Aus der Klinik für Neurologie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

Dissertation

Einwanderung und Differenzierung von hämatogenen Zellen zu Mikroglia im adulten Zentralnervensystem – eine qualitative und semiquantitative Studie in Mäusen unter Verwendung des grünen fluoreszierenden Proteins

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Tim Wehner

aus Georgsmarienhütte

Dekan: Prof. Dr. med. J. W. Dudenhausen

Gutachter:
1. Prof. Dr. A. Faissner
2. Prof. Dr. G. Stoll
3. PD Dr. J. Priller

Datum der Promotion:26. Januar 2004

Zusammenfassung

Zur langfristigen Markierung von hämatogenen Zellen wurde Knochenmark mit dem Gen für das grüne fluoreszierende Protein (GFP) transduziert und in bestrahlte Empfängermäuse transplantiert. Die GFP-Expression im peripheren Blut dieser Tiere war über den untersuchten Zeitraum von vier Monaten stabil. Die Hirne der Empfängertiere wurden zu den Zeitpunkten zwei, vier, acht und fünfzehn Wochen nach Knochenmarktransplantation auf die Präsenz von GFP-exprimierenden Zellen untersucht. Es fand sich eine im Zeitverlauf zunehmende Einwanderung und Differenzierung von GFP-exprimierenden hämatogenen Zellen zu ramifizierten Mikrogliazellen in der grauen und weißen Substanz. Nach vier Monaten stammten bis zu ein Viertel aller regionalen Mikrogliazellen aus dem transplantierten Knochenmark. Nach fokaler cerebraler Ischämie wanderten deutlich mehr GFP-positive Zellen aus dem Blut in das ischämische Areal ein und differenzierten zu ramifizierten Mikrogliazellen. Diese Ergebnisse implizieren einen Weg für den Transfer des humanen Immunodefizienzvirus in das Zentralnervensystem und offerieren einen nichtinvasiven Weg, genetisch manipulierte Zellen in das adulte Hirnparenchym einzuschleusen.

Eigene Schlagworte: Knochenmarkchimären, GFP, fokale cerebrale Ischämie, Maus, Mikroglia, Transduktion

Abstract

In order to stably label hematogenous cells, bone marrow was transduced with the gene for the green fluorescent protein (GFP) and transplanted into irradiated recipient mice. The GFP-expression in peripheral blood cells of these animals was stable within the examined time frame of four months. Brains of recipient animals were examined for the presence of GFP-expressing cells at two, four, eight and fifteen weeks after bone marrow transplantation. An increasing migration and differentiation of hematogenous GFP-expressing cells into ramified parenchymal microglia within the white and grey matter was found. After four months, up to quarter of regional microglia were bone-marrow derived. Following focal cerebral ischemia, an increased influx of GFP-positive blood-borne cells differentiating into ramified microglia was observed. These results imply a route for the human immunodeficiency virus into the central nervous system, and they offer a noninvasive approach for the transfer of genetically manipulated cells into the adult brain parenchyma.

Keywords: bone marrow chimera, GFP, focal cerebral ischemia, microglia, mouse, transduction

