Weichert, Wilko : Fokal segmentale Glomerulosklerose und juxtaglomerulärer Apparat der hypertensiven “fawn-hooded“ Ratte

Aus der Anatomie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin


Dissertation
Fokal segmentale Glomerulosklerose und juxtaglomerulärer Apparat der hypertensiven “fawn-hooded“ Ratte

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

vonWilko Weichert,
aus Tübingen

Dekan: Prof. Dr. J. W. Dudenhausen

Gutachter:
1. Prof. Dr. S. Bachmann
2. Prof. Dr. H. Pavenstädt
3. Prof. Dr. H.-J. Gröne

Datum der Promotion: 17.12.2001

Abstract (deutsch)

In dieser Arbeit wurden 8 und 16 Wochen alte, hypertensive „fawn-hooded“ Ratten (FHH8, FHH16) mit genetisch ähnlichen 16 Wochen alten „fawn-hooded“ Ratten mit nur geringgradiger Blutdruckerhöhung (FHL16, Kontrollgruppe) hinsichtlich der pathologisch-anatomischen Veränderungen der Nierenmorphologie und hinsichtlich der Expression von NO-Synthase-1 (NOS1), Cyclooxygenase-2 (COX-2) und Renin am juxtaglomerulären Apparat (JGA) verglichen. Die histopathologischen Veränderungen bei FHH16 umfassten die klassischen Schädigungszeichen der fokal segmentalen Glomerulosklerose (FSGS) mit fokaler Überexpression von Kollagen IV und eine moderate Arteriolopathie. Bei FHH8 ließen sich, wie bei FHL16 keine morphologischen Schädigungen nachweisen. Die NOS1-Aktivität an der Macula densa, untersucht mittels der NADPH-Diaphorasereaktion und die NOS1 mRNA Expression waren bei FHH8 (+153 and +88%; P < 0.05) und FHH16 (+93 and +98%; P < 0.05) im Vergleich zu FHL16 signifikant erhöht. Eine gleichgerichtete signifikante Erhöhung zeigte sich für die COX-2-Expression an der Macula densa von FHH8 (+166%; P < 0.05) und FHH16 (+157%; P < 0.05) im Vergleich zu FHL16. Des weiteren ließ sich eine signifikante, ebenfalls gleichgerichtete Überexpression von Renin in der afferenten Arteriole auf Protein- und mRNA-Ebene bei FHH8 (+51 and +166%; P < 0.05) und FHH16 (+105 and +136%; P < 0.05) im Vergleich zu FHL16 nachweisen. Somit konnte gezeigt werden, dass die gleichgerichtete Überexpression von NOS1, COX-2 und Renin am JGA bei der FHH-Ratte der Entwicklung einer fokal segmentalen Glomerulosklerose vorausgeht und damit möglicherweise pathogenetische Bedeutung für die Entstehung der Nierenschädigung bei diesem Rattenstamm hat.

Schlagwörter:
Glomerulosklerose, NO, Prostaglandine, Renin

Abstract (english)

This study describes elevated histochemical signals for nitric oxide synthase-1 (NOS1) and cyclooxygenase-2 (COX-2) in juxtaglomerular apparatus (JGA) and adjacent thick ascending limb of the kidney of fawn-hooded hypertensive rats (FHH). Two different age groups of FHH (8 and 16 wk; FHH8 and FHH16, respectively) were compared with genetically related fawn-hooded rats with close to normal blood pressure (FHL) that served as controls. Histopathological changes in FHH16 comprised focal segmental glomerulosclerosis (FSGS), focal matrix overexpression (mainly of collagen IV), and a moderate arteriolopathy with hypertrophy of the media, enhanced immunoreactivity for alpha-smooth muscle actin, and altered distribution of myofibrils. Macula densa NOS activity, as expressed by NADPH-diaphorase staining, and NOS1 mRNA abundance were significantly elevated in FHH8 (+153 and +88%; P < 0.05) and FHH16 (+93 and +98%; P < 0.05), respectively. Even higher elevations were registered for COX-2 immunoreactivity in FHH8 (+166%; P < 0.05) and FHH16 (+157%; P < 0.05). The intensity of renin immunoreactivity and renin mRNA expression in afferent arterioles was also elevated in FHH8 (+51 and +166%; P < 0.05) and FHH16 (+105 and +136%; P < 0.05), respectively. Thus we show that coordinate upregulation of tubular NOS1, COX-2, and renin expression precedes, and continues after, the manifestation of glomerulosclerotic damage in FHH. These observations may have implications in understanding the role of local paracrine mediators in glomerular disease.

