Weichert, Wilko : Fokal segmentale Glomerulosklerose und juxtaglomerulärer Apparat der hypertensiven “fawn-hooded“ Ratte

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Kapitel 3. Material und Methoden

3.1 Versuchstiere

Die in dieser Arbeit beschriebenen Experimente wurden durchgeführt mit 8 Wochen und 16 Wochen alten, hypertensiven „fawn-hooded“ Ratten (FHH8; n=4, FHH16; n=5) und 16 Wochen alten „fawn-hooded“ Ratten mit nahezu normalem Blutdruck (FHL16; n=4). Das Züchten der Ratten erfolgte in den Versuchstiereinrichtungen der Erasmus Universität Rotterdam, Niederlande, sie wurden uns im Rahmen einer Forschungskooperation von Prof. Dr. A. P. Provoost zur Verfügung gestellt. Die Versorgung und Fütterung der Tiere erfolgte nach Standardbedingungen, mit Trinkwasser ad libitum. Da die üblichen klinischen Parameter bei Nierenschädigung (glomeruläre Filtrationsrate, Art und Menge der Proteinurie, Blutdruck, renaler Plasmafluss, u.v.a.) durch vorhergehende Studien [Simons et al. 1993, van Dokkum et al. 1997, van Dokkum et al. 1998] an gleich gehaltenen und gleich alten Tieren ausreichend dokumentiert sind, beschränkten wir uns auf das Messen des systolischen Blutdruckes durch indirekte Schwanzplethysmografie an bewußtseinsklaren Tieren und Messung der Proteinexkretion im Urin in metabolischen Käfigen über 24 Stunden. Die Proteinkonzentration wurde colorimetrisch durch Präzipitation mit 3% Sulfosalizylsäure bestimmt. Alle Messungen wurden kurz vor der Perfusionsfixierung durchgeführt.

3.2 Perfusionsfixierung und Gewebsprozessierung

Zunächst wurden die Tiere mit Äther narkotisiert. Die Anästhesie erfolgte durch intraperitoneale Injektion von 40 mg/kg Körpergewicht Nembutal (Sanofi-CEVA, Bad Segeberg). Anschließend wurde der Bauchraum der Tiere eröffnet. Nach Anschlingen der Aorta wurde diese distal des Abganges der Arteriae renales eröffnet und über einen nach proximal gerichteten Polyethylenschlauch mit dem Perfusionssystem verbunden. Zum Druckausgleich erfolgte die Eröffnung der unteren Vena Cava. Nach Vorspülen mit einer 21º warmen Sucrose/PBS-Lösung (330 mosmol, pH 7,35) für 30 Sekunden mit 220 mmHg erfolgte die Perfusion mit frisch präpariertem, 3 prozentigen Paraformaldehyd (Merck, Darmstadt) in PBS (pH 7,35, 21º) mit initial 220 mmHg (90 Sekunden) und anschließend 60 mmHg für 3,5 Minuten. Um die Nieren vor Gefrierartefakten zu bewahren, wurde nach Abklemmen und Entnahme der rechten Niere zur Paraffin/Eponeinbettung abschließend eine Perfusion mit einer Sucrose/PBS-Lösung (800 mosmol, pH 7,35, 21º) für 5 Minuten durchgeführt. Anschließend wurde die linke Niere entnommen und sofort in flüssigem Isopentan schockgefroren. Von der vorher entnommenen rechten Niere wurde jeweils ein kleiner Gewebsblock zur Eponeinbettung abgetrennt. Der Rest wurde im Rahmen der Paraffineinbettung für 4 Stunden bei 4º in einer Immersionslösung, die in ihrer Zusammensetzung der Perfusionslösung entsprach, belassen. Dann folgten 3 Waschschritte für jeweils 1 Stunde in PBS und die Entwässerung bei 4º in einer aufsteigenden Ethanolreihe (50%,2x75%,90%,2x96%,3x100% für jeweils 1 Stunde). Nun wurden die Gewebe über Nacht bei 40º in Zedernholzöl eingelegt. Das Zedernholzöl wurde anschließend noch 2x gewechselt (jeweils 1 Stunde). Dann folgte die Behandlung der Gewebe für 3x2 Stunden in Paraffin bei 58º, um sie anschließend in Kapseln zu überführen und diese mit Paraffin auszugießen. Zur Abkühlung wurden die eingebetteten Gewebe nun in Eiswasser 20 Minuten gekühlt. Zur Prozessierung der kleinen Gewebsblöcke für die Elektronenmikroskopie wurden diese bei 4º über Nacht in einer Immersionslösung, bestehend aus 1,5% Glutaraldehyd (Merck, Darmstadt) und 1,5% Paraformaldehyd in PBS (pH 7,4), nachfixiert. Anschließend erfolgte die Entwässerung in einer Ethanolreihe mit aufsteigender Konzentration (50%,70%,90%,96% für je 15 Minuten, 3x100% für je 20 Minuten) und danach die Behandlung in einer 1:1 Lösung aus Propylenoxid und Epon (Fluka, Buchs, Schweiz) über Nacht. Anschließend wurde das Gewebe in Beem-Kapseln (Roth, Karlsruhe) gegeben und mit Epon ausgegossen. Die Aushärtung erfolgte bei 60º in 3 Tagen.


