1 Einleitung

1.1  Endothel

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Den menschlichen Körper invadierende Keime und deren Produkte treten über die Blutzirkulation oder von Gewebeseite in direkten Kontakt mit dem Endothel. Physiologie und Pathophysiologie des Endothels sind daher von wesentlicher Bedeutung für das Verständnis von erfolgreicher Infektabwehr einerseits, persistierender und fortschreitender Infektion andererseits. Das Endothel bedeckt als einschichtige Barriere zwischen Blut und Gewebe eine Fläche von mehr als 1000 , wobei seine annähernd ca 1012 Einzelzellen ungefähr 0,1 kg Gesamtmasse haben [Jaffe, 1987]. Neben seiner Bedeutung für die selektive Permeabilität zwischen Blut und Gewebe ist es unter anderem beteiligt an der Regulation von Gefäßtonus und Blutfluss sowie an der Homöostase von Gerinnung und Fibrinolyse. Mit seinen immunmodulatorischen Funktionen nimmt es an der Regulation von Inflammation und Abwehr teil [Aird, 2003].

1.1.1 Bedeutung des Endothels für Inflammation und Immunität

Inflammation als Antwort auf die Exposition gegenüber Mikroorganismen oder ihren Bestandteilen, ist nach Celsus gekennzeichnet durch die klassischen Entzündungszeichen Rubor, Calor, Tumor und Dolor [Nathan, 2002]. Auf der Ebene der Gefäße umfasst die Inflammation unter anderem die Dilatation von Arteriolen, Kapillaren und Venolen mit erhöhter Permeabilität und erhöhtem Blutfluss sowie transendothelialer Migration leukozytärer Zellen in das Gewebe [Michiels, 2003]. Wesentliche zelluläre Elemente dieses Prozesses sind Granulozyten, Monozyten und Endothelzellen. Im aktivierten inflammatorischen Zustand werden eine Vielzahl löslicher und zelloberflächengebundener Proteine wie Chemokine und Adhäsionsmoleküle von diesen Zellen exprimiert [Pober undCotran, 1990]. Diese vermitteln das klinische Bild der inflammatorischen Reaktion. Die frühe Abwehrreaktion gegen Mikroorganismen stützt sich auf das System der angeborenen Immunität [Medzhitov undJaneway, 2000]. Dieses identifiziert über Muster erkennende Rezeptoren, die unter anderem auf phagozytierenden und endothelialen Zellen exprimiert werden, evolutionär konservierte molekulare Strukturen, die jeweils einer Vielzahl an Mikroorganismen gemeinsam sind. Zu diesen Molekülen gehört Lipopolysaccharid (LPS) gramnegativer Bakterien, das von Toll-like-Rezeptor-4 erkannt wird und wesentliche Bedeutung für die Pathogenese der Sepsis hat [Chow, et al., 1999;Van Amersfoort, et al., 2003]. Das Erkennen von LPS durch das Endothel führt über eine zytoplasmatische Signalkaskade zur Aktivierung von Transkriptionsfaktoren wie und konsekutiv zur Transkription abhängiger Gene mit nachfolgender Expression inflammatorischer Zytokine und Adhäsionsmoleküle [Zeuke, et al., 2002]. Unter diesen ist Interleukin-8 (IL-8/CXCL8) exemplarisch und von besonderer Bedeutung für die Pathogenese der Sepsis [Andonegui, et al., 2003;Hack, et al., 1992]. Eine vorhergehende Arbeit zeigte, dass zumindest eines der kleinen GTP-binden Proteine für die Expression von IL-8/CXCL8 in Endothelzellen von Bedeutung ist [Hippenstiel, et al., 2000]. Deshalb wurde deren Beteiligung in der vorliegenden Arbeit mit Hilfe der Überexpression inaktiver Mutanten eingehend untersucht.

1.1.2 Endotheliale Aktivierung und die Sepsis

Die Inflammation ist eine adaptive Reaktion des Endothels und essentiell zur Eindämmung und Elimination eines infektiösen Herdes. Die überschießende, generalisierte Aktivierung des Endothels ist gekennzeichnet durch exzessive Expression inflammatorisch wirksamer Proteine, Minderung antikoagulatorischer Faktoren, gestörte Barrierefunktion und endotheliale Apoptose [Peters, et al., 2003]. Diese maladaptive Antwort auf Pathogene, darunter insbesondere LPS, trägt wesentlich zur Pathophysiologie des klinischen Syndroms der Sepsis bei [Aird, 2003]. Definierend für die Sepsis ist das Vorhandensein mindestens zweier der klinischen Kriterien des Systemischen Inflammatorischen Antwortsyndroms (SIRS), die sich auf Fieber oder Hypothermie, Tachykardie, Tachypnoe oder Hypokapnie, Leukozytose oder Leukopenie beziehen, und zusätzliche Evidenz für eine ursächliche Infektion [Bone, et al., 1992]. Dabei ist die Sepsis ein Kontinuum, das über die Schwere Sepsis, definiert als Sepsis kompliziert durch akute Organdysfunktion, bis zum Multiorgandysfunktionssyndrom (MODS) reicht. Die Inzidenz der Sepsis mit Erregernachweis in der Blutkultur lag 1989 in einer prospektiven Einjahresstudie am Klinikum Steglitz der Freien Universität Berlin bei 8,1 Promille der Krankenhauseinweisungen und die Mortalität bei 20,8 % [Geerdes, et al., 1992]. Zahlreiche experimentelle Ansätze in der Therapie der Sepsis zielen auf Elemente der proinflammatorischen und prokoagulatorischen

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Signalkaskaden und umfassten bisher unter anderem Antikörper gegen LPS [McCloskey, et al., 1994], gegen LPS-Rezeptor-Bestandteile [Verbon, et al., 2001], Inhibitoren intrazellulärer Signalmoleküle wie der p38-MAPK [Branger, et al., 2002] sowie aktiviertes Protein C [Bernard, et al., 2001]. Weil mit diesen Therapieansätzen kaum Erfolge erzielt wurden, wird die Bedeutung der Inflammation für die Pathophysiologie der Sepsis kontrovers diskutiert [Hotchkiss undKarl, 2003]. Allein für den Einsatz von aktiviertem Protein C konnte eine Minderung der sepsisassoziierten Mortalität gezeigt werden [Bernard, et al., 2001].

1.1.3 Die humane mikrovaskuläre Endothelzelllinie HPMEC-ST1.6R

Primäre Endothelzellen exprimieren konstitutiv den von Willebrand-Faktor (vWF) [Jaffe, et al., 1974], das Plättchen-Endothelzell-Adhäsionsmolekül-1 (PECAM-1/ CD31) [Albelda, et al., 1990] sowie die Vaskulären Endothelialen Wachstumsfaktor-Rezeptoren Flt-1 und KDR [Hewett undMurray, 1996]. Sie reagieren in vitro auf proinflammatorische Stimuli mit der Expression der Zelladhäsionsmoleküle Interzelluläres Zelladhäsionsmolekül-1 (ICAM-1, CD54), Vaskuläres Zelladhäsionsmolekül-1 (VCAM-1, CD106), Endotheliales Leukozyten-Adhäsionsmolekül-1 (ELAM-1, E-Selektin, CD62E) und der Sekretion inflammatorischer Zytokine, darunter Interleukin-8 (IL-8/CXCL8) und Interleukin-6 (IL-6) [Unger, et al., 2002]. Diese zellspezifischen Charakteristika definieren neben einigen weiteren den endothelialen Zelltyp und können zur Identifikation endothelialer Zellen benutzt werden. Die humane pulmonale mikrovaskuläre Endothelzelllinie HPMEC-ST1.6R wurde durch Transformation mit zwei Genen, codierend für das große T-Antigen aus SV40 und für die humane Telomerase generiert [Krump-Konvalinkova, et al., 2001]. Sie ist gekennzeichnet durch die Induktion von ICAM-1, ELAM-1 und VCAM-1 nach Stimulation mit LPS, TNF-α, IL-1β und durch die Induktion von IL-6, IL-8/CXCL8, MCP-1, GM-CSF nach Exposition gegen LPS [Krump-Konvalinkova, et al., 2001]. Der Vorteil dieser Linie gegenüber anderen endothelialen Zelllinien ist damit der weitgehende Erhalt des endothelialen Phänotyps, der vermutlich auf die zusätzliche Expression der humanen Telomerase zurückzuführen ist [Unger, et al., 2002]. Im Vergleich zur Nutzung primärer Endothelzellen fällt bei Verwendung der Linie HPMEC-ST1.6R die zeitaufwändige Isolation primärer Zellen, die innerhalb weniger Passagen verschiedene der genannten zellspezifischen Charakteristika verlieren, weg. Daneben ist die Kontaminationswahrscheinlichkeit geringer und die genetische Variabiltät primärer Zellen aus verschiedenen Spenderindividuen entfällt. Die Linie eignet sich daher gut für das Studium der Pathomechanismen der Inflammation am reifen mikrovaskulären Endothel und wurde in dieser Arbeit eingesetzt.

