Materialien

2.1 Plasmide, Bakterienkultur, Transformation, Plasmidpräparation

↓18

Plasmide aus dem Labor von Prof. Alan Hall, University College London, die Myc-markierte inaktive Mutanten der Gene für RhoA, Rac1 und Cdc42 im Vektor pRK5 [Self undHall, 1995] enthalten, wurden von Prof. Stefan Ludwig, Zentrum für Molekularbiologie der Entzündung an der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster überlassen.

Die für Varianten des Grünen Fluoreszenzproteins codierenden Plasmide wurden von Gibco, Karlsruhe (pGreenLantern1) und von BD Clontech, Heidelberg (pIRES2-EGFP) bezogen.

↓19

Das -Reporterplasmid pGL3.BG.6κB [Schwarzer, et al., 1998] wurde von Prof. Robert Newton, Department of Biological Siences, University of Warwick, Coventry, England zur Verfügung gestellt.

Das für die β-Galaktosidase codierende Plasmid pRSVβ-Gal wurde von Werner Hallatschek, Institut für Mikrobiologie und Hygiene an der Charité, Universitätsmedizin Berlin überlassen.

Bakterienstamm

 

E. coli: TOP10 (Genotyp wie DH10B strain)

Invitrogen, Karlsruhe

↓20

Luria-Bertani- Medium

  

Tryptone

10 g

Sigma, Deisenhofen

Yeast-Extract

5 g

Sigma, Deisenhofen

NaCl

10 g

C. Roth, Karlsruhe

dH2O

ad 1000 ml

 

der pH-Wert des LB-Mediums wurde mit 0,1 N NaOH-Lsg. auf 7,0 eingestellt und das Medium für 40 Minuten bei 120°C und 1 bar autoklaviert.

Agarplatten

↓21

LB-Medium wie oben beschrieben wurde zusätzlich mit 20 g Agar versetzt, nach Autoklavieren wurde die Agarlösung im Wasserbad auf 55°C abgekühlt, dann die jeweiligen Antibiotika in nachstehender Konzentration zugegeben und die Agarplatten mit einem Volumen von ca. 25 ml gegossen.

Antibiotika

 

Ampicillin in LB-Medium und LB-Agar

50 µg/ml

  

Ampicillin Stocklösung

50 mg/ml in dH2O

  

Ampicillin

C. Roth, Karlsruhe

Kanamycin in LB-Medium, -Agar

30 µg/ml

 

Kanamycin Stocklösung

50 mg/ml in dH20

 

Kanamycin Monosulfat

 

Sigma, Deisenhofen

↓22

Miniplasmidpräparation nach dem Prinzip der Alkalischen Lyse

Lösung I

  

Tris-HCl, pH 8,0

25 mM

 

Glucose

50 mM

 

EDTA

10 mM

 

Lösung II

  

NaOH

0,2 N

 

SDS

1 %

 

Lösung III

  

Kaliumacetat

3 M

 

Essigsäure

2 M

 

HiSpeed Plasmid Midi Kit

Qiagen, Hilden

2.2 Molekularbiologie

Restriktionsendonukleasen und Arbeitspuffer

Promega, Mannheim

ClaI, XhoI, PstI und EcoRI

 

DNA Polymerase 1 Large (Klenow) Mini Kit

Promega, Mannheim

LigaFast Rapid DNA Ligation System

Promega, Mannheim

  

MiniElute Reaction Cleanup Kit

Qiagen, Hilden

QIAquick Gel Extraction Kit

Qiagen, Hilden

  

↓23

Agarosegelelektrophorese

Tris-Acetat-EDTA (TAE)-Elektrophorese-Puffer 20x

  

Tris Base (Trizma®) 100 g

Sigma, Deisenhofen

 

Essigsäure 100 % 23 ml

Merck, Darmstadt

 

EDTA 0,5 M pH 8,0 40 ml

Merck, Darmstadt

 

dH2O ad 1000 ml

  

Tris-Acetat-EDTA (TAE)-Elektrophorese-Puffer 20x

 

Tris Base (Trizma®)

100 g

Sigma, Deisenhofen

Essigsäure 100 %

23 ml

Merck, Darmstadt

EDTA 0,5 M pH 8,0

40 ml

Merck, Darmstadt

dH2O

ad 1000 ml

 

Agarosegel, 1,5 %

 

Agarose

1,5 g

Promega, Mannheim

TAE-Puffer

100 ml

 

Ethidiumbromidlsg. 1%

2,5 µl

Sigma, Deisenhofen

↓24

Agarose in TAE-Puffer bis zum Lösen erhitzen, abkühlen und 2,5 µl 1 % Ethidium-bromidlsg. zugeben.

