Diskussion

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In dieser Dissertation wurde gezeigt, dass inaktive Mutanten der Rho-GTPasen RhoA, Rac1, Cdc42 die LPS-induzierte Expression von IL-8/CXCL8 in humanen Endothelzellen inhibieren. Zu diesem Zweck wurde für diese Arbeit die Methode der GFP-assoziierten Flusszytometrie etabliert, welche die Messung von intra-zellulärem IL-8/CXCL8 in transfizierten Endothelzellen trotz niedriger Effizienzen bei der Transfektion erlaubt. Nach dem gleichen methodischen Grundprinzip der GFP-assoziierten Flusszytometrie wurde auch die Wirkung der Überexpression von RhoAN19, Rac1N17, Cdc42N17 auf die LPS-stimulierte Reporterexpression in der LPS-reagiblen Reporterlinie CHO-3E10 untersucht. Deshalb werden unter 5.1 und 5.2 zunächst die Überexpression inaktiver Mutanten kleiner GTP-bindender Proteine und die GFP-assoziierte Identifikation transfizierter Zellen als zentrale in dieser Arbeit verwendete Methoden diskutiert. Unter 5.3–5.6 wird dann auf die einzelnen gezeigten Ergebnisse eingegangen.

5.1 Methodik der Überexpression inaktiver Mutanten GTP-bindender Proteine

Bisher wurden zum Studium der zellulären Funktionen kleiner GTP-bindender Proteine zwei experimentelle Ansätze verwandt, die Modifikation ihrer Funktion durch bakterielle Toxine oder wie in dieser Arbeit die Überexpression aktivitätsverändernder Mutanten. Ihr wird allgemein eine hohe Spezifität zugeschrieben [Qiu, et al., 1997]. Um die Spezifität inaktiver Mutanten zu beurteilen, ist es notwendig, den speziellen Mechanismus, über den sie inaktivierend wirken, zu kennen. Die inaktiven Mutanten der Rho-Familie leiten sich direkt von den inaktiven Mutanten der Ras-Familie ab. Aus dem Studium der onkogenetischen Eigenschaften von Ras waren primär die aktivierenden Mutationen in Codon 12, 13 oder 61 bekannt, die dem mutierten Gen seine transformatorische Eigenschaft verleihen [Feig, et al., 1987]. Die erste Gruppe inhibitorischer Ras-Mutanten wurde 1988 durch Studien der Zufallsmutagenese am HaRas-Gen etabliert [Feig undCooper, 1988]. Später wurden inaktive Varianten anderer GTP-bindender Proteine konstruiert, indem die in Ras als inaktivierend identifizierte Mutation an der korrespondierenden Stelle in den anderen GTP-bindenden Proteinen, darunter RhoA, Rac1 und Cdc42, erzeugt

