Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin

Prof. Dr. Christoph Markschies

• 1 Einleitung

  • 1.1  Molekulare Grundlagen der NF-κB-Aktivierung

    • 1.1.1  Die NF-κB-Familie

    • 1.1.2 Der Mechanismus der NF-κB-Aktivierung

    • 1.1.3 Der IKK-Komplex

  • 1.2 Die Rolle von NF-κB bei der Steuerung der angeborenen Immunantwort

    • 1.2.1  Die proinflammatorische Wirkung von NF-κB

    • 1.2.2 Mechanismus der TLR, IL-1- und TNFα-vermittelten NF-κB-Aktivierung

  • 1.3 Die Rolle von NF-κB bei der Steuerung der erworbenen Immunantwort

    • 1.3.1  Grundlagen der T-Zell Antwort

      • 1.3.1.1  Aktivierung von T-Zellen

      • 1.3.1.2 Der T-Zell/APC Kontakt

      • 1.3.1.3 Kostimulation und Anergie

      • 1.3.1.4 Beeinflussung des Schwellenwerts der T-Zell Aktivierung durch Kostimulation

      • 1.3.1.5 Die Immunologische Synapse

    • 1.3.2 PKCθ-vermittelte Aktivierung von NF-κB in T-Zellen

      • 1.3.2.1  Die Funktion von PKC θ

      • 1.3.2.2 Der Mechanismus der Aktivierung von PKCθ

    • 1.3.3 Carma1, Bcl10 und Malt1, essentielle Regulatoren der Antigenrezeptor-vermittelten NF-κB-Aktivierung

      • 1.3.3.1  Carma1

      • 1.3.3.2 Bcl10

      • 1.3.3.3 Malt1

      • 1.3.3.4 Die Funktion von Carma1, Bcl10 und Malt1 bei der Aktivierung des IKK-Komplexes

  • 1.4 Zielsetzung

• 2 Material und Methoden

  • 2.1  Geräte und Zubehör

  • 2.2 Chemikalien

  • 2.3 Enzyme und Kits

  • 2.4 Bakterien

  • 2.5 Eukaryontische Zelllinien

  • 2.6 Vektoren und Oligonukleotide

  • 2.7 Antikörper

  • 2.8 Rekombinante Proteine

  • 2.9 Puffer und Lösungen

  • 2.10 Zellbiologische Methoden

    • 2.10.1  Kultur adhärenter Zellen

    • 2.10.2 Suspensionskultur von Jurkat T-Zellen

    • 2.10.3 Aufreinigung und Kultur primärer Suspensionszellen

    • 2.10.4 Lagerung des Zellvorrats

    • 2.10.5 Zellstimulation

    • 2.10.6 Transiente Transfektion

    • 2.10.7 Präparation von Zellextrakten

  • 2.11 Nukleinsäuretechniken

    • 2.11.1  PCR

    • 2.11.2 PCR-basierte Mutagenese

    • 2.11.3 Agarose-Gelelektrophorese

    • 2.11.4 Restriktionspaltung

    • 2.11.5 Ligation und Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten

    • 2.11.6 Bakterien-Übernachtkultur

    • 2.11.7 Herstellung kompetenter Bakterien

    • 2.11.8 Transformation kompetenter Bakterien

    • 2.11.9 DNA-Aufreinigung

    • 2.11.10 Hybridisierung von Oligonukleotiden

    • 2.11.11 Radioaktive Markierung von DNA-Enden

    • 2.11.12 DNA-Konzentrationbestimmung

    • 2.11.13 Kapillar-Sequenzierung von DNA

  • 2.12 Proteinchemische und immunologische Methoden

    • 2.12.1  Konzentrationsbestimmung von Proteinen

    • 2.12.2 SDS-PAGE

    • 2.12.3 Coomassie-Färbung

    • 2.12.4 Western Blot

    • 2.12.5 Immunologischer Proteinnachweis

    • 2.12.6 Bakterielle Expression rekombinanter Proteine

    • 2.12.7 Aufreinigung von GST-Fusionsproteinen

    • 2.12.8 Immunopräzipitationen

    • 2.12.9 Nachweis Ubiquitin-konjugierter Proteine

    • 2.12.10  In vitro Kinasereaktionen

    • 2.12.11 Gelretardationsexperiment

    • 2.12.12 Färbung von Oberflächenproteinen

    • 2.12.13 Intrazelluläre Proteinfärbung

    • 2.12.14 Konfokal-Mikroskopie

    • 2.12.15 Retrovirale Infektion Bcl10-defizienter CD4⁺ T-Zellen

    • 2.12.16 Messung intrazellulärer Zytokin-Produktion Bcl10-defizienter CD4⁺ T-Zellen

• 3 Ergebnisse

  • 3.1  Regulierung der CBM-Komplexaktivität durch IKKβ und Phosphorylierung von Bcl10

    • 3.1.1  CBM-Komplexbildung nach T-Zell Aktivierung

    • 3.1.2 Die Bildung des CBM-Komplexes ist abhängig von IKKβ-Kinaseaktivität

    • 3.1.3 IKKβ-Inaktivierung durch RNAi blockiert die Bildung des CBM-Komplexes

    • 3.1.4 IKKβ phosphoryliert Bcl10 im C-Terminus

    • 3.1.5 C-terminale Bcl10-Phosphorylierung ist keine Voraussetzung für primäre NF-κB-Aktivierung

