das Trypsin zu inaktivieren. Nach adäquater Verdünnung mit Kulturmedium wurde die Zellsuspension erneut ausplattiert.

Phoenix-Verpackungszellen wurden auf 150mm Zellkulturschalen unter Verwendung von DMEM (komplementiert mit 10% FCS, 1% Penicillin/Streptomycin, 1% Glutamin und 50µM β-Mercaptoethanol) kultiviert. Die Passagierung erfolgte wie bei HEK293-Zellen unter Verwendung von 2ml Trypsin/EDTA je Platte.

Jurkat T-Zellen wurden in Zellkulturflaschen unter Verwendung von RPMI-Medium (komplementiert mit 10% FCS, 1% Penicillin/Streptomycin und 2% Glutamin) kultiviert. Durch regelmäßiges Verdünnen der Zellsuspension wurden die Zellen in einem Dichtebereich von 0,5x10⁶ bis 1.5x10⁶ Zellen/ml gehalten.

Primäre Suspensionszellen wurden in Zellkulturflaschen unter Verwendung von RPMI Medium (komplementiert mit 10% FCS, 1% Penicillin/Streptomycin, 1% Glutamin und 50µM β-Mercaptoethanol) kultiviert.

Humane PBMCs („Peripheral Blood Mononulear Cells“) wurden aus frisch entnommenen Blut mittels Ficoll-Gradient Zentrifugation aufgereinigt. Hierzu wurde das Blut in einem 50ml Falcongefäß über vorgelegtes Ficoll-Paque geschichtet (Verhältnis 2:1) und danach 30 Minuten mit 2000 rpm („Rounds Per Minute“; ohne Bremse) bei 18°C zentrifugiert. Hierbei sammeln sich die PBMCs in der Interphase zwischen Ficoll und Medium. Die angereicherten Zellen wurden mit einer Pipette abgenommen, zweimal mit PBS gewaschen und in frischem Medium resuspendiert. Humane PBMCs wurden maximal 24 Stunden in Kultur genommen.

Murine CD4⁺ Zellen wurden durch Dyna-Beads-basierte Positivselektion aus der Milz sowie inguinalen, cervicalen und mesenterialen Lymphknoten isoliert. Bei über 95% dieser Zellen handelt es sich um CD4⁺ T-Zellen die mittels anschließender IL-2-induzierter Proliferation weiter angereichert wurden.

Das Dyna-Beads-Protokoll beruht auf der spezifischen Interaktion CD4-exprimierender Zellen mit mCD4-Antikörper beschichteten Partikeln (mCD4-Dyna-Beads). Da diese Partikel zusätzlich magnetisch sind, können gebundene Zellen im Magnetfeld aus einer Zellsuspension abgetrennt werden. Zur Herstellung der Zellsuspension wurden die Milz und Lymphknoten separat in gekühltem Medium zerkleinert, zwischen gläsernen Objektträgern homogenisiert und durch Zentrifugation (5 min, 1000 rpm, 4°C) von Geweberesten befreit. Um rote Blutkörperchen abzutrennen, wurden die Milzzellen einer partiellen Zelllyse unterworfen. Hierfür wurde das Zellpellet in ungekühltem TAC-Lyse Puffer resuspendiert und 5 Minuten auf Eis inkubiert. Unter diesen Bedingungen platzen die Erythrozyten aufgrund verminderter Fähigkeit zur Osmoseregulation. Die verbleibenden Spleenozyten wurden in PBS gewaschen und für die weitere Aufreinigung mit den Lymphozyten vereinigt.

Um die Bindung der Antikörperpartikel an die CD4⁺ Zellen zu ermöglichen wurde die Zellsuspension je eingesetzter Maus für 30 Minuten mit 50µl CD4-Dyna-Beads inkubiert. Unter Verwendung eines „Magnetic Particle Concentraters“ wurden die gebundenen CD4⁺-Zellen anschließend im Magnetfeld von den restlichen Spleenozyten und Lymphozyten abgetrennt. Zur Elution der Zellen von den Beads wurden 20 µl CD4-Detachabeads pro Maus eingesetzt (Abbildung 2.1).

Abbildung 2.1 Dokumentation der Aufreinigung von murinen CD4+-Zellen. FACS-Analyse zur Bestimmung des Anteils von CD4+-Zellen vor und nach der Aufreinigung durch mCD4-Dyna-Beads aus einer Sleenozyten/Lymphozyten-Zellsuspension.

Die gereinigten CD4⁺ Zellen wurden in Medium resuspendiert und für weiterführende Analysen in mCD3- und mCD28-Antikörper-beschichteten Zellkulturflaschen kultiviert. Innerhalb von 30 Minuten setzen sich die Zellen auf dem beschichteten Plastik ab, wonach morphologische Veränderungen auftreten, die die Aktivierung der Zellen wiederspiegeln. Nach 48 Stunden wurden die haftenden Zellen vom Flaschenboden abgeschabt und in frischem Medium mit IL-2 Zusatz (20 U/ml) resuspendiert. Durch verstärkt einsetzende Proliferation der T-Zellen stieg die Zellzahl, durch Zugabe von frischem Medium zwischen 1x10⁶ und 3x10⁶ gehalten, innerhalb der nächsten fünf Tage auf das 10- bis 30-fache an.

Zur Bevorratung über längere Zeiträume wurden Zellen in flüssigem Stickstoff eingefroren. Hierfür wurden entweder HEK293-Zellen einer 75%ig konfluenten 100 mm Schale oder 1x10⁷ Suspensionszellen durch 5-minütige Zentrifugation bei 1000 rpm pelletiert, in 1ml Lagerungsmedium aufgenommen (DMEM/RPMI, 20% FCS, 15% DMSO) und in ein Gefriergefäß abgefüllt. In einem Gefriercontainer wurden die Proben über Nacht langsam auf –80°C abgekühlt und anschließend in flüssigen Stickstoff überführt.

Bei Bedarf wurden die Zellen in einem Wasserbad bei 37°C aufgetaut, zur Entfernung des DMSOs mit PBS gewaschen und in Kultur genommen.