1.2 Lipopolysaccharid-induzierter Signalweg in Endothelzellen

1.2.1 Lipopolysaccharid (LPS) gramnegativer Bakterien

Lipopolysaccharid (LPS) ist der Hauptbestandteil der äußeren Membran gramnegativer Bakterien. Die Membran einer einzelnen E. coli enthält annähernd 3 x LPS-Moleküle [Nikaido, 1987]. Andere Membranbestandteile sind Glycerolphospholipide und Proteine. Als integraler Bestandteil der bakteriellen Membranstruktur werden die hitzestabilen Lipopolysaccharide der gramnegativen Bakterien als Endotoxine bezeichnet. Durch ihre Rezeptorbindung wird, im Gegensatz zu den sezernierten hitzelabilen, eiweißartigen und meist enzymatisch aktiven Ektotoxinen, das System der angeborenen Immunität aktiviert. LPS wird unter anderem bei bakterieller Zellteilung, Lyse der Zelle oder Interaktion mit dem Komplementsystem aus der äußeren Membran freigesetzt [Van Amersfoort, et al., 2003]. Dann kann der eigentlich endotoxisch wirksame Bestandteil des LPS, das Lipid A, die inflammatorischen Wirkungen vermitteln.

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Den bis heute untersuchten LPS verschiedener gramnegativer Bakterien ist eine molekulare Grundstruktur gemeinsam, die nach dem Grad ihrer evolutionären Konserviertheit sowie ihrer Bedeutung für das Bakterium und das Immunsystem des Wirts formal in drei Teile gegliedert wird: Kern, Lipid A und O-Kette. Lipid A verankert das LPS-Molekül in der Membran, ist evolutionär maximal konserviert, ist der rezeptorbindende Teil des LPS und damit als einzelne Komponente, auch als rein chemosynthetisches Lipid A, fähig alle endotoxischen Wirkungen des LPS zu vermitteln [Galanos, et al., 1985;Rietschel, et al., 1994]. Da die O-Kette, bzw. das O-Polysaccharid das wesentliche Antigen ist, das im Wirtsorganismus die adaptive Immunität induziert, wird es auch als O-Antigen bezeichnet. Bakterien, welche die Oberfläche von Schleimhäuten besiedeln, exprimieren oft eine trunkierte O-Kette, die als Lipooligosaccharid (LOS) bezeichnet wird. Die Teile Lipid A und innerer Kern sind evolutionär so hoch konserviert, dass sie für alle

Stämme von E. coli und Salmonella identisch sind [Erridge, et al., 2002]. Dagegen sind für den äußeren Kern von E. coli 4 eigene Strukturen und für die O-Kette 160 Serotypen beschrieben [Erridge, et al., 2002].

1.2.1.1 Struktur von Lipid A und endotoxische Aktivität

Die Struktur des Lipid A variiert je nach bakterieller Spezies. Diese Strukturvariationen beeinflussen die endotoxische Aktivität des jeweiligen Lipid A. Die Struktur des Lipid A von E. coli gilt als nahe am Optimum für das Erkennen durch den humanen LPS-Rezeptor, so dass Lipid A von E. coli maximale endotoxische Aktivität zeigt [Rietschel, et al., 1994]. Abweichungen von dieser Struktur führen typischerweise zu einer geringeren biologischen Aktivität, wie sie für LPS von Clamydia trachomatis [Ingalls, et al., 1995] beschrieben ist, bis hin zur antagonistischen biologischen Aktivität, die für das Lipid A von Rodobacter sphaeroides [ Qureshi, et al., 1991 ] nachgewiesen wurde.

1.2.1.2 Lipopolysaccharid von Escherichia coli

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E. coli ist als einer der wesentlichen Kommensalen im menschlichen Darm ein notwendiger Bestandteil für die Physiologie des Gastrointestinaltraktes, und der Darm enthält einige Gramm an LPS von E. coli [ Erridge, et al., 2002 ]. Unter physiologischen Umständen gelangt ein sehr begrenzter Teil davon in den Portalkreislauf und wird von Kupfer-Zellen der Leber über nicht stimulierende Wege degradiert. Unter pathophysiologischen Bedingungen können größere Mengen LPS aus dem Gastrointestinaltrakt in den Kreislauf gelangen und die LPS-abhängigen Signalwege aktivieren [Erridge, et al., 2002;Martinez-Pellus, et al., 1997]. Das in dieser Arbeit eingesetzte LPS wurde aus E. coli, Serotyp O111:B4, aufgereinigt.

1.2.2 Rezeptorbindung von LPS

Endothelzellen binden Lipopolysaccharid gramnegativer Bakterien an ihrer Zelloberfläche über einen Rezeptorkomplex, der zumindest die drei Komponenten sCD14 [Pugin, et al., 1993], Toll-like Rezeptor-4 (TLR-4) [Zeuke, et al., 2002] und MD-2 [Shimazu, et al., 1999] enthält, wobei der transmembranäre TLR-4 die signalweiterleitende Komponente ist [Henneke undGolenbock, 2002]. Dass auch in Endothelzellen die Aktivierung über TLR-4 erfolgt, wurde für eine Linie humaner dermaler mikrovaskulärer Endothelzellen gezeigt [Faure, et al., 2000].

1.2.3 Humane Toll-like-Rezeptoren

Der transmembranäre LPS-Rezeptor TLR-4 gehört der Interleukin-1-Rezeptor- Toll-like-Rezeptor-Superfamilie an [Dunne undO'Neill, 2003]. Deren Mitglieder sind durch eine zytosolisch lokalisierte homologe Domäne gekennzeichnet, die nach den zuerst bekannten Mitgliedern dieser Superfamilie, dem menschlichen Interleukin-1-Rezeptor und dem Protein Toll aus Drosophila melanogaster, Toll-IL-1-Rezeptor-Domäne (TIR-Domäne) genannt wird [Gay undKeith, 1991]. Der Superfamilie gehören neben humanen Rezeptoren und dem Toll-Protein auch Mitglieder in Pflanzen an. Speziesübergreifend ist die Abwehr von Infektionen das gemeinsame "Thema" im IL-1-TLR-System [O'Neill undGreene, 1998].

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Zurzeit sind 10 humane TLRs beschrieben, die verschiedene evolutionär konservierte Strukturen mikrobieller Herkunft, darunter Bestandteile der Zellmembran grampositiver und gramnegativer Bakterien, DNA bakterieller und RNA viraler Herkunft, aber auch körpereigene Strukturen, die in Verbindung mit Gewebeschädigung stehen, z.B. Hitzeschockprotein-60 und Fibrinogen, erkennen [Lien, et al., 2002]. Die TLRs werden deshalb auch Muster erkennende Rezeptoren und ihre Liganden pathogen assoziierte molekulare Muster genannt. Allen TLRs ist gemeinsam, dass sie mehr als einen Liganden erkennen und für die Signaltransduktion Rezeptorkomplexe formen, die aus einem Heterodimer verschiedener TLRs oder, wie bei der Signaltransduktion von LPS über TLR-4, aus einem Homodimer desselben TLRs bestehen. Sie werden unter anderem auf Monozyten und Makrophagen, Granulozyten, dendritischen Zellen und Endothelzellen sowie auf Zellen der lymphatischen Gewebe exprimiert. Für verschiedene Zellen wurde gezeigt, dass die Expression nicht allein konstitutiv ist, sondern durch Zellaktivierung reguliert wird [Lien, et al., 2002].

Am besten untersucht sind TLR-2 und -4, die u.a. bakterielle Strukturen erkennen. TLR-4 erkennt neben LPS weitere bakterielle Glykolipide, Bestandteile von Mykobakterien und Aspergillus fumigatus, Hitzeschockprotein-60, Fibrinogen und wird in Monozyten, Endothelzellen und Granulozyten exprimiert [Lien, et al., 2002].