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3.3 Morphologische Analyse

3.3.1 Anfertigung der Gewebsschnitte

Zum Studium der Histopathologie und des Ausmaßes der glomerulären Schädigung wurden 5 µm dicke Paraffinschnitte auf einem Rotationsmikrotom (Leica, Heidelberg) angefertigt, in einer absteigenden Ethanolreihe (Xylol 2x10 Minuten, 2x100%, 2x96%, 80%, 70% Ethanol für jeweils 5 Minuten) vorbereitet und in Aqua dest. überführt. Zur Anfertigung einer PAS-Färbung erfolgte die Inkubation in 0,5% Perjodsäure für 10 Minuten. Anschließend wurden die Schnitte für 10 Minuten unter fließendem Wasser gespült und für 20 Minuten in Schiffsches Reagenz gegeben. Danach wurden die Schnitte für 3x2 Minuten in Sulfitwasser verbracht und erneut fließend gewässert. Nun erfolgte die Inkubation mit Hämalaun nach Mayer (1:5 verdünnt) für 3 Minuten und eine erneute Wässerung. Dann wurden die Schnitte unter Verwendung von Eukitt (Riedel-de-Haën,Seelze) eingedeckelt. Aus dem in Epon eingebetteten Gewebe wurden auf einem Ultramikrotom (LKB, Ultrotom 8800) Semidünnschnitte (1 µm) angefertigt, auf alkoholgereinigte Objektträger verbracht, mit Methylenblau-Azur (nach Richardson) gefärbt und unter Verwendung von Eukitt eingedeckelt. Die Beurteilung der Schnitte und die Anfertigung der Photos erfolgte mit Hilfe eines Lichtmikroskops der Firma Leica (Leica DMRB mit HBO Fluoreszenzlampe). Der größte Teil der Photos wurde mit Hilfe einer an das Mikroskop angeschlossenen herkömmlichen Leica-Kamera angefertigt, die restlichen Photos entstanden mit Hilfe einer digitalen Kamera (Spot32, Diagnostic Instruments, USA) aufgenommen und mit der Software Metaview 4.1 (Universal Imaging Corporation, West Chester, USA) verarbeitet. Die Herstellung von Ultradünnschnitten (60 nm) für die elektronenmikroskopische Beurteilung erfolgte mit einem Ultracut-Microtom (Reichert-Jung/Leica). Zur exakten Lokalisation der glomerulären Schädigungen wurden von den entsprechenden Gewebeblöcken zunächst so lange Semidünnschnitte angefertigt, bis sich auf diesen für die elektronenmikroskopische Beurteilung interessante Strukturen identifizieren ließen. Anschließend folgte die Anfertigung der Ultradünnschnitte und das Verbringen derselben auf mit Formvar (Sigma, St.Louis, USA) beschichtete Schlitznetze (Plano, Marburg). Dann wurden die Schnitte 15 Minuten in 5% Uranylacetat inkubiert und für 2 Minuten mit Bleicitrat (Merck) nachkontrastiert. Die Beurteilung erfolgte an einem Zeiss-Elektronenmikroskop (EM 900).

3.3.2 Histopathologische Beurteilung

Die grundsätzliche morphologische Beurteilung erfolgte unter Bewertung der PAS-gefärbten Paraffinschnitte, der Semidünnschnitte und unter Berücksichtigung der Ultrastruktur im Elektronenmikroskop. Zur Quantifizierung der glomerulären Schädigungen erfolgte die Auswertung von 400-600 Glomerula pro Tier an PAS-Schnitten. Glomerula, die ausgeprägte Veränderungen im Sinne einer segmentalen oder globalen Sklerose zeigten (Anheftung von Glomerulumschlingen an die Bowman-Kapsel mit ausgeprägter Ballonierung der Kapillaren, ausgeprägte podozytäre Schädigungszeichen, ausgeprägte segmentale oder globale Einlagerungen von PAS-positivem Material), wurden als positiv bewertet. Nicht als positiv bewertet wurden Veränderungen im Sinne einer dezenten diffusen, vor allem mesangial betonten Sklerosierung. Die Prozentwerte der geschädigten Glomerula mit Bezug auf die Gesamtzahl der Glomerula wurden als Skleroseindex beschrieben. Dieses orientierende Bewertungsverfahren zur Erstellung eines Sklerosescores wurde in einer Reihe vergleichbarer Studien in dieser Form ebenfalls genutzt.