Keywords:
glomerulosclerosis; nitric oxide; prostaglandins; renin


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Inhaltsverzeichnis

TitelseiteFokal segmentale Glomerulosklerose und juxtaglomerulärer Apparat der hypertensiven “fawn-hooded“ Ratte
Abkürzungsverzeichnis Im Text verwendete Abkürzungen
1 Einleitung
1.1Allgemein
1.2Die fokal segmentale Glomerulosklerose beim Menschen
1.2.1Klassifikation und Häufigkeit
1.2.2Morphologie
1.2.3Pathogenese
1.2.4Prognose und Therapie
1.3Die „fawn-hooded“ Ratte
1.3.1Herkunft
1.3.2Systemischer Hypertonus
1.3.3Pulmonaler Hypertonus
1.3.4Proteinexkretion im Urin
1.3.5Plättchendysfunktion
1.3.6Zerebraler Stoffwechsel und Verhalten
1.3.7Fokal segmentale Glomerulosklerose
1.3.8Zusammenhang zwischen renaler Schädigung, Blutdruck und Proteinurie
1.3.9Glomeruläre Hämodynamik
1.3.10Entwicklung von renalen Schädigungen im Zusammenhang mit Manipulationen des Blutdruckes
1.3.11Genetik
1.4Der juxtaglomeruläre Apparat
1.4.1Morphologie und Funktion
1.4.2NO-Synthase im JGA
1.4.2.1Morphologie
1.4.2.2NO und TGF
1.4.2.3NO und Reninsekretion
1.4.2.3.1In vivo
1.4.2.3.2In vitro
1.4.2.3.3Parallele Regulation von NOS1 und Renin
1.4.2.3.4Signaltransduktion
1.4.3Prostaglandine im JGA
1.4.3.1Morphologie
1.4.3.2Prostaglandine und TGF
1.4.3.3Prostaglandine und Renin
1.4.3.4Interaktion von Prostaglandinen und NO am JGA
2 Zielsetzung der Arbeit
3 Material und Methoden
3.1Versuchstiere
3.2Perfusionsfixierung und Gewebsprozessierung
3.3Morphologische Analyse
3.3.1Anfertigung der Gewebsschnitte
3.3.2Histopathologische Beurteilung
3.4Histochemische Analyse
3.4.1Diaphorase-Reaktion
3.4.2Proteinnachweis durch Antikörperdetektion
3.4.2.1Primärantikörper
3.4.2.2Detektion der gebundenen Primärantikörper
3.4.2.2.1Peroxidase-Anti-Peroxidase-Reaktion
3.4.2.2.2Silberverstärkte Goldmarkierung
3.4.2.2.3Fluoreszenzmarkierung
3.4.3In situ-Hybridisierung
3.4.3.1cDNA Präparation
3.4.3.2In vitro-Transkription
3.4.3.3Hybridisierung mit Digoxigenin-gelabelten Riboproben
3.4.3.4Waschen der Gewebsschnitte zur Entfernung nicht hybridisierter, markierter Riboproben
3.4.3.5Detektion und Darstellung der hybridisierten Riboproben
3.5Statistische Auswertung
3.5.1Quantifizierung der Signale
3.5.2Statistische Tests
4 Ergebnisse
4.1Klinische Parameter
4.2Histopathologische Veränderungen
4.2.1Glomeruläre und interstitielle Veränderungen
4.2.2Gefäßveränderungen
4.2.3Quantifizierung der sklerotischen Läsionen
4.3Kollagen IV und Kollagen I
4.4Natrium-Kalium-2-Chlorid-Kotransporter
4.5Renin mRNA und Protein
4.6NOS1-Proteinaktivität und mRNA-Expression
4.7Cyclooxygenase 2-Protein
5 Diskussion
5.1Morphologische Schäden
5.1.1Arteriolopathie
5.1.2Fokal segmentale Glomerulosklerose
5.1.3Matrixexpression
5.2Hypertonus
5.3Glomeruläre Hämodynamik der FHH-Ratte
5.4Das RAS der FHH-Ratte
5.5Regulation von MD NOS1 und COX-2 bei der FHH-Ratte
5.6Genetik
5.7Mögliche Zusammenhänge mit menschlicher FSGS
6 Zusammenfassung
Bibliographie Literaturverzeichniss
Danksagung
Selbständigkeitserklärung
Lebenslauf
Anhang A Publikationsliste