    • 3.1.6  C-terminale Phosphorylierung von Bcl10 reguliert Bindungsaffinitäten innerhalb des CBM-Komplexes

    • 3.1.7 C-terminale Phosphorylierung von Bcl10 schwächt T-Zell Aktivierung

  • 3.2 Regulierung der CBM-Komplexaktivität durch Degradation von Bcl10

    • 3.2.1  Lysosomale Degradation von Bcl10 nach T-Zell Aktivierung

    • 3.2.2 Bcl10-Phosphorylierung ist kein Signal für anschließende Bcl10-Degradation

    • 3.2.3 Bcl10-Ubiquitinierung durch die HECT E3-Ubiquitin-Ligasen Itch und Nedd4

    • 3.2.4 Charakterisierung der Bcl10-Ubiquitinierung

    • 3.2.5 Inaktivierung von Nedd4 und Itch durch RNAi stabilisiert Bcl10

    • 3.2.6 Die Degradation von Bcl10 dient der Deaktivierung TCR-vermittelter NF-κB-Signaltransduktion

    • 3.2.7 Jnk induziert Bcl10-Degradation

• 4 Diskussion

  • 4.1  IKKβ Funktion bei der CBM-Komplexbildung

  • 4.2 Der Zusammenhang zwischen CBM-Komplexbildung und Phosphorylierung von Bcl10

  • 4.3 IKKβ-Funktion bei der Phosphorylierung von Bcl10

  • 4.4 IKKβ phosphoryliert Bcl10 im C-Terminus

  • 4.5 Umbau und negative Regulation des CBM-Komplexes durch Bcl10-Phosphorylierung

  • 4.6 Bcl10-Degradation durch HECT E3-Ligasen

  • 4.7 Der lysosomale Abbauweg

  • 4.8 Der Einfluss von Jnk auf die Stabilität von Bcl10

  • 4.9 Reprimierende Regulationsmechanismen nach T-Zell Aktivierung

  • 4.10 Ausblick

• 5 Zusammenfassung

• Erklärung

• Abkürzungen

• Literaturverzeichnis

• Publikationen

• Lebenslauf

• Danksagung

• Abbildung 1.1 Übersicht zur Familie der NF-κB/IκB Proteinfamilie. Charakteristisches Merkmal der NF-κB Transkriptionsfaktoren ist die „Rel Homology“-Domäne (RHD), welche für DNA-Bindung und Dimerisierung der Rel-Faktoren untereinander verantwortlich ist. Die Transaktivierungsdomäne (TAD) wird für die Aktivierung der Transkription nach DNA-Bindung benötigt. Die inhibitorischen IκB-Proteine binden über die „Ankyrin Repeat“–Domäne (ARD) an den C-terminalen Teil der RHD und verhindern den Kernimport der Rel-Faktoren durch Maskierung des Kernlokalisierungssignals. Innerhalb der „Signal Response“-Domäne (SRD) liegen Phosphoakzeptorstellen, die für die IκB-basierte Regulation von NF-κB von essentieller Bedeutung sind. p100 und p105 bilden Vorläufermoleküle, die proteolytisch zu p50 und p52 prozessiert werden. Wichtige zytosolische IκBs sind IκBα, IκBβ und IκBε, bei MAIL und Bcl3 handelt es sich um nukleäre IκBs.

• Abbildung 1.2 Mechanismus der kanonischen Signal-induzierten NF-κB-Aktivierung. Schematische Abbildung zur Verdeutlichung der zentralen Rolle des IKK-Komplexes bei der kanonischen NF-κB-Aktivierung. Eine Vielzahl extrazellulärer Stimuli führt zur Aktivierung dieses zytoplasmatischen Kinasekomplexes, der daraufhin die NF-κB-bindenden IκB-Inhibitorproteine phosphoryliert. Dies initiiert die Ubiquitin (Ubi)-vermittelte, proteosomale Degradation der IκBs, wodurch transkriptionsaktive NF-κB-Dimere freigegeben werden und in den Zellkern translozieren, um die Transkription spezifischer Zielgene in Gang zu setzen.

• Abbildung 1.3 Domänenstruktur von IKKα und IKKβ. Phosphorylierung innerhalb der Aktivierungsschleife der Kinase-Domäne (KD) aktiviert IKKα und IKKβ. Die „Leucin-Zipper“ (LZ)-Domäne vermittelt Dimerisierung. Über den äußersten C-terminalen Teil der Proteine wird IKKγ, die regulatorische Untereinheit des IKK-Komplexes, gebunden („IKKγ Binding Domain“). Obwohl die „Helix-Loop-Helix“ (HLH)-Domäne zur Aktivierung benötigt wird, ist ihre genaue Funktion unbekannt.