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3.4 Histochemische Analyse

3.4.1 Diaphorase-Reaktion

Zur Demonstration der Gewebsaktivität der NO-Syntase wurde die Diaphorasereaktion durchgeführt. Hierbei wird Nitro-blue Tetrazolium in Gegenwart von NADPH durch die katalytische Aktivität der NO-Synthase der Macula densa zu einem blauen Farbstoff umgesetzt [vgl. Bachmann et al. 1995]. Zu diesem Zweck wurden am Kryostaten (Kryostat CM3000, Leica) 5 µm dicke Gewebsschnitte (jeweils 2 pro Versuchstier) angefertigt und auf mit Chromgelatine (Kaliumchromsulfat-12-Hydrat, Riedel-de-Haën) beschichtete Objektträger aufgenommen. Anschließend wurden die Gewebsschnitte für 30 Minuten an der Luft getrocknet. Nach Hydrierung der Schnitte für 2x 15 Minuten in einer mit Phosphat gepufferten Salzlösung (Phosphate-buffered Saline (PBS), bestehend aus 8 g NaCl, 240 mg KH2PO4, 1,78 g Na2HPO4, 200 mg KCl in 1000 ml H2O; pH 7,4) bei Raumtemperatur, wurden die Schnitte mit Entwicklungspuffer (0,01% Nitro-blue Tetrazolium, 0,3% Triton-X-100, 0,1% ß-NADPH (alles Sigma) in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,5) beschichtet und bei 37º inkubiert. Zur Kontrolle wurde bei einem Teil der Schnitte NADH (Boehringer, Ingelheim) anstatt NADPH eingesetzt, was zu einem Ausbleiben der Blaufärbung führte. Die Entwicklung wurde nach 37 Minuten bei Vorliegen eines gut sichtbaren Macula-densa-Signals und relativem Fehlen von Hintergrundfärbung durch Waschen der Schnitte für 2x15 Minuten in PBS bei Raumtemperatur gestoppt. Die Schnitte aller Versuchstiere wurden im gleichen Experiment prozessiert und die Reaktion für alle Schnitte gleichzeitig gestoppt. Die Beurteilung der Schnitte erfolgte mit Hilfe eines Leica DMRB-Mikroskops, die Erstellung der Photos mit einer auf das Mikroskop montierten Leica-Kamera.

3.4.2 Proteinnachweis durch Antikörperdetektion

3.4.2.1 Primärantikörper

Alle in dieser Arbeit verwendeten Primärantikörper sind bereits eingesetzt und charakterisiert worden. Bei dem zur Detektion von Renin eingesetzten Antikörper handelte es sich um einen im Kaninchen generierten, polyklonalen, gegen aufgereinigtes Renin gerichteten Antikörper, der freundlichst von Dr. E. Hackenthal aus Heidelberg zur Verfügung gestellt wurde. Bei dem zur Detektion von Kollagen IV eingesetzten Antikörper handelt es sich um einen polyklonalen, im Kaninchen generierten, gegen alpha1alpha2-Kollagen IV der Maus gerichteten Antikörper (Beckton/Dickinson, Bedford, USA). Die Detektion des glattmuskulären alpha-Aktins erfolgte durch einen monoklonalen, in der Maus generierten, gegen humanes alpha-smooth-muscle-actin gerichteten Antikörper (Dako, Glostrup, Dänemark). Zur Darstellung des Cyclooxygenase-2-Proteins wurde ein polyklonaler, in der Ziege generierter und gegen das carboxyterminale Ende der COX-2 der Ratte gerichteter Antikörper verwendet (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg).

3.4.2.2 Detektion der gebundenen Primärantikörper

3.4.2.2.1 Peroxidase-Anti-Peroxidase-Reaktion

Als Detektionssystem zur Darstellung des gebundenen Renin-Primärantikörpers wurde das Peroxidase-Anti-Peroxidase-System eingesetzt. Hierzu wurden jeweils zwei 5 µm dicke Paraffinschnitte pro Versuchstier auf einem Rotationsmikrotom angefertigt, entsprechend des im Rahmen der PAS-Färbung beschriebenen Procedere in einer absteigenden Ethanolreihe entparaffiniert und für 5 Minuten bei Raumtemperatur in PBS verbracht. Anschließend erfolgte zum


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Blocken unspezifischer Proteinbindungsstellen die Inkubation mit 10% nativem Schweineserum (NSS, Boehringer) in Wasser für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Nach 2 weiteren Waschschritten in PBS (jeweils 5 Minuten bei Raumtemperatur) wurden die Schnitte zum Blocken der endogenen Peroxidasen für 12 Minuten bei Raumtemperatur mit 10% H2O2 (Merck) in 100% Methanol (J.T.Baker, Griesheim) behandelt. Es erfolgten 2 weitere Waschschritte mit PBS für 5 Minuten, bevor der Primärantikörper 1:5000 in PBS mit 1% nativem Schweineserum aufgetragen wurde. Die Inkubation erfolgte in einer feuchten Kammer, die für 2 Stunden auf einem Schüttler bei Raumtemperatur belassen wurde und anschließend über Nacht bei 4º lagerte. Am nächsten Morgen wurden die Schnitte für 3x10 Minuten bei Raumtemperatur in PBS gewaschen und mit einem Schwein-Anti-Kaninchen-IgG-Serum (Dako; 1:20 in PBS) überschichtet. Nach Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf dem Schüttler und 2 Waschschritten (2x5 Minuten PBS bei Raumtemperatur) erfolgte das Auftragen des PAP-Komplexes (im Kaninchen generierte, mit Peroxidase gekoppelte Anti-Peroxidase-Antikörper (Dako) 1:100 in PBS mit 1%NSS). Nach 1 Stunde Inkubation bei Raumtemperatur erfolgte dreimaliges Waschen (jeweils 5 Minuten bei Raumtemperatur) in PBS und die Entwicklung der Farbreaktion durch Aufbringen von 0,1% Diaminobenzidin (Sigma) und 0,02% H2O2 in PBS. Die Entwicklung wurde bei ausreichender Ausprägung des Signals in der afferenten Arteriole nach 18-20 Minuten durch Baden der Schnitte in PBS (3x 10 Minuten bei Raumtemperatur) gestoppt und anschließend erfolgte das Eindeckeln unter Verwendung von Eukitt . Bei den Experimenten wurden jeweils 2 Nierenschnitte pro Tier im gleichen Experiment verwertet und die Reaktion wurde an allen Schnitten gleichzeitig gestoppt. Als Kontrolle dienten Schnitte, bei deren Behandlung die Inkubation mit dem Primärantikörper durch Beschichtung mit PBS ersetzt wurde. Die Auswertung erfolgte unter Verwendung des Interferenzkontrastes an einem Leica DMRB Mikroskop. Die Photos wurden mit einer aufmontierten Leica-Kamera angefertigt.