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Klassifikation der fokal segmentalen Glomerulosklerose. Unterstrichen sind FSGS-Formen, bei denen dem initial vorliegenden glomerulären Hypertonus pathogenetisch eine entscheidende Rolle zukommt.
Tabelle 2: Anteil von Patienten mit der histologischen Diagnose FSGS an der Gesamtheit der Patienten mit nephrotischem Syndrom, bei denen eine Biopsie durchgeführt wurde.
Tabelle 3: Mittelwerte des systolischen Blutdrucks und der Proteinexkretion im Urin in den einzelnen Versuchsgruppen. Die Werte sind ± Standardabweichung angegeben. Signifikant (*) eröhte Proteinexkretion bei FHH16 im Vergleich zu FHL16 und FHH8. Moderater, aber signifikant (*) erhöhter Blutdruck bei FHH8 und FHH16 im Vergleich zu FHL16.
Tabelle 4: Mittelwerte ± Standardabweichungen der Renin-mRNA und Proteinsynthese in den einzelnen Versuchsgruppen. Es zeigt sich eine signifikante (*) Zunahme beider Parameter bei FHH8 und FHH16-Ratten im Vergleich zur FHL16-Kontrollgruppe. Die Werte für FHH8 und FHH16-Ratten wiesen im Vergleich untereinander für beide Parameter keine signifikanten Unterschiede auf.
Tabelle 5: Mittelwerte ± Standardabweichungen für NOS1-mRNA Expression und NOS I Proteinaktivität, nachgewiesen durch die Diaphorasereaktion der einzelnen Versuchsgruppen. Es fand sich eine signifikante (*) Erhöhung für beide Parameter im Vergleich der Werte von FHH8 und der FHH16-Ratten mit den Werten der FHL-Gruppe. Die Werte der FHH8 und FHH16-Gruppe untereinander differieren jeweils nicht signifikant.
Tabelle 6: COX-2-Protein-Immunreaktivität der Versuchsgruppen im Vergleich. Signifikant (*) erhöhte COX-2-Proteinexpression in der FHH16 und der FHH8-Gruppe, bezogen auf die Werte der FHL16-Gruppe. Die Unterschiede zwischen der FHH8 und der FHH16-Gruppe sind nicht signifikant.