Ob LPS Ligand an TLR-2 oder TLR-4 ist, war zunächst unklar, denn zuerst postulierte eine Arbeit TLR-2 als den LPS-bindenden Rezeptor. Weitere Studien zeigten aber, dass die nicht LPS-sensiblen Mausstämme C3H/HeJ und

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C57BL/10ScCr jeweils eine Mutation bezüglich ihres für TLR-4 codierenden Gens aufweisen [Poltorak, et al., 1998]. Eine nachfolgend konstruierte TLR-4-defiziente Maus erwies sich ebenfalls als nicht LPS-sensitiv [Hoshino, et al., 1999]. Überexpressionsexperimente mit TLR-4 in HEK293-Zellen zeigten dann, dass für die Aktivierbarkeit durch LPS TLR-4 allein hinreichend ist [Chow, et al., 1999]. Weitere Studien bewiesen, dass Zellen des Chinesischen Hamsters LPS-sensibel sind, obwohl im Chinesischen Hamster eine natürliche Mutation des TLR-2-Gens vorliegt, die zur Expression eines nicht funktionierenden Proteins führt [Heine, et al., 1999]. Diese Ergebnisse wurden mit einer TLR-2-Knockout-Maus bestätigt, die sich ebenfalls als LPS-sensitiv erwies [Takeuchi, et al., 1999]. Eine spätere Arbeit legte nahe, dass die vermeintliche Aktivierbarkeit durch LPS via TLR-2 nicht durch LPS, sondern durch Kontaminationen der verwendeten LPS-Zubereitung mit Lipoprotein verursacht wurde [Hirschfeld, et al., 2000]. Die kontaminierenden Proteine konnten durch Phenol-Extraktion beseitigt werden. Das in dieser Arbeit verwendete LPS wurde ebenfalls durch Phenol-Extraktion gereinigt. So ist heute Konsens, dass TLR-4 sicher als transmembranärer Rezeptor für LPS fungiert [Beutler undPoltorak, 2000;Medzhitov, 2001]. Ausnahmen sind allerdings beschrieben für LPS von Porphyromonas gingivalis und Leptospira interogans, die beide an TLR-2 binden [Lien, et al., 2002].

1.2.4 Signalkaskade unterhalb TLR-4 in humanen Endothelzellen

Über die zytoplasmatische Domäne von TLR-4, die TIR-Domäne, wird eine nachfolgende intrazelluläre Signalkaskade aktiviert, welche jener unterhalb anderer TLRs oder des IL-1-Rezeptors als weitgehend ähnlich gilt [Zhang, et al., 1999]. Für diese zytoplasmatische Signalkaskade unterhalb der TIR-Domäne ist in unterschiedlichen Zellen für verschiedene Stimuli eine Vielzahl an Proteinen nachgewiesen. Nach Henneke sind danach in Endothelzellen vermutlich zumindest das myeloid differentiation protein 88 (MyD88) [Medzhitov, et al., 1998], die IL-1 receptor associated kinase (IRAK) [Zhang, et al., 1999], der tumor necrosis factor associated factor-6 (TRAF-6) [Zhang, et al., 1999], das MyD88-adapter-like/TIR domain-containing adapter protein (MAL/TIRAP), das Toll-interacting protein (TOLLIP), das Evolutionär-konservierte Intermediat im Toll-Signalweg (ECSIT) und unterhalb dieser Proteine die MAP-Kinasen [Arditi, et al., 1995;Schumann, et al., 1996] und Mitglieder der /-Superfamilie [Wrighton, et al., 1996] in der Signalweiterleitung beteiligt [Henneke undGolenbock, 2002]. Hippenstiel et al. haben die Beteiligung von Rho-GTPasen, MKK6, p38-MAPK und NF-κB bei der LPS-induzierten Expression von Interleukin-8 nachgewiesen [Hippenstiel, et al., 2000].

Abb. 1: LPS-induzierter Signalweg in Endothelzellen

Grün unterlegte Signalproteine sind in LPS-stimulierten Endothelzellen experimentell nachgewiesen, TLR-4 und CD14 in dermalen mikrovaskulären Endothelzellen, MKK6, erk-1, p38 und Mitglieder der Rho-Familie in humanen umbilikalvenösen Endothelzellen (HUVEC). Nicht unterlegte Signalproteine werden vermutet. Die einzelnen Rho-GTPasen im Signalweg werden in dieser Arbeit näher untersucht.

1.2.5 Kleine GTP-bindende Proteine in der LPS-induzierten Signalkaskade

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Eine Beteiligung kleiner GTP-bindender Proteine aus der Rho-Familie in der LPS- induzierten Signalkaskade in Endothelzellen wurde erstmals durch Verwendung bakterieller Exotoxine aus Clostridium difficile, die Proteine der Rho-Familie durch kovalente Modifikation des GTP-bindenden Proteins in ihrer GTPase-Aktivität inhibieren, nachgewiesen [Hippenstiel, et al., 2000]. Darauf wird unter 1.3.7 Bedeutung von RhoA, Rac1 und Cdc42 für die Expression von lL-8/CXCL8 näher eingegangen.

1.2.6 Transkriptionsfaktoren in der Signalkaskade

LPS aktiviert über intrazelluläre Signalwege Transkriptionsfaktoren, welche die Expression inflammatorischer Proteine regulieren. Von besonderer Bedeutung für die Inflammation ist der Transkriptionsfaktor NF-κB [Barnes undKarin, 1997]. Weiterhin wird die Expression inflammatorisch wirksamer Zytokine u.a. auch durch AP-1 [Foletta, et al., 1998] und C/EBP [Tengku-Muhammad, et al., 2000] reguliert. Diese drei Transkriptionsfaktoren und die in dieser Arbeit verwendete Reporterzelllinie für zwei dieser Faktoren werden nachfolgend vorgestellt.

1.2.6.1 Nukleärer Faktor-κB (NF-κB)

1986 wurde erstmals als nukleärer Faktor, der an ein Verstärkerelement in der Promotorregion des für die codierenden Gens bindet, identifiziert und wurde zunächst als spezifisch für B-Lymphozyten beschrieben [Sen undBaltimore, 1986]. Es wurde aber schnell deutlich, dass als Teil der Superfamilie von NF-κB/Rel-Proteinen ein ubiquitär verbreiteter Transkriptionsfaktor mit evolutionär konservierten Homologen in zahlreichen Spezies von der Fruchtfliege bis zu Säugern ist, und dass in der Transkriptionskontrolle schnell induzierbarer Proteine eine zentrale und meist unverzichtbare Rolle spielt [Baldwin, 2001;Silverman undManiatis, 2001]. ist ein Dimer aus verschiedenen Mitgliedern der /Rel-Familie, die über ihre gemeinsame evolutionär konservierte Rel-Homologie-Region (RHR) definiert sind. In den meisten Säugerzelltypen ist das p65/p50-Heterodimer am häufigsten vorhanden. Im Zytosol liegt als inaktiver Komplex aus dem -Dimer und dem Protein IκB vor. Die Aktivierung von erfolgt durch proteolytische Degradierung von IκB, folgende Translokation in den Nukleus und Bindung an das -Kontrollelement in der Verstärkerregion des abhängigen Gens. Darüberhinaus kann die Phosphorylierung der p65-Untereinheit von als ein Mechanismus der Transaktivierung erfolgen [Schmitz, et al., 2001].

1.2.6.2 Aktivatorprotein-1 (AP-1)

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Aktivatorprotein-1 (AP-1) bezeichnet eine Familie dimerer Transkriptionsfaktoren, die durch Bindungsaktivität für die Sequenz TGACTCA gekennzeichnet ist [Foletta, et al., 1998]. Mitglieder der b-zip-Superfamilie formen AP-1, indem sie Homo- oder Heterodimere bilden. AP-1 wurde primär als Protein, das eine regulatorische Sequenz in der Verstärkerregion des SV-40 bindet, beschrieben [Lee, et al., 1987]. Inzwischen wurden Bindungsstellen für AP-1 in einer Vielzahl von Genen eukaryotischer Zellen nachgewiesen, darunter auch in vielen, die für Zytokine und Adhäsionsmoleküle mit immunmodulatorischen Funktionen codieren [Martin, et al., 1997;Mukaida, et al., 1990;Whitley, et al., 1994]. Die Regulation von AP-1 selbst ist komplex, weil eine Reihe verschiedener Proteine aus der b-zip-Gruppe zu AP-1 dimerisieren können und die Transkription dieser Proteine selbst durch mitogene, stressende und inflammatorische Stimuli reguliert wird [Foletta, et al., 1998]. Eine inaktivierende Mutation innerhalb der AP-1-Bindungsstelle in der Verstärkerregion des IL-8/CXCL8-Gens reduzierte die IL-1β-stimulierte Reporterexpression in Caco-2-Zellen auf 30 % des Wertes der Wildtypsequenz [Wu, et al., 1997].

