4 Ergebnisse

4.1 Subklonierung von RhoAN19, Rac1N17 und Cdc42N17

↓62

Um transfizierte von nicht transfizierten Zellen zu unterscheiden, wurde in nachfolgenden Experimenten neben dem Gen von Interesse auch ein Gen für das Grüne Fluoreszenzprotein in die Zellen transfiziert. Die Expression beider Proteine von einem mRNA-Transkript unter Verwendung des pIRES2-EGFP-Vektors führt zu einem definierten Mengenverhältnis zwischen exprimiertem Protein von Interesse und Fluoreszenzprotein von ~ 2,5 : 1 [Mizuguchi, et al., 2000]. Außerdem erlaubt der pIRES2-EGFP-Vektor die Selektion transformierter Zellen durch Expression eines Antibiotikaresistenzgens in eukaryoten Zellen. Deshalb wurden die für inaktive Varianten der Proteine RhoA, Rac1 und Cdc42 codierenden Mutanten aus dem Vektor pRK5 ausgeschnitten und in die MCS des bicistronischen Expressionsvektors pIRES2-EGFP eingefügt. Diese Plasmide wurden später für die transiente Expression in der Linie CHO-3E10 genutzt und für die Generation der stabilen Linien CHO-RhoAN19 und Cdc42N17 verwendet.

↓63

Nachfolgend sind die neuen Vektoren und ihre für das jeweilige GTP-bindende Protein codierende Sequenz dargestellt. Diese wurde durch Sequenzierung bei der Firma Qiagen, Hilden und Vergleich der Sequenz mit dem jeweiligen Code für den Wildtyp des betreffenden Gens überprüft, wobei zum Vergleich der Gensequenzen das über das Internet zugängliche „Basic Local Alignment Search Tool“ (BLAST) des National Center for Biotechnology Information (NCBI), USA genutzt wurde [Altschul, et al., 1990]. Der Vergleich der mutierten Sequenzen mit dem jeweiligen Wildtyp zeigt die mit der inaktivierenden Mutation in Ras (T17N) korrespondierenden inaktivierenden Mutationen für RhoA, Rac1 und Cdc42 [Self undHall, 1995]. Rot dargestellt sind in der jeweiligen Gensequenz Mutationen, die eine geänderte Aminosäure im Protein zur Folge haben, kursiv dargestellt sind stille Mutationen, die ohne Folge für die Aminosäureabfolge des Proteins sind, mit Grün sind die Start- und Stopcodons für die Translation gekennzeichnet und mit Blau die für das Myc-Epitop codierende Nukleotidsequenz.

4.1.1 pRhoAN19-IRES-EGFP

Abb. 6: Vektorkarte pRhoAN19-IRES-EGFP

Sequenzierungsergebnis

↓64

Der Vergleich mit der codierenden Sequenz für Homo sapiens ras homology gene family, member A (gi: 17439388) zeigt folgende Differenzen:

T19N: Durch Mutation in Codon 19 (ACA→AAC) wird Asparagin (N) statt Threonin (T) codiert, diese Mutation verändert das Protein in eine bezüglich seiner GTP-bindenden Aktivität inaktive Variante. F25N: Durch Mutation in Codon 25 (TTC→AAC) wird Asparagin (N) statt Phenylalanin (F) codiert, diese vorbeschriebene Mutation nimmt keinen Einfluss auf die biologische Aktivität, aber erhöht die Stabilität des Proteins und wird anerkannterweise in experimentellen Anordnungen genauso wie der Wildtyp genutzt [Self undHall, 1995]. Die Mutation in Codon 24 (GTC→GTT) ist still. Der Sequenz für RhoAN17 geht die Sequenz für das Myc-Epitop voraus, und beide sind von Start- und Stopcodon korrekt eingeschlossen.

4.1.2 pRac1N17-IRES-EGFP

↓65

Abb. 7: Vektorkarte pRac1N17-IRES-EGFP

Sequenzierungsergebnis

↓66

Der Vergleich mit der codierenden Sequenz für Human ras-related C3 botulinum toxin substrate (rac) zeigt folgende Differenzen:

T17N: Durch Mutation in Codon 17 (ACT→AAT) wird Asparagin (N) statt Threonin (T) codiert, diese Mutation verändert das Protein in eine bezüglich seiner GTP-bindenden Aktivität inaktive Variante. Die Mutation in Codon 151 (GCT→GCC) ist still. Der Sequenz für Rac1N17 geht die Sequenz für das Myc-Epitop voraus und beide sind von Start- und Stopcodon korrekt eingeschlossen.

4.1.3 pCdc42N17-IRES-EGFP

Abb. 8: Vektorkarte pCdc42N17-IRES-EGFP

↓67

Sequenzierungsergebnis

Ein Vergleich mit der codierenden Sequenz für Human GTP-binding Protein (G25K) (gi: 182856) zeigt folgende Differenzen: T17N: Durch Mutation in Codon 17 (ACA→AAT) wird Asparagin (N) statt Threonin (T) codiert, diese Mutation verändert das Protein in eine bezüglich seiner GTP-bindenden Aktivität inaktive Variante. Die Mutationen in Codon 12 (GGT→GGC) und Codon 13 (GCT→GCC) sind still. Der Sequenz für Cdc42N17 geht die Sequenz für das Myc-Epitop voraus und beide sind von Start- und Stopcodon korrekt eingeschlossen.