Stimulierende Reagenzien und Inhibitoren wurden dem Medium direkt zugesetzt. Stimulationszeiten oder Inhibitorvorlauf sind aus den Abbildungen der einzelnen Experimente ersichtlich. Zur Aktivierung von T-Zellen wurde auf zwei unterschiedliche Methoden zurückgegriffen (Abbildung 2.2).

1. ernetzung des TCRs (CD3-Untereinheit) und des CD28-Kostimulationsrezeptors unter Verwendung spezifischer Antikörper. Auf diese Weise wird die in vivo durch den
   T-Zell/APC-Kontakt ausgelöste Rezeptoraggregation simuliert, was zur Aktivierung intrazellulärer Antigenrezeptor-spezifischer Signalkaskaden führt.

2. Stimulation durch PMA („Phorbol 12-Myristate 13-Acetate“) oder PMA/Iono (Ionomycin). PMA, ein Phorbolester mit struktureller Ähnlichkeit zu DAG, fungiert in T-Zellen als ein potenter Aktivator von PKCθ und damit auch von NF-κB. Iono hingegen induziert wie IP₃ den Ca²⁺-Influx aus intrazellulären Speicherkompartimenten und nimmt hauptsächlich Einfluss auf die Aktivierung von NF-AT [Isakov und Altman, 1985; Kaibuchi et al, 1985; Truneh et al, 1985].

Abbildung 2.2 Unterschiedliche Stimuli zur Aktivierung Antigenrezeptor-abhängiger Signalwege.
1. Rezeptor-Vernetzung durch spezifische Antikörper (anti-CD3/anti-CD28 und anti-IgG). 2. Direkte Aktivierung PKCθ-abhängiger Signaltransduktion durch PMA-Stimulation oder direkte Aktivierung PKCθ/Ca2+-abhängiger Signaltransduktion durch PMA/Iono-Stimulation.

Falls nicht anders vermerkt, wurden folgende Konzentrationen der Substanzen eingesetzt:

ALLN

50 µg/ml

Bay 11-7085

20 µM

Ionomycin

300 ng/ml

Leupeptin

100 µM

MG132

25 µM

Pepstatin

100 µM

PMA

200 ng/ml

Rottlerin

30 µM

sc-514

100 µM

sp-600125

50 µM

Die Stimulation von Jurkat T-Zellen mit CD3/CD28-Antikörpern wurde in Lösung durchgeführt. CD3/CD28-Vernetzung wurde durch die Zugabe von IgG₁-und IgG_2a-Antikörpern ausgelöst. Folgende Antikörper-Konzentrationen wurden verwendet:

hCD3 (IgG_2a)

1 µg/ml

hCD28 (IgG₁)

5 g/ml

anti-IgG₁

25 µg/ml

anti-IgG_2a

25 µg/ml

Die Stimulation von murinen CD4⁺ T-Zellen erfolgte unter Verwendung immobilisierter Antikörper entweder auf zuvor mit anti-Hamster-Antikörper beschichteten Zellkulturplatten nach Zugabe von mCD3/mCD28 Antikörpern (aus Armenischem/Syrischem Hamster) oder auf Streptavidin-beschichteten Zellkulturplatten (Firma Biotez) nach Zugabe von biotinylierten mCD3/mCD28-Antikörpern. Folgende Antikörper-Konzentrationen wurden verwendet:

mCD3

05 µg/ml

mCD28

1 µg/ml

mCD3 biotinyliert

5 µg/ml

mCD28 biotinyliert

2,5 µg/ml

Die Antikörper-Beschichtung erfolgte durch Inkubation der Platten über Nacht bei 4°C mit in PBS gelösten anti-Hamster-Antikörpern (0,3 mg/ml).

CaPO₄-Kristalle können während des Kristallwachstums in der Lösung enthaltene Plasmid-DNA einschließen. Zellen wiederum sind in der Lage, diese Kristalle aufzunehmen und exprimieren daraufhin die Plasmid-kodierten Proteine (ektopische Expression). Für die Transfektion einer 100mm Kulturschale mit HEK293 wurden folgende Lösungen verwendet:

Lösung 1

10µg Gesamt-DNA

37µl 2M CaCl₂-Lösung (RT)

mit H₂O (RT) auf 300µl auffüllen

Lösung 2

300µl 2xHBS (pH 7,2; RT)

Für die Transfektion einer 100mm Kulturschale mit Phoenix-Zellen wurden folgende Lösungen verwendet:

Lösung 1

20µg Gesamt-DNA

50µl CaCl₂-Lösung (-20°C)

mit H₂O (RT) auf 500µl auffüllen

Lösung 2

500µl 2xHBS (pH 7,0; 4°C)

HEK293- und Phoenix-Zellen wurden 24 Stunden vor der Transfektion durch Passagieren so verdünnt, dass zum Zeitpunkt der Zugabe der Transfektionslösung eine maximale Konfluenz von 40% erreicht war. Zur Herstellung der Transfektionslösung wurde Lösung 2 in einem Reaktionsgefäß vorgelegt. Unter kontinuierlichem Mischen wurde Lösung 1 tröpfchenweise zugegeben. Nach 15-minütiger Inkubation bei RT wurde die Mischung gleichmäßig ins Medium der zu transfizierenden Zellen gegeben. Innerhalb von 30 Minuten sind unter dem Lichtmikroskop kleine Kristalle erkennbar. Für weiterführende Analysen wurden die Zellen mindestens 24 Stunden im Brutschrank kultiviert.

Während der Einwirkung eines elektrischen Impulses auf Zellen in Lösung werden spannungsgesteuerte Zellmembranporen kurzzeitig geöffnet, wodurch extrazelluläre Plasmid-DNA ins Zytoplasma diffundieren kann (Elektoporation). Um Jurkat T-Zellen zu transfizieren, wurden 1x10⁸ Zellen in einer Elektroporations-Küvette (4 mm Spalt) mit 30 µg Gesamt-DNA gemischt und unter Verwendung eines Gene-Pulsers elektroporiert (200 V, 950 µF). Die Zellen wurden nach dem Puls in 10 ml Medium aufgenommen und mindestens 48 Stunden vor der Analyse im Brutschrank kultiviert (Abbildung 2.3).