wurde [Ridley, et al., 1992;Self undHall, 1995]. Die entsprechenden Sequenz-abschnitte stimmen in den genannten GTPasen weitgehend überein und die Aminosäuresequenzen sind einander homolog (Abb. 3, Seite 15). Als inaktivierend wurden Substitutionen an den Aminosäurepositionen 15, 16 und 17 in HaRas identifiziert, von denen die Mutante Ras S17N am häufigsten eingesetzt wurde [Feig undCooper, 1988]. Ihr entsprechen die Mutationen Rac1/Cdc42 T17N und RhoA T19N. Die negativen Mutanten konkurrieren in der Zelle kompetetiv mit ihrem jeweiligen Wildtyp um die Bindung von GEFs, wobei die Mutanten auch nach Bindung eines GDP oder sogar eines GTP keinen Effektor aktivieren können. Röntgenkristallographische Analysen von Ras deuten darauf hin, dass die Bindung von Magnesium-Ionen an Serin17 eine notwendige Voraussetzung für den Wechsel in die aktive Konformation ist und die reduzierte Bindung von -Ionen in den 17N-Mutanten ursächlich für deren Unfähigkeit zur Aktivierung von Effektoren ist [Feig, 1999]. Da die Mutanten eine höhere Affinität zu ihren GEFs aufweisen als der jeweilige Wildtyp und die Mutante überexprimiert wird, wird der physiologische Wildtyp der GTPase weniger oder kaum aktiviert. Bemerkenswert bezüglich der Spezifität der eingesetzten negativen Mutanten ist also, dass diese nicht inhibitorisch wirken, indem sie direkt mit ihrem zellulären Wildtyp interferieren, wie dies unter anderem bei inhibitorischen Mutanten von Rezeptor-Tyrosinkinasen oder Transkriptionsfaktoren der Fall ist, sondern indem sie den flussaufwärts stehenden aktivierenden GEF binden [Feig, 1999]. Theoretisch wäre Spezifität für eine einzelne GTPase dann nur gegeben, wenn ein GEF nur eine einzelne spezifische GTPase aktiviert, aber tatsächlich aktivieren einige GEFs in vitro mehrere verschiedene GTPasen [Zheng, et al., 1995]. Es könnte von einer negativen Mutante aus der Rho-Familie also angenommen werden, sie inhibiere auch nahe verwandte Familienmitglieder. Tatsächlich belegen experimentelle Daten aber, dass der Einsatz negativer Mutanten aus der Rho-Familie zu sehr spezifischen Phänotypen führt, und es ist allgemein anerkannt, dass die Expression negativer Mutanten von kleinen GTP-bindenden Proteinen hochspezifisch für die einzelne GTPase ist [Bishop undHall, 2000;Feig, 1999;Qiu, et al., 1997]. So wurden in den vergangenen zehn Jahren über sechshundert Veröffentlichungen zu negativen Mutanten von Ras und mehr als zweihundert Veröffentlichungen zu analogen negativen Mutanten anderer Mitglieder der Ras-Superfamilie publiziert. Der beschriebene Mechanismus, über den inaktive

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Mutanten der Rho-Familie wirksam werden, sollte jedoch bedacht und die auf diesem Weg gewonnenen Ergebnisse mit anderen Methoden, etwa der Anwendung kurzer interferierender RNA (siRNA), bestätigt werden.

5.2 Methoden zur Identifikation der transfizierten Subpopulation

Die Transfektionseffizienzen, die beim Gentransfer in Endothelzellen und andere hoch differenzierte humane Zelltypen mit Transfektionsreagenzien erreicht werden, sind mit 0,1–10 % sehr gering [Martin undMurray, 2000]. Für die humane mikrovaskuläre Endothelzelllinie wurde damit übereinstimmend eine Effizienz im niedrigen einstelligen Prozentbereich erreicht. Um spezifische Parameter, die von der Überexpression eines transfizierten Gens abhängig sind, zu messen, ist deshalb die separate Analyse der transfizierten Subpopulation notwendig. Chen hat zu diesem Zweck in der Untersuchung von RhoA in der LPS-induzierten Expression von IL-8/CXCL8 in Monozyten die Methode der magnetkügelchen-assoziierten Zellsortierung eingesetzt [Chen, et al., 2003]. Bei dieser Methode wird mit dem Gen von Interesse ein Expressionsvektor für ein Oberflächenantigen kotransfiziert. Zellen, die das Oberflächenantigen exprimieren, werden dann durch Bindung an einen magnetkügelchengekoppelten Antikörper selektiert und stehen für weitere Untersuchungen zur Verfügung. Die Methode eignet sich besonders für Zellen, die in Suspension kultiviert werden, weil die Zellen für das magnetkügelchenbasierte Sortieren suspendiert sein müssen. Die Endothelzellen müssten für diese Methodik nicht nur trypsiniert und für den Zeitraum des Sortierens suspendiert werden, sondern auch in hinreichender Anzahl für einen Elisa aus dem Überstand erneut ausplattiert und kultiviert werden. Bei der niedrigen Transfektionseffizienz und der Empfindlichkeit der Endothelzellen erscheint dieses Verfahren schwer durchführbar.