1.2.6.3 Die Lipopolysaccharid-reagible Reporterlinie CHO-3E10

Die Reporterzelllinie CHO-3E10 wurde gezielt konstruiert, um den Lipopolysaccharid-induzierten Signalweg zu studieren. Unter Verwendung der Zelllinie wurden die LPS-induzierten Proteine Hop und H411 identifiziert, und sie wurde eingesetzt, um die Frage nach der transmembranären Komponente des LPS-Rezeptors zu klären [Chow, et al., 1999]. Die Linie CHO-3E10 ist stabil mit dem humanen Zelloberflächenantigen CD14 und dem Reporterplasmid pUMS(ELAM)-Tac transfiziert. Dieser Vektor enthält als zu exprimierende DNA die für das humane CD25-Antigen codierende cDNA unter der transkriptionellen Kontrolle einer Promotorregion, die aus einem Segment der humanen ELAM-1/ CD62E-Verstärkerregion von –241 bis –54 bp relativ zur Stelle des Transkriptionsstarts und einem Minimalpromotor aus dem Hasen-β-Globin-Gen zusammengesetzt ist. Das Konstrukt mit dem Fragment aus der ELAM-1/CD62E-Verstärkerregion, enthält Kontrollelemente für die Transkriptionsfaktoren und AP-1 [Delude, et al., 1998;Jensen undWhitehead, 2003;Whitley, et al., 1994]. Die Expression von CD25 in CHO-3E10 ist LPS-reagibel. Die LPS-induzierte Translokation von in den Nukleus sowie die Expression von CD25 an der Zelloberfläche wurden nachgewiesen [Delude, et al., 1998].

1.2.6.4 CCAAT/Verstärker-bindendes Protein-β (C/EBP-β)

Der zur C/EBP-Familie gehörigen Transkriptionsfaktor CCAAT/Enhancer- bindendes Protein-β (C/EBP-β) wurde 1990 als Nukleärer Faktor-Interleukin-6 (NF-IL-6) für die Transkription von Interleukin-6 beschrieben [Akira, et al., 1990]. Er transaktiviert die Genexpression durch Bindung an sein cis-Element, die CCAAT-Sequenz [Wedel undZiegler-Heitbrock, 1995]. C/EBP-β gehört zur Superfamilie der Basic-Zipper-Transkriptionsfaktoren, die sich durch zwei homologe konservierte Domänen, die Basic- und die Leucin-Zipper-Region, definieren [Ramji undFoka, 2002]. Über Heterodimere innerhalb der C/EBP-Familie hinaus wurde auch die Dimerisierung mit anderen Mitgliedern der b-zip-Superfamilie mit konsekutiv veränderter Affinität zu entsprechenden Bindungsstellen beschrieben. Weiterhin interagieren C/EBPs mit Transkriptionsfaktoren außerhalb der b-zip-Superfamilie, insbesondere mit [LeClair, et al., 1992;Stein, et al., 1993]. Als Zielgene für die Transkriptionskontrolle durch C/EBP-β und weitere Mitglieder der Familie wurden unter anderem eine Vielzahl von in die Immunantwort involvierten Genen wie Zytokingenen in monozytären Zellen [Bretz, et al., 1994], ICAM-1 in Endothelzellen [Hou, et al., 1994] und für Akute-Phase-Proteine codierende Gene in Leberzellen [Ramji, et al., 1993] beschrieben. Für die TNF-α-stimulierte IL-8/ CXCL8-Expression in COS- und HeLa-Zellen konnte bei gleichzeitiger Bindung von an sein cis-Element eine verbesserte Bindung von C/EBP-β an sein Kontrollelement nachgewiesen und ein synergistisches Wirken auf die Transkription gezeigt werden [Stein undBaldwin, 1993]. Für die IL-1β- stimulierte Expression von IL-8/CXCL8 in Caco-2-Zellen wurde ebenfalls ein synergistisches Wirken von C/EBP-β mit gezeigt [Wu, et al., 1997].

1.3 Kleine GTP-bindende Proteine

1.3.1 Die Ras-Superfamilie

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Die Ras-Superfamilie kleiner GTP-bindender Proteine ist gekennzeichnet durch übereinstimmende Aminosäuresequenzen, welche die molekulare Basis für die Wechselwirkungen mit Guanosindiphosphat (GDP) und Guanosintriphosphat (GTP) der Proteine darstellen. Sie hat Mitglieder in allen untersuchten eukaryoten Spezies. Die kleinen GTP-bindenden Proteine haben intrinsische GTP-hydrolysierende Aktivität, die GTP in GDP und Phosphat umsetzt, und werden deshalb als GTPasen (Guanosintriphosphatasen) bezeichnet. Bei ihnen handelt es sich im Unterschied zu den heterotrimeren G-Proteinen, die in ihrer α-Untereinheit eine homologe GTP-bindende Aminosäuresequenz aufweisen, um monomere Proteine mit Molekularmassen zwischen 20 und 40 kDa [Bourne, et al., 1991]. Die für die namengebenden Ras-Proteine (von rat sarcoma) codierenden Gene wurden 1978 und 1979 erstmals als Onkogene in den zur Gruppe der Retroviren gehörigen Harvey- und Kirsten-Sarkom-Viren beschrieben, die bei ihrem Wirt, der Ratte, Sarkome induzieren [Shih, et al., 1978]. Später wurden ihre korrespondierenden zellulären Proto-Onkogene in humanem Gewebe und ihre mutierten Formen in humanen Krebsgeweben nachgewiesen [Ellis, et al., 1981]. Aktivierende Mutationen in Ras Genen finden sich in 10–20 % aller humanen Tumorgewebe [Feig, et al., 1987], wobei die Inzidenz für einzelne Tumorgewebe wesentlich höher liegt, etwa bei 50 % für das Colonkarzinom [Calvert undFrucht, 2002]. Es wurde gezeigt, dass die Ras-Proteine für Zellteilung, Proliferation und Differenzierung bedeutsam sind [Spaargaren, et al., 1995]. In Folge wurde eine große Zahl strukturell verwandter kleiner GTP-bindender Proteine mit vielfältigen Funktionen, darunter Regulation des Zytoskeletts, Zellmotilität, Vesikeltransport und Beteiligung in Signalwegen zur Transkriptionskontrolle, beschrieben. Die zurzeit bekannten über 100 Mitglieder der Ras-Superfamilie können nach ihrer Struktur in fünf Subfamilien, die Ras-, Rho-, Rab-, Sar1/Arf-und Ran-Familie, klassifiziert werden [Takai, et al., 2001]. Die Mitglieder der Ras-, Rho- und Rab-Familien tragen an ihrem COOH-terminalen Ende spezielle Sequenzen, deren posttranslationelle Substitution mit Lipiden als Voraussetzung für ihre Membranverankerung und damit subzelluläre Lokalisation dient. Diese membranständige Lokalisation ist wiederum eine Voraussetzung für ihre physiologische Funktion [Zhang undCasey, 1996].

1.3.2 Molekulares Funktionsprinzip

Durch ihre GTPase-Aktivität wechseln die kleinen GTP-bindenden Proteine zwischen ihrer aktiven GTP-bindenden Konformation und ihrer inaktiven GDP-bindenden Konformation, wobei Bindung und Hydrolyse des GTP durch verschiedene Proteine, die aktivierenden GDP/GTP-Exchange-Faktoren (GEFs) und die inaktivierenden GTPase-Aktivierenden-Proteine (GAPs) katalytisch reguliert werden (Abb. 2) [Hall, 1990]. Die GTP-bindenden Proteine wirken auf diese Weise als molekulare Schalter. In ihrer aktiven Konformation aktivieren sie flussabwärtsstehende Effektorproteine. Die Regionen der Konformationsänderung werden Switch1 und Switch2 genannt. Unter anderem für den experimentellen Einsatz negativer Varianten der GTP-bindenden Proteine ist von Bedeutung, dass einige GEFs in vitro mehrere verschiedene GTPasen aktivieren können [Feig, 1999]. Die Mitglieder der Rho-Familie werden zusätzlich von GDP-Dissoziations-Inhibitoren (GDIs) inhibiert [Ridley, 1997]. Diese GDIs können mit der inaktiven GDP-bindenden Form der Rho-Proteine komplexieren, deren membran-verankerndes Lipidmotiv maskieren und so inaktive Proteine im Zytosol lokalisieren. GTPase-Aktivität und Schaltermechanismus sind durch ent-sprechende Identitäten der Aminosäuresequenz in nahezu allen bekannten GTP-bindenden Proteinen konserviert [Takai, et al., 2001]. Die in stetig steigender Anzahl beschriebenen GEFs, GAPs und GDIs bilden die biochemische Grundlage für die komplexe zell- und stimulusspezifische Aktivierung der Rho-GTPasen.