Abbildung 2.3 Bestimmung der Transfektionsrate elektroporierter Jurkat T-Zellen. Mittels FACS-Analyse wurde die Anzahl grün-fluoreszierender Zellen 48 Std. nach Elektroporation mit 5 µg EGFP-kodierendem Vektor gemessen. Zur Auswertung wurde die Hauptpopulation herangezogenen, als Referenz wurden Leervektor-transfizierte Zellen verwendet. Die Transfektionsrate lag konstant über 70%.

Um zelluläre Proteine immunbiochemischen Analyseverfahren zugänglich zu machen, wurden die Zellen unter Verwendung spezieller Lyse-Puffer lysiert. Je nach Anwendung wurde NP40-Puffer für Immunpräzipitationen, Triton-Puffer für Ubiquitinierungsexperimente und Standard-Lyse-Puffer für allgemeine proteinbiochemische Analysen verwendet (siehe Material und Methoden 2.9). Adhärente Zellen wurden mit bis zu 1ml Lysis-Puffer je 100mm Schale, Suspensionszellen mit bis zu 1ml je 1,5x10⁷ Zellen lysiert. Adhärente Zellen wurden auf der Platte mit PBS gewaschen, in Lyse-Puffer abgeschabt und in ein Eppendorfreaktionsgefäß überführt. Suspensionszellen wurden pelletiert, in ein Eppendorfreaktionsgefäß überführt, mit PBS gewaschen und in Lyse-Puffer resuspendiert. Danach wurden die Zellen zur vollständigen Lyse 20 Minuten bei 4°C inkubiert. Nach 10-minütiger Zentrifugation mit 14000 rpm bei 4°C zur Abtrennung von Zellbruchstücken wurde das Lysat für weiterführende Analysen verwendet.

Die PCR („Polymerase Chain Reaction“) ermöglicht eine Amplifizierung definierter DNA-Abschnitte in einem Thermocycler, ohne auf Klonierungstechniken zurückzugreifen. Durch geeignete Primerwahl lassen sich an den Enden des zu amplifizierenden Bereichs für weiterführende Subklonierung Restriktionschnittstellen einführen. Die verwendete Polymerase DEEP VENT gewährleistet durch zusätzliche Exonucleaseaktivität eine geringe Fehlerfrequenz bei der Produktsynthese. Für eine Standardreaktion wurden folgende Komponenten gemischt und mit H₂O auf 50µl aufgefüllt:

Template-DNA

50 ng

sense- und antisense-Primer

je 50 pmol

dNTPs

je 400 µM

5x DEEP VENT Reaktionpuffer

5 µl

DEEP VENT Polymerase

1 U

Folgendes Thermocycler-Standardprogramm wurde für die Reaktionen verwendet:

1. 96°C, 5 Min.

2. 96°C, 30 Sek.

3. 55°C, 30 Sek.

4. 72°C, 60 Sek. je 1000 Basen zu amplifiziereder DNA, zurück zu 2. (35 x)

5. 72°C, 3 Min.

6. 4°C, Pause

Zur Einführung von Mutationen in Plasmid-kodierte cDNA wurden zwei gestaffelte Mutagenese-PCR-Reaktionen kombiniert. Die erste PCR-Reaktion wurde wie beschrieben durchgeführt, wobei in der Regel ein 3’ cDNA-flankierender Standard-Primer und ein cDNA-interner Mutagenese-Primer zum Einsatz kamen. Je Mutagenese-Primer wurden maximal sechs Basen ausgetauscht, wobei der mutierte Bereich von mindestens zehn nicht-mutierten Basen flankiert war. In der zweiten Mutagenese-PCR wurde das aufgereinigte Produkt der ersten PCR wiederum als Primer mit einem 5’-cDNA-flankierenden Standard-Primer eingesetzt. Für die zweite Mutagenese-PCR wurden folgende Komponenten gemischt und mit H₂O auf 50µl aufgefüllt:

Template-DNA

1 ng

Standard-Primer

50 pmol

Produkt der ersten Mutagenese-PCR

750-facher molarer Überschuss zum Template

dNTPs

je 400 µM

5x DEEP VENT Reaktionpuffer

5 µl

DEEP VENT Polymerase

1 U

Das Produkt der zweiten Mutagenese-PCR, welches die vollständige cDNA inklusive eingeführter Mutationen enthält, wurde aufgereinigt und zur weiteren Verwendung subkloniert.

Zur Auftrennung von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Größe wurden Agarose-Gelelektrophoresen (1% Agarose in TBE) bei 90 V in TBE durchgeführt. Hierfür wurden die Proben in DNA-Probenpuffer aufgenommen und zur Abschätzung der Fragmentgrößen gemeinsam mit einem DNA-Längenstandard aufgetragen.

Die Fähigkeit von Restriktionsnukleasen, DNA Sequenz-spezifisch zu schneiden (Restriktionsspaltung), bildet die Grundlage molekularbiologischer Klonierungsarbeiten. In der Regel erkennen Restriktionsnukleasen spezifische palindromische DNA-Sequenzen und erzeugen 5’- oder 3’-Überhänge („Sticky Ends“) bzw. glatte Enden („Blunt Ends“) durch Hydrolisierung von Phosphodiesterbindungen. Für Restriktionsspaltungen wurden variable Mengen an zu linearisierendem Vektor oder gereinigtem PCR-Fragment und 5 bis 20 ng an Restriktionsenzym eingesetzt. Unter Berücksichtigung der Herstellerangaben wurden sowohl Einzel- als auch Doppelrestriktionspaltungen innerhalb einer Stunde durchgeführt. Die Reaktion wurde entweder durch Hitzeinaktivierung der Enzyme oder durch Gelaufreinigung der DNA beendet.