4.2 Zellmorphologie nach Expression von RhoAN19, Rac1N17, Cdc42N17

↓68

Der immunfluoreszenzmikroskopische Nachweis veränderter zellmorphologischer Merkmale wie der Ausbildung von Stressfasern in fibroblastären Zellen nach Mikroinjektion aktiver Proteinmutanten war die erste beschriebene Wirkung von Proteinen der Rho-Familie [Ridley, et al., 1992]. In dieser Arbeit wurde deshalb die Zellmorphologie nach Überexpression der inaktiven Varianten RhoAN19, Rac1N17, Cdc42N17 in Endothelzellen und CHO-3E10-Zellen dokumentiert. Es wurden fluoreszenzmikroskopisch dargestellte GFP-positive Zellen 24 h nach Transfektion fotografiert. In Endothelzellen konnte für die einzelnen Mutanten keine sicher unterschiedliche Zellmorphologie nachgewiesen werden, transfizierte Zellen zeigten aber eher ein entspanntes weites Zytoplasma. Mit Mutanten transfizierte Endothelzellen waren tendenziell größer als nur mit GFP und Leervektor transfizierte Kontrollzellen. Abbildung 9 zeigt repräsentative Beispiele für die Transfektion mit den einzelnen Mutanten. In Zellen der Linie CHO-3E10 zeigten sich für jede der einzelnen Mutanten charakteristische Veränderungen gegenüber der Kontrolle mit EGFP. Abbildung 10 zeigt typische Beispiele für jede der Mutanten und die allein EGFP-transfizierten Kontrollen. RhoAN19-transfizierte Zellen waren eher größer mit weitem Zytoplasma. Rac1N17-transfizierte Zellen bildeten häufiger Vesikel, die über den Zellleib verteilt erschienen. Cdc42N17- transfizierte Zellen waren häufig kleiner, eher abgerundet mit scharfer kontinuierlicher Zellbegrenzung. Im Unterschied zu in der Literatur beschriebenen Veränderungen unter aktiven GTPasen wurde hier allein die Zellform und die GFP-Verteilung in der Zelle nach Überexpression inaktiver GTPasen dargestellt.

4.2.1 Humane mikrovaskuläre Endothelzellen der Linie HPMEC-ST1.6R

Abbildung 9: Endothelzellen der Linie HPMEC-ST1.6R 24 Stunden nach Transfektion

Zellen der Linie HPMEC-ST1.6R wurden wie unter 3.4.1 beschrieben im Verhältnis 1:1 mir pGreenLantern1 und den Mutanten pRK5-RhoAN19, pRK5-Rac1N17, pRK5-Cdc42N17 oder pRK5-Leer transfiziert. Repräsentative GFP-positive Zellen in fluoreszenzmikroskopischer Darstellung sind abgebildet. Nach Transfektion mit Rac1N17 zeigten sich häufiger Zellen mit fadenförmigen vom Kern her radiären Strukturen.

4.2.2 Zellen der LPS-reagiblen Reporterlinie CHO-3E10

Abbildung 10: Zellen der Linie CHO-3E10 24h nach Transfektion

Zellen der Linie CHO-3E10 wurden wie unter 3.4.2 beschrieben mit pRhoAN19-IRES-EGFP, pRac1N17-IRES-EGFP, pCdc42N17-IRES-EGFP oder pIRES-EGFP transfiziert. Zu sehen sind EGFP-positive Zellen in fluoreszenzmikroskopischer Darstellung mit den jeweils charakteristischen Veränderungen.

4.3 Überexpression von RhoAN19, Rac1N17, Cdc42N17 und Expression von IL-8/CXCL8 in Endothelzellen der Linie HPMEC-ST1.6R

↓69

Vorhergehende Arbeiten hatten die Hemmung der LPS-stimulierten IL-8/CXCL8- Sekretion durch enzymatisch wirksame Toxine, die GTPasen der Rho-Familie inhibieren, gezeigt [Hippenstiel, et al., 2000]. Hier wurde für die einzelnen Mitglieder der Rho-Familie RhoA, Rac1 und Cdc42 ihre jeweilige Bedeutung für die IL-8/CXCL8-Expression untersucht, indem inaktive Mutanten der Gene überexprimiert wurden. Um das Problem der niedrigen Transfektionseffizienz in humanen Endothelzellen zu lösen, wurde die GFP-assoziierte flusszytometrische intrazelluläre IL-8/CXCL8-Messung etabliert.

Humane mikrovaskuläre Endothelzellen der Linie HPMEC-ST1.6R wurden mit den inaktiven Varianten der GTPasen RhoA, Rac1 und Cdc42 und dem GFP-Expressionsvektor pGreenLantern1 transfiziert. Nach Stimulation mit LPS von E. coli in der Konzentration 150 ng/ml für 8 h wurden die Zellen fixiert und intrazelluläres IL-8/CXCL8 flusszytometrisch bestimmt. Mit Leervektor und GFP-Expressionsvektor transfizierte Zellen dienten nicht LPS-stimuliert als Negativkontrolle und LPS-stimuliert als Positivkontrolle.