Abb. 2 : Aktivierung von Rho-Proteinen, modifiziert nach [Ridley, 1997]

1.3.3  Die Rho-Familie

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Im Jahr 2003 waren für die Rho-Familie 22 in Säugerzellen exprimierte Mitglieder beschrieben, von denen RhoA, Rac1 und Cdc42 am häufigsten untersucht wurden [Aspenstrom, et al., 2003;Etienne-Manneville undHall, 2002]. Später be-schriebene Mitglieder zeigen zum Teil trotz naher Sequenz-Homologie zu RhoA biochemisch und zellbiologisch sehr verschiedene Eigenschaften. So haben die Proteine Rnd1, 2 und 3 keine GTPase-Aktivität und sind konstitutiv aktiv, sie sollen in einem Signalweg stehen, der die RhoA-abhängigen zytoskelettalen Wirkungen antagonisiert [van Nieuw Amerongen undvan Hinsbergh, 2001]. Für RhoH sind als einzigem der Rho-Proteine direkt onkogene Eigenschaften nachgewiesen. Es ist an der Genese einer Untergruppe von Non-Hodgkin-Lymphomen beteiligt und soll daneben antagonistisch gegenüber anderen Rho-Proteinen bezüglich der Aktivierung der p38-MAPK und des Transkriptionsfaktors wirken [Aspenstrom, et al., 2003]. Abbildung 3 zeigt, dass 70 % der Aminosäuresequenz von Rac1 und Cdc42 identisch sind. Beide GTPasen rekrutieren eine gemeinsame Gruppe von Effektoren, die jeweils über eine gemeinsame als Cdc42/Rac-interaktives-Bindungs-Muster (CRIB) bezeichnete Sequenz von 15 Aminosäuren verfügen. Zu den von Rac1 und Cdc42 gemeinsam rekrutierten Effektoren gehört zum Beispiel die Familie der p21-aktivierten Kinase (PAKs). Mit RhoA teilen Rac1/Cdc42 dagegen nur ca. 45 % gemeinsame Aminosäuresequenz, wie Abbildung 3 zeigt. RhoA rekrutiert über spezifische Sequenzen Effektoren wie die Protein-Kinase N (PKN), Rho-Kinase (ROCK) und ihre Homologe, für die keine Interaktion mit Rac1/Cdc42 beschrieben ist [Hakoshima, et al., 2003].

Abb. 3: Aminosäuresequenzen für RhoA, Rac1 und Cdc42 (Genbank, NCBI) Identische Aminosäuren (AS) sind eingerahmt, RhoA teilt mit Rac1, Cdc42 zu ≈ 45 % gemeinsame AS-Sequenzen, Rac1 und Cdc42 zu ≈ 70 %. Hoch konserviert ist unter anderem der Bereich der inaktivierenden Mutationen RhoAT19N und Rac1/Cdc42T17N, die der inaktivierenden Mutation RasS17N entsprechen. Darstellung der Sequenzen mit SeqVu Alignment Software (Garvan Institute of Medical Research).

1.3.3.1 RhoA (Ras homologous member A)

Das erste Gen der Rho-Familie wurde 1985 aus der Nacktschnecke Aplysia geklont [Madaule undAxel, 1985]. In der Folge wurden drei hoch konservierte humane Homologe, RhoA, RhoB und RhoC geklont. Zum Beispiel sind die Proteine RhoB und RhoC in Mensch und Maus zu 100 % identisch. Die Aminosäuresequenz von humanem RhoA ist zu 92 % identisch mit humanem RhoC und zu 85 % mit humanem RhoB [Ridley, 1997]. Alle drei GTPasen werden posttranslationell modifiziert, wobei RhoA und RhoC mit einer Geranylgeranyl-Gruppe und RhoB zusätzlich mit einer Farnesylgruppe substituiert werden. Entsprechend der unterschiedlichen Isoprenylierung sind RhoA und RhoB an der Plasmamembran lokalisiert, während RhoB primär mit Endosomen und Lysosomen assoziiert ist.

1.3.3.2 Rac1 (Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1)

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Rac1 und 2 wurden 1989 [Didsbury, et al., 1989], Rac3 1997 jeweils aus humanen Genbibliotheken geklont. Bei den Proteinen handelt es sich um Isoformen, deren Aminosäuresequenzen zu 89 bis 92 % homolog sind, wobei Rac1 und 3 ubiquitär und Rac2 primär in Zellen der hämatopoetischen Linie exprimiert werden [Haataja, et al., 1997]. Wie Rho werden die Rac-Proteine posttranslationell modifiziert, wobei sich Rac3 in der hierfür relevanten C-terminalen Region von Rac1 und 2 unterscheidet. Rac-Proteine können in vitro durch die C3-Transferase aus Clostridium botulinum ADP-ribosyliert werden und wurden danach benannt, aber die Rac-Proteine sind nicht in vivo Substrat der C3-Transferase [Just, et al., 1992]. Der Unterschied ist insofern bemerkenswert, als die C3-Transferase vielfach als molekulares Werkzeug zur spezifischen Inhibition von RhoA, B und C eingesetzt wurde, wobei neuere Ergebnisse daneben auch eine Interaktion der C3-Transferase mit der kleinen Ras-GTPase Ral A zeigen [Wilde, et al., 2002].

1.3.3.3 Cdc42 (cell division cycle 42)

Die Sequenz für Cdc42 wurde 1990 aus einer humanen plazentären Genbibliothek geklont und aufgrund der hohen Sequenzidentität mit dem Gen Cdc42 aus Saccharomyces cerevisiae, dessen Genprodukt in der Hefe den Zellzyklus reguliert, Cdc42Hs (Human source) genannt [Munemitsu, et al., 1990]. Die ektope Expression von Cdc42Hs kann in der Hefe eine Funktionsverlustmutante des Hefe-Gens voll ersetzen [Shinjo, et al., 1990]. In der humanen Rho-Familie kann Cdc42 mit den GTPasen TC10 und TCL aufgrund einer Identität der Aminosäuresequenzen von ungefähr 80 % zu einer Subgruppe zusammengefasst werden. Cdc42 wird posttranslationell prenyliert und ist subzellulär mit mikrosomalen Membranen assoziiert.

Die Funktion kleiner GTP-bindender Proteine der Rho-Familie wurde in bisherigen Arbeiten vor allem durch den Einsatz aktivitätsverändernder clostridialer Toxine und die Mikroinjkektion dominant negativer Proteinmutanten untersucht. Mit diesen Mitteln wurde zuerst ihre das Zytoskelett regulierende Funktion beschrieben. Eine Arbeit, welche die zellabrundende Wirkung des Enzyms C3-Transferase aus Clostridium botulinum auf die Inaktivierung von RhoC zurückführte, war dabei wegweisend [Chardin, et al., 1989]. Im folgenden werden zunächst die bakteriellen Toxine vorgestellt, anschließend die Wirkungen von Rho-GTPasen auf das Zytoskelett beschrieben und dann ihre Bedeutung für die Transkription und Expression von IL-8/CXCL8 erläutert.

1.3.4 Bakterielle Toxine modifizieren die Aktivität kleiner GTP-bindender Proteine

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Verschiedene bakterielle Proteine katalysieren die kovalente Modifikation kleiner GTP-bindender Proteine und verändern damit deren biologische Aktivität [Barbieri, et al., 2002]. Während der Zytotoxische Nekrotisierende Faktor (CNF) aus E. coli GTP-bindende Proteine der Rho-Familie aktiviert [Hoffmann undSchmidt, 2004], wirken verschiedene Toxine aus der Gattung der Clostridien inaktivierend auf kleine GTP-bindende Proteine [Schirmer undAktories, 2004]. Die C3-Transferase aus Clostridium botulinum inhibiert RhoA, B und C durch ADP-Ribosylierung an Asparagin 41 [Aktories undHall, 1989]. Die C3-Transferase ribosyliert keine weiteren Proteine aus der Rho-Familie und wurde in zahlreichen Arbeiten als Werkzeug zur spezifischen Rho-Inhibition eingesetzt. 2002 wurde dann auch eine Wechselwirkung der C3-Transferase mit der kleinen Ras-GTPase RalA nachgewiesen [Wilde, et al., 2002]. Das große clostridiale Toxin TcdB-10463 aus dem Stamm 10463 von Clostridium difficile inhibiert RhoA, Rac1, Cdc42 durch Glykosylierung. Das Toxin TcdB-1470 aus dem nichthumanpathogenen Stamm 1470 von Clostridium difficile blockiert primär Rac1, Cdc42, aber glykosiliert nicht RhoA und modifiziert daneben auch R-Ras und weitere Proteine aus der Ras-Subfamilie kleiner GTP-bindender Proteine [Chaves-Olarte, et al., 2003].