• Abbildung 1.4 Schema zur Verdeutlichung der zentralen Rolle von NF-κB bei der Steuerung der angeborenen Immunantwort. Pathogenerkennung z.B. durch TLRs führt zu einer NF-κB-regulierten Ausschüttung von Entzündungsmediatoren wie IL-1 und TNFα, deren proinflammatorische Wirkung durch Aktivierung weiterer NF-κB-regulierter Zielgene gesteuert wird. Auf diese Weise wird eine Kaskade systemischer Effekte angestoßen, die eine effiziente erste Immunabwehr ermöglicht.

• Abbildung 1.5 Mechanismus der IL-1R/TNFR1-vermittelten IKK-Aktivierung. Rezeptoraktivierung induziert die Oligomerisierung und nachfolgende K63-Autoubiquitinierung von TRAF E3-Ubiquitin-Ligasen. Der Proteinkomplex aus TAB1, TAB2 und TAK1 erkennt diese Polyubiquitinketten, worauf über einen noch unbekannten Mechanismus die Kinase TAK1 aktiviert wird, die IKKβ in der Aktivierungsschleife phosphoryliert.

• Abbildung 1.6 Produktive T-Zell Aktivierung benötigt Kostimulation. APCs präsentieren Antigene über MHC Klasse II Moleküle. Die Erkennung spezifischer Antigene durch den TCR führt nur dann zur klonalen Expansion der T-Zelle, wenn ein Kostimulationssignal durch die Interaktion von B7-Molekülen mit dem Kostimulationsrezeptor CD28 auftritt. Fehlt das Kostimulationssignal, verfällt die T-Zelle in Anergie.

• Abbildung 1.7 Zentrale Funktion von NF-κB bei der T-Zell Aktivierung. Zielgene, die unter der Kontrolle von NF-κB stehen, spielen eine entscheidende Rolle bei der Steuerung von Proliferation, Differenzierung und Lebensdauer aktivierter T-Zellen.

• Abbildung 1.8 Domänenstruktur von PKCθ. Die „C2-like“-Domäne vermittelt Protein-Protein-Interaktionen zwischen PKCθ und Bestandteilen des Zytoskeletts. Die C1-Domäne bindet an DAG und trägt im Allgemeinen zur Aktivierung von PKCs bei. Im C-terminalen Bereich des Proteins liegt die Kinase-Domäne (KD).

• Abbildung 1.9 Schematische Darstellung der CBM-Komplexkomponenten. Die Interaktion zwischen Bcl10 und Carma1 wird durch CARD-CARD Wechselwirkung vermittelt. Malt1 bindet über die Ig-l Domänen an Bcl10 und über die CLD an Carma1.

• Abbildung 1.10 Schematische Darstellung der Prozesse, die nach Kostimulation von T-Zellen zur Aktivierung des IKK-Komplexes führen. PDK1 rekrutiert über PKCθ den IKK-Komplex und über Carma1 den CBM-Komplex an die Membran. Der genaue Mechanismus zur Ubiquitinierung von IKKγ und zur Phosphorylierung von IKKβ ist nicht bekannt, könnte aber in Anlehnung an die TNFR1/IL-1R-aktivierten Signalketten TRAF6 und TAK1 involvieren.

• Abbildung 2.1 Dokumentation der Aufreinigung von murinen CD4+-Zellen. FACS-Analyse zur Bestimmung des Anteils von CD4+-Zellen vor und nach der Aufreinigung durch mCD4-Dyna-Beads aus einer Sleenozyten/Lymphozyten-Zellsuspension.

• Abbildung 2.2 Unterschiedliche Stimuli zur Aktivierung Antigenrezeptor-abhängiger Signalwege.  1. Rezeptor-Vernetzung durch spezifische Antikörper (anti-CD3/anti-CD28 und anti-IgG). 2. Direkte Aktivierung PKCθ-abhängiger Signaltransduktion durch PMA-Stimulation oder direkte Aktivierung PKCθ/Ca2+-abhängiger Signaltransduktion durch PMA/Iono-Stimulation.

• Abbildung 2.3 Bestimmung der Transfektionsrate elektroporierter Jurkat T-Zellen. Mittels FACS-Analyse wurde die Anzahl grün-fluoreszierender Zellen 48 Std. nach Elektroporation mit 5 µg EGFP-kodierendem Vektor gemessen. Zur Auswertung wurde die Hauptpopulation herangezogenen, als Referenz wurden Leervektor-transfizierte Zellen verwendet. Die Transfektionsrate lag konstant über 70%.

• Abbildung 2.4 Bestimmung der Transfektionsrate pMSCV/Thy1.1-transfizierter Phoenix-Zellen. Mittels FACS-Analyse wurde die Anzahl Thy1.1-exprimierender Zellen gemessen, die unter Einsatz der CaPO₄-Methode 48 Std. zuvor mit pMSCV/Thy1.1 tranzifiziert worden waren. Für die Analyse wurden nur Zellen der Hauptpopulation herangezogen. Als Referenz dienten Zellen, die nicht transfiziert, aber der Thy1.1-Färbung unterzogen wurden. Die Transfektionsrate der Phoenix-Zellen, deren Überstand für die Infektion der CD4⁺ T-Zellen weiterverwendet wurden, lag bei mindestens 75%.