Das Grundprinzip der GFP-assoziierten intrazellulären Bestimmung von IL-8/ CXCL8 ist die gleichzeitige Transfektion der für das Grüne Fluoreszenzprotein (GFP) codierenden DNA mit dem Gen von Interesse, wobei das GFP Reporter für die erfolgreiche Transfektion ist [Trouet, et al., 1997]. Die Zellen werden dann durch die flusszytometrische Zellsortierung anhand der Fluoreszenz des GFP sortiert und in einem Arbeitsgang nach vorheriger intrazellulärer Färbung IL-8/CXCL8 gemessen [Jung, et al., 1993]. Diese Methode ermöglicht über die Sortierung transfizierter Zellen mit Hilfe des Flusszytometers hinaus die

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kontinuierliche Beobachtung der Expression von GFP vitaler transfizierter Zellen im Fluoreszenzmikroskop. Damit erlaubt dieses Reportersystem nicht nur die Selektion transfizierter Zellen, sondern gibt zusätzlich Informationen über die Transfektionseffizienz, den zeitlichen Verlauf der Überexpression und die morphologischen Veränderungen durch das kotransfizierte Gen von Interesse.

5.2.1 Intrazelluläre IL-8/CXCL8-Messung versus ELISA aus dem Überstand

Verschiedene Proteine der Rho-Familie stehen auch in Signalwegen, die Zellzyklus, Proliferation und Apoptose beeinflussen [Jaffe undHall, 2002]. So wurde unter Verwendung inaktivierender Toxine auch für humane Endothelzellen eine Bedeutung GTP-bindender Proteine der Rho-Familie in der Apoptose gezeigt [Hippenstiel, et al., 2002]. Für einen Zytokinelisa aus dem Überstand wirft das selbst bei hinreichender Effektivität des DNA-Transfers das Problem auf, dass unterschiedliche Messwerte nicht nur durch die unterschiedliche Expression von IL-8/CXCL8 beeinflusst werden, sondern auch durch aufgrund von Proliferation und Apoptose variierende Zellzahlen. Die in dieser Arbeit angewandte intrazelluläre Messung in nachweislich transfizierten Zellen schließt dieses Problem aus, denn aus jeder Probe wurde die gleiche Anzahl transfizierter Zellen (5000 Zellen) gemessen. Gerade in Bezug auf den quantitativen Vergleich der IL-8/CXCL8-Expression nach Transfektion von RhoAN19, Rac1N17 und Cdc42N17 ist die angewandte Methode der intrazellulären Messung deshalb der magnetischen Zellsortierung und anschließender Stimulation mit Messung im Überstand überlegen.