3.4.2.2.2 Silberverstärkte Goldmarkierung

Zur Detektion des glattmuskulären Aktins wurde die silberverstärkte Goldmarkierung genutzt. Zu diesem Zweck wurden 5 µm dicke Paraffinschnitte angefertigt und in der im vorigen Abschnitt beschriebenen Weise entparaffiniert und in PBS verbracht. Zur Verbesserung der Antigenität wurden die Schnitte in einen Puffer, bestehend aus 0,1 M Natriumzitrat (Merck) in Wasser (mit einem pH von 6,0), überführt und unter Wechseln des Puffers für 2x10 Minuten bei 600 Watt in einer herkömmlichen Mikrowelle gekocht. Anschließend kühlten die Schnitte bei Raumtemperatur in PBS für 20 Minuten ab. Es folgte die Überschichtung mit 5% Milchpulver (Magermilchpulver, Nestlé, Frankfurt) in Wasser zum Blocken unspezifischer Proteinbindungen und nach Entfernen des Blockingmediums das Aufbringen des alpha-smooth-muscle-actin-Antikörpers 1:100 verdünnt in PBS mit 1% NSS. Die Gewebsschnitte wurden für 1 Stunde in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur auf dem Schüttler inkubiert und über Nacht bei 4º gelagert. Nach 3 Waschschritten in PBS zu je 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Schnitte mit in der Ziege generierten, mit 4nm großen kolloidalen Goldpartikeln gekoppelten Anti-Maus-IgG-Antikörpern (1:200 in PBS mit 1% NSS, Dianova) überschichtet und für 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend 2x 5 Minuten in PBS gewaschen (Raumtemperatur) und mit 2% Glutaraldehyd (Merck) in PBS für 15 Minuten bei Raumtemperatur nachfixiert. Nach 5 weiteren Waschschritten in PBS bei Raumtemperatur zu jeweils 5 Minuten erfolgte das Aufbringen der Silberverstärkungslösung (Biotrend, Köln). Die Reaktion wurde nach 15 Minuten bei deutlich vorliegendem Signal durch 3x5 minütiges Waschen in PBS bei Raumtemperatur gestoppt. Die Schnitte wurden anschließend unter Verwendung von Eukitt eingedeckelt. Die Auswertung erfolgte unter Verwendung des Interferenzkontrastes an einem Leica DMRB Mikroskop und die Herstellung der Photos mit einer angeschlossenen LEICA-Kamera. Kontrollschnitte wurden statt mit Primärantikörperserum mit PBS überschichtet.

3.4.2.2.3 Fluoreszenzmarkierung

Die Darstellung von Cyclooxygenase-2-Protein und von Kollagen IV erfolgte unter Verwendung von mit Cy3 gekoppelten Sekundärantikörpern. Für die Detektion der Cyclooxygenase wurden 5 µm dicke Paraffinschnitte angefertigt und nach dem im letzten Abschnitt beschriebenen Protokoll entparaffiniert, gekocht und anschließend in PBS überführt. Zum Darstellen des Kollagen IV wurden 5 µm dicke


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Gefrierschnitte im Kryostaten angefertigt, auf mit Chromgelatine beschichtete Objektträger aufgenommen und für 30 Minuten bei Raumtemperatur luftgetrocknet. Anschließend wurden die Schnitte in PBS verbracht. Bei beiden Experimenten wurden die Schnitte nun für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 2% bovinem Serumalbumin in PBS (Kollagen IV) bzw. mit 10% nativem Schweineserum (NSS) in PBS (COX-2) vorbehandelt, ehe sie mit den entsprechenden Primärantikörperverdünnungen überschichtet wurden. Hierzu kam zur Detektion von Kollagen IV eine 1:500 Verdünnung des alpha1alpha2-Kollagen IV Antikörpers in PBS und zur Detektion der Cyclooxygenase-2 eine 1:250 Verdünnung des Cyclooxygenase-2-Antikörpers in PBS mit 1%NSS zum Einsatz. Nach der Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur auf dem Schüttler wurden die Schnitte über Nacht bei 4º gelagert. Es folgten 3 fünfminütige Waschschritte in PBS und anschließend das Auftragen einer 1:250 Verdünnung des in der Ziege generierten, mit Cy3 gekoppelten Anti-Kaninchen-IgG-Antikörpers (Dianova, Hamburg) in PBS (Kollagen IV) bzw. das Auftragen einer 1:500 Verdünnung von im Affen generiertem, mit Cy3 gekoppeltem Anti-Ziege-IgG-Antikörper (Dianova) in PBS (COX-2). Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur auf dem Schüttler wurden die Schnitte bei Raumtemperatur für 3x10 Minuten in PBS gewaschen und anschließend unter Verwendung von 50% Glycerin (Merck) in PBS eingedeckelt. Zur Kontrolle wurde jeweils anstelle der Primärantikörperverdünnung PBS eingesetzt. Auf Kontrollschnitten ließ sich kein Immunlabeling nachweisen. Die Beurteilung der Schnitte und die Erstellung der Photografien erfolgte fluoreszenzmikroskopisch an einem Leica DMRB Mikroskop mit Auflicht-Fluoreszenzzusatz, aufmontierter Kamera (Kollagen IV) und angeschlossener digitaler Spot32-Kamera (COX-2).

