-Reporterplasmid pGL3.BG.6κB [Schwarzer, et al., 1998] wurde von Prof. Robert Newton, Department of Biological Siences, University of Warwick, Coventry, England zur Verfügung gestellt.| ↓18 |
Plasmide aus dem Labor von Prof. Alan Hall, University College London, die Myc-markierte inaktive Mutanten der Gene für RhoA, Rac1 und Cdc42 im Vektor pRK5 [Self undHall, 1995] enthalten, wurden von Prof. Stefan Ludwig, Zentrum für Molekularbiologie der Entzündung an der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster überlassen.
Die für Varianten des Grünen Fluoreszenzproteins codierenden Plasmide wurden von Gibco, Karlsruhe (pGreenLantern1) und von BD Clontech, Heidelberg (pIRES2-EGFP) bezogen.
| ↓19 |
Das -Reporterplasmid pGL3.BG.6κB [Schwarzer, et al., 1998] wurde von Prof. Robert Newton, Department of Biological Siences, University of Warwick, Coventry, England zur Verfügung gestellt.
Das für die β-Galaktosidase codierende Plasmid pRSVβ-Gal wurde von Werner Hallatschek, Institut für Mikrobiologie und Hygiene an der Charité, Universitätsmedizin Berlin überlassen.
|
Bakterienstamm | |
|
E. coli: TOP10 (Genotyp wie DH10B strain) |
Invitrogen, Karlsruhe |
| ↓20 |
|
Luria-Bertani- Medium | ||
|
Tryptone |
10 g |
Sigma, Deisenhofen |
|
Yeast-Extract |
5 g |
Sigma, Deisenhofen |
|
NaCl |
10 g |
C. Roth, Karlsruhe |
|
dH2O |
ad 1000 ml |
der pH-Wert des LB-Mediums wurde mit 0,1 N NaOH-Lsg. auf 7,0 eingestellt und das Medium für 40 Minuten bei 120°C und 1 bar autoklaviert.
Agarplatten
| ↓21 |
LB-Medium wie oben beschrieben wurde zusätzlich mit 20 g Agar versetzt, nach Autoklavieren wurde die Agarlösung im Wasserbad auf 55°C abgekühlt, dann die jeweiligen Antibiotika in nachstehender Konzentration zugegeben und die Agarplatten mit einem Volumen von ca. 25 ml gegossen.
|
Antibiotika | ||||
|
Ampicillin in LB-Medium und LB-Agar |
50 µg/ml | |||
|
Ampicillin Stocklösung |
50 mg/ml in dH2O | |||
|
Ampicillin |
C. Roth, Karlsruhe |
|||
|
Kanamycin in LB-Medium, -Agar |
30 µg/ml | |
|
Kanamycin Stocklösung |
50 mg/ml in dH20 | |
|
Kanamycin Monosulfat |
Sigma, Deisenhofen |
| ↓22 |
|
Miniplasmidpräparation nach dem Prinzip der Alkalischen Lyse |
||
|
Lösung I | ||
|
Tris-HCl, pH 8,0 |
25 mM | |
|
Glucose |
50 mM | |
|
EDTA |
10 mM | |
|
Lösung II | ||
|
NaOH |
0,2 N | |
|
SDS |
1 % | |
|
Lösung III | ||
|
Kaliumacetat |
3 M | |
|
Essigsäure |
2 M | |
|
HiSpeed Plasmid Midi Kit |
Qiagen, Hilden |
|
Restriktionsendonukleasen und Arbeitspuffer |
Promega, Mannheim |
|
ClaI, XhoI, PstI und EcoRI | |
|
DNA Polymerase 1 Large (Klenow) Mini Kit |
Promega, Mannheim |
|
LigaFast Rapid DNA Ligation System |
Promega, Mannheim |
|
MiniElute Reaction Cleanup Kit |
Qiagen, Hilden |
|
QIAquick Gel Extraction Kit |
Qiagen, Hilden |
| ↓23 |
|
Agarosegelelektrophorese |
||
|
Tris-Acetat-EDTA (TAE)-Elektrophorese-Puffer 20x | ||
|
Tris Base (Trizma®) 100 g |
Sigma, Deisenhofen | |
|
Essigsäure 100 % 23 ml |
Merck, Darmstadt | |
|
EDTA 0,5 M pH 8,0 40 ml |
Merck, Darmstadt | |
|
dH2O ad 1000 ml | ||
|
Tris-Acetat-EDTA (TAE)-Elektrophorese-Puffer 20x | ||
|
Tris Base (Trizma®) |
100 g |
Sigma, Deisenhofen |
|
Essigsäure 100 % |
23 ml |
Merck, Darmstadt |
|
EDTA 0,5 M pH 8,0 |
40 ml |
Merck, Darmstadt |
|
dH2O |
ad 1000 ml | |
|
Agarosegel, 1,5 % | ||
|
Agarose |
1,5 g |
Promega, Mannheim |
|
TAE-Puffer |
100 ml | |
|
Ethidiumbromidlsg. 1% |
2,5 µl |
Sigma, Deisenhofen |
| ↓24 |
Agarose in TAE-Puffer bis zum Lösen erhitzen, abkühlen und 2,5 µl 1 % Ethidium-bromidlsg. zugeben.
