Methoden

3.1 Transformation, Bakterienkultur und Präparation von Plasmid-DNA

↓38

Die Gewinnung von Plasmid-DNA für die Transfektion in eukaryote Zellen erfolgt durch Präparation plasmidtragender E. coli. Für die Präparation der Plasmid-DNA werden die kompetenten E. coli zunächst mit dem jeweiligen Plasmid transformiert und dann durch Kultivierung vermehrt, wobei sie das übertragene Plasmid gemeinsam mit ihrem eigenen Genom replizieren. Die Expression eines Antibiotikaresistenzgens, das den transformierten prokaryoten Zellen Resistenz gegen ein dem Kulturmedium zugegebenes Antibiotikum verleiht, ermöglicht eine alleinige Proliferation plasmidtragender Bakterien.

3.1.1 Transformation

Ein Aliquot der kompetenten E. coli wurde auf Eis getaut und mit 0,7 µl 25 mM β-Mercaptoethanol gemischt, um die Aufnahmefähigkeit der Bakterien für die Plasmid-DNA zu erhöhen, und für 10 min auf Eis inkubiert. Dann wurden 0,5 µg Plasmid-DNA zu den zu transfizierenden Zellen gegeben und der Ansatz für 30 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Zellen im Wasserbad bei 42°C für 45 s einem Hitzepuls ausgesetzt und danach sofort wieder auf Eis gekühlt. Nach 2 min wurden 450 µl auf 37°C erwärmtes SOC-Medium zugegeben, und die Zellsuspension wurde für eine Stunde bei 37°C auf dem Schüttler bei 250 rpm inkubiert. Danach wurden je 50 µl der Zellsuspension auf einer Agarplatte ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Nach Transformation mit Plasmid-DNA waren am nächsten Tag auf der Agarplatte mehr als 100 Einzelkolonien gewachsen. Wurden die Bakterien mit einem Ligationsansatz transformiert, waren am nächsten Tag auf der Agarplatte 0 bis 5 Kolonien gewachsen.

3.1.2 Bakterienkultur

Die hier verwendeten Plasmide enthalten entweder ein Resistenzgen gegen Ampicillin oder eine Resistenzgen gegen Kanamycin.

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Transformierte E. coli wurden in Luria-Bertani-Medium (LB-Medium) bei 37°C unter Schütteln mit 250 rpm in Kulturkolben kultiviert, wobei dem LB-Medium je nach Antibiotikaresistenz des transformierenden Plasmids 50 µg/ml Ampicillin (pRK5-Plasmide, pGL3.BG.6κB, pRSVβ-Gal) oder 30 µg/ml Kanamycin (pIRES2-EGFP) zugesetzt wurde. Für eine Minipräparation wurde eine Kolonie in 10 ml, für eine Midipräparation in 90 ml überimpft und jeweils über Nacht inkubiert.

3.1.3 Plasmidpräparation

Die Minipräparation wurde nach dem Prinzip der Alkalischen Lyse durchgeführt, indem 1,8 ml Bakterienkultur in ein 2 ml Reaktionsgefäß überführt wurden, die Bakterien durch Zentrifugation bei 10000 g für 5 min pelletiert wurden, das Zellpellet in 150 µl Lösung I resuspendiert und die Lyse durch Zugabe von 150 µl Lösung II und Mischen initiiert wurde. Nach 30 s Inkubation wurden durch Zugabe von 150 µl Lösung III unerwünschte Zellbestandteile zusammen mit Kalium-SDS ausgefällt und durch Zentrifugation bei 10000 g für 5 min pelletiert. Der klare Überstand wurde in einem neuen Reaktionsgefäß mit 1 ml Ethanol gemischt und bei 15000 g, 4°C für 15 min zentrifugiert. Das gewonnene DNA/RNA-Pellet wurde getrocknet, in 100 µl RNAse-Wasser resuspendiert, und die DNA konnte nach Übernachtinkubation weiterverarbeitet werden.

Die Midipräparation wurde mit dem Qiagen HighSpeed Midi Kit durchgeführt. 90 ml Bakteriensuspension wurden durch Zentrifugation bei 4500 g für 15 min pelletiert, und das Pellet wurde mit den Puffern des HighSpeed Midi Kits entsprechend den Anweisungen des Herstellers weiterverarbeitet. Es konnten pro Präparation eines Ansatzes von 90 ml ca. 250 µg Plasmid-DNA aufgereinigt werden. Die Konzentration der DNA wurde spektrophotometrisch anhand der Absorption bei 260 nm bestimmt.

3.2 Subklonierung der Genvarianten aus pRK5 in pIRES2-EGFP

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Die für negative Mutanten von RhoA, Rac1 und Cdc42 codierenden Gene wurden aus dem Vektor pRK5 ausgeschnitten und in die multiple cloning site (MCS) des bicistronischen Expressionsvektors pIRES2-EGFP eingefügt. Da die MCS des Vektors pRK5 keine Sequenzen enthielt, um die Gene mit für die MCS des Vektors pIRES2-EGFP passenden beidseitig überhängenden Enden auszuschnei-den, wurden die Inserts und der Vektor pIRES2-EGFP so bearbeitet, dass die Inserts an ihrem 3'-5'-Ende glatt (blunt-ended) und an ihrem 5'-3'-Ende über-hängend (sticky-ended) in den Vektor pIRES2-EGFP eingefügt werden konnten.

Dazu wurden folgende Arbeitsschritte durchgeführt:

Aufschneiden von Vektor pRK5 mit der Restriktionsendonuklease Cla I und von Vektor pIRES2-EGFP mit Xho I, anschließend Aufreinigen der DNA.

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Auffüllen überhängender Enden in den Vektoren pRK5 und pIRES2-EGFP mit Klenow-Polymerase, anschließend Aufreinigen der DNA.

Ausschneiden des Inserts aus dem vorbehandelten Vektor pRK5 mit der Restriktionsendonuklease Pst I für RhoA und Rac1 bzw. mit EcoR I für Cdc42, korrespondierend dazu Schneiden des vorbehandelten Vektors pIRES2-EGFP mit Pst I oder EcoR I.

Auftrennung von Insert und pRK5-Vektorbackbone mittels Agarosegel-elektrophorese und Gelelution der Insert-DNA, Aufreinigen der Vektor-DNA pIRES2-EGFP.