1.3.5 Bedeutung für Zytoskelett und Zellmorphologie

Die Mikroinjektion von rekombinantem RhoA in T3-Fibroblasten induziert die Bildung von Aktin-Stressfasern und Fokalen Adhäsionen [Ridley undHall, 1992]. Die Überexpression aktiver Mutanten von RhoA, RhoB und RhoC in porcinen aortalen Endothelzellen zeigte für jede der Mutanten die Induktion von Stressfasern und Fokalen Adhäsionen [Aspenstrom, et al., 2003]. Daneben wurde für transfizierte Zellen eine kleine und abgerundete Morphologie beschrieben. Ein wesentlicher Effektor von Rho für die Formierung von Stressfasern ist die Rho-Kinase, welche neben anderen Zielproteinen die regulatorische Myosin-Leichtkette phosphoryliert, so dass konsekutiv aktiviertes Myosin F-Aktin zu Stressfasern bündelt [Essler, et al., 2000;Ridley, 1999]. Die Mikroinjektion von rekombinantem Rac1 und die Überexpression von aktivem Rac1V12 induzierte in T3-Fibroblasten die Bildung von Lamellipodien und nachfolgend Stressfasern [Ridley, et al., 1992]. Die gleichen charakteristischen Veränderungen werden nach Überexpression von aktivem Rac1, 2 und 3 in porcinen aortalen Endothelzellen beschrieben, wobei die Bündel von Aktin-Fasern hier nach der Expression von Rac1L61 und Rac2L61 im Vergleich zu klassischen Stressfasern prominenter sind [Aspenstrom, et al., 2003]. Wie für RhoA und Rac1 wurde in der ersten Arbeit über die Funktion von humanem Cdc42 1995 die Wirkungen auf das Zytoskelett anhand der Mikroinjektion von konstitutiv aktivem Protein in T3-Fibroblasten untersucht [Nobes undHall, 1995]. In den injizierten Fibroblasten induzierte das rekombinante Protein die Bildung von Filopodien [Nobes undHall, 1995]. Darüber hinaus wird auch die Bildung von Lamellipodien und Stressfasern beschrieben. Da die Bildung von Lamellipodien und Stressfasern durch Koinjektion von inaktivem Rac und C3-Transferase inhibiert werden konnte, postulierten die Autoren eine sequentielle Aktivierung von Rac und Rho durch Cdc42 [Nobes undHall, 1995]. Für die Überexpression von aktivem Cdc42L61 in porcinen aortalen Endothelzellen wurde die Induktion von Lamellipodien, vinculinpositiver fokaler Komplexe und prominenter Stressfasern sowie kleiner ringförmiger aktinpositiver intrazellulärer Strukturen 24 Stunden nach Transfektion berichtet [Aspenstrom, et al., 2003].

1.3.6 Bedeutung für die Transkription

Die Bedeutung von Mitgliedern der Rho-Familie für weitere zelluläre Prozesse neben ihrer Wirkung auf das Zytoskelett wurde durch Arbeiten belegt, welche die Aktivierung von JNK und p38-MAPK durch aktive Mutanten von Rho-Proteinen zeigten. JNK und p38-MAPK gehören mit den Extrazellulärsignal-regulierten Kinasen (ERK) zu den Mitogenaktivierten Protein-Kinasen (MAPK). Diese vermitteln als ubiquitäre parallele Signalkaskaden z.B. Proliferation, Apoptose, Zellzyklusregulation und Inflammation als Reaktion auf extrazelluläre Reize [Hazzalin undMahadevan, 2002]. Die Stressaktivierten Protein-Kinasen JNK und die p38-MAPK reagieren auf proinflammatorische Stimuli wie Störungen der osmotischen Homöostase, Hitze, Hypoxie, proinflammatorische Zytokine oder LPS [Kumar, et al., 2003] [Kyriakis undAvruch, 2001]. Mehrere Arbeiten beschrieben die Aktivierung von Mitgliedern der Stressaktivierten Protein-Kinase-Familie c-Jun NH2-Terminale Kinasen (JNKs) und der p38-MAPK durch Überexpression konstitutiv aktiver Mutanten von Rac1 und Cdc42 in Zellen der Linien HeLa, NIH 3T3, COS und HEK 293T [Bagrodia, et al., 1995;Coso, et al., 1995;Minden, et al., 1995]. Außerdem wurde die Inhibition der IL-1β-induzierten Aktivierung von JNK1

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durch die inaktive Mutante Cdc42N17 in COS-Zellen nachgewiesen. Eine aktive Mutante von RhoA stimulierte in den meisten Linien nicht die JNK oder p38-MAPK, aber konnte die JNK in Zellen der Linie HEK 293T genauso wie Cdc42 aktivieren [Teramoto, et al., 1996].

Perona wies 1997 für die Überexpression aktiver Mutanten kleiner GTP-bindender Proteine in verschiedenen Zellinien die Aktivierung eines -abhängigen Reporterkonstruktes nach [Perona, et al., 1997]. Dies wies auf eine Bedeutung GTP-bindender Proteine der Rho-Familie für die Aktivierung von , eines zentralen Transkriptionsfaktors proinflammatorisch wirksamer Proteine, hin.

1.3.7 Bedeutung von RhoA, Rac1 und Cdc42 für die Expression von IL-8/CXCL8

Hemmung GTP-bindender Proteine der Rho-Familie durch die Toxine TcdB-10464 und TcdB-1470 in humanen Endothelzellen aus der Nabelschnur reduzierte die LPS-induzierte Sekretion von IL-8/CXCL8 und hemmte die Aktivierung von [Hippenstiel, et al., 2000].

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Eine weitere Arbeit untersuchte die Bedeutung des kleinen GTP-bindenden Proteins RhoA für die LPS-induzierte Transkription inflammatorischer Mediatoren in primären humanen Monozyten und der humanen monozytären Zellinie THP-1-CD14 [Chen, et al., 2002]. Die Autoren konnten eine LPS-abhängige Aktivierung von RhoA in primären humanen Monozyten nachweisen. Sie zeigten, dass die Überexpression der negativen Mutante RhoAN19 die LPS-induzierte Transkription von IL-8/CXCL8 vermindert.

Einen weiteren Hinweis auf GTP-bindende Proteine im Signalweg flußabwärts von TLR-4 lieferte eine Arbeit, die eine Beteiligung von Rac1 in der durch hitzeinaktivierte Staphylococcus aureus induzierten Signaltransduktion unterhalb von TLR-2 nachwies [Arbibe, et al., 2000]. Die Autoren zeigten eine Aktivierung der GTP-bindenden Proteine Rac1 und Cdc42 in THP1-CD14 und HEK293-TLR-2 im jeweiligen GTPasen-Aktivitäts-Assay. Allerdings wurde eine verminderte Aktivierung von im Luziferasereporterassay in HEK293 nur nach Überexpression der inaktiven Mutante Rac1N17 gezeigt. Die Wirkung auf die Expression inflammtorischer Zytokine wurde in der genannten Arbeit nicht untersucht.

1.3.8 Statine und kleine GTP-bindende Proteine

Wie bereits erklärt ist die membranständige Lokalisation kleiner GTP-bindender Proteine eine notwendige Vorraussetzung für ihre Funktion. Ein C-terminales CAAX-Peptidmuster der Rho-Proteine vermittelt die posttranslationelle kovalente Substitution mit einem Farnesyl- oder Geranylgeranyl-Isoprenoid, wobei A für eine aliphatische Aminosäure steht und die Aminosäure an Stelle X beeinflusst, ob das Protein farnesyliert (S,M,A,Q) oder geranylgeranyliert (L) wird [Zhang undCasey, 1996]. Da die Modifikation mit Isoprenoiden auf Farnesyl-PP als Intermediärprodukt der Cholesterinbiosynthese zurückgreift, wirken die als Hemmstoffe der Hydroxymethylglutaryl-CoenzymA (HMGCoA)-Reduktase klinisch eingesetzten Statine inhibitorisch auf kleine GTP-bindende Proteine der Rho-Familie. In Zellkulturstudien konnte eine Hemmung der Expression pro-inflammatorischer Mediatoren in Endothelzellen und in der monozytären Linie THP-1 durch Statine nachgewiesen werden. Für humane umbilikalvenöse Endothelzellen wurde gezeigt, dass die LPS-induzierte IL-8/CXCL8-Expression durch Lovastatin [Hippenstiel, et al., 2000] und die PMA- oder LPS-stimulierte Expression von IL-1β und IL-6 durch Simvastatin und Fluvastatin [Inoue, et al., 2000] inhibiert wird. Für die monozytäre Zelllinie THP-1 wurde eine Minderung der Expression von IL-6 und IL-8/CXCL8 durch Statine [Ikeda undShimada, 1999;Terkeltaub, et al., 1994] sowie eine Hemmung der LPS-induzierten Aktivierung von Rac durch Mevastatin im Rac-Aktivitätsassay nachgewiesen [Patel undCorbett, 2003]. Eine prospektive klinische Beobachtungsstudie an 361 Patienten belegte, dass die Vorbehandlung mit Statinen eine präventiven Effekt auf die Entwicklung einer Sepsis hat [Almog, et al., 2004]. Die Autoren stellten vorab die Hypothese auf, dass aufgrund der antiinflammatorischen Effekte der Statine ein präventiver Effekt zu erwarten sei [Almog, 2003].