Auftragepuffer

 

OrangeG

20 mg

Sigma, Deisenhofen

Glycerol

2,5 ml

Merck, Darmstadt

EDTA 0,5M pH 8,0

10 ml

Merck, Darmstadt

dH2O

2,5 ml

 

Ready-Load 1kB DNA-Ladder

Invitrogen, Karlsruhe

  

Sub-Cell GT Agarose Gel Electrophoresis System

Bio-Rad, München

Power NPAC 200

Bio-Rad, München

2.3 Zelllinien und Zellkultur

↓25

Zellen der humanen pulmonalen mikrovaskulären Zelllinie HPMEC-ST1.6R [Krump-Konvalinkova, et al., 2001] aus dem Labor von Prof. James Kirkpatrick wurden von Frau Dr. Vera Krump-Konvalinkova, Institut für Pathologie der Universität Mainz zur Verfügung gestellt.

Zellen der LPS-reagiblen Linie CHO-3E10 [Delude, et al., 1998] aus dem Labor von Prof. Douglas T. Golenbock am Maxwell Finnland Laboratory for Infectious Diseases in Boston wurden von Herrn Dr. Norbert Reiling, Laborgruppe Molekulare Infektiologie am Forschungszentrum Borstel überlassen.

Endothelzellkulturmedium: 500 ml Medium 199 Earle supplementiert mit 0,3 mg/ml L-Glutamin, 20 % Fötalem Kälberserum, 100 ng/ml Endothelial Cell Growth Supplement, 5 ng Epidermal Growth Factor, 25 ug/ml Natrium-Heparin und 140 units/ml Penicillin/Streptomycin.

↓26

Endothelzellwachstumsmedium: 50 % Endothelzellkulturmedium wie oben beschrieben und 50 % Endothelial Cell Growth Medium.

CHO-Zellkulturmedium: Medium NUT.MIX.F-12(HAM) with GLUTAMAX supplementiert mit 10 % Fötalem Kälberserum und 140 units/ml Penicillin/Streptomycin.

CHO-Zellwachstumsmedium: Medium NUT.MIX.F-12(HAM) with GLUTAMAX supplementiert mit 20 % Fötalem Kälberserum und 140 units/ml Penicillin/Streptomycin.

↓27

Medium 199 EARLE 1x

Biochrom, Berlin

Medium NUT.MIX.F-12(HAM) with GLUTAMAX

Invitrogen Gibco, Karlsruhe

Endothelial Cell Growth Medium (ECGM)

PromoCell, Heidelberg

Fötales Kälberserum

PAA Laboratories, Wien

Penicillin/Streptomycin

Biochrom AG, Berlin

Endothelial Cell Growth Supplement(ECGS)

BD Discovery Labware,

 

Heidelberg

Epidermal Growth Factor (EGF)

Invitrogen Gibco, Karlsruhe

Natrium Heparin

Sigma, Deisenhofen

L-Glutamin

Invitrogen Gibco, Karlsruhe

Trypsin-EDTA

Invitrogen Gibco, Karlsruhe

Accutase

PAA Laboratories, Wien

Hygromycin

Calbiochem, Hamburg

G418 Sulphate

PAA Laboratories, Wien

PBS+/+ (mit Ca2+ und Mg2+)

Biochrom, Berlin

PBS-/-

PAA Laboratories, Wien

a. d. Spüllösung

Braun, Melsungen

Gelatine

Sigma, Deisenhofen

Gelatine Stocklösung (0,5 %)

↓28

2,5 g Gelatine (G) auf 500 ml a. d., bei 60°C gelöst, sterilfiltriert und aliquotiert.