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Ligation und Transformation der subklonierten Vektoren:

pRhoAN19-IRES-EGEP, pRac1N17-IRES-EGFP, pCdc42N17-IRES-EGFP

Abb. 5: Subklonierung der inaktiven Mutanten in pIRES2-EGFP

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Zunächst wurden beide Vektoren im jeweils aufzufüllenden Sequenzabschnitt geschnitten und mit Klenow-Polymerase die Enden aufgefüllt. Dann wurden mit gleichen Schnittenzymen die überhängenden Enden generiert und Insert und Vektorbackbone ligiert.

3.2.1 Spezifische Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen

Restriktionsendonukleasen schneiden sequenzspezifisch doppelsträngige DNA, indem sie die hydrolytische Spaltung der Phosphodiesterbindung innerhalb der für sie spezifischen Nukleotidsequenz katalysieren. 1 Einheit Enzym ist definiert als die Menge, die 1ug DNA in einer Stunde unter optimalen Bedingungen schneidet. Die DNA wurde mit 2-3fachem Überschuss an Enzym in einem Volumen von 20 µl des mitgelieferten Puffers bei 37°C für 2 h inkubiert. In dieser Arbeit wurden die Enzyme Cla I, Pst I und EcoR I genutzt, um die für RhoA, Rac1 und Cdc42 codierenden Nukleotidsequenzen aus dem Vektor pRK5 auszuschneiden und den Vektor pIRES2-EGFP für das Einfügen der genannten Gene aufzuschneiden. Es wurden jeweils 10 µg DNA in einem Reaktionsansatz geschnitten, wobei für die spätere Insert-DNA insgesamt 20 µg DNA des jeweiligen pRK5-Vektors verarbeitet wurden, um nach den zahlreichen Arbeitsschritten genügend Insert-DNA für die Ligation zu erhalten.

Reaktionsansatz für die Restriktionshydrolyse:

Puffer, korrespondierend zum Enzym

10x

 

BSA, acetyliert

1 mg/ml

 

DNA

10 µg

 

Enzym

30 Units

 

dH20

ad 20 µl

 

Der Reaktionsansatz wurde bei 37°C für 2 h inkubiert.

3.2.2 Aufreinigen von DNA aus enzymatischen Reaktionen

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Zum Aufreinigen von DNA aus Ansätzen zur Restriktionshydrolyse und aus Ansätzen zum Auffüllen von 5'-Enden mit Klenow-Polymerase wurde der Qiagen MiniElute Reaction Cleanup Kit verwand. Der Kit basiert auf dem Prinzip der Adhäsion von DNA an eine Silikamembran in Anwesenheit chaotroper Rea-genzien. Die Reaktionsansätze wurden auf eine Säule, deren zentraler Bestandteil die genannte Silikamembran war, gegeben und die DNA entsprechend den Anweisungen des Herstellers nach Waschen mit den mitgelieferten Puffern mit 10 µl Tris-Puffer für 1 min bei 10000 g in einer Tischzentrifuge eluiert. Je ein Ansatz zur Restriktionshydrolyse von 10 µg Plasmid-DNA wurde über zwei Säulen des Kits aufgereinigt. Je ein Ansatz zum Begradigen von überhängenden 5'-Enden wurde über eine Säule des Kits aufgereinigt.

3.2.3 Auffüllen überhängender 5'-DNA-Enden mit Klenow-Polymerase

Das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I besitzt eine 3'-5'-Exonuklease-Aktivität und eine 5'-3'-Endonuklease-Aktivität, dem Klenow-Fragment fehlt die 5'-3'-Exonuklease-Aktivität der vollständigen DNA-Polymerase II. In der vorliegenden Arbeit wurde die Klenow-Polymerase zum Auffüllen von überhängenden 5'-Enden mit unmarkierten Desoxynukleotidtriphosphaten (dNTPs) nach Spaltung der Vektoren pRK5-RhoAN19, pRK5-Rac1N17 und pRK5-Cd42N17 mit der Restriktionsendonuklease Cla1 verwandt. Dazu wurde folgender Reaktionsansatz in 20 µl Gesamtvolumen hergestellt, für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend bei 75°C für 10 min inaktiviert:

Reagenz:

Menge

Volumen

Klenow-Puffer, 10x

 

2 µl

DNA

4 µg

8,6 µl

BSA, 10x

20 µg/ml

2 µl

dNTP-Stock, 5x

40 µM

4 µl

Klenow-Polymerase

4 u

0,8 µl

dH2O

 

ad 20 µl

3.2.4 Agarosegelelektrophorese

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Für die elektrophoretische Auftrennung der DNA-Fragmente wurden Agarosegele verwandt. Ein 1 % Agarosegel wurde hergestellt, indem 5 ml 20 x Tris-Acetat-EDTA-Puffer (TAE-Puffer) mit 95 ml dH2O und 1 g Agarose gemischt, die Suspension kurz aufgekocht und 5 µl 1 % Ethidiumbromidlösung zugegeben wurde. Die Lösung wurde in eine Horizontalgelkammer gegossen, und nach Aushärten des Gels wurde der jeweilige Ansatz zur Restriktionshydrolyse mit 8 µl Auftragepuffer versetzt und in zwei Taschen des 1 % Agarosegels aufgetragen. Als Laufpuffer wurde 1 x TAE-Puffer verwandt, und die DNA-Fragmente wurden bei einer Spannung von 80 V aufgetrennt.

3.2.5 Elution elektrophoretisch aufgetrennter DNA-Fragmente aus Agarosegelen

Zur Elution elektrophoretisch aufgetrennter DNA-Fragmente aus Agarosegelen wurde der QIAquick Gel Extraction Kit verwendet. Die entsprechende DNA-Bande wurde unter UV-Licht aus dem Agarosegel ausgeschnitten und in ein 2-ml- Reaktionsgefäß überführt. Das der Aufreinigung zugrunde liegende Prinzip ist unter 3.2.2 beschrieben. Das Gelstück wurde mit den mitgelieferten Puffern entsprechend den Angaben des Herstellers bearbeitet und die DNA mit 30 µl Tris-Puffer bei 10.000 g für 1 min in einer Tischzentrifuge eluiert.