Zur Fusionierung von linearisierten Vektoren mit kürzeren DNA-Fragmenten wurde T4 DNA-Ligase verwendet. Dabei wurden 100ng an linearisiertem Vektor und ein drei- bis vierfacher molarer Überschuss an Fragment-DNA eingesetzt. In der Regel wurde eine einstündige Inkubation bei RT oder bei 16°C über Nacht durchgeführt, um ausreichende Mengen an ligiertem Produkt zu erhalten.

Bei einfach linearisierten Vektoren wurde vor der Ligation eine Dephosphorylierung des Vektors mit alkalischer Phosphatase („Shrimp Alkaline Phosphatase“, SAP) durchgeführt, um die Religation des Vektors zu unterbinden. Falls nötig, wurde die Funktion von Restriktionsenzymen zuvor durch Hitzeinaktivierung (10-minütige Inkubation bei 70°C) zerstört. Die Zugabe der Phosphatase erfolgte direkt in den Restriktionsansatz, wobei 1 U SAP für die Dephosphorylierung von maximal 5 µg DNA eingesetzt wurde. Der Reaktionansatz wurde eine Stunde bei 37°C inkubiert und danach zur Abtrennung der enthaltenen Enzyme über Affinitätssäulen oder Agarosegele aufgereinigt.

Transformierte Bakterien wurden entsprechend der Plasmid-kodierten Resistenz in Antibiotikum-haltigem LB-Medium über Nacht bei 37°C in einem Warmluftschüttler kultiviert. Die folgenden Antibiotika wurden zur Selektion resistenter Klone in der angegebenen Konzentration verwendet:

Ampicillin

100 µg/ml

Kanamycin

25 µg/ml

Zur Vereinzelung resistenter Klone wurden transformierte Bakterien entsprechend der Plasmid-kodierten Resistenz auf Antibiotikum-haltigem LB/Agar ausgestrichen und über Nacht in einem Brutschrank bei 37°C inkubiert.

Zur Herstellung kompetenter E.coli Bakterien wurde die CaCl₂-Methode verwendet. Hierzu wurden 250ml SOB-Medium mit 10ml einer E.coli-Übernachtkultur (LB/10 µg Tetracyclin) angeimpft und bis zu einer OD₆₀₀ von 0,6 bei 18°C im Schüttler inkubiert. Nach 10-minütiger Kühlung im Eisbad wurden die Bakterien durch Zentrifugation bei 2500xg für 10 Minuten bei 4°C pelletiert. Das Baterienpellet wurde darauf in 80 ml eiskaltem TB-Puffer resuspendiert, weitere 10 Minuten auf Eis gekühlt, erneut zentrifugiert und in 20 ml eiskaltem TB-Puffer aufgenommen. Vor der Aliquotierung wurde die Suspension mit 1,9 ml DMSO (7% Endkonzentration) versetzt. Die Aliquots wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80°C gelagert. Auf diese Weise hergestellte Bakterien zeigten eine Transformationsrate von 1,5x10⁷ Kolonien je µg transformierter DNA.

Kompetente Bakterien wurden durch Hitzeschock-abhängige DNA-Aufnahme transformiert. Hierfür wurden 100 µl eiskalte Bakteriensuspension mit 50 ng Plasmid-DNA gemischt und 10 Minuten auf Eis inkubiert. Nach einem 1-minütigen Hitzeschock im Wasserbad bei 42°C und anschließender kurzer Eiskühlung wurden 900 µl LB-Medium zum Transformationsansatz gegeben. Es folgte eine Inkubation im Schüttler für eine Stunde. Die Bakteriensuspension wurde danach entweder zur Selektion transformierter Klone auf Antibiotikum-enthaltendem LB-Agar ausgestrichen oder zur Vermehrung direkt in Antibiotikum-enthaltendes LB-Medium gegeben und über Nacht im Warmluftschüttler inkubiert.

Für die Aufreinigung kleiner Mengen DNA wurden Affinitätssäulen der Firma Qiagen je nach Anwendung und Vorschrift des Herstellers verwendet.

PCR-Fragmente, DNA-Sonden

QIAquick PCR Purification Kit

Gel Extraktion

QIAquick Gel Extraction Kit

Für die Aufreinigung größerer Mengen DNA wurde das Qiagen Plasmid Purification Maxi Kit verwendet. Hierfür wurden 200 ml bakterielle Übernachtkultur zur Plasmid-DNA Reinigung über tip500 Säulen nach Vorschrift des Herstellers eingesetzt. Die gereinigte DNA wurde in H₂O zu einer Konzentration von 1µg/µl aufgenommen.

Zum Screenen von Bakterienkolonien wurden Plasmid Mini-Präparationen wahlweise unter Verwendung des QiaPrep Spin Mini Kits oder mittels Ethanol-Fällung bakterieller Plasmid-DNA durchgeführt.

Bakterien einer Übernachtkultur (2ml) wurden durch Zentrifugation für eine Minute bei 14000 rpm pelletiert und nach Vorschrift des QiaPrep Spin Mini Kits aufgenommen und lysiert. Dem neutralisierten Lysat wurde dann die doppelte Menge an gekühltem Ethanol
(-20°C) zugesetzt. Die präzipitierte DNA wurde durch 10-minütige Zentrifugation bei 14000 rpm abgetrennt, einmalig ohne Resupendierung mit 70%igem Ethanol (RT) gewaschen, getrocknet und in H₂O aufgenommen.

Oligonukleotide wurden in OligoHybrid-Puffer unter Mischung äquimolarer Mengen hybridisiert. Nach 5-minütigem Aufkochen in einem Heizblock wurde die Reaktionsmischung durch Unterbrechung der Stromzufuhr langsam auf RT abgekühlt.

Zur Auffüllung 5’-überhängender Enden doppelsträngiger DNA-Oligonukleotide wurde das Klenow-Fragment der E.coli Polymerase I verwendet. In einem Standardansatz wurden folgende Komponenten in 25 µl Klenow-Puffer gemischt und 30 Minuten bei 30°C inkubiert:

DNA

200 ng

dCTP, dGTP, dTTP

je 250 µM

α[³²P]dATP

40 µCi

Klenow-Enzym

1 U

Vor Messung der Strahlungsintensität im Szintillationszähler wurde der Reaktionsansatz unter Verwendung des Qiaquick Nucleotide Removal Kits von freien Nukleotiden befreit.