1.4 Interleukin-8 (IL-8/CXCL8)

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Interleukin-8 (IL-8/CXCL8) wurde erstmals 1987 nach Aufreinigung aus dem Überstand LPS-stimulierter humaner Monozyten als chemotaktischer Faktor für Neutrophile beschrieben [Yoshimura, et al., 1987]. Die chemotaktische Wirkung von IL-8/CXCL8 ist besonders stark [Larsen, et al., 1989] und gilt als langanhaltend [Strieter undKunkel, 1994]. Gebildet wird IL-8/CXCL8 von leukozytären Zellen und nicht leukozytären Zellen, darunter Endothelzellen [Strieter, et al., 1989] und Epithelzellen [Li, et al., 2002]. Da das Endothel an der Gefäß-Gewebe-Grenze die Extravasation leukozytärer Zellen vermittelt kommt der endothelialen Expression von IL-8/CXCL8 besondere Bedeutung zu. Endothelzellen reagieren auf Exposition gegenüber LPS, TNF-α, IL-1β mit der Expression von IL-8/CXCL8 [Strieter, et al., 1989]. IL-4 und IL-10 allein induzieren keine IL-8/CXCL8- Expression in Endothelzellen, aber bewirken bei gleichzeitiger Exposition gegen-über LPS eine Erhöhung der LPS-stimulierten Expression von IL-8/CXCL8 um 300% [De Beaux, et al., 1995].

1.4.1 Chemokine

Mit IL-8/CXC8 wurde eine Superfamilie strukturell verwandter Zytokine begründet, deren überwiegende Anzahl eine chemotaktische Wirkung auf eine jeweils begrenzte Subpopulation von Leukozyten ausübt [Baggiolini, et al., 1997]. Die Mitglieder der mit Interleukin-8 begründeten Superfamilie werden als Chemokine (chemotactic cytokines) bezeichnet. Es wurden über 40 verschiedene Chemokine und ca. 20 Chemokinrezeptoren beschrieben [Mahalingam undKarupiah, 1999]. Da die Namengebung oft rein deskriptiv nach der zuerst beschrieben Funktion erfolgte, aber für viele der Chemokine weitere Wirkungen neben ihrer zumeist primär beschriebenen Chemotaxie nachgewiesen wurden, darunter z. B. angiogenetische Aktivität für Interleukin-8, wurde eine systematische Nomenklatur vorgeschlagen [Murphy, et al., 2000]. Bei den Chemokinen handelt es sich um niedermolekulare (8-14kDa) Proteine, die an ihrem aminoterminalen Ende durch Zysteine charakterisiert sind und nach deren Anzahl und Verteilung in die 4 Untergruppen CXC, CC, CX3C (je 4–6 Zysteine) und C (2 Zysteine) unterteilt werden. IL-8/CXCL8 gehört zur Gruppe der CXC Chemokine, deren erste beiden Zysteine durch eine interponierende Aminosäure (X) getrennt sind. Um die Chemokine von ihren Rezeptoren, die eine korrespondierende Nomenklatur verwenden, abzugrenzen, folgt auf die Bezeichnung der Subgruppe ein L für Ligand. Die folgende Nummer stimmt mit der Nummer in der Nomenklatur der korrespondierenden Gene überein. Die CXC-Gruppe kann hinsichtlich des Vorhandenseins eines aminoterminalen Glu-Leu-Arg-Motivs (ELR-Motivs) vor dem ersten Zystein in CXC-(ELR+) oder CXC-(ELR–) klassifiziert werden, wobei die Mitglieder der CXC-(ELR+)-Gruppe, zu denen auch IL-8/CXCL8 gehört, funktionell durch starke chemotaktische Wirkung insbesondere auf neutrophile Granulozyten und eine starke angiogenetische Potenz gekennzeichnet sind [Strieter, 2002].

1.4.2 Zielzellen und Wirkungen von IL-8/CXCL8 in vitro

Zielzellen sind neben neutrophilen Granulozyten auch T-Lymphozyten [Larsen, et al., 1989], Monozyten und nicht leukozytäre Zellen [Mukaida, 2000]. Es wird davon ausgegangen, dass IL-8/CXCL8 aufgrund seiner molekularen Struktur, wie andere Chemokine auch, gut an Proteoglykane des vaskulären Endothels bindet, um dort seine Wirkungen auf Zielzellen auszuüben. Die chemotaktische Wirkung auf Neutrophile ist z. B. Stimulus für die transendotheliale Migration [Huber, et al., 1991], wie auch für die Migration über pulmonales Epithel und über Fibroblasten [Mukaida, 2003]. Zusätzlich induziert IL-8/CXCL8 die Degranulation von Neutrophilen und die Generierung reaktiver Sauerstoffmetabolite durch Neutrophile [Djeu, et al., 1990;Schroder, et al., 1987]. IL-8/CXCL8 ist damit ein zentraler Faktor für die massive Infiltration von Neutrophilen bei akuter Entzündung [Harada, et al., 1996]. IL-8/CXCL8 induziert auch die Freitsetzung von Histamin aus Basophilen [Dahinden, et al., 1989]. Außerdem erhöht IL-8/CXCL-8 endotheliale Permeabilität unabhängig von Granulozyten [Biffl, et al., 1995].

1.4.3 Wirkungen von IL-8/CXCL8 in vivo und klinische Bedeutung

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Die chemotaktische Wirkung von IL-8/CXCL8 ist für die physiologische entzündliche Immuneaktion zur Elimination bakterieller Infektionen essentiell [Standiford, et al., 1996]. Bei massiver Entzündung kann IL-8/CXCL8 aber auch als Marker der unbalancierten Inflammation nachgewiesen werden. Dies wird durch Korrelationen zwischen klinischer Symptomatik und quantitativem Nachweis von IL-8/CXCL8 belegt: Eine tierexperimentelle Studie an Primaten zeigte, dass nach intravenöser Applikation von E. coli und LPS ein letaler Verlauf mit höheren Spiegeln an IL-8/CXCL8 verbunden war als ein nicht tödlicher Verlauf [Van Zee, et al., 1991]. Eine klinische Beobachtungsstudie fand bei 89 % Prozent der Patienten einer mit der Diagnose Sepsis auf die Intensivpflegestation aufgenommenen Patientenpopulation (n=47) erhöhte IL-8/CXCL8 Plasmaspiegel, wobei die erhöhten Plasmaspiegel invers korreliert waren mit zirkulierender Leukozytenzahl, Thrombozytenzahl und mittlerem arteriellen Druck [Hack, et al., 1992]. Diese Studie zeigte auch, Patienten mit der Diagnose septischer Schock wiesen signifikant höhere Plasmaspiegel an IL-8/CXCL8 auf als Patienten ohne die Diagnose Schock. Patienten aus dieser Studie, deren Erkrakung einen letalen Verlauf nahm, wiesen bei Diagnose der Sepsis höhere Spiegel an IL-8/CXCL8 auf als solche mit nicht tödlichem Ausgang [Hack, et al., 1992]. Eine weitere Beobachtungsstudie untersuchte die Korrelation zwischen IL-8/CXCL8-Spiegeln in der bronchoalveolären Lavage (BALF) in einem Kollektiv von 29 Patienten mit Risiko für die Entwickung eines akuten Atemnotsyndroms des Erwachsenen (ARDS) [Donnelly, et al., 1993]. Die Spiegel an IL-8/CXCL8 in der BALF von Patienten mit erhöhtem Risiko für die Entwicklung eines ARDS korrelierten mit der Entwicklung eines ARDS [Donnelly, et al., 1993]. Sie erwiesen sich damit auch als prognostisch bedeutsam. Eine weitere Beobachtungsstudie an 27 Patienten fand höhere IL-8/CXCL8-Spiegel in der BALF von Patienten mit der Diagnose ARDS im Vergleich zu Patienten mit cardiogenem Lungenödem, aber keine signifikant unterschiedlichen Plasmaspiegel an IL-8/CXCL8 zwischen diesen Gruppen [Miller, et al., 1996]. Signifikant erhöhte Level an IL-8/CXCL8 konnten auch im Serum und in der bronchoalveolären Lavage von Patienten mit der Diagnose Idiopathische Pulmonale Fibrose und in der bronchoalveolären Lavage von Patienten mit der Diagnose diffuse Panbronchiolitis nachgewiesen werden [Car, et al., 1994;Koga, 1993]. Bei der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung war der Gehalt an IL-8/CXCL8 im Sputum invers korreliert mit dem forcierten endexpiratorischen Volumen in der Lungenfunktionsdiagnostik [Mukaida, 2003].