• Abbildung 2.5 Bestimmung der Infektionsrate Bcl10-defizienter CD4⁺ T-Zellen nach Inkubation mit Phoenix-Virusüberstand. Mittels FACS-Analyse wurde die Anzahl Thy1.1 positiver CD4⁺ T-Zellen 48 Std. nach Inkubation mit Phoenix-Virusüberstand gemessen. Die Verpackungszellen wurden zuvor mit pMSCV/Thy1.1 transfiziert und der Überstand wie im Text beschrieben zur Infektion der aufgereinigten CD4⁺ T-Zellen eingesetzt. Die Infektionsrate betrug bis zu 15%. Für die Analyse wurde die Hauptpopulation der Zellen herangezogen.

• Abbildung 2.6 Schematischer Überblick zur zeitliche Abfolge einzelner Schritte bei der Infektion primärer Bcl10-defizienter CD4⁺ T-Zellen. Zur Infektion der Zellen wurde ein gestaffeltes System mit zwei Chargen transfizierter Phoenix-Verpackungszellen verwendet (nähere Angaben dazu im Text).

• Abbildung 3.1 Transiente Natur der NF-κB DNA-Bindung nach T-Zell Aktivierung. EMSA-Analyse der NF-κB DNA-Bindungsaktivität nach Stimulation (Stim.) von Jurkat T-Zellen mit PMA, CD3/CD28-Antikörpern und TNFα. T-Zell-aktivierende Agenzien führen zu einer transienten NF-κB-Aktivierung, wobei die beobachtete Resynthese von IκBα allein für die effiziente Repression nicht verantwortlich sein kann.

• Abbildung 3.2 Bildung des endogenen CBM-Komplexes nach T-Zell Aktivierung. (a) CBM-Komplex in PMA/Iono (P/I)- oder CD3/CD28-stimulierten Jurkat T-Zellen: die Analyse von Bcl10-Immunopräzipitat zeigt, dass Bcl10 und Carma1 Stimulus-induziert interagieren. Nach Aktivierung treten langsamer migrierende Bcl10-Modifikationen in Erscheinung. Malt1 bindet konstitutiv an Bcl10. (b) CBM-Komplex in primären Lymphozyten: Die Analysen von Bcl10-Immunopräzipitat aus PMA/Iono-stimulierten humanen Lymphozyten und aus PMA/Iono- oder CD3/CD28-stimulierten murinen CD4+ T-Zellen bestätigen die Ergebnisse aus Jurkat T-Zellen. (c) Bei der Bcl10-Modifikation handelt es sich um Phosphorylierung. Die langsamer migrierenden Bcl10-Banden sind λ-Phosphatase sensitiv. Behandlung mit Hitze-inaktivierter (H.i.) Phosphatase hat keinen Effekt.

• Abbildung 3.3 Die Kinaseaktivität von IKKβ wird zur CBM-Komplexbildung benötigt. Pharmakologische Inhibierung der Kinaseaktivität von PKCθ durch Rottlerin und von IKKβ durch Bay11-7085 oder sc-514 verhindert PMA/Iono-induzierte Bcl10-Carma1-Interaktion und Bcl10-Phosphorylierung. Die inhibitorische Wirkung der Substanzen wurde am Maß der Stabilisierung von IκBα abgeschätzt, die Phosphorylierung von ERK1/2 ist nicht beeinflusst.

• Abbildung 3.4 IKKβ-Assoziation mit dem CBM-Komplex. Analyse der CBM-Komplexinteraktionen in Jurkat T-Zellen durch Immunopräzipitation von Malt1. IKKβ und Malt1 binden konstitutiv aneinander. Nach PMA/Iono-Stimulation bindet verstärkt aktiviertes (phosphoryliertes) IKKβ an den CBM-Komplex .

• Abbildung 3.5 Malt1, Carma1 und IKKβ sind wichtige Regulatoren der NF-κB Signalkaskade in aktivierten T-Zellen. In shMalt1-, shCarma1- und shIKKβ-behandelten Jurkat T-Zellen ist die PMA/Iono-induzierte IκBα-Degradation verzögert, was die Inhibierung des NF-κB-Signalweges nach Inaktivierung der Proteine belegt. shKontr-Behandlung zeigt Effekt.

• Abbildung 3.6 Die Carma1-Funktion wird für die Phosphorylierung von Bcl10 benötigt. Sowohl in shCarma1-behandelten Jurkat T-Zellen (a) wie auch in Carma1-defizienten Jurkat T-Zellen (b, JPM50.6) wird Bcl10 nach T-Zell Aktivierung durch PMA/Iono-Stimulation nicht mehr phosphoryliert.

• Abbildung 3.7 Die Malt1 Funktion wird für die Phosphorylierung von Bcl10 benötigt. Die Inaktivierung von Malt1 mittels shRNA in Jurkat T-Zellen schwächt die Bcl10 Phosphorylierung und unterbindet die Bildung des CBM-Komplexes.