3.4.3 In situ-Hybridisierung

3.4.3.1 cDNA Präparation

Die verwendeten cDNAs zur Generierung der Riboproben waren alle schon in anderen Experimenten der Gruppe Bachmann zum Einsatz gekommen und lagen in klonierter Form vor. Die cDNA für NOS1 bestand aus einem 1255 Basenpaare langen, partiellen Ratten-NOS1 Fragment, flankiert durch die Promotorstellen der Transkriptionspolymerasen T7 und Sp6 und lag subkloniert in den pGem4-Vektor vor. Das Plasmid wurde dem Labor freundlicherweise von S. H. Snyder (Baltimore, USA) zur Verfügung gestellt. Zur Generierung der Antisenseprobe erfolgte die Linearisierung des Plasmides mit Hilfe von EcoR 1 und die Transkription mit Hilfe der T7 Polymerase. Zur Generierung der Senseprobe wurde mit Kpn 1 linarisiert und mit Sp6 transkribiert. Die cDNA für Renin lag als 330 Basenpaare langes, Sac 1-Pst 1 Fragment des Maus-Reningens (Ren-2d, zur Verfügung gestellt von K. Gross, Buffalo, USA), subkloniert in den pSP65-Vektor und einseitig flankiert durch die Promotorsite für Sp6, vor. Die Linearisierung erfolgte unter Verwendung von Acc1 und die Transkription mit Hilfe der Sp6 Transkriptionspolymerase. Zur Generierung der Senseprobe wurde eine in den pSP64 Vektor und einseitig mit Sp6 Promotorsite flankierte cDNA-Probe verwendet [vgl. Bosse et al. 1995]. Die Linearisierung erfolgte mit Kpn 1, die Transkription mit Sp6-Polymerase. Die 712 Basenpaare lange cDNA für den murinen thiazidsensitiven Na-Cl-Kotransporter (NCC), die für die Membrandomänen 1-7 des Proteins kodiert [Obermüller et al. 1995], lag, flankiert durch die Promotorstellen für T3 und T7, subkloniert in die EcoRV site des pBlueskript KS+ Vektors vor. Das cDNA-Fragment für den bumetanidsensitiven Na-K-2Cl-Kotransporter (NKCC2) umfaßte 375 Basenpaare, kodierte für die Aminosäuren 61-188 des Proteins [Obermüller et al. 1996] und lag ebenfalls, flankiert durch die Promotorstellen für T3 und T7, subkloniert in die EcoRV site des pBlueskript KS+ Vektor vor. Als Matrize zur Transkription der beiden Kotransporter wurden unter Verwendung vektorspezifischer Primer PCR-Produkte generiert, die die jeweiligen einklonierten cDNA-Abschnitte und die flankierenden Transkriptionspromotoren umfaßten. Die Generierung der Antisenseprobe erfolgte beim NCC mit T7 und beim NKCC2 mit T3, zur Generierung der Senseprobe wurde für den NCC T3 und für den NKCC2 T7 benutzt. Die cDNA für alpha1-Kollagen IV bestand aus einem 1140 Basenpaare langen, partiellen alpha1-Kollagen IV-Fragment, das zum einen für die NC1 Domäne der alpha1-Kette des Kollagen IV kodiert und zum kleineren Teil die 3’ untranslatiere Region der mRNA miterfaßt. Die cDNA lag, subkloniert in den pBlueskript SK Vektor, flankiert von Promotorstellen für T3 und T7 vor. Aus dem Plasmid wurde unter Verwendung vektorspezifischer Primer ein PCR-Produkt erzeugt, das als Matrize für die Transkription diente (s.o.). Mittels der Transkriptionspolymerase T3 wurde die Antisenseprobe, mittels T7 die Senseprobe generiert [vgl. Schäfer et al. 1994]. Die zur Detektion von Kollagen I


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verwendete cDNA kodiert für ein Fragment des 3’ Endes des murinen alpha1-Kollagen I [Metsäranta et al. 1991] und wurde dem Labor freundlicherweise von T. Aigner aus Erlangen-Nürnberg zur Verfügung gestellt. Die cDNA lag, flankiert durch die Promotorstellen der Transkriptionspolymerasen T3 und T7, subkloniert in den pBlueskript KS+ Vektors vor. Zur Generierung der Antisenseprobe erfolgte die Linearisierung des Plasmides mit Hilfe von EcoR 1 und die Transkription mit Hilfe der T3 Polymerase. Zur Generierung der Senseprobe wurde mit Hind 3 linarisiert und mit T7 transkribiert. Erworben wurden alle Transkriptionspolymerasen von Boehringer. Die jeweiligen cDNA-Proben wurden zwecks Aufreinigung vor der Transkription in Phenol/Chloroform (J.T. Baker) gelöst und unter Verwendung von Lithiumchlorid (4M, Merck) in Ethanol (100%, J.T. Baker) gefällt. Anschließend wurde zur Qualitätskontrolle eine Agarosegel-Elektrophorese (Seakem-ME Agarose, FMC, USA) durchgeführt und die Menge der generierten DNA photometrisch bestimmt (GenQuant2, Pharmacia Biotech, Freiburg).