3.2.6 Ligation von einseitig glatt beendeten DNA-Fragmenten und Transformation

Die T4-DNA-Ligase katalysiert die Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen der 5'-Phosphat- und 3'-Hydroxylgruppe zweier DNA-Fragmente. Das Enzym katalysiert sowohl die Verbindung glatter Enden als auch die Verbindung überhängender Enden, wobei die Verbindung glatter Enden mehr Zeit erfordert. Neben der Zeit ist das molare Verhältnis zwischen Vektor-DNA und Insert-DNA wesentlich für eine erfolgreiche Ligation. Daneben sollte das Reaktionsvolumen eine Größe von 20 µl nicht übersteigen. Für jedes neu zu ligierende Plasmid wurden zwei Ligationsansätze mit 15 µl und 20 µl Gesamtvolumen hergestellt, um das passende molare Verhältnis zu erhalten. Es wurden je 100 ng Vektor-DNA und variable Mengen an Insert-DNA in molarem Überschuss eingesetzt:

↓46

Vektor-DNA

100 ng

Insert-DNA

4-10-facher molarer Überschuss

Rapid Ligation Buffer, 2x

7,5 µl/10 µl

T4 DNA Ligase

3 u

dH20

ad 15 µl/20 µl

Die Ligationsansätze wurde entsprechend den Herstellerangaben für das LigaFast-System bei Raumtemperatur für 20 min inkubiert und dann wie unter 3.1.1 beschrieben transformiert.

3.2.7 Identifizierung geeigneter Subklone und DNA-Sequenzierung

Von den Agarplatten, auf denen die mit einem Ligationsansatz transformierten E. coli kultiviert wurden, wurden pro Ligationsansatz 10 Kolonien gepickt und wie unter 3.1.3 beschrieben nach Inkubation eine Minipräparation durchgeführt. Die präparierte Plasmid-DNA wurde einer Restriktionshydrolyse mit dem Enzym BamH I entsprechend 3.2.1 unterzogen, und die DNA-Fragmente wurden entsprechend 3.2.4 im Agarosegel nach ihrer Größe aufgetrennt, um eine erfolgreiche Subklonierung des jeweiligen Gens in den Vektor pIRES2-EGFP zu überprüfen. Unter den 10 überprüften Kolonien fanden sich je nach subkloniertem Gen 1 bis 5, in deren Plasmid-DNA das Insert durch Ausschneiden mit BamH I nachgewiesen wurde. DNA aus einem solchen Klon wurde für alle drei subklonierten Gene von der Firma Qiagen, Hilden sequenziert, um die jeweilige Gensequenz und ihre das Protein inaktivierende Mutation zu überprüfen.

3.3 Zellkultur

↓47

Beide benutzten Zelllinien wurden in T75-Zellkulturflaschen jeweils mit 20 ml Kulturmedium bei 37°C und 0,5 % CO2 bis zum Erreichen der Konfluenz kultiviert. Wenn Zellen für Experimente ausplattiert wurden, wurde zunächst unter Verwendung einer Neubauer-Zählkammer die Anzahl an Zellen pro ml in der Zellsuspension bestimmt und dann die definierte Anzahl an Zellen ausplattiert.

3.3.1 Zellkultur der humanen mikrovaskulären Endothelzelllinie HPMEC-ST1.6R

Alle Kulturgefäße wurden mit Gelatinelösung für 30 min vorbehandelt, um den Zellen verbesserte Adhäsionsmöglichkeiten zu bieten. Dem unter 2.3 beschriebenen Endothelzellmedium wurde 50 µg/ml Geneticin (G418) zugesetzt. Das Medium wurde alle 2–3 Tage ausgetauscht. Die Zellen wurden bis zur Bildung eines Monolayers kultiviert und dann im Verhältnis 1 : 3 gesplittet. Zum Splitten wurden die Zellen 1x mit 10 ml PBS -/- gespült, mit 3 ml Trypsin für 1/2 min inkubiert und dann durch Klopfen restlos abgelöst. Die enzymatische Aktivität des Trypsin wurde durch Zugabe von 10 ml Endothelzellmedium gestoppt und die Zellsuspension für 6 min bei 680 g zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 3 ml Endothelzellmedium resuspendiert und die Zellen wurden ausplattiert. Für Experimente ausplattierte Zellen wurden in einem Gemisch aus 50 % des unter Materialien beschriebenen Endothelzellmediums und 50 % des Endothelial Cell Growth Medium ohne Zusatz von G418 kultiviert.

3.3.2 Zellkultur der LPS-reagiblen Reporterzelllinie CHO-3E10

Zellen der Linie CHO-3E10 wurden in T75-Kulturflaschen mit 20 ml des unter 2.3 beschriebenen CHO-Kulturmediums bei 37°C und 0,5 % CO2 kultiviert. Dem CHO-Zellmedium wurden 400 µg/ml Hygromycin zugesetzt. Das Medium wurde nach 4 Tagen ausgetauscht. Nach spätestens 7 Tagen wurden die konfluenten Zellen passagiert. Dazu wurden die Zellen 1x mit 10 ml PBS-/- gespült und anschließend mit 3 ml Trypsin für 3–5 Minuten bei 37°C inkubiert. Durch Beklopfen der Kulturflasche wurden die Zellen gänzlich abgelöst und die enzymatische Aktivität des Trypsin mit 10 ml CHO-Kulturmedium abgestoppt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 680 g für 6 min pelletiert und das Pellet in 3 ml CHO-Kultur-medium resuspendiert. Davon wurden 100 µl in einer neuen T75 subkultiviert.

3.4 Transfektion und transiente Überexpression inaktiver Genvarianten

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Alle Zellen, die später in die Messung eingingen, wurden mit gleichen Mengen an Plasmid-DNA unter Verwendung gleicher Mengen an Transfektionsreagenzien transfiziert. In Ansätzen für Zellen, die später als Negativ- und Positivkontrollen dienten, wurde die für kleine GTP-bindende Proteine codierende Plasmid-DNA mit DNA des Leervektors pRK5 bzw. für CHO-Zellen mit dem Vektor pIRES2-EGFP ersetzt.