Meinen lieben Eltern, denen ich alles verdanke

Inhaltsverzeichnis

• 1  Einleitung
  • 1.1 Zellen des Monozyten-Makrophagen-Systems im Gehirn
    • 1.1.1  Mikroglia
      • 1.1.1.1 Identifizierung von Mikrogliazellen
      • 1.1.1.2 Rolle der Mikroglia als Immunsystem des ZNS
      • 1.1.1.3 Herkunft von Mikrogliazellen
    • 1.1.2  Perivaskuläre und meningeale Zellen
  • 1.2  Das Modell der Knochenmarkchimären
  • 1.3  Der ischämische Hirnfarkt
    • 1.3.1 Pathogenese
    • 1.3.2 Das Tiermodell der fokalen cerebralen Ischämie
  • 1.4 GFP als inerter Langzeitzellmarker
• 2  Herleitung einer Aufgabenstellung
• 3  Material und Methoden
  • 3.1 Material
  • 3.2  Generierung GFP-exprimierender Knochenmarkchimären
    • 3.2.1 allgemeine Zellkulturbedingungen
    • 3.2.2 Präparation von Knochenmark
    • 3.2.3  Prästimulationskultur
    • 3.2.4 Kultur der MGirL22Y-produzierenden GP+E86 Zelllinie und Vorbereitung der Kokultur
    • 3.2.5 Kokultur von Knochenmark und GP+E86-Zelllinie
    • 3.2.6 Bestrahlung der Empfängertiere
    • 3.2.7  Aufbereitung der Zellen aus der Kokultur und Transplantation
  • 3.3 Evaluation von Transduktion und Knochenmarktransplantation
    • 3.3.1 Methylzellulosekulturen
    • 3.3.2  Blutentnahme, Durchflusszytometrie und Zellsortierung
  • 3.4 Ischämieexperimente
  • 3.5 Perfusion, Organfixierung und Schneiden
  • 3.6 Immunhistochemie, Mikroskopie und Quantifizierung
• 4  Ergebnisse
  • 4.1 Validierung des Modells
    • 4.1.1 Evaluation der Transduktion
    • 4.1.2 Evaluation der Knochenmarktransplantation
    • 4.1.3 Vergleich der Empfindlichkeit von Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie
    • 4.1.4  Kontrollexperimente
  • 4.2 Untersuchung von Hirnen knochenmarktransplantierter Mäuse
    • 4.2.1 Charakterisierung GFP-exprimierender Zellen im nativen Hirn
  • 4.3 Semiquantitative Bestimmung der Einwanderung von parenchymalen ramifizierten Mikrogliazellen
  • 4.4 Erhöhte Einwanderung von GFP-positiven Mikrogliazellen nach transienter fokaler cerebraler Ischämie
• 5  Diskussion
  • 5.1 Zusammenfassung der Ergebnisse
    • 5.1.1 Einordnung von ramifizierten Mikroglia in das Monozyten-Makrophagen-System und Vergleich zu anderen Studien
    • 5.1.2 Reife Monozyten als wahrscheinliche Vorläuferzellen von Mikrogliazellen
    • 5.1.3 Verhältnis von ramifizierten Mikrogliazellen zu perivaskulären Zellen
  • 5.2 Bedeutung für die Therapie von ZNS-Erkrankungen
  • 5.3  Bedeutung für die Pathogenese der HIV-Enzephalitis
  • 5.4 Unterscheidung hämatogener Zellen von ortsständiger Mikroglia im ZNS
  • 5.5 Methodische Gesichtspunkte
    • 5.5.1 Bestrahlung
    • 5.5.2 Mögliche toxische Effekte von GFP
    • 5.5.3  Vorteile des murinen Stammzellvirus
• 6  Ausblick
• Literatur
• Abkürzungen
• Danksagung
• Lebenslauf
• Publikationsliste
• Eidesstattliche Erklärung

Tabellen

• Tabelle 1: Übersicht über die in der Durchflusszytometrie verwendeten Antikörper. Die Lösung bestand jeweils aus Antikörper in der angegebenen Verdünnung in FACS-Puffer.
• Tabelle 2: Eigenschaften der verwendeten Filter im Durchflusszytometer / Zellsortierer
• Tabelle 3: Übersicht über die verwendeten Primärantikörper. Die Lösung bestand jeweils aus Primärantikörper in der angegebenen Verdünnung + 2 % Ziegenserum in Triton X 0,1 %.
• Tabelle 4: Übersicht über die verwendeten Sekundärantikörper. Die Lösung bestand jeweils aus Sekundärantikörper in der angegebenen Verdünnung in 2 % Kälberserum.
• Tabelle 5: Eigenschaften der verwendeten Filterblöcke im Fluoreszenzmikroskop