• Abbildung 3.8 Inaktivierung von IKKβ mittels RNAi verhindert Bildung des CBM-Komplexes. (a) Die Analyse von Bcl10-Immunopräzipitat aus Jurkat T-Zellen zeigt, dass die Inaktivierung von IKKβ mittels zweier unterschiedlicher shRNA-kodierender Vektoren in beiden Fällen zu abgeschwächter Bcl10-Carma1-Interaktion und Bcl10-Phosphorylierung nach PMA/Iono Stimulation führt. Auch die CD3/CD28-induzierte CBM-Komplexbildung ist durch IKKβ-Inaktivierung unterbunden. (b) Die Analyse von Malt1-Immunopräzipitat zeigt, dass die Rekrutierung von Malt1 zu Carma1 in shIKKβ-vorbehandelten Jurkat T-Zellen defekt ist. In allen Experimenten ist die ERK1/2-Phosphorylierung durch shRNA-Behandlung unbeeinflusst.

• Abbildung 3.9 IKKγ ist nicht an der Regulation der CBM-Komplexbildung beteiligt. (a) IKKγ Inaktivierung in Jurkat T-Zellen durch RNAi hat keinen Effekt auf PMA/Iono-induzierte Bcl10-Carma1 Interaktion und Bcl10-Phosphorylierung. (b) Vergleichende Analyse von JM 4.5.2 Zellen, die kein IKKγ exprimieren und JM 4.5.2, die mit Epitop-markiertem IKKγ rekonstituiert wurden, zeigt, dass auch genetische Inaktivierung von IKKγ die PMA/Iono-induzierbare Bcl10-Carma1 Interaktion nicht beeinflusst.

• Abbildung 3.10 Bcl10-Phosphorylierung durch IKKβ. (a) Bcl10-Migrationsverhalten aus PMA/Iono-aktivierten Jurkat T-Zellen sowie HEK293-Zellen, die Epitop-markiertes Bcl10 und IKKβ koexprimieren. Das Muster der langsamer migrierenden Banden ähnelt sich stark. (b) Langsamer migrierende Bcl10-Banden, die nach Koexpression von IKKβ in HEK293-Zellen auftreten, sind Phosphatase sensitiv. Behandlung mit Hitze-inaktivierter (H.i.) Phosphatase hat keinen Effekt.

• Abbildung 3.11 Spezifität der Bcl10 Phosphorylierung durch IKKβ. Koexpression der entsprechenden Epitop-markierten Proteine in HEK293-Zellen zeigt, dass neben IKKβ weder IKKα noch PKCθ die Phosphorylierung von Bcl10 induzieren. Die Bcl10-Phosphorylierung durch IKKβ ist abhängig von der Funktionalität der IKKβ-Kinase-Domäne.

• Abbildung 3.12 Phosphorylierung von Bcl10 durch den aktivierten IKK-Komplex. (a) In vitro Kinasereaktion mit gereinigten Proteinen: GSTBcl10 ist im Vergleich mit GSTIκBα 1-53 ein schlechtes Subtrat von rekombinantem IKKβ. (b) In vitro Kinasereaktion mit IKK-Präzipitat aus PMA/Iono-aktivierten Jurkat  T-Zellen: GSTBcl10 wird zwar schwächer als GSTIκBα, aber spezifisch in Abhängigkeit vom Stimulus phosphoryliert. Die Coomassie-Färbungen bestätigen ausgeglichen eingesetzte Proteinmengen.

• Abbildung 3.13 Eingrenzung der Phosphoakzeptor-Region von Bcl10. Koexpressionsstudien in HEK293-Zellen mit C-terminal deletierten Bcl10-Mutanten ergeben, dass die IKKβ-abhängige Phosphorylierung von Bcl10 im C-terminalen Bereich stattfindet, da Bcl10 1-140 nicht, Bcl10 1-149 und Bcl10 1-159 aber wieder phosphoryliert werden. Zur Verdeutlichung dient die schematische Angabe der verwendeten Bcl10-Deletionsmutanten.

• Abbildung 3.14 IKK-Präzipitat phosphoryliert Bcl10 im C-Terminus. In in vitro Kinasereaktionen mit IKKγ- und IKKβ-Präzipitat aus aktivierten Jurkat T-Zellen wird GSTBcl10 WT, aber nicht die C-terminale Deletionsmutante GSTBcl10 1-140 phosphoryliert. Die Coomassie-Färbung dokumentiert die Mengenverhältnisse der eingesetzten Proteine.

• Abbildung 3.15 IKKβ-vermittelte Phosphorylierung von Bcl10 findet an mehreren C-terminalen Serinen statt. (a) Bcl10 5xA wird bei Koexpression von IKKβ nicht mehr phosphoryliert, wobei Bcl10 2xA und Bcl10 3xA jeweils noch restliche Phosphorylierung zeigen. Zur besseren Übersicht dient die schematische Angabe der verschiedenen Bcl10-Punktmutationen. (b) In einer Kinasereaktion unter Verwendung von IKKγ-Präzipitat wird GSTBcl10 5xA signifikant schwächer phosphoryliert als GSTBcl10 WT. Die Coomassie-Färbung bestätigt den Einsatz äquivalenter Proteinmengen in der Kinasereaktion.