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Exemplarische Darstellung von Glomerula aus den Nieren von FHH8 und FHH16-Ratten in der PAS-Färbung. Das mit (A) bezeichnete Glomerulum der FHH8-Ratte erscheint morphologisch unverändert. In (B) erkennt man in einem Glomerulum der FHH16-Ratte einen partiellen Kollaps des glomerulären Gefäßknäuels mit einzelnen, die Kapillaren füllenden hyalinen Thromben. Der Harnraum und einige Tubulusanschnitte erscheinen gefüllt mit einer proteinösen Flüssigkeit. In (C) kommt das klassische Bild der segmentalen Glomerulosklerose einer FHH16-Ratte zur Darstellung. Der untere Teil des Glomerulum erscheint komplett sklerosiert bei erhaltener Architektur des oberen Bereichs des Gefäßknäuels. Ungefähre Vergrößerung (A-C) x250
Abbildung 2: Segmental geschädigte Glomerula von FHH16-Ratten. (A) Segmentale vom Gefäß- bis zum Harnpol reichende Sklerose. Der obere Anteil des Glomerulum erscheint unbeschädigt. Die mit (*) gekennzeichnete Kapillare zieht aufgeweitet und entfaltet über die ganze Länge des glomerulären Gefäßknäuels. Deutlich zu erkennen ist der mit (4) gekennzeichnete, unter Zellen der Bowman-Kapsel neu entstandene paraglomeruläre Raum. In der den paraglomerulären Raum füllenden proteinösen Flüssigkeit sind einzelne Zelltrümmer eingelagert. Die Kapillaren in der sklerotischen Region erscheinen kollabiert. Vergrößerung x250. (B) Ausschnittsvergrößerung (x800) des Glomerulum aus (A). Man erkennt den sich von unter der Bowman-Kapsel bis unter das proximale Tubulusepithel fortsetzenden, paraglomerulären Raum (*). Ebenfalls gut zu erkennen ist die den Raum zum umgebenden Gewebe abgrenzende Fibroblastenschicht, während das parietale Epithel in die sklerotische Region „verbacken“ erscheint. In (C) kommt ein schwerer geschädigtes Glomerulum zur Darstellung. Durch (4) gekennzeichnet sieht man einen von der Basalmembran abgehobenen Podozytenzellkörper. Mehrere mit (*) bezeichnete Glomerulumkapillaren bilden Mikroaneurismata aus. Der auf dem Bild unten liegende Anteil erscheint komplett mit der parietalen Epithelschicht fusioniert. Vergrößerung x350. (D) zeigt den JGA mit MD (4) und afferenter Arteriole in einer Ausschnittsvergrößerung (x1000) des in (C) zur Darstellung kommenden Glomerulum. Die Wand der afferenten Arteriole ist verdickt, man erkennt ausgeprägte subepitheliale Blasenbildung. Des weiteren gut zu erkennen sind die Reningranulationen in der glattmuskulären Gefäßschicht, die das Gefäß als afferente Arteriole identifizieren.
Abbildung 3: Elektronenmikroskopische Darstellung der Arteriolopathie am vaskulären Glomerulumpol von FHH16-Ratten. (A) Der Ausschnitt zeigt einen glomerulumnahen Anschnitt einer afferenten Arteriole. Man erkennt deutliche subendotheliale Hyalinablagerungen (*), eine juxtaglomeruläre granulierte Zelle ist an den spezifischen Reningranulationen erkennbar (4). (B) Ausgeprägte Mediahypertrophie im Bereich einer afferenten Arteriole. Erkennbar sind weiterhin deutliche degenerative Veränderungen in den im Anschnitt getroffenen glatten Muskelzellen. Vergrößerung (A,B) x 4500
Abbildung 4: Silberverstärkte Goldmarkierung des glattmuskulären Aktins in Vas afferens und efferens. Man erkennt den im Vergleich zur zarten glattmuskulären Lamina der Glomerulumgefäße einer FHL-16 Ratte extrem verdickten Muskelanteil der Polgefäße einer FHH16-Ratte. Vergrößerung beide x500.
Abbildung 5: Signifikantes Vorliegen einer fokal segmentalen Glomerulosklerose bei Ratten der FHH16-Gruppe im Vergleich zu Tieren der FHH8 und FHL16-Gruppe.
Abbildung 6: Verteilung von Kollagen IV mRNA und Protein in Glomerula von FHL16 (oben) und FHH16 Ratten (unten), nachgewiesen durch In situ-Hybridisierung (links) und Immunofluoreszenz (rechts). Im Bereich der sklerotischen Läsion zeigt sich im Glomerulum der FHH-Ratte in vereinzelten Zellen, die Mesangialzellen und parietalen Kapselepithelien entsprechen, ebenso wie in nicht in die Sklerose einbezogenen angrenzenden Bowman-Kapselzellen und subsklerotisch gelegenen interstitiellen Fibroblasten eine vermehrte Kollagen IV-Expression. Im Vergleich hierzu lagen die Level für Kollagen IV mRNA in Glomerula der FHL16 Gruppe unter der Nachweisgrenze. In der Immunfluoreszenz für Kollagen IV zeigt sich im sklerotischen Glomerulum der FHH16-Ratte eine starke Einlagerung des Proteins im Bereich der Sklerose. Die Fluoreszenz im Bereich der Basalmembran des parietalen Epithels und des Tubulusepithels erscheint vermehrt im Vergleich zu einem „gesunden“ Glomerulum der FHL16-Gruppe. Alle Vergrößerungen ungefähr x300.
Abbildung 7: Expression des NKCC2 im TAL bei FHL16, FHH8 und FHH16-Ratten. Ebenso wie auf der hier dargestellten Übersichtsvergrößerung waren auch bei genauerem Durchmustern gröbere Abweichungen im Expressionsmuster zwischen den einzelnen Tieren, speziell im Bereich der Macula densa, nicht zu erkennen. Alle Vergrößerungen ungefähr x100.
Abbildung 8: Repräsentative Abbildungen der Renin mRNA- (rechte Spalte) und Proteinexpression (linke Spalte) in der afferenten Arteriole von FHL16-, FHH8- und FHH16-Ratten. Man erkennt die im Vergleich zu FHL16-Ratten deutlich verstärkte Signalintensität und Signalausbreitung bei FHH8- und FHH16-Ratten (siehe Diagramm). Lichtmikroskopie mit Interferenzkontrast. Ungefähre Vergrößerung (alle) x300
Abbildung 9: Repräsentative Abbildung von Glomerula von FHL16-, FHH8- und FHH16-Ratten mit Darstellung der NADPH-d-Reaktion (linke Spalte) und der NOS1 mRNA-Expression (rechte Spalte) an der MD. Man beachte die höhere Anzahl von signalpositiven Zellen in der MD von FHH8- und FHH16-Ratten im Vergleich zu FHL-16-Ratten (siehe Diagramm). Lichtmikroskopie mit Interferenzkontrast. Ungefähre Vergrößerung (alle) x300
Abbildung 10: Repräsentative Abbildung der Glomerula von FHL16-, FHH8- und FHH16-Ratten. Man erkennt die deutlich gesteigerte Immunreaktivität für COX-2 im Bereich der MD und der angrenzenden TAL-Abschnitte von FHH8- und FHH16-Ratten im Vergleich zu FHL16-Ratten (siehe Diagramm). Immunfluoreszenzmikroskopie. Ungefähre Vergrößerung x250

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