3.4.3.2 In vitro-Transkription

Die zur Durchführung der Transkription der einzelnen cDNAs verwendeten Transkriptionspolymerasen finden aus Gründen der Übersichtlichkeit schon im vorhergehenden Abschnitt Erwähnung. Grundsätzlich wurden für alle Versuche Sense- und Antisenseproben mit Hilfe der entsprechenden Polymerasen generiert. Während die Antisenseproben zum Nachweis der zellulären RNA dienten, mit der sie Hybridverbindungen eingingen, wurden die Senseproben im gleichen Experiment als Kontrollsonden genutzt. Ein Transkriptionsansatz setzte sich jeweils zusammen aus 1 µg (Restriktionsfragment) oder 0,2 µg (PCR-Produkt) der entsprechenden DNA, gelöst in 14 µl mit Diethyl-Pyrocarbonat (DEPC,Sigma) behandeltem Wasser, 2 µl Transkriptionspuffer, 2 µl eines Nukleotidgemisches mit Digoxigenin-gelabeltem Uridintriphosphat (DIG-Labeling-Mix) und 2 µl der entsprechenden Transkriptionspolymerase (alles Boehringer). Das Gemisch wurde für 140 Minuten bei 37º inkubiert. Anschließend folgte die Degradation der DNA-Vorlage durch Zugabe von RNAse freier DNAse (Boehringer) bei 37º für 15 Minuten. Die RNA wurde entsprechend der im vorherigen Abschnitt beschriebenen DNA-Fällung gefällt, mit 80% Ethanol gewaschen und in 50-100 µl DEPC-Wasser aufgenommen. Die Qualität der Sonden wurde durch eine Agarosegel-Elektrophorese sichergestellt, die Quantität der enthaltenen RNA photometrisch bestimmt. Da bei entsprechender Sondenlänge (über 400 bp) eine verminderte zelluläre Zugänglichkeit zu erwarten war, wurden alle oben beschriebenen Transkriptionsprodukte, mit Ausnahme der Renin-, NKCC2- und Kollagen I-Sonden durch alkalische Hydrolyse fragmentiert. Hierzu wurden 50 µl des gelösten Transkripts mit 50µl eines aus 20µl 0,2 M NaHCO3 und 30 µl 0,2 M Na2CO3 (beide Riedel-de-Haën) bestehenden Carbonatpuffers versetzt und bei 60º für die Dauer einer sich aus der Ausgangslänge und Temperatur des Wasserbades errechnenden Zeiteinheit inkubiert (zwischen 45 und 60 Minuten, je nach Sonde). Die Fällung des Hydrolysates erfolgte entsprechend wie bei der Transkription. In der Regel wurden frische Hydrolysate/Transkriptionsprodukte als Sonden eingesetzt.

3.4.3.3 Hybridisierung mit Digoxigenin-gelabelten Riboproben

Zur Durchführung der In situ-Hybridisierung wurden 7 µm dicke Gefrierschnitte verwendet. Nach dem Schneiden im Kryostaten wurden die Schnitte auf silanisierte (1% Aminopropyltriethoxysilan in Wasser, Sigma) Objektträger verbracht und für 15 Minuten in 4º kaltem, 4 prozentigen Paraformaldehyd (pH 7,4) nachfixiert. Es folgten Waschschritte mit 3x5 Minuten PBS, 2x5 Minuten Wasser und erneut 2x5 Minuten PBS bei Raumtemperatur, bevor die Gewebsschnitte zur Aufschlüsselung von Proteinbindungen, die das Eindringen der Riboproben erschweren könnten, für 10 Minuten in 0,1 M HCl inkubiert wurden. Nach dem Acetylierungsschritt, der mit 0,25% Essigsäure (J.T. Baker) in 0,1 M Triethanolamin (Sigma) bei einem pH von 7,4 für 20 Minuten und 2x5 Minuten PBS durchgeführt wurde, erfolgte die Entwässerung der Schnitte in einer aufsteigenden Ethanolreihe (70%, 80%, 96% für jeweils 5 Minuten), die durch das 20 minütige Trocknenlassen der Gewebsschnitte an der Luft abgeschlossen wurde. Nach Überschichtung mit 100 µl Prähybridmix pro Schnitt, der sich zusammensetzte aus 50% deionisiertem Formamid (Merck) und 50% DEPC-H20 mit 2,5x Denhardt‘s (50x=0,5 g Ficoll 400, 0,5 g Polyvinylpyrolidon, 0,5 g bovines Serumalbumin (alles


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Boehringer) ad 50 ml DEPC-H20), 25 mM EDTA (Roth) mit einem pH von 8,0, 40 mM Tris-HCl (Trometamol (Merck)/HCl (J.T. Baker) mit einem pH von 7,4), 0,25 mg/ml t-RNA (Boehringer) und 20mM NaCl (Merck), wurden die Schnitte für 2 Stunden bei 40º in einer mit Wasser befeuchteten Kammer inkubiert und nach Absaugen mit Hybridmix bedeckt. Der Hybridmix setzte sich zusammen aus 50% deionisiertem Formamid, 40% DEPC- H20 mit 10x Denhardt‘s, 1mM EDTA (pH 8), 200mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mg/ml t-RNA , 330 mM NaCl, 1mg/ml Heringssperma-DNA (Boehringer), 0,2 M Dithiothreitol (Biomol, Hamburg), 10% Dextransulfat (Sigma) und 6-12 pg Digoxigenin-gelabelter Riboprobe. Die Gewebsschnitte wurden anschließend, um sie gegen Austrocknung zu schützen, mit silanisierten Deckgläsern (Sigmacoat, Sigma) bedeckt und für einen Zeitraum von 16-22 Stunden bei 40º in einer befeuchteten Kammer inkubiert. Die exakte Menge der zuzugegebenen Riboproben wurde in Vorversuchen bestimmt. Des weiteren wurden in jedem Versuchsansatz auch die entsprechenden Sense-Riboproben als Kontrollen verwendet. Hybridisierung mit der Sense-Probe führte in allen Experimenten zu einem Ausbleiben des Signals. Bis zu diesem Punkt der Experimente wurde für das Herstellen der Lösungen und das Befeuchten der Kammern ausschließlich autoklaviertes Wasser verwendet.