• Abbildung 3.16 Die Bcl10-CARD vermittelt Stimulus-induzierte Bcl10-Carma1-Interaktion. Jurkat T-Zellen wurden mit verschiedenen Epitop-markierten Bcl10-Konstrukten transfiziert und hinsichtlich der PMA/Iono-induzierbaren Bcl10-Carma1-Interaktion untersucht. Mutation oder Deletion der C-terminalen Phosphoakzeptor-Region von Bcl10 hat keinen Einfluss auf die primäre CBM-Komplexbildung. Eine funktionale CARD ist dafür unter den beschriebenen experimentellen Bedingungen ausreichend.

• Abbildung 3.17 C-terminale Phosphorylierung von Bcl10 spielt keine Rolle bei primärer NF- B-Aktivierung. shBcl10-Behandlung von Jurkat T-Zellen verursacht die Verzögerung PMA/Iono-induzierter Degradation von I B. Sowohl durch Expression von flagBcl10 WT wie auch durch Expression von flagBcl10 5xA wird die I B -Stabilisierung rückgängig gemacht.

• Abbildung 3.18 Bestimmung der Malt1-Bindungsstelle von Bcl10. Stufenweise Deletion des C-terminalen Bereichs von Bcl10 führt zu einer sukzessiven Schwächung der Bcl10-Malt1-Interaktion. Inaktivierung der CARD von Bcl10 hat keinen Einfluss auf die Bindungsstärke. Zur besseren Übersicht sind die verwendeten Bcl10-Mutanten schematisch mit Kennzeichnung der Carma1- und Malt1-Interaktionsoberflächen angegeben.

• Abbildung 3.19 C-terminale Phosphorylierung von Bcl10 durch IKKβ beeinflusst die Bcl10-Bindungsaffinitäten zu Carma1 und Malt1. (a) Die Phosphorylierung von Bcl10 verstärkt die Bcl10-Carma1-Interaktion. Nach IKKβ-Kotransfektion bindet hauptsächlich C-terminal phosphoryliertes Bcl10 an Carma1. (b) Im Gegensatz dazu schwächt IKKβ-vermittelte Phosphorylierung von Bcl10 die Bcl10-Malt1-Interaktion, da  C-terminal phosphoryliertes Bcl10 nicht mit Malt1 kopräzipitiert und (c) Malt1 deutlich schwächer an  C-terminal phosphoryliertes Bcl10 bindet.

• Abbildung 3.20 Schematische Verdeutlichung der Identifizierung retroviral rekonstituierter, Bcl10-defizienter CD4⁺ T-Zellen. T-Zellen der Bcl10-defizienten Mäuse exprimieren aufgrund des genetischen Hintergrunds der Tiere ausschließlich Thy1.2. Da die erfolgreiche Infektion zur simultanen ektopischen Expression von Bcl10 und Thy1.1 führt, konnten infizierte Zellen anhand von Thy1.1-Oberflächenexpression identifiziert werden. Die Fähigkeit zur Rekonstitution der Antigenrezeptor-vermittelten Zytokinproduktion durch Bcl10-Expression wurde weiterführend analysiert.

• Abbildung 3.21 Mutation der C-terminalen Phosphorylierungsstelle von Bcl10 verstärkt Zytokin-Produktion in primären T-Zellen. CD4⁺ T-Zellen wurden retroviral mit Bcl10 WT, Bcl10 5xA und Bcl10 L41Q rekonstituiert und die intrazelluläre Zytokinproduktion per FACS analysiert. Koexpression von Bcl10 mit dem Oberflächenmarker Thy1.1 ermöglicht die Identifizierung infizierter Zellen. Die Expression von Bcl10 WT und Bcl10 5xA, aber nicht die Expression von L41Q stellt die Fähigkeit der Zellen zur CD3/CD28- oder PMA/Iono-induzierten IL-2- und TNFα-Produktion wieder her. Im Vergleich mit Bcl10 WT ist die Wiederherstellung der Antigenrezeptor-induzierten Zytokinproduktion durch Bcl10 5xA deutlich effektiver. Dies deutet auf eine negativ-regulatorische Funktion der C-terminalen Bcl10-Phosphorylierungsstelle hin. Zur Kontrolle der Spezifität wurden auch nicht infizierte Zellen analysiert, die keine induzierbare Zykokinproduktion zeigen.

• Abbildung 3.22 Die Bcl10 Proteinmenge nimmt bei längerer Stimulationszeit stark ab. Die Analyse der Bcl10-Carma1-Interaktion in Jurkat T-Zellen zeigt, dass nach 90-minütiger PMA/Iono-Stimulation die Menge an direkt präzipitiertem Bcl10-Protein und im Zuge dessen auch die Menge an kopräzipitiertem Carma1-Protein stark abnimmt.

• Abbildung 3.23 T-Zellaktivierung zieht Reduktion der zytoplasmatischen Bcl10-Proteinkonzentration nach sich. (a) Die Analyse von zytoplasmatischen Jurkat T-Zell Extrakten zeigt, dass PMA Stimulation, aber nicht TNFα-Stimulation zur Reduktion der Bcl10-Proteinmenge führt. Die Degradation von IκBα bestätigt die Aktivierung der NF-κB-Signalkette, p65 Proteinlevel dokumentiert ausgeglichene Proteinladung. (b) Auch in primären humanen Lymphozyten und murinen CD4⁺ T-Zellen induziert T-Zellaktivierung durch PMA/Iono oder CD3/CD28-Antikörper die Reduktion der Bcl10-Proteinmenge.