Die flusszytometrische Bestimmung GFP-positiver Zellen einen Tag nach Transfektion subkonfluenter humaner mikrovaskulärer Endothelzellen allein mit dem GFP-Expressionsvektor pGreenLantern1 (2 µg Plasmid-DNA) ergab eine Transfektionseffizienz von 3–4 %. Der Anteil gemessener GFP-positiver Zellen verminderte sich in den durchgeführten Experimenten auf knapp 1 %, weil die Zellen bedingt durch die Stimulation erst am zweiten Tag nach Transfektion gemessen wurden und außerdem 1:1 mit dem jeweiligen pRK5-GTPase Plasmid (1 µg Plasmid-DNA) und pGreenLantern1 (1 µg Plasmid-DNA) transfiziert wurden.

↓70

Für die flusszytometrische Messung wurden zunächst die transfizierten Zellen durch Gating der GFP-positiven Zellen ausgewählt. Abbildung 11 zeigt in drei mit Cell Quest Pro erstellten Dot Plots das Gating der GFP-positiven Zellen, in denen intrazelluläres IL-8/CXCL8 gemessen wurde. Im linken Dot Plot der Abb. 11 werden in der Region R1 Zellen von mittlerer Größe und Granularität ausgewählt. Im mittleren und rechten Dot Blot ist die Fluoreszenz im Kanal Fl-1(530/30), in dem GFP detektiert wird, gegen die Granularität aufgetragen.

Im mittleren Dot Plot ist eine Probe nicht transfizierter Zellen dargestellt, die genutzt wurde, um die Eigenfluoreszenz der Endothelzellen zu bestimmen und eine Region R2 GFP-positiver Zellen zu definieren. Im linken Dot Plot sind Zellen dargestellt, die einer Transfektion unterzogen wurden, wobei die tatsächlich transfizierte Subpopulation in der Region R2 zur Bestimmung von IL-8/CXCL8 ausgewählt wurde. Dazu wurde das Gate1 = R1*R2 definiert, in dem pro Meßwert 5000 Zellen gezählt wurden.

Abb. 11: Gating der transfizierten Endothelzellen anhand ihrer GFP- bedingten Fluoreszenz in Fl-1

Im linken Dot Plot ist die Granularität gegen die Größe aufgetragen. Es wurden Zellen mittlerer Granularität und Größe in der Region R1 (rot) ausgewählt, die im mittleren und rechten Dot Plot dargestellt sind. Im mittleren und rechten Dot Blot ist die Granularität gegen die Fluoreszenz in Fl-1 aufgetragen. Zu sehen ist im mittleren Dot Plot eine Probe, die keiner Transfektion unterzogen wurde, und im rechten Dot Plot eine der Transfektion unterzogene Probe, die sich in eine GFP-negative Population (rot) und eine GFP-positive Population in der Region R2 (grün) aufteilt.

↓71

Die Messung von IL-8/CXCL8 erfolgte nach Färben mit einem Cyanin5- konjugierten Antikörper im Kanal Fl-4 (661/16). Abbildung 12 zeigt, dass die IL-8/CXCL8-Messung nicht in den Kanälen Fl-2 und Fl-3 möglich war, weil GFP-positive Zellen auch in diesen beiden Kanälen ein (nicht kompensierbares) Signal verursachten.

Abb. 12: Fluoreszenz GFP-transfizierter Zellen in den einzelnen Kanälen

Auf der Abszisse ist in allen Dot Plots die Fluoreszenz in Fl-1 abgetragen, anhand derer transfizierte Zellen identifiziert wurden. Auf der Ordinate ist in dem Dot Plot links die Fluoreszenz in Fl-2, auf dem Dot Plot in der Mitte die Fluoreszenz in Fl-3 und in dem Dot Plot rechts die Fluoreszenz in Fl-4 abgetragen. Die Dot Plots zeigen GFP-bedingte nicht kompensierbare Fluoreszenz in Fl-2 und Fl-3, aber keine GFP-bedingte Fluoreszenz in Kanal Fl-4, der für die quantitative Bestimmung von IL-8/CXCL8 genutzt wurde.

In Abbildung 13 sind die Ergebnisse aus einem repräsentativen Versuch für alle drei getesteten inaktiven GTPasen jeweils als Histogramm der Fluoreszenz-intensität in Fl-4 dargestellt. Induzierbare Antigene wie das gemessene IL-8/ CXCL8 sind im Gegensatz zu konstitutiv exprimierten Oberflächenantigenen meist nicht normalverteilt, und das Histogramm wird deshalb optimal durch den Median seiner Werte beschrieben.

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Abb. 13: Histogrammdarstellung der für IL-8/CXCL8 repräsentativen in Fl-4 gemessenen Fluoreszenzwerte

Zu sehen ist jeweils die Linksverschiebung der Histogramme für die Transfektion mit RhoAN19 (blau oben), für Rac1N17 (orange, Mitte) und Cdc42N17 (rot, unten) gegenüber dem Histogramm für stimulierte GFP/Leervektor-transfizierte Zellen (grün, durchgezogen). In Grün und gestrichelt ist die Histogrammlinie für nicht stimulierte Zellen, in Grau und gepunktet die Linie für die Isotypenkontrolle dargestellt. Zugehörige Medianwerte der Fluoreszenz stehen jeweils oben rechts.