5.2.2 Andere Reporter der Transfektion bei flusszytometrischer Bestimmung

Alternativ zur Kotransfektion der GFP-DNA als Reporter der Transfektion ist die Identifikation transfizierter Zellen über die Antikörperbindung des Myc-Epitops der untersuchten GTP-bindenden Proteine denkbar. Dann müssten die Endothelzellen nach Fixierung und Permeabilisierung mit Antikörpern gegen IL-8/CXCL8 und gegen das Myc-Epitop behandelt werden. In dieser Arbeit wurde diese Methodik aus verschiedenen Gründen nicht gewählt. Zunächst entfiele die oben genannte kontinuierliche Beobachtung der Überexpression in vitalen Zellen. Darüber hinaus hätte es zunächst keine korrekten Positiv- und Negativkontrollen gegeben, denn der pRK5-Leervektor codiert nicht für das Myc-Peptid. Die Myc-Sequenz wurde erst bei der Konstruktion der pRK5-Expressionsvektoren für die Rho-Mutanten gemeinsam mit diesen eingefügt. Ein Ausschneiden der kompletten für die Mutanten codierenden Sequenz unter Erhalt des Leserahmens für die Myc-Sequenz war mangels passender Restriktionsendonukleasen nicht möglich. Mit dem pRK5-Leervektor transfizierte Zellen wären also nicht zu detektieren gewesen. Für alle Transfektionsexperimente ist aber von wesentlicher methodischer Bedeutung,dass als Kontrollen – in diesem Fall also nicht stimulierte und LPS-stimulierte Zellen ohne Überexpression einer inaktiven GTPase – ebenfalls transfizierte Zellen verwendet werden. Denn denkbar ist, dass allein der Transfer von Fremd-DNA und die Überexpression eines Proteins die Zelle aktivieren und die basale Produktion von Zytokinen/Chemokinen sowie die Reagibilität auf Stimuli erhöhen können. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit als Kontrollen zu den mit inaktiven GTPasen transfizierten Zellen ebenfalls GFP-positive transfizierte Zellen gemessen. Die Identifikation transfizierter Zellen über das Myc-Epitop in dieser Arbeit war auch nicht möglich, weil Antikörper für das exprimierte Epitop (Myc-Epitop; Ak-Klon: 9E10) wie auch Antikörper gegen humanes IL-8/CXCL-8, die für intrazelluläre Anwendung geeignet sind, nur aus dem gleichen Tier zur Verfügung standen, so dass eine getrennte flusszytometrische Bestimmung über sekundäre fluoreszenzkonjugierte Antikörper nicht möglich gewesen wäre. Direkt fluoreszenzkonjugierte Primärantikörper gegen IL-8/CXCL8 für die Messung in Fl-4 standen ebenfalls nicht zur Verfügung. In dieser Arbeit wurde neben der intrazellulären IL-8/CXCL8-Bestimmung aber auch das Oberflächenantigen CD25 als LPS-reagibler Reporter in der Linie CHO-3E10 flusszytometrisch bestimmt, und hier hätte eine Identifikation transfizierter Zellen über das Myc-Epitop eine Permeabilisierung und damit Fixierung der Zellen erfordert. Unter Verwendung des GFP als Reporter der Transfektion konnten vitale Zellen gemessen werden, was eine optimale Schonung der quantitativ zu messenden Oberflächenantigene ermöglicht.

5.2.3 Detektion GFP-positiver Zellen in den Kanälen Fl-1 bis Fl-4 des Facscalibur

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Unter Verwendung des GFP als Reporter der Transfektion ist, wie unter 4.3 gezeigt wurde, die flusszytometrische Messung eines weiteren Parameters in Endothel- und CHO-Zellen am Facscalibur aufgrund der Breite des Emissionsspektrums intrazellulär lokalisierten GFPs nur in Fluoreszenz-4 (Fl-4) möglich. Die in dieser Arbeit verwendeten GFP-Mutanten basieren beide auf der von Heim beschriebenen S65T-Mutante [Heim, et al., 1995]. Ihre Anregungs- und Emissionsspektra sind gegenüber dem Wildtyp-GFP nach rechts verschoben und ihre Spitzen liegen etwa bei λexc = 490 nm und λem = 505 nm [Diamond undDeMaggio, 2000]. Sie sind damit für übliche Filtersysteme, die der Detektion von Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) dienen, optimiert. Tatsächlich geben mit pGreenLantern1 und pIRES2-EGFP transfizierte Endothel- oder CHO-Zellen nach Anregung bei 488 nm wie erwartet ein intensives Signal im Kanal Fl-1 (530/30 nm Bandpassfilter) des Facscalibur. Allerdings emittieren GFP-positive Zellen auch im Kanal Fl-2 (585/42 nm Bandpassfilter) und im Kanal Fl-3 (670 nm Langpassfilter) des Facscalibur. Abbildung 12 auf Seite 64 zeigt im linken Dot Plot, dass aufgrund der mit der Fluoreszenzintensität in Fl-1 linear ansteigenden Intensität in Fl-2 keine elektronische Kompensation dieser GFP-assoziierten Fluoreszenz möglich ist. Der in dieser Arbeit für Endothel- und CHO-Zellen gezeigte Sachverhalt wird auch von Ducrest in einer Veröffentlichung über die Verwendung von destabilisiertem GFP als Reporter der Promotoraktivität in humanen Lungenfibroblasten (HLF) beschrieben [Ducrest, et al., 2002]. Die Bestimmung eines weiteren Parameters ist allerdings in Fl-4 (661/16 Bandpass) möglich, wie der rechte Dot Plot in Abb. 12 auf Seite 64 rechts zeigt. Der Bandpassfilter in Fl-4 ist sehr schmal und die Fluoreszenzintensität der hier detektierten Farbstoffe Cyanin 5 (Cy5) und Allophycocyanin (APC) ist genau in diesem schmalen Bandbereich sehr hoch. Demgegenüber ist eine GFP-induzierte Fluoreszenz in diesem Kanal nicht messbar. Aus diesem Grund wurde sowohl IL-8/CXCL8 als auch das LPS-reagible Reporter-Oberflächenprotein CD25 in Fl-4 mit Hilfe Cy5- bzw. APC-konjugierter Antikörper gemessen. Beide Fluoreszenzfarbstoffe werden durch einen zweiten Laser mit 635 nm angeregt. Während für das Reporterprotein CD25 ein APC-konjugierter Primärantikörper zur Verfügung stand, musste für den intrazellulären IL-8/CXCL8-Nachweis eine Kombination aus primärem und sekundärem Cy5- konjugiertem Antikörper eingesetzt werden.