|
Auftragepuffer | |||
|
OrangeG |
20 mg |
Sigma, Deisenhofen |
|
|
Glycerol |
2,5 ml |
Merck, Darmstadt |
|
|
EDTA 0,5M pH 8,0 |
10 ml |
Merck, Darmstadt |
|
|
dH2O |
2,5 ml | ||
|
Ready-Load 1kB DNA-Ladder |
Invitrogen, Karlsruhe |
|
Sub-Cell GT Agarose Gel Electrophoresis System |
Bio-Rad, München |
|
Power NPAC 200 |
Bio-Rad, München |
| ↓25 |
Zellen der humanen pulmonalen mikrovaskulären Zelllinie HPMEC-ST1.6R [Krump-Konvalinkova, et al., 2001] aus dem Labor von Prof. James Kirkpatrick wurden von Frau Dr. Vera Krump-Konvalinkova, Institut für Pathologie der Universität Mainz zur Verfügung gestellt.
Zellen der LPS-reagiblen Linie CHO-3E10 [Delude, et al., 1998] aus dem Labor von Prof. Douglas T. Golenbock am Maxwell Finnland Laboratory for Infectious Diseases in Boston wurden von Herrn Dr. Norbert Reiling, Laborgruppe Molekulare Infektiologie am Forschungszentrum Borstel überlassen.
Endothelzellkulturmedium: 500 ml Medium 199 Earle supplementiert mit 0,3 mg/ml L-Glutamin, 20 % Fötalem Kälberserum, 100 ng/ml Endothelial Cell Growth Supplement, 5 ng Epidermal Growth Factor, 25 ug/ml Natrium-Heparin und 140 units/ml Penicillin/Streptomycin.
| ↓26 |
Endothelzellwachstumsmedium: 50 % Endothelzellkulturmedium wie oben beschrieben und 50 % Endothelial Cell Growth Medium.
CHO-Zellkulturmedium: Medium NUT.MIX.F-12(HAM) with GLUTAMAX supplementiert mit 10 % Fötalem Kälberserum und 140 units/ml Penicillin/Streptomycin.
CHO-Zellwachstumsmedium: Medium NUT.MIX.F-12(HAM) with GLUTAMAX supplementiert mit 20 % Fötalem Kälberserum und 140 units/ml Penicillin/Streptomycin.
| ↓27 |
|
Medium 199 EARLE 1x |
Biochrom, Berlin |
|
Medium NUT.MIX.F-12(HAM) with GLUTAMAX |
Invitrogen Gibco, Karlsruhe |
|
Endothelial Cell Growth Medium (ECGM) |
PromoCell, Heidelberg |
|
Fötales Kälberserum |
PAA Laboratories, Wien |
|
Penicillin/Streptomycin |
Biochrom AG, Berlin |
|
Endothelial Cell Growth Supplement(ECGS) |
BD Discovery Labware, |
|
Heidelberg |
|
|
Epidermal Growth Factor (EGF) |
Invitrogen Gibco, Karlsruhe |
|
Natrium Heparin |
Sigma, Deisenhofen |
|
L-Glutamin |
Invitrogen Gibco, Karlsruhe |
|
Trypsin-EDTA |
Invitrogen Gibco, Karlsruhe |
|
Accutase |
PAA Laboratories, Wien |
|
Hygromycin |
Calbiochem, Hamburg |
|
G418 Sulphate |
PAA Laboratories, Wien |
|
PBS+/+ (mit Ca2+ und Mg2+) |
Biochrom, Berlin |
|
PBS-/- |
PAA Laboratories, Wien |
|
a. d. Spüllösung |
Braun, Melsungen |
|
Gelatine |
Sigma, Deisenhofen |
Gelatine Stocklösung (0,5 %)
| ↓28 |
2,5 g Gelatine (G) auf 500 ml a. d., bei 60°C gelöst, sterilfiltriert und aliquotiert.