Nukleinsäuren weisen ein charakteristisches Absorptionsspektrum im UV-Bereich mit einem Maximum bei 260 nm Wellenlänge (OD₂₆₀) auf. Verunreinigungen durch Proteine, die ein Absorptionsmaximum bei 280 nm (OD₂₈₀) besitzen, können durch Bestimmung des OD-Quotienten abgeschätzt werden. Hierbei gilt:

1 OD₂₆₀ entspricht 50 µg/µl doppelsträngiger DNA, bzw. 40 µg/µl einzelsträngiger DNA oder RNA, bzw. 20-25 µg/µl Oligonukleotid

der OD-Quotient nicht kontaminierter doppelsträngiger DNA liegt zwischen 1,5 und 2

Zur Sequenzierung von DNA wurde ein Kapillar-Sequenzierungsautomat der Firma Applied Biosystems eingesetzt. DNA-Produkte für die Kapillar-Auftrennung wurden mittels PCR des zu sequenzierenden Templates unter Verwendung der Kettenabbruch-Methode fluoreszenzmarkierter Didesoxynukleotide hergestellt. Für eine Standard-PCR wurden folgende Komponenten gemischt und auf 10 µl mit H₂O aufgefüllt:

DNA

300 ng

Primer

5 pmol

5x Sequencing Puffer

2 µl

ABI PRISM BigDye Terminator v1.1

0,5 µl

Folgendes PCR-Standardprogramm wurde für Sequenzier-Reaktionen verwendet:

• 95°C, 3 Min.

• 95°C, 35 Sek.

• 50°C, 12 Sek., zurück zu 2. (35 x)

• 60°C, 4 Min.

• 4°C, Pause

Die PCR-Produkte wurden per Ethanolfällung aufgereinigt, in Template Suppression Reagent aufgenommen und 2 Minuten zur Denaturierung bei 90°C inkubiert. Die Bedienung des Sequenzier-Automaten erfolgte nach Vorschriften des Herstellers.

Kolorimetrische Bestimmung von Proteinkonzentrationen wurden mit Protein Dye Reagent Concentrate der Firma Biorad durchgeführt. Das Protokoll beruht auf Extinktions-Messung bei 595 nm der nach Herstellerangaben behandelten Proben. Die erhaltenen Werte wurden anschließend zur Abschätzung der effektiven Proteinkonzentration mit BSA-Standardwerten verglichen.

Proteine einer Probe wurden unter Anwendung der diskontinuierlichen SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt. Der Vernetzungsgrad der verwendeten Gele wurde durch Variation der Acrylamid-Prozentigkeit den individuellen Erfordernissen angepasst. Durch Überschichten des Trenngels im nicht polymerisierten Zustand mit Isobutanol wurde ein gleichmäßiger Übergang zwischen Sammel- und Trenngel gewährleistet. In das Sammelgel wurden Kämme mit bis zu 15 Taschen eingepasst. Die Proteinproben wurden in 4x SDS-Probenpuffer aufgenommen und zur Denaturierung vor dem Auftragen 5 Minuten auf 95°C erhitzt. Zur Abschätzung des Molekulargewichts wurden vorgefärbte Molekulargewichts-Standards aufgetragen. Die Elektrophorese wurde in SDS-PAGE Laufpuffer bei maximal 150 V durchgeführt und nach Gelaustritt der Bromphenolblau-gefärbten Lauffront beendet.

Proteine, die durch SDS-PAGE aufgetrennt wurden, können durch direkte Färbung im Gel sichtbar gemacht werden. Hierfür wurden die Gele 30 Minuten in Coomassie-Färbelösung inkubiert und darauf partiell durch mehrmalige Behandlung mit Coomassie-Entfärbelösung entfärbt. Anschließend wurden die Gele in Zellophan auf einem Vakuumtrockner bei 80°C getrocknet.

Zum immunologischen Nachweis wurden per SDS-PAGE aufgetrennte Proteinen auf PVDF-Membranen transferiert (Western Blot). Hierfür wurde unter Verwendung einer Semi-Dry Blotting Apparatur ein Elektrotransfer durchgeführt. Gele und Methanol-aktivierte Membranen wurden beidseitig umgeben von Blotting-Puffer-getränkten Filterpapieren zwischen den Elektroden plaziert und 60 bis 90 Minuten bei RT einer Stromstärke von 60 mA je Gel ausgesetzt.

Der immunologische Nachweis bestimmter Membran-fixierter Proteine erfolgte über Protein-spezifische Erst- und Erstantikörper-spezifische Zweitantikörper. Nach dem Elektrotransfer wurde die Membran mit PBST gewaschen, eine Stunde bei RT mit 3%BSA/PBST blockiert und anschließend mit dem Protein-spezifischen Erstantikörper in 1,5%BSA/PBST entweder eine Stunde bei RT oder über Nacht bei 4°C inkubiert. Um ungebundenen Erstantikörper zu entfernen, wurde die Membran dreimal für 5 Minuten mit PBST gewaschen und dann eine Stunde bei RT mit Erstantikörper-spezifischem Zweitantikörper in 1,5%BSA/PBST inkubiert. Die verwendeten Zweitantikörper sind an Meerrettich-Peroxidase gekoppelt. Während der Peroxidase-Reaktion mit Substrat wird elektromagnetische Strahlung freigesetzt, die durch Auflegen eines Röntgenfilms detektiert wurde. Als Phosphatase-Substratlösung wurde PhototypeR-HRP System unter Berücksichtigung der Herstellerangaben eingesetzt. Die Membran kann nach Ablösen der gebundenen Antikörper durch Inkubation in Stripping-Puffer über Nacht bei 4°C erneut verwendet werden.