• Abbildung 3.24 Bcl10 wird nicht durch das Proteasom abgebaut. Die Analyse von Jurkat T-Zellextrakt zeigt, dass Vorbehandlung der Zellen mit den proteosomalen Inhibitoren ALLN oder MG132 zwar die PMA-induzierte Degradation von IκBα verhindert, aber keinen Einfluss auf die Stabilität von Bcl10 hat.

• Abbildung 3.25 Lysosomen-Inhibition stabilisiert Bcl10 nach T-Zellaktivierung. (a) Analyse der intrazellulären Proteinlokalisation von Bcl10 in Jurkat T-Zellen. Nach PMA-Stimulation akkumuliert Bcl10 in Lysosomen-ähnlichen Strukturen. (b) Vorbehandlung von Jurkat T-Zellen mit den Protease-Inhibitoren Pepstatin A und Leupeptin verzögert die PMA/Iono-induzierte Reduzierung des Bcl10-Proteinlevels. Dies deutet einen Lysosomen-abhängigen Degradationsmechanismus für Bcl10 an.

• Abbildung 3.26 Phosphorylierung von Bcl10 hat keinen Einfluss auf Proteinstabilität. Die Analyse von Kotransfektionsstudien in CHX-behandelten HEK293-Zellen ergibt, dass die Proteinmengen von C-terminal phosphoryliertem und nicht-phosphoryliertem Bcl10 gleichmäßig abnehmen. Dies bedeutet, dass die Phosphorylierung weder Proteinabbau noch Proteinstabilisierung von Bcl10 begünstigt.

• Abbildung 3.27 Bcl10-Degradation ist nicht abhängig von IKKβ-Kinaseaktivität. Die Analyse von Rottlerin oder Bay 11-7085 vorbehandelten Jurkat T-Zellen zeigt, dass die PMA/Iono-induzierte Bcl10-Degradation von PKCθ-, aber nicht von IKKβ-Kinaseaktivität abhängt. Die unspezifische Bande (*) dokumentiert ausgeglichen geladene Proteinmengen.

• Abbildung 3.28 T-Zell Aktivierung induziert die Ubiquitinierung von Bcl10. Die Analyse von Bcl10-Präzipitat aus PMA- oder CD3/CD28-stimulierten Jurkat T-Zellen ergibt, dass Bcl10 Signal-induziert auch unter stringenten Zelllyse-Bedingungen (1% SDS) ubiquitiniert wird. Dadurch wird die Möglichkeit einer indirekten Ubiquitinierung assoziierter Proteine ausgeschlossen. Längere Belichtungszeit ermöglicht auch die Detektion kurzkettiger Ubiquitinmodifikationen von Bcl10.

• Abbildung 3.29 Bcl10-Ubiquitinierung durch Itch und Nedd4. Koexpression von Itch oder Nedd4 mit  Bcl10 in HEK293-Zellen induziert Bcl10-Ubiquitinierung (a), während Koexpression von Cbl-b keinen  Effekt zeigt (b).

• Abbildung 3.30 Charakterisierung der Bcl10-Ubiquitinierung durch Nedd4 und Itch. Die Analyse von Koexpressionsstudien in (a) HEK293-Zellen und (b) Jurkat T-Zellen zeigt, dass für Bcl10-Ubiquitinierung durch Nedd4 und Itch die E3-Ligaseaktivität und eine funktionale CARD von Bcl10 benötigt werden.

• Abbildung 3.31 Eingrenzung der Bcl10-Ubiquitinierungsstelle. Koexpressionsanalysen von verschiedenen Bcl10-Lysinmutanten und Nedd4 in HEK293-Zellen deuten an, dass die Nedd4-abhängige Ubiquitinierung nicht an einem bestimmten Lysin von Bcl10 stattfindet, sondern der Bcl10 Ubiquitinierungsstatus von der Gesamtzahl verfügbarer Lysine abhängt. Die Lysinmutante Bcl10 K0 wird wie Bcl10 L41Q nicht mehr ubiquitiniert. Zur besseren Übersicht sind die unterschiedlichen Bcl10-Lysinmutanten schematisch, zu Argenin mutierte Lysine in rot (unterstrichen) dargestellt.

• Abbildung 3.32 Polyubiquitinverknüpfung bei Nedd4-abhängiger Bcl10-Ubiquitinierung. Die Koexpressionsanalyse von Bcl10 und Nedd4 mit unterschiedlichen Ubiquitinmutanten in HEK293-Zellen deutet an, dass Nedd4 weder die Bildung von K48- noch von K63-polyubiquitiniertem Bcl10 katalysiert. Zur besseren Übersicht sind die unterschiedlichen Bcl10-Lysinmutanten schematisch dargestellt und zu Argenin mutierte Lysine rot (unterstrichen) markiert.