G-Arbeitslösung (0,05 %): 50 ml Stocklösung wurden mit 450 ml a. d. verdünnt.
|
Effectene Transfection Reagent |
Qiagen, Hilden |
|
Superfect Transfection Reagent |
Qiagen, Hilden |
| ↓29 |
|
Antikörper | ||
|
mouse anti-human IL-8, Clone G265-8, Isotype IgG2b, Kat.-Nr. 554717 |
BD Pharmingen, Heidelberg |
|
|
mouse IgG2b, Isotype Control, Kat.-Nr. MG2b00 |
Caltag, Hamburg |
|
|
goat anti-mouse IgG2b-Cy5, Kat.-Nr. M32411 |
Caltag, Hamburg |
|
|
mouse anti-CD25-APC, Clone 2A3, Isotype IgG1, Kat.-Nr. 340907 |
BD Immunocytometry, Heidelberg |
|
|
mouse gamma1-APC, Isotype Control, Kat.-Nr. 345818 |
BD Immunocytometry, Heidelberg |
|
|
Stimulus |
||||
|
Lipopolysaccharid von E.coli 0111:B4, |
Sigma, Deisenhofen | |||
|
Kat.-Nr. 4291 | ||||
|
LPS-Stocklösung |
1 mg/ml in PBS+/+ | |||
|
LPS-Arbeitslösung |
10 ug/ml in PBS+/+ | |||
|
Paraformaldehydstocklösung 20 % |
|||
|
Paraformaldehyd |
20 g |
Sigma, Deisenhofen | |
|
dH2O |
100 ml | ||
| ↓30 |
Kochen, bis eine trübe Lösung entsteht, durch Titration mit 1 M NaOH-Lösung aufklären,
|
PBS 0,2 M |
100 ml zugeben, |
Sigma, Deisenhofen |
nach Abkühlen filtern, pH auf 7,6 einstellen.
| ↓31 |
Paraformaldehydarbeitslösung 2 %: 2 ml Stocklösung auf 18 ml PBS-/-
|
Saponin von Quillaja Bark |
Sigma, Deisenhofen |
|
Monensinstocklösung 2 mM in PBS+/+ | |
|
Monensinarbeitslösung 20uM in PBS+/+ | |
|
Monensin |
Sigma, Deisenhofen |
|
Flusszytometer BD Facscalibur |
BD Biosciences, Heidelberg |
|
mit Software Cellquest Pro | |
|
Betriebsmittel für Flusszytometer: | |
|
FacsFlow |
BD Biosciences, Heidelberg |
|
Luciferase Assay System |
Promega, Mannheim |
|
beta-Gal Reporter Gene Assay |
Roche, Basel |
|
Lumat LB 9501/16 |
Berthold, Bad Wildbad |
| ↓32 |
|
Antikörper | ||
|
primärer Ak: mouse anti-human myc-tag (9B11), Isotype IgG2a, monoklonal, Kat.-Nr. 2276 |
New Eng. Biolabs, Ffm. |
|
|
sekundärer Ak: goat anti-mouse, IRDye800, |
Biomol, Hamburg |
|
|
Kat.-Nr. 610 131 121 | ||
|
Blotmembran Immobilion-P PVDF Membran |
Millipore, Eschborn |
|
|
Blotpapier |
C.Roth, Karlsruhe |
|
|
Proteinlaufhöhenmarker BOA-Marker |
Biomol, Hamburg |
|
|
Lyse-Puffer für Proteinextraktion | |||
|
Tris-HCl |
50 mM, pH 7,4 | ||
|
EDTA |
0,2 mM |
Merck, Darmstadt |
|
|
PMSF |
1 mM |
Sigma, Deisenhofen |
|
|
Antipain, Leupeptin, Pepstain, je |
10 ug/ml |
Sigma, Deisenhofen |
|
|
NP-40 |
1 % |
Sigma, Deisenhofen |
|
|
Lösung für die Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford |
|||
|
Bradfordreagenz |
2 ml |
Bio-Rad, München | |
|
dH2O |
8 ml | ||
| ↓33 |
|
Auftragepuffer nach Lämmli | |||
|
Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8 |
1,0 ml | ||
|
Glycerol 100 % |
0,8 ml |
Merck, Darmstadt |
|
|
SDS 10 % |
1,6 ml |
Serva, Heidelberg |
|
|
Bromphenolblau 1 % |
0,4 ml |
Pharmacia-Biotech, Freiburg |
|
|
ß-Mercaptoethanol 1 % |
0,4 ml |
Sigma, Deisenhofen |
|
|
Sammelgel |
Trenngel, 12,5 % | ||
|
Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8 |
2,5 ml |
Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8 |
2,5 ml |
|
SDS 10 % |
100 µl |
SDS 10 % |
100 µl |
|
Acrylamid-Bis 40 % |
1,33 ml |
Acrylamid-Bis 40 % |