In Abb. 14 sind die Ergebnisse aus drei voneinander unabhängigen Versuchen dargestellt. Die Fluoreszenzintensität der Positivkontrolle (Leervektor/GFP- transfiziert und LPS-stimuliert ) wurde gleich 100 % gesetzt und die übrigen Werte wurden in Prozent der Positivkontrolle angegeben. Der Wert der Isotypenkontrolle als Ausdruck unspezifischer Antikörperbindung wurde von den übrigen Meßwerten jeweils abgezogen. Die Stimulation mit 150 ng/ml LPS über 8 h führte zu einer Erhöhung der IL-8/CXCL8-Expression in Endothelzellen um den Faktor 10.

Es wurde gezeigt, dass die Überexpression jeder einzelnen der drei getesteten inaktiven GTPasen die Expression von IL-8/CXCL8 vermindert. Die Abnahme an IL-8/CXCL8 ist für Rac1N17 mit 62 % des Kontrollwerts am ausgeprägtesten, während die Überexpression von RhoAN19 und Cdc42N17 zu einer Abnahme auf jeweils 85 % führt. Wie unter 5.2 diskutiert ist bei diesen Werten zu bedenken, dass die Hälfte der zellulären Kapazität zur Überexpression von transfiziertem Plasmid durch die Expression von GFP beansprucht wird und die gemessenen Abnahmen an IL-8/CXCL8 jeweils Mindestwerte darstellen, die bei Verzicht auf die Koexpression von GFP vermutlich unterschritten werden.

↓73

Abb. 14: Expression von IL-8/CXCL8 in humanen mikrovaskulären Endothelzellen

Zellen der Linie HPMEC-ST1.6R wurden im Verhältnis 1 : 1 mit dem jeweiligen pRK5-GTPasen- Plasmid und pGreenLantern1 transfiziert. 36 h später wurde für 8 h mit 150 ng/ml LPS stimuliert und in GFP-positiven Zellen intrazelluläres IL-8/CXCL8 gemessen. IL-8/CXCL8-Werte aus pRK5-Leervektor/GFP-transfizierten und -stimulierten Zellen wurden gleich 100 % gesetzt. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen des Mittelwerts der Ergebnisse aus drei unabhängigen FACS-Messungen. Signifikante Unterschiede (p<0,01) gegenüber der Positivkontrolle sind gekennzeichnet (*).

Nachdem gezeigt wurde, dass alle drei Proteine Rac1, Cdc42 und RhoA in der LPS-induzierten Signaltransduktion beteiligt sind, wurde untersucht, wie sich die Überexpression der inaktiven Varianten von Rac1, Cdc42 und RhoA auf die Aktivierung verschiedener Reporterkonstrukte für Transkriptionsfaktoren auswirkt.

Es wurden zwei verschiedene Reportersysteme verwendet: Zunächst die transiente Transfektion des -Reporterkonstruktes pGL3.BG.6κB in Zellen der Linie HPMEC-ST1.6R, darüber hinaus die stabil transfizierte LPS-reagible Reporterzelllinie CHO-3E10, deren Verstärkerregion einen Ausschnitt aus der Verstärkerregion des ELAM-1/CD62E -Gens enthält und Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren und AP-1 aufweist.

4.4 Überexpression von RhoAN19, Rac1N17, Cdc42N17 und Aktivierung von NF-κB in Endothelzellen der Linie HPMEC-ST1.6R

↓74

Die IL-8/CXCL8-Verstärkerregion weist Bindungsstellen für den Transkriptions-faktor auf und in der Arbeit von Hippenstiel wurde mit Hilfe des Reporterplasmids pGL3.BG.6κB gezeigt, dass die LPS-induzierte Aktivierung von in humanen umbilikalvenösen Endothelzellen (HUVEC) durch GTPasen hemmende Toxine inhibiert wird [Hippenstiel, et al., 2000]. In dieser Arbeit wurde unter Verwendung desselben spezifischen -Reporterkonstruktes die Wirkung der inaktiven Mutanten von RhoA, Rac1 und Cdc42 auf die Aktivierung von untersucht.

Zellen der Linie HPMEC-ST1.6R wurden im Verhältnis 2 : 1 : 1 mit dem jeweiligen pRK5-GTPasen-Plasmid, dem -Reporterplasmid pGL3.BG.6κB und dem Plasmid pRSVβ-Gal transfiziert. Am folgenden Tag wurde für 6 h mit 150 ng/ml LPS stimuliert und nach Zellyse die Luziferase-abhängige Biolumineszenz als Maß für die Aktivierung von und die β-Galaktosidase-abhängige Lumineszenz zur Normalisierung der Luziferaseaktivität gemessen. Für die Auswertung wurden die normalisierte Lumineszenz für pRK5-Leervektor- transfizierte und -stimulierte Zellen gleich 100 % gesetzt und die anderen Lumineszenzen in Prozent dieses Wertes angegeben.