3.4.3.4 Waschen der Gewebsschnitte zur Entfernung nicht hybridisierter, markierter Riboproben

Nach der Hybridisierung wurden die Objektträger mit den aufgelegten silanisierten Deckgläschen in eine 40 º warme Lösung aus 2xSSC (standard sodium citrat (1x): 15%Natriumcitrat (Merck) und 18% Natriumchlorid in Wasser) überführt, wodurch sich die Deckgläschen von den Objektträgern lösten. In der gleichen Lösung wurden die Schnitte für 30 Minuten belassen. Nach drei weiteren Waschschritten bei 40 º (60 Minuten in 1xSSC mit 50% deionisiertem Formamid, 60 Minuten in 0,375% SSC/50%, 0,2x SSC/ 50% Formamid für 30 Minuten) erfolgten drei weitere Waschschritte bei Raumtemperatur (je zweimal 0,5x SSC für 10 Minuten und 0,2x SSC für 10 Minuten).

3.4.3.5 Detektion und Darstellung der hybridisierten Riboproben

Nach einer zehnminütigen Inkubation in Puffer 1 (100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl in Wasser mit einem pH von 7,5) wurden die Schnitte für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit jeweils 100 µl modifiziertem Blockingmedium (1% Boehringer Blocking Reagenz und 0,5% bovines Serumalbumin in Puffer 1) bedeckt. Anschließend folgte die Inkubation in einer feuchten Kammer mit einem an alkalische Phosphatase gekoppelten Antidigoxigenin-Antikörper (1:500 in modifiziertem Blockingmedium) für 2 Stunden bei Raumtemperatur auf dem Schüttler, bevor die Schnitte bei 4º über Nacht gelagert wurden. Nach zwei fünfzehnminütigen Waschschritten in Puffer 1 bei Raumtemperatur wurden die Schnitte für 2 Minuten in Puffer 3 (100mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2, in Wasser, pH 9,5) equilibriert und anschließend mit 100 µl Entwicklungspuffer, bestehend aus 4,5 µl/ml Nitro-blue Tetrazolium (75 mg/ml in 70% Dimethylformamid, Boehringer), 3,5µl/ml 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Phosphat (50mg/ml in 100% Dimethylformamid) als Substrate der Phosphatase und Levamisole (Sigma) zum Blocken der endogenen Phosphatasen gelöst in Puffer 3, bedeckt und unter Lichtabschluß in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur/4º entwickelt. Das Abstoppen der Signalentwicklung erfolgte je nach Intensität des Signales und gewählter Umgebungstemperatur nach 6-24 Stunden durch das Verbringen der Schnitte in Puffer 4 (100mM Tris-HCl, 1mM EDTA in Wasser, pH 8,0) für 2x15 Minuten bei Raumtemperatur und das anschließende Waschen für 2x15 Minuten in PBS bei Raumtemperatur. In der Folge wurden die Schnitte mit 50% Glycerin in PBS eingedeckelt und unter einem Leica DMRB- Mikroskop mit und ohne Verwendung des Interferenzkontrastes begutachtet. Das Erstellen der Photografien erfolgte mit einer angeschlossenen Leica-Kamera. Die Gewebsschnitte der Nieren aller Tiere aller Versuchsgruppen wurden jeweils in einem Experiment gemeinsam prozessiert und ausgewertet. Das Abstoppen der Entwicklungsreaktion erfolgte ebenfalls für alle Schnitte simultan.