4 ml |
|
TEMED |
5 µl |
TEMED |
5 µl |
|
Ammoniumpersulfat 10 % |
50 µl |
Ammoniumpersulfat 10 % |
50 µl |
|
dH2O |
6 ml |
dH2O |
3,35 ml |
|
Acrylamid-Bis (19:1), 40 % (W/V) |
Serva, Heidelberg |
|
TEMED (N,N,N‘,N‘-Tetramethylethylenediamine) |
Serva, Heidelberg |
|
Sodium-Dodecylsulfate (SDS) |
Serva, Heidelberg |
| ↓34 |
|
Laufpuffer 5x |
Laufpuffer 1x |
|||
|
Tris Base |
15 g |
Laufpuffer 5x |
200 ml | |
|
Glycin |
72 g |
dH2O |
800 ml | |
|
SDS |
5 g | |||
|
dH2O |
ad 1000 ml | |||
|
Blotting-Puffer 10x |
Blotting-Puffer 1x | |||
|
Tris-Base |
15 g |
Blotting 10x |
80 ml |
|
|
Glycerol |
72 g |
Methanol |
200 ml |
|
|
dH2O |
ad 500 ml |
dH2O |
720 ml |
|
|
Blocking-Puffer |
|||
|
Odyssey Blocking Buffer |
50 % |
Li-Cor, Homburg | |
|
PBS |
50 % | ||
| ↓35 |
|
Antikörperinkubationslösung |
|||
|
Odyssey Blocking Buffer |
50 % |
Li-Cor, Homburg | |
|
PBS |
50 % | ||
|
Tween |
0,1 % |
Sigma, Deisenhofen | |
|
Waschpuffer |
||
|
PBS mit 0,1 % Tween, letztes Waschen vor Detektion PBS ohne Tween |
||
|
Tween 20 |
Sigma, Deisenhofen | |
|
Spektralphotometer Uvicon UV 860 |
Kontron, München |
|
Mini-Protean 3 Cell |
Bio-Rad, München |
|
Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell |
Bio-Rad, München |
|
Electrophoresis Power Supply EPS600 |
Pharmacia Biotech, |
|
Hamburg |
|
|
Odyssey Infrared Imaging System + Software R 1.0 |
Li-Cor, Homburg |
| ↓36 |
|
Kultur- und Reaktionsgefäße |
BD Discovery Labware, |
|
Heidelberg |
|
Phasenkontrast-und Fluoreszenzmikroskopie | |
|
Olympus IMT-2, Inverses Forschungsmikroskop, |
Olympus, Hamburg |
|
Olympus IMT-2-RFA/340 und BH2-RFL, |
Olympus, Hamburg |
|
Fluoreszenzeinheit für Olympus IMT-2 |
Olympus, Hamburg |
|
Fluoreszenzfilter: | |
|
Anregung: BP 490 nm, | |
|
Strahlenteiler (Dichromatischer Spiegel): 500 nm, | |
|
Emission: LP 515 nm |
|
Fotografie und Filmmaterial | |
|
Olympus OM-4, Spiegelreflexkamera |
Olympus, Hamburg |
|
Kodak Farbdiafilm für Tageslicht EC, |
Kodak, Stuttgart |
|
Empfindlichkeit DIN 21° |
| ↓37 |
|
Konfokalmikroskopie | |
|
Reagenz zur Anfärbung von F-Aktin: | |
|
Alexa Fluor 546 phalloidin Kat.-Nr. A22283 |
Mobitec, Göttingen |
|
Paraformaldehydlösung 2 % wie unter Flußzytometrie | |
|
Flusszytometrie | |
|
Triton X 100 |
Sigma, Deisenhofen |
|
Triton X 100 1 % Arbeitslösung in PBS-/- | |
|
Permafluor |
BC Immunotech, Krefeld |
|
Zeiss Axioskop2 LSM5 Pascal, Konfokalmikroskop |
Zeiss, Berlin |
Zur Darstellung der Aminosäuresequenzen in Abb. 3 wurde die Software SeqVu, Garvan Institute of Medical Research, Sydney, Australien verwand. Die Vektorkarten in Abb. 6 – 8 wurden mit der Software Macplasmap, CGC Scientific, Ballwin, USA erstellt.
Die Software Prism, GraphPad Software, San Diego, USA wurde verwand für die Berechnung von Mittelwerten, Standardabweichung der Mittelwerte und die Signifikanzprüfung, die als Einwegvarianzanalyse für unverbundene Stichproben durchgeführt wurde.
| © Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme. | ||
| DiML DTD Version 4.0 | Zertifizierter Dokumentenserver der Humboldt-Universität zu Berlin | HTML-Version erstellt am: 21.11.2005 |