Abbildung 15 zeigt die Ergebnisse aus drei voneinander unabhängigen Experimenten. Die LPS-induzierte Aktivierung des -Reporterkonstrukts in humanen mikrovaskulären Endothelzellen wurde durch Überexpression von Cdc42N17 auf 54 % des Wertes für die mit Leervektor transfizierten Zellen reduziert. Rac1N17 reduzierte die Aktivierung des Reporterkonstruktes auf 80 %, und die Überexpression von RhoAN19 blieb praktisch ohne Auswirkung auf die Aktivierung des Reporterkonstruktes.

↓75

Abb. 15: Aktivierung von NF-κB in humanen mikrovaskulären Endothelzellen

Die normalisierte Lumineszenz der pRK5-Leervektor-transfizierten Zellen wurde gleich 100 % gesetzt, die normalisierte Lumineszenz der mit inaktiven Mutanten transfizierten Zellen ist in Prozent dieser Positivkontrolle dargestellt. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standard-abweichungen des Mittelwerts aus drei unabhängigen Messungen. Signifikante Unterschiede (p<0,01) gegenüber der Positivkontrolle sind gekennzeichnet (*).

4.5 Überexpression von RhoAN19, Rac1N17, Cdc42N17 und Aktivierung des LPS-reagiblen Reporters in Zellen der Linie CHO-3E10

Neben der Bindungsstelle für finden sich in der Promotorregion des Gens für IL-8/CXCL8 Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren C/EBP-β und AP-1 [Wu, et al., 1997]. Die speziell als LPS-reagible Linie konstruierte Reporterlinie CHO-3E10 enthält in der Verstärkerregion ihres Reporters einen Ausschnitt aus der Verstärkerregion des Gens für ELAM-1/CD62E und in diesem Ausschnitt ebenfalls Bindungsstellen für und AP-1 [Delude, et al., 1998;Jensen undWhitehead, 2003].

Weil die Reporterlinie bezüglich der Bindungsstellen in ihrem Promoter dem IL-8/ CXCL8-Promotor sehr ähnlich ist, wurde in dieser Arbeit die Wirkung von RhoAN19, Rac1N17 und Cdc42N17 auf die Reporterexpression in CHO-3E10 untersucht. Das Reporterantigen CD25 wird nach LPS-Stimulation an der Zelloberfläche exprimiert und kann flusszytometrisch gemessen werden. In dieser Arbeit wurden transfizierte Zellen analog dem Vorgehen bei der intrazellulären Bestimmung von IL-8/CXCL8 als GFP-positive Zellen identifiziert und gemessen. Die Zellen wurden dazu mit den subklonierten Plasmiden pRhoAN19-IRES-EGFP, pRac1N17-IRES-EGFP, pCdc42N17-IRES-EGFP und dem Vektor pIRES2-EGFP transfiziert und 24 h nach Transfektion für 18 h mit 150 ng/ml LPS stimuliert. Das Reporterantigen CD25 wurde mit einem APC-konjugierten Antikörper nachgewiesen und seine Expression in nativen Zellen im Kanal Fl-4 (661/16) des Facscalibur flusszytometrisch quantifiziert.

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Abbildung 16 zeigt das Gating der EGFP-positiven Zellen, in denen das Reporterantigen CD25 gemessen wurde. Der linke Dot Plot der Abb. 14 zeigt die Auswahl von Zellen, die von mittlerer Größe und Granularität sind, in der Region R1. Im mittleren und rechten Dot Plot ist die Fluoreszenz im Kanal Fl-1(530/30), in dem EGFP detektiert wird, gegen die Granularität aufgetragen. Im mittleren Dot Plot ist eine Probe nicht transfizierter Zellen dargestellt, die genutzt wurde, um die Eigenfluoreszenz der CHO-3E10-Zellen zu bestimmen und eine Region R2 EGFP-positiver Zellen zu definieren. Im linken Dot Plot sind Zellen dargestellt, die einer Transfektion unterzogen wurden, wobei die tatsächlich transfizierte Subpopulation in der Region R2 zur Bestimmung von CD25 ausgewählt wurde. Dazu wurde das Gate1 = R1*R2 definiert, in dem pro Meßwert 10000 native Zellen gezählt wurden.

Abb. 16: Gating der transfizierten CHO-3E10-Zellen anhand des EGFP

Die Messung von CD25 erfolgte nach Färben mit einem APC-konjugierten Primärantikörper im Kanal Fl-4 (661/16). In Abbildung 17 sind die Ergebnisse aus einem repräsentativen Versuch für alle drei getesteten inaktiven GTPasen jeweils als Histogramm der Fluoreszenzintensität in Fl-4 dargestellt. Die Werte für das Reporterprotein als induzierbares Antigen sind im Gegensatz zu konstitutiv exprimierten Oberflächenantigenen nicht normalverteilt und das Histogramm wird deshalb optimal durch den Median seiner Werte beschrieben.