1.4.4 Die Expressionskontrolle von IL-8/CXCL8

Die konstitutive Expression von IL-8/CXCL8 ist gering, wird aber durch eine Vielzahl von Induktoren massiv gesteigert. Je nach Stimulus und Zellart kann eine Steigerung um den Faktor 10 bis 100 bewirkt werden [Hoffmann, et al., 2002]. In humanen Endothelzellen, die aus der Nabelschnur isoliert wurden, konnte nach Stimulation mit 100 ng LPS pro ml Medium eine Steigerung um den Faktor 10 nachgewiesen werden [Hippenstiel, et al., 2000]. Die Expression von IL-8/CXCL8 steht unter der Kontrolle der Transkriptionsfaktoren Nukleärer Faktor-κB (NF-κB), CCAAT-Verstärker bindendes Protein-β (C/EBP-β) und Aktivatorprotein-1 (AP-1) [Strieter, 2002]. Neben der transkriptionellen Kontrolle wird die Expression auf der Ebene der mRNA-Stabilität weiter reguliert [Kowalski undDenhardt, 1989]. Die Promotorregion des IL-8/CXCL8-Gens ist in Abbildung 4 gezeigt [Wu, et al., 1997]. Der Bindungsstelle für kommt zwar für die meisten Stimuli die wesentliche Bedeutung in der Induktion der Transkription zu, aber für eine maximale Expression von IL-8/CXCL8 wurde in vielen Zelltypen die Kooperation mit C/EBP oder AP-1 als notwendig nachgewiesen [Kunsch, et al., 1994;Matsusaka, et al., 1993;Stein undBaldwin, 1993]. Das stimulus- und zellspezifische Zusammenspiel der verschiedenen Transkriptionsfaktoren zeichnet dabei für das quantitativ und zeitlich unterschiedliche Expressionsmuster von IL-8/CXCL8 in den einzelnen Geweben verantwortlich [Roebuck, 1999]. Im nichtinduzierten Status wird die Promotoraktivität durch Bindung des Proteins Oct-1 supprimiert [Wu, et al., 1997]. Für humane Endothelzellen konnte bisher die Regulation auf der Ebene der Transkriptionskontrolle und dort die Beteiligung des Transkriptionsfaktors an der Induktion von IL-8/CXCL8 durch LPS nachgewiesen werden [Hippenstiel, et al., 2000;Wrighton, et al., 1996].

Abb. 4 : Transkription von IL-8/CXCL8 modifiziert nach [Wu, et al., 1997]

1.5 DNA-Transfer in humane Endothelzellen

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Die Expression eines rekombinanten Proteins setzt den erfolgreichen Transfer der codierenden DNA in die jeweiligen Zielzellen voraus. Die verschiedene Methoden zum DNA-Transfer lassen sich vom Prinzip unterteilen in nicht virale und virale Transfersysteme. Der nicht virale Transfer von Nukleinsäuren in eukaryote Zellen wird als Transfektion bezeichnet. Die ersten Transfektionsstudien wurden in den späten 1960ger und frühen 1970ger Jahren von Graham und van der Eb unter Verwendung von Calciumphosphat und von Vaheri und Pagano unter Verwendung von Dextran durchgeführt [Graham undvan der Eb, 1973;Pagano, et al., 1967]. In den 1980ger Jahren wurden lipidbasierte Transfektionsreagenzien, die DNA in Liposomen einschließen, entwickelt. Humane Endothelzellen sind mit den genannten Reagenzien nur sehr schwer zu transfizieren [Axel, et al., 2000]. Je nach verwendetem Reagenz, speziellen Bedingungen, verwendetem Reporter-system und Autor werden für humane Endothelzellen im Allgemeinen Transfektionseffizienzen in der Größenordnung von 0,1 bis 10 % der behandelten Zellpopulation berichtet [Kiefer, et al., 2004;Martin undMurray, 2000]. Eine deutlich höhere Effizienz des DNA-Transfers wird erreicht, indem mit viralen Systemen die evolutionär entwickelten viralen Mechanismen zum Gentransfer genutzt werden. Virale Vektorsysteme, von denen das erste 1981 von Wei beschrieben wurde, beruhen auf Retroviren, Adenoviren oder dem Adeno-assoziierten Virus (AAV), wobei unter Verwendung adenovirusbasierter Systeme für Endothelzellen Effizienzen von 88–98 % berichtet werden [de Martin, et al., 1997;Martin undMurray, 2000;Wei, et al., 1981]. Die Infektion von Endothelzellen mit replikationsunfähigen viralen Vektoren ist also bezüglich der Effizienz überlegen und wurde inzwischen auch in der Analyse Rho-abhängiger Signalwege schon eingesetzt [Zhao, et al., 2003]. Die Etablierung des Systems ist zeitauf-wändig, und seine Anwendung erfordert sicherheitstechnische Voraussetzungen.

1.5.1 Das Grüne Fluoreszenzprotein (GFP) als Reporter der Transfektion

Um bis zur Etablierung eines viralen Transfersystems die Wirkung der Überexpression inaktiver Mutanten der GTP-bindenden Proteine auf die IL-8/ CXCL8 Expression in humanen Endothelzellen studieren zu können, bestand für diese Arbeit die Notwendigkeit, den geringen Anteil an transfizierten Zellen von nicht transfizierten Zellen zu unterscheiden und selektiv zu messen. Zu den für diesen Zweck entwickelten Methoden gehört die Koexpression eines Oberflächen-antigens, das später über einen magnetkügelchengekoppelten Antikörper detektiert wird und so die magnetische Separation der transfizierten Zellen ermöglicht. Das System wurde von Chen zur Untersuchung der Bedeutung von RhoAN19 in der LPS-induzierte Sekretion von IL-8/CXCL8 in humanen Monozyten eingesetzt [Chen, et al., 2002]. Ein anderer Ansatz, der auch in der vorliegenden Arbeit gewählt wurde, ist die Kotransfektion des Grünen Fluoreszenzproteins (GFP) aus Aquorea victoria, das als Reporter für die erfolgreiche Transfektion dient [Trouet, et al., 1997]. Das GFP kann sowohl in nativen als auch fixierten Zellen detektiert werden. Die GFP-DNA wurde in ihrer Sequenz für die Expression in Säugerzellen und die Detektion durch für Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) geeignete Filtersysteme optimiert [Diamond undDeMaggio, 2000]. Sie wird gemeinsam mit dem Gen von Interesse transfiziert. Später werden durch die Flusszytometrie-assoziierte Zell-Sortierung (FACS) transfizierte Zellen identifiziert und selektiv gemessen. Dabei wird das exprimierte IL-8/CXCL8 nach Hemmung der Ausschleusung intrazellulär quantitativ bestimmt. Schwierigkeiten und Vorteile der Methodik werden in der Diskussion unter 5.2 erläutert.

1.5.2 Selektion transformierter Zellen

Eine weitere Möglichkeit, das Problem niedriger Effizienzen in der Transfektion differenzierter humaner Zellen zu lösen, ist die Generation stabil transfizierter Zelllinien. Solche Linien epithelialer Herkunft wurden von Hobert in der Analyse von Cdc42N17 und Rac1N17 in der durch Salmonella typhimurum induzierten Expression von IL-8/CXCL8 in Epithelzellen genutzt [Hobert, et al., 2002]. Eine „stabil transfizierte Zelllinie“ geht aus einer mit dem Gen von Interesse transformierten Zelle hervor. Allerdings werden nach Transfektion einer Zell-population nur sehr wenige der transfizierten Zellen dauerhaft transformiert, so dass diese relevanten transformierten Zellen mit Hilfe von Selektionsantibiotika selektioniert werden müssen [Liu, et al., 2000]. Die gleichzeitige Transfektion eines für ein GFP codierenden Gens ist dabei hilfreich, weil die transfizierte Population im zeitlichen Verlauf kontinuierlich auf transformierte Zellen durchgesehen werden kann.

1.6 Zielsetzung der Arbeit

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In bisherigen Untersuchungen konnte eine Beteiligung von Mitgliedern der Rho-Subfamilie der kleinen GTP-bindenden Proteine in der LPS-induzierten - abhängigen Expression von IL-8/CXCL-8 nachgewiesen werden. Der Nachweis gründete sich auf den Einsatz bakterieller Toxine, die durch kovalente Modifikation GTP-bindender Proteine der Rho-Subfamilie als Inhibitoren wirksam sind. Allerdings sind jeweils mehrere GTP-bindende Proteine Substrat der katalytisch aktiven Toxine, so dass eine spezifische Aussage über die Funktion einzelner Proteine der Rho-Familie im proinflammatorischen Signalweg nicht zu treffen war. Die Überexpression inaktiver Genvarianten eines Proteins und die anschließende Messung abhängiger Parameter ist dagegen als hochspezifischer Test auf die Funktion dieses einzelnen Proteins anerkannt. Als Ausgangspunkt für diese Untersuchung standen inaktive Varianten der für RhoA, Rac1 und Cdc42 codierenden Gene kloniert in den Vektor pRK5 zur Verfügung. Ziel der Arbeit war es, mittels Überexpression zu klären, welche Stellung die drei einzelnen Proteine RhoA, Rac1 und Cdc42 im Signalweg zur Expression des proinflammatorischen IL-8/CXCL8 in humanen Endothelzellen einnehmen. Zu diesem Zweck war die GFP-assoziierte flusszytometrische Messung zu etablieren, welche die selektive Bestimmung von IL-8/CXCL8 im erfolgreich transfizierten Anteil der Zellpopulation erlaubt.


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21.11.2005