3.4.1 Transfektion humaner Endothelzellen mit dem Transfektionsreagenz Superfect

Endothelzellen wurden in subkonfluentem bis konfluentem Zustand zwei Tage nach Ausplattieren von 2 x Zellen pro Vertiefung einer Sechslochplatte in 3 ml Endothelzellwachstumsmedium transfiziert. Pro Vertiefung einer Sechslochplatte wurden 3 µg DNA und 10 µl Superfect eingesetzt: In einem 2-ml-Reaktionsgefäß wurden 3 µg Plasmid-DNA in 100 µl zusatzfreiem Medium 199 verdünnt, 10 µl Superfect hinzugefügt, das Gemisch 5 s gevortext und 10 min inkubiert. Währenddessen wurden die Zellen 1 x mit 3 ml PBS+/+ pro Vertiefung gewaschen, und dann wurden 600 µl Endothelzellkulturmedium auf eine Vertiefung einer Sechslochplatte gegeben. Das Superfect-DNA Gemisch wurde zu den 600 µl Kulturmedium gegeben, und die Zellen wurden für 4 h bei 37°C inkubiert. Nach dieser Inkubationszeit wurden die Zellen einmal mit 3 ml PBS+/+ gewaschen und mit 4 ml Endothelzellkulturmedium pro Vertiefung weiter inkubiert.

3.4.2 Transfektion von CHO-3E10-Zellen mit dem Transfektionsreagenz Effectene

Die Transfektion von CHO-3E10 erfolgte in Sechslochplatten. Die Zellen wurden in subkonfluentem Zustand am 2. Tag nach Ausplattieren von 2 x Zellen pro Vertiefung in 3 ml CHO-Wachstumsmedium transfiziert. Pro Vertiefung einer Sechslochplatte wurden 0,75 µg DNA, 6 µl Enhancer und 10 µl Effectenereagenz eingesetzt: In einem 2-ml-Reaktionsgefäß wurden die 0,75 µg DNA in 100 µl des zum Kit gehörenden Puffers EC verdünnt und 6 µl Enhancer zugegeben, das Gemisch wurde 2 s gevortext und 5 min inkubiert, dann wurden 10 µl Effectene zugegeben, das Gemisch 10 s gevortext und 10 min inkubiert. Während der Inkubation wurden die Zellen 1 x mit 3 ml PBS+/+ pro Vertiefung gewaschen, und anschließend wurde 1 ml CHO-Kulturmedium in eine Vertiefung einer Sechslochplatte gegeben. Dann wurde das DNA-Effectene Gemisch zu dem 1 ml Kulturmedium gegeben und die Zellen wurden für 2,5 Stunden im Brutschrank inkubiert. Nach einmaligem Waschen mit 3 ml PBS+/+ wurden die Zellen mit 3 ml Wachstumsmedium pro Vertiefung wieder inkubiert.

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Die erfolgreiche Transfektion wurde am nächsten Tag sowohl für Endothel- als auch für CHO-Zellen anhand der Fluoreszenz GFP-transfizierter Zellen unter dem Olympus IMT-2 Mikroskop mit einem für FITC gebräuchlichen Filterset überprüft. Die Effizienz, gemessen an GFP-positiven Zellen, einen Tag nach Transfektion entsprechend obiger Beschreibung lag für Endothelzellen in der Größenordnung 3–5 % und für CHO-Zellen in der Größenordnung 20 %.

3.5 GFP-assoziierte selektive durchflusszytometrische Messung

Die Durchflusszytometrie, auch als fluorescence-aided cell sorting (FACS) bezeichnet, bestimmt für eine Population von in einem kontinuierlichen Flüssigkeitsstrom durch eine Flusszelle geführten Zellen verschiedene Parameter. Das sind neben den Standardparametern Größe und Granularität je nach Gerät eine Reihe weiterer Fluoreszenzparameter für jede einzelne Zelle. Die Detektion der Fluoreszenzsignale erfolgt nach Anregung durch einen Laser und Aufspaltung des emittierten Lichts mittels optischer Filtereinheiten durch Photomultipliertubes, in denen ein der Lichtintensität korrelierendes elektrisches Signal induziert wird. Nach Verarbeitung durch einen Rechner werden die gemessenen Fluoreszenzen als Dot Plot oder Histogramm dargestellt. Die vorhergehende Markierung zu detektierender zellulärer Antigene mit fluoreszenzkonjugierten Antikörpern ermöglicht die qualitative und quantitative Bestimmung dieser Antigene. In dieser Arbeit wurde neben den antikörpermarkierten Zielantigenen IL-8/CXCL8 und CD25-Reportermolekül auch von den transfizierten Zellen exprimiertes Grünes Fluoreszenzprotein (GFP) detektiert. Das für das GFP codierende Gen als Marker der erfolgreichen Transfektion wurde gemeinsam mit dem zu untersuchenden Gen von Interesse in die Zelle transferiert. Wesentlich ist, dass die eingesetzten Fluoreszenzmoleküle auf die optische Ausstattung des Flusszytometers abgestimmt sind. Das für diese Arbeit verwendete BD Facscalibur regt die Zellen mit zwei Lasern bei 488 nm und 635 nm an, wobei das exprimierte GFP bei 488 nm angeregt wird und die beiden eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffe Allophycocyanin (APC) und Cyanin-5 (Cy5) bei 635 nm. Die Auswahl der verwendeten Detektionskanäle und Farbstoffe wird unter 5.2.3 diskutiert.

3.5.1 Selektive Bestimmung von intrazellulärem IL-8/CXCL8 in transfizierten Endothelzellen

Unter Verwendung des BD Facscalibur und der Software Cell Quest Pro wurden für jede einzelne Zelle neben den Standardparametern Größe und Granularität die Fluoreszenzen im Kanal Fluoreszenz-1 (Fl-1) bei 530 nm mit einer Bandbreite von 30 nm und im Kanal Fl-4 bei 661 nm mit einer Bandbreite von 16 nm bestimmt. Anhand der Fluoreszenz in Fl-1 wurden, nachdem die Eigenfluoreszenz der Endothelzellen mit einer nicht transfizierten Population bestimmt wurde, die transfizierten GFP-positiven Zellen identifiziert. Im Kanal Fl-4 wurde nach intrazellulärem Färben die IL-8/CXCL8-assoziierte durch Cy5 verursachte Fluoreszenz als Maß für die Expression von IL-8/CXCL8 quantifiziert, wobei die intrazelluläre Zytokinbestimmung nach der Methode von Jung erfolgte [Jung, et al., 1993]. Dieses Vorgehen ermöglicht die selektive Messung der IL-8/CXCL8- Expression in transfizierten Zellen und erlaubt damit eine Aussage über die getesteten Mutanten der GTP-bindenden Proteine, obwohl die Transfektions-effizienz der schwer transfizierbaren Endothelzellen in einer Größenordnung < 5 % liegt.