Bilder

• Abbildung 1: Transduktion von Knochenmark: (a) Schema des Vektors MGirL22Y. (b) MGirL22Y produzierende GP+E86-Zellen in Kultur. (c) Kokultur von prästimulierten Knochenmarkzellen als Suspension auf bestrahlten MGirL22Y produzierende GP+E86-Zellen. (d) Transduzierte Knochenmarkzellen acht Tage nach Ausplattieren auf Methylzellulose. (b, d) inverse Fluoreszenzmikroskopie, (c) inverse Durchlichtmikroskopie, der Maßstab entspricht in (b) 100 µm, in (c)+(d) 25 µm.
• Abbildung 2: Evaluation der Transplantationseffizienz. (a) Durchflusszytometrisch ermittelter Anteil GFP-exprimierender Zellen in einzelnen Zelllinien des Blutes; gezeigt sind Mittelwert und Standardabweichung von jeweils vier Tieren. (b) Milz eines transplantierten Tieres 15 Wochen nach KMT. Fluoreszenzmikroskopie, der Maßstab entspricht 50 µm.
• Abbildung 3: Durchflusszytometrische Analysen von peripherem Blut knochenmarktransplantierter Mäuse. Dargestellt sind relative Fluoreszenzen. Erläuterung im Text.
• Abbildung 4: Repräsentative Beispiele verschiedener GFP-exprimierender Zellen im Hirn einer Maus 15 Wochen nach Transplantation von GFP-transduziertem KM. (a, b) Langgestreckte Zellen ohne Verzweigungen fanden sich entlang von Blutgefäßen und in den Hirnhäuten. (c) Amöboide Zellen mit wenigen kurzen Fortsätzen erschienen im Plexus choroideus. (d) Mehrfach verzweigte Zellen im Hirnparenchym. (a-d) Fluoreszenzmikroskopie, der Maßstab entspricht jeweils 20 µm.
• Abbildung 5: Immunzytochemische Charakterisierung von GFP-exprimierenden Zellen im Hirnparenchym. (a, d) GFP-positive ramifizierte Zellen. (b, e) Die Zellen exprimieren F4/80 (b) bzw. Iba1 (e), hier visualisiert mit Texas Red. (c, f) Die Übereinanderlagerung von (a) und (b) bzw. (d) und (e) demonstriert, dass es sich jeweils um dieselbe Zelle handelt. Konfokalmikroskopie, der Maßstab entspricht jeweils 10 µm.
• Abbildung 6: Die dreidimensionale Rekonstruktion aus konfokalen Einzelaufnahmen einer GFP-exprimierenden Zelle im Hirnparenchym demonstriert ihre feinen Verästelungen. Der Maßstab entspricht 10 µm.
• Abbildung 7: Mehrere GFP-exprimierende ramifizierte Mikrogliazellen im Cerebellum fünfzehn Wochen nach KMT. Fluoreszenzmikroskopie, der Maßstab entspricht 20 µm.
• Abbildung 8: Semiquantitative Analyse der regionalen Verteilung von GFP-positiven parenchymalen Mikrogliazellen zu verschiedenen Zeitpunkten. Angegeben ist der Anteil GFP-positiver an allen Iba1-positiven parenchymalen Mikrogliazellen. Jeder schwarze Punkt repräsentiert den Anteil pro Region und individuellem Tier; der entsprechende grüne Punkt den um den Faktor 100 : [Anteil GFP-positiver Mac-1-positiver Zellen im peripheren Blut] extrapolierten Wert. Zwei Wochen nach KMT fanden sich noch keine GFP-exprimierenden Mikrogliazellen im Hirnparenchym. Insgesamt wurden über 45.000 Zellen gezählt.
• Abbildung 9: Mikrogliale Differenzierung von GFP-exprimierenden hämatogenen Zellen nach fokaler cerebraler Ischämie. (a) 24 Stunden nach Ende der Ischämie markiert ein GFP-positives Infiltrat runder Zellen das geschädigte Areal. (b) In der kontralateralen Hemisphäre finden sich keine GFP-exprimierenden Zellen. (c-h) Immuncytochemische Charakterisierung von Zellen im Infiltrat. (c, f) GFP markiert hämatogene Zellen; (d, g) Iba1 markiert Monozyten und Mikroglia. Nach 24 Stunden exprimiert keine GFP-positive Zelle Iba1 (e, Überlagerung von c und d), was darauf hinweist, dass das Infiltrat zu diesem Zeitpunkt aus nicht-monozytären Zellen besteht. Nach 14 Tagen hingegen sind einige der eingewanderten GFP-positiven Zellen zu Iba1 exprimierenden Mikroglia differenziert (h, Überlagerung von f und g). Der Pfeil markiert eine parenchymale Mikrogliazelle, die Pfeilspitze eine perivaskuläre Zelle. (a, b) Fluoreszenzmikroskopie, (c-h)  Konfokalmikroskopie, der Maßstab entspricht in (a)+(b) 20 µm, in (c)-(h) 10 µm.