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Abb. 17: Histogrammdarstellung der für den LPS-reagiblen Reporter CD25 repräsentativen Fluoreszenzwerte

Gezeigt ist jeweils die Linksverschiebung der mit pRhoAN19-IRES-EGFP (oben), mit pRac1N17-IRES-EGFP (Mitte) und mit Cdc42N17-IRES-EGFP (unten) transfizierten Population gegenüber der pIRES2-EGFP-transfizierten Kontrollpopulation. Medianwerte der Fluoreszenz sind jeweils rechts oben im Diagramm angegeben.

In Abb. 18 sind die Ergebnisse aus drei voneinander unabhängigen Versuchen dargestellt. Die Fluoreszenzintensität der Positivkontrolle (pIRES2-EGFP- transfiziert und LPS-stimuliert) wurde gleich 100 % gesetzt und die übrigen Werte wurden in Prozent der Positivkontrolle angegeben. Der Wert der Isotypenkontrolle als Maß unspezifischer Antikörperbindung wurde von den übrigen Meßwerten jeweils abgezogen. Die Stimulation mit 150 ng/ml LPS über 18 h führte zu einer Erhöhung der Reporterexpression in Zellen der Linie CHO-3E10 um den Faktor 10. Das entspricht den Angaben in der Literatur für die Stimulation nicht transfizierter CHO-3E10-Zellen mit 100 ng/ml LPS für 18 h. Es wurde gezeigt, dass die Überexpression jeder einzelnen der drei getesteten inaktiven GTPasen die Expression des Reporters vermindert. Die Abnahme an CD25-Antigen ist für Rac1N17 mit 49 % des Kontrollwerts am stärksten, während die Überexpression von RhoAN19 und Cdc42N17 zu einer Abnahme auf 75 % und 76 % führt.

Abb. 18: Expression von CD25 als LPS-reagiblem Reporter in Zellen der Linie CHO-3E10

Zellen der Linie CHO-3E10 wurden mit dem jeweiligen pGTPasen-IRES-EGFP-Plasmid transfiziert. 24 h nach Transfektion wurden die Zellen für 18 h mit 150 ng/ml LPS stimuliert und für GFP-positive Zellen die CD25-Expression bestimmt. CD25-Werte aus pIRES-EGFP-transfizierten und -stimulierten Zellen wurden gleich 100 % gesetzt. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen des Mittelwerts der Ergebnisse aus drei unabhängigen FACS-Messungen. Signifikante Unterschiede (p<0,01) gegenüber der Positivkontrolle sind gekennzeichnet (*).

4.5.1 Die Minderung des LPS-reagiblen Reportersignals ist abhängig vom Ausmaß der Rac1N17-Überexpression

↓78

Bei der flusszytometrischen Bestimmung EGFP-positiver Zellen wird nicht nur qualitativ zwischen EGFP-positiv und -negativ unterschieden, sondern die Fluoreszenzintensität des EGFP auch quantifiziert. Die Intensität der emittierten Fluoreszenz ist ein direktes Maß für die Expression von EGFP [Ducrest, et al., 2002]. Die Expression von EGFP steht bei Verwendung des IRES-Vektors in festem 2,5-zu-1-Verhältnis zur Expression des Gens von Interesse [Mizuguchi, et al., 2000]. Zellen stärkerer EGFP-Fluoreszenz überexprimieren also auch in stärkerem Maß das Gen von Interesse [Trouet, et al., 1997]. Die Überexpression inaktiver Genvarianten kleiner GTP-bindender Proteine wird wirksam, indem die überexprimierten Proteine mit den zelleigenen funktionsfähigen Proteinen kompetetiv um Bindungspartner konkurrieren . Eine stärkere Überexpression sollte deshalb zu einer ausgeprägteren Hemmung des Signals führen. Für die Überexpression von Rac1N17 konnte die Abhängigkeit der Signalreduktion des LPS-reagiblen Reporterproteins CD25 vom Ausmaß der Überexpression gezeigt werden. Dazu wurde das Reportersignal von in Fl-1 (EGFP) verschieden intensiv fluoreszierenden Zellpopulationen verglichen. Die Dot Plots der Abbildung 19 zeigen die Verschiebung des gemessenen Reportersignals in Fl-4 (y-Achse) in Abhängigkeit der Fluoreszenz von EGFP in Fl-1 (x-Achse). Die für die Reporterexpression repräsentative Fluoreszenzintensität in Fl-4 steigt mit steigender Fluoreszenzintensität des EGFP für die Positivkontrolle (links) und fällt mit steigender Fluoreszenzintensität des EGFP für Rac1N17 (rechts). Der Anstieg der Reporterexpression mit steigender Expression von EGFP ist Ausdruck der erhöhten Reagibilität der Zelle durch die Proteinüberexpression des EGFP.

Der Abfall der Reporterexpression unter steigender Expression von Rac1N17/ EGFP ist Ausdruck der blockierenden Wirkung der inaktiven Proteinvariante. Die Abhängigkeit der Reportersignalreduktion von der Stärke der Überexpression konnte nur für Rac1N17, nicht aber für RhoAN19 und Cdc42N17 gezeigt werden.