Zur Expression rekombinanter Proteine wurden 100 µl kompetente BL21-Bakterien mit pGEX-Expressionsvektor transformiert und Ampicillin-resistente Klone über Platten-Selektion identifiziert. Anschließend wurden ausgehend von einer Einzelkolonie 40 ml Übernachtkultur angelegt, die am nächsten Tag mit 360 ml LB-Medium verdünnt wurde. Bei Erreichen einer OD₆₀₀ von 0,6 wurde die Proteinexpression durch Zugabe von IPTG (0,4 mM Endkonzentration) induziert. Für maximale Ausbeute an GST-Fusionsprotein wurde die Kultur anschließend weitere drei Stunden bei 37°C im Warmluftschüttler inkubiert.

Die Aufreinigung bakteriell-exprimierter GST-Fusionsproteine erfolgte über Glutathion-Sepharose. GST-Fusionsprotein exprimierende Bakterien wurden pelletiert und in Sonifizierungs-Puffer resuspendiert. Auf Eis wurde die Bakteriensuspension zweimal 5 Minuten bei einer Amplitude von 70% in 15-sekündigen Intervallen sonifiziert. Durch anschließende 30-minütige Zentrifugation wurden Zellbruchstücke abzentrifugiert und die im Überstand befindlichen GST-Fusionsproteine durch Inkubation mit Glutathion-Sepharose für zwei Stunden bei 4°C gebunden. Nach Pelletierung der Sepharose wurden die gebundenen Proteine dreimal mit kaltem Sonifizierungs-Puffer gewaschen und schrittweise mit reduziertem Glutathion (20 mM in Sonifizierungspuffer) von der Sepharose-Matrix eluiert.

Immunopräzipitationen werden zur Untersuchung von Protein-Modifikationen oder Protein-Protein Wechselwirkungen durchgeführt. Grundlage für diese Art der Analyse ist der Einsatz eines Protein-spezifischen Antikörpers, der die selektive Abtrennung des zu untersuchenden Proteins aus einem Zelllysat unter Verwendung von Immunglobulin-bindender Sepharose per Fällung erlaubt. Bei weiterführender Analyse des Präzipitats mittels SDS-PAGE und Western Blot besteht die Möglichkeit u.a. Phosphorylierungs- und Ubiquitinierungstatus des gefällten Proteins zu untersuchen, aber auch Protein-Protein-Interaktionen mit assoziierten Bindungspartnern nachzuweisen.

Zelllysate wurden wie beschrieben unter Verwendung von NP40- oder Triton-Lyse-Puffer angefertigt. Zur Abtrennung unspezifisch bindender Komponenten wurde das Lysat ohne Zugabe des Antikörpers 30 Minuten bei 4°C mit 20 µl Protein G-Sepharose Suspension (1:1 in PBS) inkubiert. Die Sepharose wurde anschließend durch Zentrifugation (1 Min., 1000rpm, 4°C) pelletiert und verworfen. Die eigentliche Immunopräzipitation wurde nach Zugabe von bis zu 2 µg Antikörper zum gereinigten Lysat über Nacht bei 4°C durchgeführt. Zur Isolation des Antikörper/Protein-Komplexes wurden am nächsten Tag 30 µl Protein G-Sepharose Suspension addiert. Nach weiteren 30 Minuten Inkubation unter Kühlung wurde die Sepharose durch Zentrifugation pelletiert und dreimal mit eiskaltem Lyse-Puffer gewaschen. Um konstante und möglichst kleine Auftragsvolumina zu erhalten, wurde die Sepharose anschließend unter Verwendung einer Wasserstrahlpumpe trockengesaugt, in 20 µl SDS-Probenpuffer aufgenommen und für 3 Minuten auf 95°C erhitzt. Die erhaltenen Proben wurden weiterführend per SDS-PAGE und Western Blot analysiert.

Zur Analyse der Ubiquitinierung endogener und ektopisch-exprimierter Proteine wurden mindestens 5x10⁶ Jurkat T-Zellen oder eine 100mm Schale HEK293-Zellen je Ansatz pelletiert und wie beschrieben in Triton Lyse-Puffer lysiert. Das erhaltene Lysat wurde in Anwesenheit von NEM (N-Ethylmaleimide, 20 mM) einer Immunopräzipitation unterzogen. Da NEM die Aktivität von deubiquitinierenden Enzymen hemmt, ermöglicht es die Detektion von ubiquitinierten Proteinen mit spezifischen Ubiquitin-Antikörpern nach SDS-PAGE und Westen-Blot.

In in vitro Kinasereaktionen wurde die Fähigkeit von Kinasen analysiert, bakteriell exprimierte und gereinigte Substrate zu phosphorylieren. Hierbei kamen in erster Linie IKK-Immunopräzipitate aus ruhenden und aktivierten Jurkat T-Zellen zum Einsatz, deren Herstellung in NP40 Lyse-Puffer bereits beschrieben wurde. Für in vitro Kinasereaktionen wurden die Präzipitate durch zweimaliges Waschen mit eiskaltem Kinase-Reaktions-Puffer umgepuffert und schließlich in 15µl Kinase-Reaktions-Puffer aufgenommen. Die Kinasereaktion wurde nach Zugabe von 1 µg rekombinantem Substratprotein und 3 µCi [³²P]γATP für 30 Minuten bei 37°C durchgeführt. Durch Zugabe von 4x SDS-Probenpuffer und 5-minütigem Erhitzen auf 95°C wurde die Reaktion gestoppt. Nach Auftrennung der Proteine mittels SDS-PAGE wurde das Gel getrocknet und radioaktiv-markierte Proteine durch Audioradiographie sichtbar gemacht, wobei der Vergleich mit einem Molekulargewichtsstandard die Zuordnung der Signale ermöglicht.

DNA-Fragmente wandern in einem nativen Polyacrylamidgel nach dem Anlegen einer Spannung zur Anode. Bei Anwesenheit DNA-bindender Proteine verlangsamt sich die Laufgeschwindigkeit, es kommt zur Retardierung. Unter Verwendung radioaktiv-markierter DNA-Oligonukleotide lassen sich auf diese Weise geringe Mengen an DNA/Protein-Komplexen sichtbar machen („Electrophoretic Mobility Shift Assay“, EMSA).