5.2.4 Verhältnis zwischen GFP und Gen von Interesse bei der Überexpression

Für die Transfektion von Endothelzellen und CHO-Zellen in dieser Arbeit galt: Um eine Identifikation transfizierter Zellen anhand ihrer GFP-Expression zu ermöglichen, musste eine Mindestmenge an Fluoreszenzprotein exprimiert werden, welche die Detektion durch das Facscalibur ermöglicht. Diese Menge ist unter anderem abhängig von der GFP-Variante und liegt für die Expression von EGFP in HeLa-Zellen bei ~30 nM [Diamond undDeMaggio, 2000]. Außerdem sollte die Expression des Gens von Interesse möglichst hoch sein, um eine maximale Überexpression im Verhältnis zum korrespondierenden zelleigenen nicht mutierten Gen zu bewirken. Für die Zellen der Linie CHO-3E10 wurde diese Forderung durch die Plasmide pRhoAN19-IRES-EGFP, pRac1-IRES-EGFP und pCdc42N17-IRES-EGFP optimal erfüllt. Die in diesen bicistronischen Expressionsvektoren vorhandene IRES-Sequenz codiert für eine interne ribosomale Eintrittsstelle (IRES), eine Sequenz die primär in verschiedenen Viren nachgewiesen wurde. Diese erlaubt die cap-unabhängige Translation, das heißt, das Ribosom bindet die mRNA am Startcodon unabhängig von der 5'-wärts gelegenen unübersetzten Region [Mountford undSmith, 1995]. Für die in dieser Arbeit hergestellten Derivate des pIRES2-EGFP-Vektors bedeutet das: Unter einem Promotor werden zwei singuläre Proteine von einem mRNA-Transkript exprimiert. Das Verhältnis der Expression zwischen Protein 1 und 2 in einem IRES-Vektor (pGen1-IRES-Gen2) liegt je nach Zelltyp, exprimierten Protein, IRES-Element und Vohandensein einer Kozak-Sequenz bei ungefähr 70 : 30 [Mizuguchi, et al., 2000]. Damit ist für jede GFP-positive CHO-Zelle eine deutlich stärkere Expression des zu untersuchenden Gens von Interesse garantiert. Darüber hinaus ermöglicht das feste Expressionsverhältnis dieser bicistronischen Vektoren die Expression des Gens von Interesse anhand der Intensität der GFP-Fluoreszenz zu quantifizieren [Trouet, et al., 1997]. Leider konnten die IRES-Vektoren nicht in der Untersuchung des Signalweges in Endothelzellen eingesetzt werden, weil in diesen Zellen die Expression von GFP von den Vektoren pRac1-IRES-EGFP und pCdc42N17-IRES-EGFP nicht ausreichend für eine Detektion mit Fluoreszenzmikroskop oder Flusszytometer war. Deshalb wurde bei der Transfektion der Endothelzellen eine Mischung aus pRK5-GTPase-Expressionsvektor und GFP-Expressionsvektor pGreenLantern1 im Verhältnis 50 : 50 eingesetzt. Mit dieser klassischen Kotransfektion konnte eine für die Detektion ausreichende Menge an GFP exprimiert werden. Dabei ist zu bedenken, dass eine größere Menge an transfizierter Mutante auch eine stärkere Überexpression im Verhältnis zum nicht mutierten zellulären Gen bewirkt. Das heißt, die in dieser Arbeit gemessenen Abnahmen in der IL-8/CXCL8- Expression spiegeln die physiologische Bedeutung der GTPasen für die Expression von IL-8/ CXCL8 möglicherweise eher unzureichend wider. Die Etablierung eines adenoviralen Vektorsystems, das auf die Koexpression von GFP verzichten kann, könnte quantitativ ausgeprägtere Ergebnisse liefern.