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Zur Messung des intrazellulären IL-8/CXCL8 wurden die Kulturen der Linie HPMEC-ST1.6R nach folgendem zeitlichen Verlauf bearbeitet:

Tag 0: Ausplattieren der Endothelzellen

Endothelzellen, die in einer T75 einen Monolayer bildeten, wurden, wie unter 3.3.1 beschrieben, abtrypsiniert, die Zellzahl unter Verwendung der Neubauer-Zählkammer bestimmt und 2 x Zellen in 3 ml Endothelzellwachstumsmedium pro Vertiefung einer Sechslochplatte ausplattiert. Für jeweils einen späteren Messwert wurde eine Sechslochplatte ausplattiert.

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Tag 1: Kotransfektion der Zellen mit den zu testenden Genvarianten in pRK5 und pGreenLantern1 unter Verwendung des Transfektionsreagenz Superfect

Die Endothelzellen wurden mit den Plasmiden pRK5-Leer, pRK5-RhoAN19, pRk5-Rac1N17, pRK5-Cdc42N17 und pGreenLantern1 kotransfiziert. Die Transfektion von insgesamt 3 µg DNA pro Vertiefung erfolgte mit pRK5-Plasmid und pGreenLantern1 im Verhältnis 1 : 1 entsprechend der unter 3.6 beschriebenen Methode. Zellen, die später als Negativ-, Positiv- und Isotypenkontrolle dienten, wurden mit dem Plasmid pRK5-Leer und pGreenLantern1 transfiziert.

Tag 3: Stimulieren mit 150 ng/ml LPS und Inhibition der Zytokinausschleusung mit 2 µM Monensin, 8 h später Ablösen, Fixieren, Färben der Endothelzellen und flusszytometrische Bestimmung des intrazellulären IL-8/CXCL8

↓52

Die LPS-induzierte IL-8/CXCL8-Sekretion von primären Endothelzellen aus der Nabelschnurvene ist 4–8 Stunden nach Expositionsbeginn maximal [Hippenstiel, et al., 2000]. Die Stimulation der in dieser Arbeit verwendeten mikrovaskulären Endothelzellen erfolgte daher für 8 h, wobei 4 h nach Expositionsbeginn dem Kulturmedium Monensin in einer Konzentration von 2 µM zugegeben wurde. Dieses bewirkt eine Akkumulation exprimierter Zytokine im Golgiapparat. In 2 ml Endothelzellkulturmedium pro Vertiefung wurde mit einer Konzentration von 150 ng/ml LPS von E. coli stimuliert, wozu 10 µl der unter 2.5 beschriebenen LPS-Stocklösung in 990 µl PBS+/+ verdünnt wurden und von diesem Substock 30 µl pro Vertiefung zugegeben wurde. Anschließend wurden die Zellen nach Waschen mit PBS-/- mit 0,5 ml Accutase pro Vertiefung abgelöst, in 3 ml Medium aufgenommen und durch Zentrifugation bei 680 g für 8 min pelletiert. Nach jedem der folgenden Arbeitsschritte wurden die Zellen mit 4 ml PBS-/- gewaschen und auf die gleiche Weise für den nächsten Arbeitsschritt pelletiert. Nach dem ersten Pelletieren wurden die Zellen einer Sechslochplatte für die weitere Verarbeitung in einem Facsröhrchen zusammengeführt. Die Zellen wurden dann durch Resuspension in 0,5 ml 2 % Paraformaldehydlösung für 10 min fixiert und anschließend durch Resuspension in 0,5 ml 0,1 % Saponinlösung für 10 min permeabilisiert. Zur Inkubation mit dem primären Antikörper (Ak) gegen IL-8/ CXCL8 bzw. dem Isotypenkontroll-Ak wurden die Zellen in 20 µl Octagam resuspendiert, dann 0,75 µg Ak zugegeben und für 30 min inkubiert. Die Inkubation mit dem sekundären Cy5-gelabelten Antikörper erfolgte mit 0,4 µg Antikörper in 50 µl 0,1% Saponinlösung für 30 min. Nach Waschen wurden die Zellen in 1ml PBS-/- resuspendiert und im BD Facscalibur gemessen.

3.5.2 Selektive Bestimmung der Reporter-Aktivierung in transfizierten CHO-3E10-Zellen

Die Zellen der Linie CHO-3E10 sind aus einem mit den beiden Plasmiden pUMS(ELAM)-Tac und pCEP4/CD14 stabil kotransfiziertem Klon hervorgegangen [Delude, et al., 1998]. pUMS(ELAM)-Tac codiert für das humane Zelloberflächen-antigen CD25, das in diesem Vektor unter der Kontrolle eines NF-κB-abhängigen Promotors steht. Die Verstärkerregion enthält daneben ein cis-reaktives Element für AP-1 [Jensen undWhitehead, 2003;Whitley, et al., 1994]. Die Expression von CD14 macht die Zellen reagibel gegen die Exposition mit LPS. Flusszytometrisch wurden entsprechend der unter 3.5 beschriebenen Methode mit den Plasmiden pRhoAN19-IRES-EGFP, pRac1N17-IRES-EGFP und pCdc42N17-IRES-EGFP transfizierte Zellen durch ihre Fluoreszenz in Fl-1 identifiziert, und anhand des Signals in Kanal Fl-4 wurde die durch Allophycocyanin verursachte CD25-assoziierte Fluoreszenz als Maß für die Reporter-Aktivierung quantifiziert.

Zur Messung der LPS-induzierten Reporter-Aktivierung wurden die Kulturen der Linie CHO-3E10 nach folgendem zeitlichem Verlauf bearbeitet:

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Tag 0: Ausplattieren der CHO-3E10-Zellen

CHO-3E10-Zellen, die sich in einer T75 in der exponentiellen Wachstumsphase befanden, wurden wie unter 3.3.2 beschrieben abtrypsiniert, die Zellzahl unter Verwendung der Neubauer-Zählkammer bestimmt und 2 x Zellen in 3 ml CHO-Wachstumsmedium pro Vertiefung einer Sechslochplatte ausplattiert. Für jeweils einen Messwert wurden 2 Vertiefungen einer Sechslochplatte ausplattiert.

Tag 2: Transfektion mit den zu testenden Genvarianten unter Verwendung von Effectene

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Die subkonfluenten Zellen wurden wie 3.4.2 beschrieben mit den Plasmiden pRhoAN19-IRES-EGFP, pRac1N17-IRES-EGFP und pCdc42N17-IRES-EGFP transfiziert. Zellen, die später als Negativ-, Positiv- und Isotypenkontrolle dienten, wurden mit dem Plasmid pIRES2-EGFP transfiziert.