Zur Präparation von Gesamtzellextrakten wurden die Zellen in Hochsalz-Puffer lysiert. Für einen Ansatz wurden folgende Komponenten gemischt und auf 20 µl mit H₂O aufgefüllt:

Gesamtprotein

2 bis 4 µg

radioaktiv-markiertes Oligonukleotid

10000 bis 20000 cpm

BSA (10 mg/ml)

0,2 µl (2 µg)

DTT (100 mM)

0,4 µl

Poly(dI-dC) (2µg/µl)

1 µl

2x EMSA-Puffer

10 µl

Der Ansatz wurde 30 Minuten bei RT inkubiert und auf ein natives Polyacrylamidgel (5% Polyacrylamid in TBE) aufgetragen. Die Elektrophorese wurde mit 25 mA in TBE als Laufpuffer durchgeführt. Anschließend wurde das Gel auf Filterpapier vakuumgetrocknet und eine Audioradiographie angefertigt.

Die Expressionsanalyse von Zelloberflächen-Proteinen wurde unter Verwendung Protein-spezifischer Erst- und Fluorophor-markierter Zweitantikörper mittels FACS („Fluorescence Activated Cell Sorting“)-Analyse durchgeführt. Hierfür wurden mindestens 0,2x10⁶ Zellen pelletiert, zweimal mit PBS gewaschen und 15 Minuten auf Eis in Erstantikörperlösung (2 µg/ml in PBS/5%FCS) inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit PBS/5%FCS wurden die Zellen 15 Minuten auf Eis in Zweitantikörperlösung (2 µg/ml in PBS/5%FCS) inkubiert und anschließend erneut gewaschen. Unter Verwendung eines BD FACS-Caliburs wurde die Anzahl spezifisch gefärbter Zellen ausgezählt.

Die Untersuchung intrazellulärer Proteine mittels FACS-Analyse wurde unter Verwendung fixierter und permeabilisierter Zellen nach Behandlung mit Protein-spezifischem Erst- und Fluorophor-markiertem Zweitantikörper durchgeführt. Für die Analyse wurden mindestens 1x10⁶ Jurkat T-Zellen pelletiert und einmal in PBS gewaschen. Die Zellen wurde in 100µl Fix-und-Perm Lösung A aufgenommen und 15 Minuten bei RT inkubiert. Nach einmaligem Waschen in PBS/5%FCS wurden die Zellen in 100 µl Fix-und-Perm Lösung B resuspendiert, Erstantikörper in einer Konzentration von 8 µg/ml zugegeben und 20 Minuten bei RT inkubiert. Daraufhin wurden die Zellen erneut mit PBS/5%FCS gewaschen, in 100 µl PBS/ 5%FCS mit 2 µg/ml anti-Maus-APC Zweitantkörper aufgenommen und anschließend 30 Minuten bei RT inkubiert. Nach dreimaligem Waschen in PBS wurden die Zellen in PBS resuspendiert und die intrazelluläre Proteinfärbung unter Verwendung eines BD FACS-Caliburs analysiert.

Für immunhistochemische Untersuchungen wurden Jurkat T-Zellen auf zuvor mit BD-Celltag behandelten Objektträgern ausgesät und nach dem Anhaften am Träger stimuliert. Danach wurden die Zellen zweimal mit PBS gewachen, 15 Minuten in 4%iger Paraformaldehyd-Lösung fixiert und zur Permeabilisierung 5 Minuten in 0,1%iger Triton X100-Lösung inkubiert. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und zuerst 30 Minuten mit anti-Bcl10 Erstantikörperlösung (333.1, 1:100) und nach zweimaligem Waschen in PBS 30 Minuten mit anti-Maus Zweitantikörperlösung (Indocarbocyanin (Cy3)-markiert, 1:100) behandelt. Nach erneutem Waschen in PBS wurde die intrazelluläre Proteinverteilung von Bcl10 mit einem Axioplan 2 Mikroskop nach Vorschrift des Herstellers analysiert.

Zur Anreicherung von amphotropen Retroviren in Zellkultur-Überständen wurden Phoenix-Verpackungszellen verwendet. Die zu infizierenden Bcl10-defizienten CD4⁺ T-Zellen wurden wie beschrieben unter Verwendung von mCD4-Dyna-Beads aus Bcl10 „Knock Out“-Mäusen aufgereinigt. Zur besseren Übersicht ist die zeitliche Abfolge der einzelnen, zur erfolgreichen Infektion erforderlichen Schritte in Abbildung 2.6 wiedergegeben.

Die Phoenix-Zellen wurden wie beschrieben auf 100mm Schalen transfiziert. Hierfür wurden pMSCV-Vektoren verwendet, die aufgrund einer IRES-Sequenz die simultane Expression von zwei unterschiedlichen Vektor-kodierten Proteinen ermöglichen. Die in dieser Arbeit verwendeten Vektoren vermitteln neben der Expression verschiedener Bcl10-Proteinvarianten die Expression des Oberflächenmarkers Thy1.1 zur Bestimmung der Transfektionseffizienz der Phoenix-Zellen und der Infektionseffizienz der CD4⁺ T-Zellen.

Die Transfektion der Phoenix-Zellen wurde wie beschrieben unter Einsatz der CaPO₄-Methode über 16 bis 24 Stunden im Brutschrank durchgeführt. Zu Beginn der Virusernte wurde die Transfektionslösung abgesaugt und durch 4,5 ml frisches Medium je Schale ersetzt. Anschließend wurden die Zellen weitere 24 bis 48 Stunden im Brutschrank inkubiert. Zur effizienten Infektion der CD4⁺ T-Zellen wurde ausschließlich Überstand von Phoenix-Zellen verwendet, die 48 Stunden nach Transfektionsbeginn zu mindestens 75% Thy1.1 positiv waren (Abbildung 2.4).