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3.5 Statistische Auswertung

3.5.1 Quantifizierung der Signale

Die Behandlung aller Gewebsschnitte aller Versuchstiere erfolgte jeweils im gleichen Experiment unter exakt gleichen, standardisierten, histochemischen Bedingungen, bei gleicher Temperatur und gleicher Expositions- und Entwicklungszeit. Zur Beurteilung der unterschiedlichen Enzymaktivität der NO-Synthase 1 wurden die jeweils signalpositiven Zellen der Maculae Densae auf 2 Gewebsschnitten pro Versuchstier gezählt und zur Gesamtzahl der auf den Schnitten vorhandenen Glomerula (400-600) ins Verhältnis gesetzt. Die Kolokalisation von NADPH-Diaphorasereaktion und NOS-Protein kann als etabliert angesehen werden [Bachmann et al. 1995]. Es wurde angenommen, dass sich die Intensität der NADPH-Diaphorasereaktion auf Gewebsschnitten perfusionsfixierter Nieren proportional zur Aktivität der NO-Synthase 1 und zur Menge des synthetisierten NO verhält. Die Quantifizierungsmethode basiert des weiteren auf der Beobachtung, dass unter physiologischen Bedingungen nur ein Teil der MD-Zellen positive Diaphorasereaktivität aufweist, während die meisten MD-Zellen eine NOS-Aktivität aufweisen, die nicht ausreicht, eine positive Reaktion zu erzeugen und somit in diesen Zellen keine Farbentwicklung erfolgt. Lag nun aber eine Stimulation der NOS1-Aktivität vor, so wurde davon ausgegangen, dass bei einigen dieser Zellen die NOS1-Aktivität über die Nachweisgrenze anstieg und damit eine größere Anzahl Zellen als Zeichen insgesamt gesteigerter Aktivität Diaphorase-postiv wurden. In gleicher Weise wurde die Expression der NOS1-mRNA quantifiziert. Da eine komplett gleiche Behandlung der Gewebsschnitte aller Versuchstiere sichergestellt war, wurde davon ausgegangen, dass eine Erhöhung der Anzahl NOS1-mRNA-positiver MD-Zellen (d.h. eine erhöhte Anzahl derjenigen Zellen, bei denen die Expression von NOS1-mRNA über der Nachweisgrenze der Methode lag) ein Maß für die Erhöhung der Transkriptionsrate von NOS1 in der Macula densa darstellt. Analog zur Auswertung der Diaphorasereaktion wurden auch hier jeweils 2 Gewebsschnitte der Niere pro Versuchstier gewertet und das Verhältnis aus positiven Zellen zur Gesamtzahl der auf den Schnitten erkennbaren Glomerula (400-600) gebildet. Ebenfalls analog zu dieser Methodik wurde jeweils 1 Gewebsschnitt pro Versuchstier (200-300 Glomerula) im Hinblick auf Cyclooxygenase-2-Protein-positive Immunreaktivität ausgewertet. Auch hier wurde ein Verhältnis aus postiven Zellen und Gesamtzahl der gezählten Glomerula gebildet. Zur Beurteilung des Reninstatus auf mRNA und Proteinebene war diese Methode allerdings nur in abgewandelter Form verwendbar, da die Zellgrenzen der Renin-synthetisierenden Zellen der afferenten Arteriole sich auf 5/7 µm dicken, ungefärbten Schnitten nicht sicher abgrenzen lassen. In diesem Fall beruht die Quantifizierug des Reningehaltes auf dem gut belegten Umstand, dass es unter verschiedenartigster Stimulation der Reninsynthese zu einer metaplastischen Transformation von glattmuskulären Zellen der afferenten Arteriole zu Renin-syntetisierenden Zellen kommt, was zu einem verstärkten und vor allem zu einem sich nach proximal in der afferenten Arteriole ausdehnenden Signal führen muß. Dies erhöht unter Vorliegen von die Renin-Synthese stimulierenden Bedingungen die Wahrscheinlichkeit, dass auf einem Anschnitt Renin-positive afferente Arteriolen getroffen werden. Daher wurde angenommen, dass die gezählte Anzahl positiver afferenter Arteriolen pro Gewebsschnitt ein Maß für die Synthese von Renin mRNA und Protein in der afferenten Arteriole darstellt. Die hier beschriebenen Quantifizierungsmethoden können als etabliert angesehen werden [vgl. Bosse et al. 1995]. Des weiteren hat diese Methode der Quantifizierung den Vorteil mit erheblich weniger methodischen Fehlern behaftet zu sein, als beispielsweise eine Quantifizierung auf dem Boden densitometrischer Computerauswertung, wiewohl sie natürlich erheblich gröbere Werte liefert. Außerdem ist sie der RNA/Protein-Extraktion mit Blot insofern überlegen, als dass lediglich extrem wenig Zellen, gemessen an der Gesamtzahl aller renaler Zellen, in die Regulation am JGA involviert sind, was die quantitative Auswertung eines Blots mit RNA/Protein-Extraktes stark erschwert.

3.5.2 Statistische Tests

Zur Auswertung und zum Vergleich der einzelnen Gruppen kam der Mann-Whitney-U-Test zum Einsatz. Die Wahl des statistischen Vergleichsverfahrens fiel vor allem aus zwei Gründen auf den Mann-Whitney-U-Test. Zum Ersten verlangt er im Gegensatz zum t-Test keine Normalverteilung der zu vergleichenden Variablen. Und zum Zweiten sind die Ergebnisse des Tests als relativ ausreißerresistent anzusehen. Einzige Bedingung zur Durchführung ist die Unabhängigkeit der


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verglichenen Variablen voneinander. Diese Bedingung war erfüllt. Zur Durchführung des Tests wurden zunächst die Werte der zu vergleichenden Gruppen in eine Rangfolge gebracht und jedem Wert ein Rangwert, beginnend mit 1 für den kleinsten Wert, zugeordnet. Anschließend wurde die Summe der Rangwerte für die zu vergleichenden Gruppen gebildet als Summe(R1) und Summe (R2). Es folgte die Berechnung der beiden U-Werte für die entsprechenden Gruppen mit

U1=(n1·n2) + {n1·(n1+1)}/2 - Summe(R1)

U2=(n2·n1) + {n2·(n2+1)}/2 - Summe(R2)

und die Überprüfung auf ihre Signifikanz hin in einer U-Wert-Tabelle (jedes handelsübliche Statistikhandbuch). Ein p-Wert kleiner 0,025 wurde für den zweiseitigen Test als signifikant angesehen und die Nullhypothese in diesem Fall verworfen.


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