Tag 3: Mindestens 24 h nach Transfektion Stimulation der Zellen mit 150 ng/ml LPS

Die Stimulation der Zellen erfolgte in 2 ml CHO-Kulturmedium pro Vertiefung mit einer Konzentration von 150 ng/ml LPS von E. coli über eine Zeit von 18 h. Dazu wurden 10 µl der unter 2.5 beschriebenen LPS-Stocklösung in 990 µl PBS+/+ verdünnt und von diesem Substock 30 µl auf 2 ml Kulturmedium in einer Vertiefung gegeben.

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Tag 4: 18 h nach Stimulation Ablösen, Färben und flusszytometrische Bestimmung der CD25-Expression als Maß für die Reporter-Aktivierung

Um die Oberflächenantigene der CHO-Zellen zu schonen, wurden die Zellen nicht fixiert, sondern nativ mit den Antikörpern inkubiert und gemessen. Nach dem Ablösen der Zellen mit Accutase erfolgten alle weiteren Schritte der Verarbeitung bis zum Messen der Zellen auf Eis, um den Stoffwechsel der nativen Zellen zu minimieren. Die Zellen wurden mit 2 ml PBS-/- pro Vertiefung gewaschen und anschließend mit 0,5 ml Accutase für 5 Minuten bei 37°C inkubiert. Durch leichtes Klopfen wurden die Zellen restlos abgelöst. Nach Zugabe von 3 ml Kulturmedium pro Vertiefung wurde die Zellsuspension aus jeweils einer Vertiefung in ein Facsröhrchen überführt und wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 680 g für 8 Minuten pelletiert. Das Pellet wurde in 0,5 ml PBS-/- resuspendiert und die Zellsuspensionen aus jeweils zwei gleich behandelten Vertiefungen in einem Facsröhrchen zusammengeführt und gemeinsam weiterverarbeitet. Die Zellsuspensionen wurden erneut wie oben beschrieben durch Zentrifugation pelletiert. Die Zellpellets wurden in 20 µl 1 % Octagamlösung resuspendiert und Negativ-, Positivkontrolle sowie die RhoAN19-, Rac1N17- und Cdc42N17- transfizierten Zellen mit jeweils 5 µl des Anti-CD25-APC-Antikörpers, die Zellen der Isotypenkontrolle mit 5 µl des mouse-gamma1-APC-Antikörpers für 30 Minuten inkubiert. Nach 30 Minuten wurden die Röhrchen mit den Zell-Antikörper- Suspensionen mit 4 ml PBS-/- aufgefüllt und wie oben beschrieben zentrifugiert. Zum Waschen der Zellen von nicht gebundenem Antikörper wurden die Zellpellets erneut in PBS-/- resuspendiert und zentrifugiert. Die dann gewonnenen Zellpellets wurden in 1 ml PBS-/- resuspendiert und im BD Facscalibur gemessen.

3.6 Luziferasebiolumineszenzassay zur Bestimmung der Aktivierung von NF-κB

Der Luziferasebiolumineszenzassay wurde in dieser Arbeit als Methode zur Messung der Transkriptionsfaktoraktivierung unabhängig von speziellen Zielgenen eingesetzt.

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Die Oxidation eines assoziierten Luziferins unter der katalytischen Aktivität einer Luziferase mit Lichtemission ist das Grundprinzip von Biolumineszenz, wobei Luziferase (Enzym) und Luziferin (Substrat) Oberbegriffe sind, unter denen je nach Organismus verschiedene Substanzen zusammengefasst werden [Chalfie undKain, 1998]. Das im Vektor pGL3.BG.6κB enthaltene Gen luc+ codiert für eine zu Reporterzwecken optimierte Variante des Luziferasegens aus Photinus pyralis und steht unter der Kontrolle eines durch Anlagerung von induzierbaren Promotors. Die von luc+ codierte Luziferase wird also in mit pGL.BG.6κB transfizierten Zellen in Abhängigkeit der Aktivierung von exprimiert. Die enzymatische Aktivität des Proteinextrakts als Maß für die -Aktivierung verschieden behandelter Proben kann anhand der Lichtemission der Biolumineszenzreaktion im Luminometer quantifiziert werden. In diesem Versuch wurden die Endothelzellen mit pGL.BG.6κB und den inaktiven Mutanten der GTP-bindenden Proteine kotransfiziert, um deren Wirkung auf die Aktivierung von zu testen. Zusätzlich wurde das Plasmid RSVβ-Gal kotransfiziert, um Schwankungen in der Transfektionseffizienz durch Abgleich der Werte für die Luziferaselumineszenz auf die Werte für β-Galaktosidasechemielumineszenz zu normalisieren.

Zur Messung der Aktivierung von mittels Biolumineszenzassay wurden die Zellen unter Verwendung des Luciferase Assay System (Promega) und des β-Gal Assay (Roche) nach folgendem Verlauf bearbeitet:

Tag 0: Ausplattieren der Endothelzellen

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Aus einer T75 wurden wie unter 3.1 beschrieben Zellen abtrypsiniert und 2 x Zellen pro Vertiefung einer Sechslochplatte in 3 ml Wachstumsmedium ausplattiert, wobei pro späteren Messwert 2 Vertiefungen Zellen angesetzt wurden.

Tag 1: Transfektion der Zellen

Es wurde jeweils ein pRK5-Plasmid der für die inaktiven Varianten der GTP-bindenden Proteine codierenden pRK5-Plasmide mit pGL.3.BG.6κB und pRSVβ-Gal im Verhältnis 50 : 25 : 25 mit einer Gesamtmenge von 2 µg DNA pro Ver-tiefung wie unter 3.4.1 beschrieben kotransfiziert.