Abbildung 2.4 Bestimmung der Transfektionsrate pMSCV/Thy1.1-transfizierter Phoenix-Zellen. Mittels FACS-Analyse wurde die Anzahl Thy1.1-exprimierender Zellen gemessen, die unter Einsatz der CaPO₄-Methode 48 Std. zuvor mit pMSCV/Thy1.1 tranzifiziert worden waren. Für die Analyse wurden nur Zellen der Hauptpopulation herangezogen. Als Referenz dienten Zellen, die nicht transfiziert, aber der Thy1.1-Färbung unterzogen wurden. Die Transfektionsrate der Phoenix-Zellen, deren Überstand für die Infektion der CD4⁺ T-Zellen weiterverwendet wurden, lag bei mindestens 75%.

Um die Infektionsrate der CD4⁺ T-Zellen zusätzlich zu optimieren, wurden zwei Chargen Phoenix-Zellen zur Virusproduktion herangezogen, die an aufeinander folgenden Tagen (Charge 1 an Tag 1 und Charge 2 an Tag 2) transfiziert wurden. Der frische Virusüberstand der beiden Chargen wurde an Tag 4 vereint und direkt für die Infektion der Zielzellen verwendet. Der erstmalig an Tag 3 anfallende Virusüberstand der Charge 1 wurde nicht verworfen, sondern einer 24-stündigen Zentrifugation (6000xg, 4°C) zur Pelletierung der enthaltenen Viruspartikel unterzogen. Das Viruspellet wurde mit den frischen Überständen beider Phoenix-Chargen an Tag 4 unmittelbar vor Beginn der Infektion vereint.

Die zu infizierenden CD4⁺ T-Zellen Bcl10-defizienter Mäuse wurden an Tag 2 aufgereinigt, zu einer Dichte von 2 bis 4x10⁶ Zellen je ml und CD3/CD28-Antikörper-beschichteter Kavität einer 6-well Platte ausgesät und 48 Stunden im Brutschrank inkubiert. Am Tag 4 wurden die Zellen mit 10 ml vereinigtem Virusüberstand überschichtet. Nach Zugabe von Polybrene
(8 µg/ml Endkonzentration) wurde die 6-well Platte bei 2000 rpm und RT eine Stunde zentrifugiert und anschließend weitere 5 Stunden im Brutschrank inkubiert. Danach wurden die Zellen vom Plattenboden abgeschabt, zu einer Konzentration von 1x10⁶ Zellen je ml in IL-2-haltigem Medium (20U/ml) aufgenommen und weitere 3 Tage im Brutschrank kultiviert (Abbildung 2.5).

Abbildung 2.5 Bestimmung der Infektionsrate Bcl10-defizienter CD4⁺ T-Zellen nach Inkubation mit Phoenix-Virusüberstand. Mittels FACS-Analyse wurde die Anzahl Thy1.1 positiver CD4⁺ T-Zellen 48 Std. nach Inkubation mit Phoenix-Virusüberstand gemessen. Die Verpackungszellen wurden zuvor mit pMSCV/Thy1.1 transfiziert und der Überstand wie im Text beschrieben zur Infektion der aufgereinigten CD4⁺ T-Zellen eingesetzt. Die Infektionsrate betrug bis zu 15%. Für die Analyse wurde die Hauptpopulation der Zellen herangezogen.

Die Fähigkeit retroviral rekonstituierter CD4⁺ T-Zellen zur CD3/CD28- oder PMA/Iono-induzierten Produktion der Cytokine IL-2 und TNFα wurde an Tag 3 nach der Infektion gemessen. Die Zytokin-Produktion wurde nach intrazellulärer Färbung von IL-2 und TNFα mittels FACS-Analyse bestimmt. Hierzu wurden die Zellen pelletiert und zweimal mit PBS gewaschen, um exogenes IL-2 zu entfernen. Anschließend wurde die Aktivierung der Zellen durch Ausplattieren in CD3/CD28 Antikörper-beschichteten 6-well-Platten (2x10⁶ Zellen je Kavität) oder durch Zugabe von PMA/Ionomycin eingeleitet. Nach dreistündiger Inkubation wurde Brefeldin A (10µg/ml Endkonzentration), ein Inhibitor des intrazellulären Proteintransports, zugefügt, um die Akkumulation der produzierten Zytokine im endoplasmatischen Reticulum hervorzurufen. Nach weiterer dreistündiger Inkubation wurden die Zellen pelletiert, einmal mit eiskaltem PBS gewaschen und 20 Minuten auf Eis mit anti-Thy1.1-PerCP Antikörper (5 µg/ml) inkubiert. Um überschüssigen Antikörper zu entfernen, wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, anschließend durch 10-minütige Inkubation bei RT in 4% Paraformaldehyd fixiert und erneut zweimal mit PBS gewaschen. Erst die Permeabilisierung der Zellmembranen ermöglicht die intrazelluläre Färbung von Proteinen durch Antikörper. Daher wurden die pelletierten Zellen durch einmaliges Waschen in 0,5% Saponin enthaltenem PBS/1%BSA umgepuffert und in PBS/1%BSA/0,5%Saponin aufgenommen. Nach Zugabe von mFcBlock (5 µg/ml) sowie anti IL-2-APC (2,5 µg/ml) und anti TNFα-PE (2,5 µg/ml) Antikörpern wurden die Zellen 30 Minuten bei RT inkubiert. Nach 3-maligem Waschen mit eiskaltem PBS/1%BSA/0,5%Saponin und 2-maligem Waschen mit eiskaltem PBS wurde die intrazelluläre Färbung der Zellen mit einem BD FACS-Calibur analysiert.

Abbildung 2.6 Schematischer Überblick zur zeitliche Abfolge einzelner Schritte bei der Infektion primärer Bcl10-defizienter CD4⁺ T-Zellen. Zur Infektion der Zellen wurde ein gestaffeltes System mit zwei Chargen transfizierter Phoenix-Verpackungszellen verwendet (nähere Angaben dazu im Text).