Abb. 19: Änderung des Reportersignals in Abhängigkeit der Stärke der Überexpression

Im linken Dot Plot LPS-stimulierte Zellen nach Transfektion von pIRES2-EGFP: entsprechend dem ansteigenden Pfeil zunehmendes Reportersignal in Fl-4 (y-Achse) mit zunehmender Überexpression von EGFP gemessen in Fl-1 (x-Achse). Im rechten Dot Plot LPS-stimulierte Zellen nach Transfektion von pRac1N17-IRES-EGFP: abnehmende Reporterexpression in Fl-4 mit zunehmender Expression von EGFP/ Rac1N17.

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In Abbildung 20 ist die oben in einem repräsentativen Dot Plot dargestellte Reduktion der Reporterexpression in Abhängigkeit vom Ausmaß der Überexpression von inaktivem Rac1N17 quantitativ für drei Populationen in Fl-1 (EGFP) zunehmend stark fluoreszierender Zellen dargestellt. Die Werte sind Mittelwerte der Ergebnisse aus drei voneinander unabhängigen FACS-Messungen. Zunehmende Überexpression von Rac1N17 führt zu einer ausgeprägteren Abnahme des Reportersignals bis auf 33 % des Kontrollwerts für die Population stärkster Fluoreszenz.

Abb. 20: Abfall des Reportersignals für drei Populationen steigender Überexpression von Rac1N17

Das Reportersignal der CHO-3E10-Zellen wurde in Abhängigkeit ihrer EGFP-Fluoreszenz, d.h. in Abhängigkeit ansteigender Proteinüberexpression, dargestellt. Für jede der drei Populationen ansteigender Fluoreszenz sind jeweils die nicht stimulierte Negativkontrolle, die stimulierte Positivkontrolle, beide pIRES2-EGFP transfiziert, und der Wert für die stimulierten pRac1N17-IRES-EGFP-transfizierten Zellen angegeben. Die Positivkontrolle wurde für jede der drei Populationen jeweils gleich 100 % gesetzt. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen des Mittelwerts aus drei unabhängigen FACS-Messungen.

4.6 Generation der stabilen Zelllinien CHO-RhoAN19 und CHO-Cdc42N17

Die Generation stabil transformierter Zelllinien ist eine Möglichkeit, Zellen für das Studium überexprimierter Proteine zu gewinnen, die nahezu vollständig das jeweilige Gen von Interesse überexprimieren. Deshalb wurde die LPS-reagible Reporterlinie CHO-3E10 mit den Plasmiden pRhoAN19-IRES-EGFP, pRac1N17-IRES-EGFP, pCdc42N17-IRES-EGFP transfiziert, und unter Verwendung des Selektionsantibiotikums G418 wurden transformierte EGFP-positve Linien für jedes der transfizierten Plasmide selektiert. Das neben der jeweiligen inaktiven GTPase exprimierte EGFP war dabei sehr hilfreich, weil tatsächlich transformierte Zellen noch während der Selektion anhand ihrer Fluoreszenz mit Hilfe des Fluoreszenzmikroskops identifiziert und ausgewählt werden konnten. Von EGFP-positiven transformierten Zellen wurde die gleichzeitige Expression der jeweiligen inaktiven GTPase erwartet, weil beide Gene mit einem IRES-Vektor transfiziert wurden und die Expression der beiden Gene von einem solchen bicistronischen Expressionsvektor im allgemeinen auch in stabil transfizierten Zellen in enger Korrelation steht [Liu, et al., 2000]. Allerdings werden die beiden Gene nicht als Fusionsprotein, sondern als singuläre Proteine von einer mRNA exprimiert [Mizuguchi, et al., 2000]. Die inaktiven GTPasen sind innerhalb ihres Start- und Stopcodons daneben mit der Sequenz für das Myc-Epitop versehen.

4.6.1 Nachweis der Expression von Myc-RhoAN19 und Myc-Cdc42N17

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Um die erwartete Expression der Myc-markierten GTPase zu verifizieren, wurde ein Western Blot zum Nachweis des Myc-Epitops durchgeführt. Der in Abbildung 21 dargestellte Blot weist die Expression des Myc-Epitops in den Linien CHO-RhoAN19 und CHO-Cdc42N17 nach, während für die EGFP-positive mit pRac1N17-IRES-EGFP transformierte Linie kein Myc-Epitop nachweisbar war. Der für die inaktive GTPase Rac1N17 codierende Sequenzabschnitt ist offensichtlich verloren gegangen.

Abb. 21: Western-Blot zum Nachweis der Myc-markierten Proteine RhoAN19 und Cdc42N17 in den Linien CHO-RhoAN19 und CHO-Cdc42N17

Die zweite Laufbahn von links zeigt den Proteinextrakt aus Zellen der Linie CHO-3E10, die dritte Bahn von links den Extrakt aus der neu transformierten Linie CHO-RhoAN19-EGFP und die fünfte Bahn den Extrakt aus der Linie CHO-Cdc42N17-EGFP. Inkubiert wurde der Blot mit einem Antikörper gegen das Myc-Epitop. Zu sehen sind auf der Laufhöhe zwischen 20 und 30 kD die durch den Myc-Ak nachgewiesenen Banden für Myc-RhoAN19 und Myc-Cdc42N17, während in der Ursprungszelllinie CH-3E10 keine Bande nachweisbar war.