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Tag 2: Stimulieren der Zellen mit 150 ng/ml LPS, Proteingewinnung und Bestimmung der Luziferinbiolumineszenz als Maß für die Aktivierung von sowie der β-Galaktosidaselumineszenz

Die Zellen wurden mit 150 ng/ml LPS von E.coli in 2 ml Kulturmedium über einen Zeitraum von 6 h stimuliert. Dann wurden die Zellen mit 400 µl Reporterassy-Lysepuffer pro Vertiefung lysiert, das Zellysat vollständig abgekratzt, in ein 2-ml- Reaktionsgefäß überführt, dort 10 min inkubiert und anschließend wurden Zellbestandteile durch Zentrifugation bei 10000 g für 10 min vom Proteinlysat getrennt. Von dem in ein neues Reaktionsgefäß überführten Proteinlysat wurden zur Messung der Luziferaseaktivität der Probe 5 µl zu 50 µl Luziferinsubstrat gegeben und die Lumineszenz für 5 s im Luminometer gemessen. Zur Bestimmung der β-Galaktosidaseaktivität derselben Probe wurden 50 µl Lysat auf 100 µl Substratreagenz aus dem β-Gal Reporter Gene Assay gegeben und nach 30 min 50 µl Initiationsreagenz zugegeben. Anschließend wurde die Chemielumineszenz der Probe im Luminometer bestimmt.

3.7 Selektion stabil transfizierter Zellen

Die Überexpression eines Proteins nach Transfektion einer Zellpopulation mit Plasmid-DNA ist in der ganz überwiegenden Zahl der transfizierten Zellen zeitlich auf wenige Tage bis Wochen beschränkt, wohingegen sehr wenige der Zellen das Protein dauerhaft exprimieren. Enthält der transfizierende Vektor neben dem Gen von Interesse zusätzlich ein Gen, das für ein Enzym codiert, welches ein für eukaryote Zellen toxisches Selektionsantibiotikum inaktiviert, ist die Selektion dieser stabil transfizierten Zellen möglich. Der Vektor pIRES2-EGFP und seine in dieser Arbeit hergestellten Derivate codieren unter anderem für ein Enzym aus der Gruppe der Aminoglykosid 3'-phosphotransferasen (APH(3')), die Aminoglykosidantibiotika inaktivieren können. Im Vektor geht dem Gen neben einem Promotor und Replikationsursprung für die Expression in E. coli zur Selektion transformierter Bakterien für die Plasmidpräparation auch ein Promotor und Replikationsursprung für die Transkription in SV40-transformierten Zelllinien voraus. Damit ist die Selektion stabil transfizierter Zellen der Linie CHO-3E10 unter Verwendung des Aminoglykosids G418, das aufgrund seiner besonderen Affinität zum eukaryotischen Ribosom verwendet wird, möglich. Die Dosierung des Selektionsantibiotikums variiert in Abhängigkeit von Zelltyp und Kulturbedingungen.

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In dieser Arbeit wurden Zellen wie unter 3.6.2 beschrieben transfiziert und die transfizierte Population nach drei Tagen Ruhezeit ohne Selektionsantibiotikum über zwei Wochen selektiert. Dazu wurde die Hälfte der Zellen aus einer Vertiefung einer Sechslochplatte zunächst für 7 Tage in einer T75 in 10 ml Medium, dann für 7 Tage in 96-Loch-Platten in 100 µl Medium pro Vertiefung jeweils mit einer Konzentration von 5 mg/ml G418 in CHO-Zellkulturmedium kultiviert. Danach wurden die 96-Loch-Platten fluoreszenzmikroskopisch auf EGFP-positive Zellen untersucht und fluoreszierende Zellklone (ca. 1 EGFP-positiver Klon auf 500-1000 Vertiefungen) abtrypsiniert, in T25-Zellkulturflaschen überführt und dort mit einer Konzentration von 1 mg/ml G418 in 5 ml Medium weiterkultiviert.

3.8 Western-Blot

Mit dem Western-Blot wird ein einzelnes Protein von Interesse in einem Proteingemisch, ggf. semiquantitativ, nachgewiesen. Die Proteine der Probe werden zunächst nach ihrer molaren Masse aufgetrennt, dann auf eine Membran übertragen, dort der Antikörperexposition ausgesetzt und dann, je nach eingesetztem Detektionssystem, hier über fluoreszenzkonjugierte Sekundär-antikörper das Protein von Interesse nachgewiesen.

In dieser Arbeit wurde der Western-Blot zum Nachweis der mit dem Myc-Epitop markierten Proteine RhoAN19 und Cdc42N17 in den Proteinextrakten der neu generierten Zelllinien CHO-RhoAN19 und CHO-Cdc42N17 genutzt.

3.8.1 Proteinextraktion

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Die Zellen zweier Vertiefungen einer Sechslochplatte wurden auf Eis mit PBS gewaschen, mit je 30 µl Lysepuffer lysiert, das Lysat in 2-ml-Reaktionsgefäße überführt, für 5 min auf Eis inkubiert, bei 10000 g und 4°C für 5 min zentrifugiert, der proteinhaltige Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt und nach Abnahme von 5 µl für die Proteinkonzentrationsbestimmung bei –20°C gelagert.

3.8.2 Konzentrationsbestimmung des Proteins im Lysat

Zur Proteinkonzentrationsbestimmung unter Verwendung des Bio-Rad Bradford Proteinassays wurden je 995 ml des 1 : 5 verdünnten Farbstoffreagenz mit 5 µl Proteinlysat gemischt, nach 5 min Inkubation die Absorption der Probe bei 595 nm im Photometer gemessen und anhand einer mit BSA generierten Standardkurve die zugehörige Proteinkonzentration bestimmt.

3.8.3 Sodium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Trenn- und Sammelgel wurden in einer Bio-Rad-Elektrophoresekammer angesetzt, indem die unter Material beschriebenen Reagenzien gemischt wurden und die Vernetzung mit TEMED angestoßen wurde. Während der Polymerisation des Gels wurden je Probe 80 µg Protein 1:1 mit β-Mercaptoethanol-haltigem Gelladepuffer versetzt, für 3 min unter Schütteln bei 95°C erhitzt und anschließend in die Taschen des Sammelgels aufgetragen. Für 15 min wurden die Proteine im Sammelgel zusammengeführt und anschließend bei 100 V im 12,5 % Trenngel bis zum Austritt des Ladepufferfarbstoffs aus dem Trenngel aufgetrennt.