G-Arbeitslösung (0,05 %): 50 ml Stocklösung wurden mit 450 ml a. d. verdünnt.

2.4 Transfektion

Effectene Transfection Reagent

Qiagen, Hilden

Superfect Transfection Reagent

Qiagen, Hilden

2.5 Flusszytometrie

↓29

Antikörper

 

mouse anti-human IL-8, Clone G265-8,

Isotype IgG2b, Kat.-Nr. 554717

BD Pharmingen, Heidelberg

mouse IgG2b, Isotype Control, Kat.-Nr. MG2b00

Caltag, Hamburg

goat anti-mouse IgG2b-Cy5, Kat.-Nr. M32411

Caltag, Hamburg

mouse anti-CD25-APC, Clone 2A3,

Isotype IgG1, Kat.-Nr. 340907

BD Immunocytometry,

Heidelberg

mouse gamma1-APC, Isotype Control,

Kat.-Nr. 345818

BD Immunocytometry,

Heidelberg

Stimulus

Lipopolysaccharid von E.coli 0111:B4,

Sigma, Deisenhofen

 

Kat.-Nr. 4291

  

LPS-Stocklösung

1 mg/ml in PBS+/+

  

LPS-Arbeitslösung

10 ug/ml in PBS+/+

  

Paraformaldehydstocklösung 20 %

Paraformaldehyd

20 g

Sigma, Deisenhofen

 

dH2O

100 ml

  

↓30

Kochen, bis eine trübe Lösung entsteht, durch Titration mit 1 M NaOH-Lösung aufklären,

PBS 0,2 M

100 ml zugeben,

Sigma, Deisenhofen

nach Abkühlen filtern, pH auf 7,6 einstellen.

↓31

Paraformaldehydarbeitslösung 2 %: 2 ml Stocklösung auf 18 ml PBS-/-

Saponin von Quillaja Bark

Sigma, Deisenhofen

Monensinstocklösung 2 mM in PBS+/+

 

Monensinarbeitslösung 20uM in PBS+/+

 

Monensin

Sigma, Deisenhofen

  

Flusszytometer BD Facscalibur

BD Biosciences, Heidelberg

mit Software Cellquest Pro

 
  

Betriebsmittel für Flusszytometer:

 

FacsFlow

BD Biosciences, Heidelberg

2.6 Biolumineszenzassay

Luciferase Assay System

Promega, Mannheim

beta-Gal Reporter Gene Assay

Roche, Basel

Lumat LB 9501/16

Berthold, Bad Wildbad

2.7 Western-Blot

↓32

Antikörper

 

primärer Ak: mouse anti-human myc-tag (9B11),

Isotype IgG2a, monoklonal, Kat.-Nr. 2276

New Eng. Biolabs, Ffm.

sekundärer Ak: goat anti-mouse, IRDye800,

Biomol, Hamburg

Kat.-Nr. 610 131 121

 
  

Blotmembran Immobilion-P PVDF Membran

Millipore, Eschborn

Blotpapier

C.Roth, Karlsruhe

Proteinlaufhöhenmarker BOA-Marker

Biomol, Hamburg

Lyse-Puffer für Proteinextraktion

 

Tris-HCl

50 mM, pH 7,4

 

EDTA

0,2 mM

Merck, Darmstadt

PMSF

1 mM

Sigma, Deisenhofen

Antipain, Leupeptin, Pepstain, je

10 ug/ml

Sigma, Deisenhofen

NP-40

1 %

Sigma, Deisenhofen

Lösung für die Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford

Bradfordreagenz

2 ml

Bio-Rad, München

 

dH2O

8 ml

  

↓33

Auftragepuffer nach Lämmli

 

Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8

1,0 ml

 

Glycerol 100 %

0,8 ml

Merck, Darmstadt

SDS 10 %

1,6 ml

Serva, Heidelberg

Bromphenolblau 1 %

0,4 ml

Pharmacia-Biotech, Freiburg

ß-Mercaptoethanol 1 %

0,4 ml

Sigma, Deisenhofen

Sammelgel

 

Trenngel, 12,5 %

 

Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8

2,5 ml

Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8

2,5 ml

SDS 10 %

100 µl

SDS 10 %

100 µl

Acrylamid-Bis 40 %

1,33 ml

Acrylamid-Bis 40 %

4 ml

TEMED

5 µl

TEMED

5 µl

Ammoniumpersulfat 10 %

50 µl

Ammoniumpersulfat 10 %

50 µl

dH2O

6 ml

dH2O

3,35 ml

Acrylamid-Bis (19:1), 40 % (W/V)

Serva, Heidelberg

TEMED (N,N,N‘,N‘-Tetramethylethylenediamine)

Serva, Heidelberg

Sodium-Dodecylsulfate (SDS)

Serva, Heidelberg

↓34

Laufpuffer 5x

Laufpuffer 1x

Tris Base

15 g

Laufpuffer 5x

200 ml

 

Glycin

72 g

dH2O

800 ml

 

SDS

5 g

   

dH2O

ad 1000 ml

   

Blotting-Puffer 10x

Blotting-Puffer 1x

 

Tris-Base

15 g

Blotting 10x

80 ml

Glycerol

72 g

Methanol

200 ml

dH2O

ad 500 ml

dH2O

720 ml

Blocking-Puffer

Odyssey Blocking Buffer

50 %

Li-Cor, Homburg

 

PBS

50 %

  

↓35

Antikörperinkubationslösung

Odyssey Blocking Buffer

50 %

Li-Cor, Homburg

 

PBS

50 %

  

Tween

0,1 %

Sigma, Deisenhofen

 

Waschpuffer

PBS mit 0,1 % Tween, letztes Waschen vor Detektion PBS ohne Tween

Tween 20

Sigma, Deisenhofen

 

Spektralphotometer Uvicon UV 860

Kontron, München

Mini-Protean 3 Cell

Bio-Rad, München

Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell

Bio-Rad, München

Electrophoresis Power Supply EPS600

Pharmacia Biotech,

 

Hamburg

Odyssey Infrared Imaging System + Software R 1.0

Li-Cor, Homburg

↓36

Kultur- und Reaktionsgefäße

BD Discovery Labware,

 

Heidelberg

2.8 Phasenkontrast-, Fluoreszenz- und Konfokalmikroskopie

Phasenkontrast-und Fluoreszenzmikroskopie

 

Olympus IMT-2, Inverses Forschungsmikroskop,

Olympus, Hamburg

Olympus IMT-2-RFA/340 und BH2-RFL,

Olympus, Hamburg

Fluoreszenzeinheit für Olympus IMT-2

Olympus, Hamburg

Fluoreszenzfilter:

 

Anregung: BP 490 nm,

 

Strahlenteiler (Dichromatischer Spiegel): 500 nm,

 

Emission: LP 515 nm

 

Fotografie und Filmmaterial

 
  

Olympus OM-4, Spiegelreflexkamera

Olympus, Hamburg

Kodak Farbdiafilm für Tageslicht EC,

Kodak, Stuttgart

Empfindlichkeit DIN 21°

 

↓37

Konfokalmikroskopie

 
  

Reagenz zur Anfärbung von F-Aktin:

 

Alexa Fluor 546 phalloidin Kat.-Nr. A22283

Mobitec, Göttingen

  

Paraformaldehydlösung 2 % wie unter

Flußzytometrie

 

Flusszytometrie

 
  

Triton X 100

Sigma, Deisenhofen

Triton X 100 1 % Arbeitslösung in PBS-/-

 
  

Permafluor

BC Immunotech, Krefeld

Zeiss Axioskop2 LSM5 Pascal, Konfokalmikroskop

Zeiss, Berlin

  

2.9 Spezielle Software und Statistik

Zur Darstellung der Aminosäuresequenzen in Abb. 3 wurde die Software SeqVu, Garvan Institute of Medical Research, Sydney, Australien verwand. Die Vektorkarten in Abb. 6 – 8 wurden mit der Software Macplasmap, CGC Scientific, Ballwin, USA erstellt.

Die Software Prism, GraphPad Software, San Diego, USA wurde verwand für die Berechnung von Mittelwerten, Standardabweichung der Mittelwerte und die Signifikanzprüfung, die als Einwegvarianzanalyse für unverbundene Stichproben durchgeführt wurde.


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21.11.2005