4.6.2 Zytomorphologie der Linien CHO-3E10, CHO-RhoAN19 und CHO-Cdc42N17

Nachdem die Expression der inaktiven GTPasen RhoAN19 und Rac1N17 in den neu transformierten Linien mittels Western Blot nachgewiesen wurde, wurde die Zytomorphologie der transformierten Linien im Vergleich zur Morphologie der Ausgangslinie CHO-3E10 als qualitativer Nachweis der funktionellen Wirksamkeit der exprimierten inaktiven GTPasen dokumentiert. Da die Wirkung der GTPasen auf Zytoskelett und Zellmorphologie unter anderem über die Kondensation von Aktin-Filamenten zu Stressfasern vermittelt wird, wurde anschließend ein konfokalmikroskopischer Nachweis des F-Aktins in den Linien CHO-3E10, CHO-RhoAN19 und CHO-Cdc42N17 durchgeführt. Abbildung 22 zeigt konfluente Monolayer der drei Linien in 40x phasenkontrastmikroskopischer Vergrößerung. Die Zellen der Linie CHO-RhoAN19 wirken regelmäßiger, entspannter und haben

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weniger Plasmaausläufer als die Zellen der Linie CHO-3E10. Zellen der Linie CHO-Cdc42N17 wirken deutlich langgezogen und spindelförmiger als Zellen der Linien CHO-3E10 und CHO-RhoAN19. Die vergleichende Phasenkontrast-mikroskopie konfluenter Monolayer zeigt: Die Expression von RhoAN19 und Cdc42N17 führt jeweils zu charakteristischen Veränderungen der Zellmorphologie gegenüber der Ursprungslinie CHO-3E10. Dieser Befund wird durch die fluoreszenzmikroskopische Darstellung der EGFP-positiven Linien in 40facher Vergrößerung, die in Abbildung 23 dokumentiert ist, bestätigt.

Abb. 22 : CHO-Phasenkontrastmikroskopie

Darstellung konfluenter Monolayer der drei Zelllinien CHO-3E10, CHO-RhoAN19 und CHO-Cdc42N17. Die Aufnahmen nativer Zellen erfolgten am inversen Mikroskop Olympus IMT-2 bei 40facher Vergrößerung. Zu sehen sind rechts die leicht spindelförmigen Zellen der Linie CHO-3E10, mittig die entspannten, kopfsteinplasterartigen Zellen der Linie CHO-RhoAN19 und links die langgestreckten Zellen der Linie CHO-Cdc42N17.

Abb. 23 : CHO-Fluoreszenzmikroskopie

Darstellung konfluenter Monolayer der zwei Zelllinien CHO-RhoAN19 und CHO-Cdc42N17. Die Aufnahmen nativer Zellen erfolgten am inversen Mikroskop Olympus IMT-2 bei 40facher Vergrößerung mit einem FITC-geeigneten Filterset. Zu sehen sind rechts die entspannten, eher rundlichen Zellen der Linie CHO-RhoAN19 mit deutlichen Interzellularspalten und links die langgestreckten Zellen der Linie CHO-Cdc42N17 mit ausgeprägtem Zell-Zell-Kontakt. Die Ausgangslinie CHO-3E10 ist mangels Expression von EGFP nicht dargestellt.

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Abbildung 24 zeigt die konfokalmikroskopische Darstellung des F-Aktins in den drei Zelllinien. Die Linie CHO-3E10 zeigt Aktinfilamente im Zellleib und aktinpositive Zellgrenzen mit engen Zell-Zell-Kontakten. Zellen der Linie CHO-RhoAN19 zeigen dagegen einen entspannten Zellleib mit wenigen Aktinfilamenten, weniger aktinpositive Zellgrenzen und weniger enge Zell-Zell-Kontakte. Zellen der Linie CHO-Cdc42N17 sind spindelförmig gespannt und zeigen dicke langgestreckte Aktinfilamente, welche die gesamte Zelle ihrer Länge nach queren.

Abb. 24: CHO-Konfokalmikroskopie

Darstellung konfluenter Monolayer der drei Linien CHO-3E10, CHO-RhoAN19 und CHO-Cdc42N17 nach Anfärben des F-Aktins mit fluoreszenzkonjugiertem Phalloidin. Die Aufnahmen fixierter Zellen erfolgten am Konfokalmikroskop Zeiss Axioskop2 LSM 5 Pascal bei 63facher Vergrößerung. Zu sehen sind neben der Linie CHO-3E10 entspannte stressfaserarme Zellen der Linie CHO-RhoAN19 und gespannte Zellen mit ausgeprägten Stressfasern der Linie CHO-Cdc42N17.

Mit den phasenkontrast-, fluoreszenz- und konfokalmikroskopischen Ergebnissen wurde für die neu generierten Zelllinien CHO-RhoAN19 und CHO-Cdc42N17 neben der Expression der jeweiligen inaktiven GTPase also auch die funktionelle Auswirkung der Überexpression der inaktiven GTPasen anhand der spezifischen Veränderungen des Zytoskeletts und der Kondensation von Aktinfilamenten nachgewiesen.


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21.11.2005