3.8.4 Protein-Blot und Antikörperexposition

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Das Blotsystem wurde in eiskaltem Blotpuffer eingelegt: zwei Blotpads, darauf je zwei Wathmann-Filterpapiere. Die Transfermembran wurde zunächst für 5 s in 100 % eiskaltem Methanol äquilibriert, dann in Blotting-Puffer eingelgt, dann auf das Filterpapier aufgebracht, das vom Sammelgel getrennte Trenngel auf die Membran gelegt, das luftblasenfrei verriegelte System in die Blotkammer eingesetzt und der Proteintransfer bei 100 V in eiskaltem Blotpuffer für 1 h durchgeführt. Nach dem Blot wurde die Membran für 2 h unter Schütteln in Blockpuffer inkubiert, um unspezifische Antikörperbindungen an die Membran zu minimieren, dann erfolgte die Inkubation mit dem ersten monoklonalen Antikörper (Ak) gegen das Myc-Epitop, 1 : 600 verdünnt in Ak-Lösung über Nacht. Nach dreimaligem Waschen für je 5 min in Waschlösung erfolgte die Inkubation mit dem zweiten IRDye800-konjugierten Ak gegen IgG-Maus 1 : 2000 verdünnt in Ak-Lösung. Nach erneutem dreimaligem Waschen, zuletzt mit Waschpuffer ohne Tween, erfolgte die Detektion.

3.8.5 Detektion des IRDye800-assoziierten Zielproteins mit dem Odyssey- Scanner

Grundlage des in dieser Arbeit eingesetzten Odyssey-Detektionssystems der Firma Licor ist die Detektion der Fluoreszenz bei 800 nm. Das detektierte Signal wird vom System digital gespeichert und kann dann mit der Odyssey-Software verarbeitet und in ein Bild umgesetzt werden. Vorteile gegenüber der klassischen Detektion mittels Enhanced Chemiluminescense (ECL) sind 1. variable Möglich-keiten das der Fluoreszenz entsprechende elektrische Signal zu verstärken, 2. digitale Speicherung des Ergebnisses, 3. ggf. Nachweis zweier verschiedener Proteine auf einer Membran durch Verwendung zwei verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe, 4. kein Zeitdruck bei der Verarbeitung, da die Fluoreszenzfarbstoffe sich auch noch nach Tagen anregen lassen.

3.9 Phasenkontrast-, Fluoreszenz- und Konfokalmikroskopie

3.9.1 Phasenkontrastmikroskopie und Fluoreszenzmikroskopie

Die phasenkontrast- und fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen nativer Zellen wurden am inversen Mikroskop Olympus IMT-2 mit der Spiegelreflexkamera Olympus OM-4 angefertigt. Für die Fluoreszenzmikroskopie wurde eine für Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) optimierte Filtereinheit bestehend aus Anregungsfilter: BP 490 nm, Farbteiler (Dichromatischer Spiegel): 500 nm und Emissionsfilter: LP 515 nm verwendet. Die spektralen Eigenschaften FITC-geeigneter Filter erlauben auch die Darstellung der eingesetzten GFP-Varianten, denn beide Varianten enthalten die Mutation S65T, die ihr Anregungsmaximum in den Bereich von 490 nm verschiebt [Diamond undDeMaggio, 2000]. Das Emissionsmaximum liegt im Bereich von 507 nm. Zellen für die transiente Transfektion und stabil transformierte Zelllinien wurden jeweils in Sechslochplatten ausplattiert. Für die Anfertigung fluoreszenz-mikroskopischer Aufnahmen transient transfizierter Zellen der Linien HPMEC-ST1.6R und CHO-3E10 wurden die Zellen entsprechend 3.4 mit inaktiven GTPasen und die Kontrolle mit Leervektor transfiziert. Transfizierte Zellen wurden fluoreszenzmikroskopisch identifiziert und die Zellmorphologie 24 h nach Transfektion dokumentiert. Um die Hintergrundfluoreszenz zu minimieren wurde vor Belichtung des Films das Kulturmedium entfernt und durch PBS+/+ ersetzt.

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Zur Darstellung transient transfizierter Einzelzellen in 40x Vergrößerung wurden Aufnahmen mit Belichtungsautomatik und manueller Einstellung der Belichtungszeit in 10-s-Intervallen unterhalb der automatisch gewählten Belichtungszeit angefertigt und nach Entwicklung korrekt belichtete Aufnahmen ausgewählt. Für die lichtmikroskopischen und fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen stabil transformierter Linien in 40x Vergrößerung wurden die Aufnahmen mit Belichtungsautomatik angefertigt.

3.9.2 Konfokalmikroskopie

Die konfokalmikroskopischen Aufnahmen des F-Aktins fixierter CHO-Zellen wurden mit dem Zeiss Axioskop2 LSM 5 Pascal angefertigt. Die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (LSM) baut auf dem Prinzip der Auflichtfluoreszenz-mikroskpie auf. Dabei wird aber nur das Licht aus einem definierten Fokus des Präparats von Photomultipliertubes detektiert und anschließend aus den Signalen der abgerasterten Foci vom Computer ein Bild berechnet. Dieses stellt die Strukturen einer Bildebene ohne Überlagerung durch die anderen Bildebenen des Präparats dar. Für die Darstellung des Alexa-Fluor-546-markierten F-Aktins wurde das Präparat bei 488 nm angeregt und eine Filtereinheit bestehend aus Hauptfarbteiler (Dichromatischer Spiegel): 534 nm und Emissionsfilter: LP 560 nm verwendet. Zellen der Linien CHO-3E10, CHO-RhoAN19-EGFP und CHO-Cdc42N17-EGFP wurden in 24-Loch-Platten auf Glasplättchen ausplattiert. Nach Wachstum zu einem konfluenten Monolayer wurden die Zellen 2x mit PBS-/- gewaschen, mit 0,5 ml 3 % Paraformaldehydlösung für 20 min fixiert und erneut 2x mit PBS-/- gewaschen. Die hochspezifische Bindung von Phalloidin, einem primär aus Amanita phalloides isoliertem Peptidtoxin, an F-Aktin ist die Grundlage für die Anfärbung des F-Aktins als wesentlichem Bestandteil des Zytoskeletts. Für die Anfärbung des F-Aktins wurden die Zellen durch fünfzehnminütige Inkubation mit 1 % Triton X-Lösung permeabilisiert und anschließend für 30 min mit Alexa-Fluor-546-konjugiertem Phalloidin in der Verdünnung 1 : 200 inkubiert. Nach jedem Arbeitsschritt wurden die Zellen mit PBS-/- gewaschen. Für die konfokalmikroskopische Detektion des angefärbten F-Aktins wurde die vom Zellrasen bedeckte Oberfläche des Glasplättchens auf einen Objektträger mit einem Tropfen Permafluor gelegt und mit Nagellack fixiert. Die Bilder wurden in 63facher Vergrößerung aufgenommen.


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21.11.2005