• Abbildung 3.33 FACS Analyse des PMA-induzierten Bcl10-Proteinabbaus. Intrazelluläre Färbung von Bcl10 und Itch in Jurkat T-Zellen: PMA-Stimulation ruft bei Bcl10 eine Verschiebung der Fluoreszenzintensität zu niedrigeren Werten hervor, die den Proteinabbau von Bcl10 anzeigt. Im Gegensatz dazu verschiebt sich die Fluoreszenz-Intensität für Itch nicht.

• Abbildung 3.34 Inaktivierung von Itch und Nedd4 stabilisiert Bcl10 nach T-Zell Aktivierung. Jurkat T-Zellen wurden mit shRNA-kodierenden Vektoren gegen Itch und Nedd4 transfiziert und die Effekte auf PMA-induzierten Bcl10-Proteinabbau analysiert. (a) Überprüfung der Inaktivierung von Itch und Nedd4 durch shRNA-Transfektion. (b) Einteilung der Hauptpopulation 72 Std. nach Elektroporation: durch Kotransfektion eines EGFP-kodierenden Vektors wurden maximal transfizierte Zellen (Region R1) anhand der Intensität grüner Fluoreszenz identifiziert und von schwach transfizierten Zellen (Region R2) unterschieden. (c) Separate Populationsanalyse Bcl10-gefärbter Zellen aus Region R1 und Region R2: in stark EGFP-positiven Zellen ist die PMA-induzierte Fluoreszenzverschiebung im Vergleich zu pmU6 Leervektor-transfizierten Zellen durch shItch- oder shNedd4-Expression deutlich abgeschwächt. Dies entspricht einer Stabilisierung von Bcl10 nach T-Zell Aktivierung. In schwach EGFP-positiven Zellen dagegen hat die Kotransfektion von shRNAs keinen stabilisierenden Effekt.

• Abbildung 3.35 Bcl10-Degradation führt zur Beendigung der Antigenrezeptor-induzierten NF-κB-Aktivierung. Der Bcl10-Proteinlevel in PMA-vorbehandelten Jurkat T-Zellen ist stark reduziert. Restimulation durch CD3- oder CD3/CD28-Antikörper deckt stark verzögerte IκBα-Degradation im Vergleich zu Referenzzellen auf, was für eine Inhibierung des Antigenrezeptor-vermittelten NF-κB Signalweges steht. Im Gegensatz dazu ist TNFα-induzierte NF-κB-Aktivierung durch PMA-Vorbehandlung nicht beeinflusst.

• Abbildung 3.36 Jnk-Inhibition stabilisiert Bcl10. (a) Inkubation von Jurkat T-Zellen mit dem spezifischen Jnk-Inhibitor SP600125 vor Aktivierung durch PMA/Iono verzögert die Degradation von Bcl10 und (b) verringert das Maß an Bcl10-Ubiquitinierung.

• Abbildung 4.1 Sequenzvergleich der Phosphoakzeptorstellen unterschiedlicher IKKβ-Substrate. Die Phosphoakzeptorstellen der IKKβ-Substrate IκBα/ß/γ, p105 und Foxo3a zeigen Sequenzhomologie zur Phosphoakzeptorstelle von β-Catenin und Vpu, die keine IKKβ-Substrate sind, da der relevante Bereich auch als Erkennungssequenz für β-TrCP dient (Konsensus-Sequenz: Ψ = hydophober Rest, X = beliebiger Rest). Die Phosphoakzeptorstelle von Bcl10 zeigt keine Homologie zur einem der anderern Proteine.

• Abbildung 4.2 Mögliche physiologische Funktion der Bcl10-Phosphorylierung. Die kostimulativ-induzierte Bildung des CBM-Komplexes ermöglicht IKK/NF-κB- und T-Zell Aktivierung. Durch simultan auftretende IKKβ-abhängige Phosphorylierung von Bcl10 wird eine Umordnung des CBM-Komplexes eingeleitet, die zur Dämpfung des ursprünglichen Signals führt.

• Abbildung 4.3 Degradation von Bcl10 verhindert konstitutive Signalweiterleitung. Durch Stimulus-induzierte lysosomale Degradation wird die für NF-κB-Signaltransduktion essentielle CBM-Komplexkomponente Bcl10 aus der Signalkette entfernt, woraufhin die Signaltransduktion trotz anhaltender Stimulation zum Erliegen kommt. Zur besseren Übersicht wurde die zeitgleich auftretende Phosphorylierung von Bcl10 nicht eingezeichnet.

• Abbildung 4.4 Reprimierend wirkende Regulationsmechanismen in der Antigenrezeptor-abhängigen  NF-κB-Signalkette. Schematische Darstellung der in dieser Arbeit identifizierten Regulationsmechanismen im Zusammenhang mit bereits bekannten Prozessen. Bcl10 dient als zentraler Regulator der CBM-Komplexaktivität. Kostimulativ induzierte Bcl10-Phosphorylierung hat reprimierenden Einfluss auf die CBM-Komplexaktivität, Ubiquitin-abhängige Bcl10-Degradation trägt zur Abschaltung der NF-κB-Aktivität trotz anhaltender Stimulation bei. Weitere reprimierend wirkende Mechanismen involvieren zytosolisches IκB, Cbl und CTLA-4 (Erläuterungen im Text).