5.3 Zytomorphologie nach Überexpression von RhoAN19, Rac1N17, Cdc42N17

Die zytomorphologischen Effekte der Rho-GTPasen waren ihre ersten durch Mikroinjektion der C3-Transferase von Clostridium botulinum studierten Wirkungen [Chardin, et al., 1989]. Im Rahmen dieser Arbeit, die primär die Bedeutung für den inflammatorischen Signalweg untersucht hat, wurden deshalb auch die zytomorphologischen Wirkungen nach Überexpression von RhoAN19, Rac1N17 und Cdc42N17 fluoreszenzmikroskopisch dokumentiert. Während für transfizierte CHO-Zellen für jede der Mutanten eine charakteristische Zellmorphologie gezeigt werden konnte, war eine solche für die transfizierten Endothelzellen nicht nachweisbar. Bei einem Vergleich der hier gezeigten Ergebnisse mit der Literatur ist zu berücksichtigen, dass die in der Literatur beschriebenen Effekte sich zumeist auf in fibroblastären Zellen immunfluoreszenzmikroskopisch nachgewiesene zelluläre Substrukturen wie Aktinfilamente beziehen [Ridley undHall, 1992;Ridley, et al., 1992], wohingegen diese Arbeit Übersichtsaufnahmen transfizierter Zellen zeigt. Hinzu kommt, dass die meisten der in der Literatur dokumentierten Effekte Minuten bis Stunden nach der Mikroinjektion von rekombinanten aktiven Proteinvarianten, rekombinanten Wildtypproteinen oder Toxinen auftraten [Ridley, et al., 1992]. Die Literatur zusammengefasst, induziert RhoA die Zellkontraktion durch Induktion von Stressfasern, während Rac1 und Cdc42 die Zellextension vermitteln [van Nieuw Amerongen undvan Hinsbergh, 2001]. Die in dieser Arbeit in Abbildung 10 gezeigten Effekte 24 Stunden nach Transfektion der fibroblastenartigen CHO-Zellen stimmen damit gut überein. Für porcine aortale Endothelzellen beschreibt Aspenstrom nach Transfektion aktiver Mutanten von

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RhoA, Rac1, Cdc42 eine kleine abgerundete Zellform [Aspenstrom, et al., 2003]. Die in dieser Arbeit nach Transfektion inaktiver Mutanten dargestellten Endothelzellen in Abbildung 9 zeigen eine der Kontrolle entsprechende große Zellform mit unregelmäßig begrenztem Zytoplasma, also wie zu erwarten eine gegenteilige Morphologie. Dass sich in den Übersichtsaufnahmen keine unterschiedliche Morphologie für die Überexpression zwischen den drei einzelnen GTPasen in Zellen des endothelialen Typs zeigen ließ, entspricht also den von Aspenstrom für transfizierte Endothelzellen berichteten Ergebnissen. Die diesbezüglichen Unterschiede zwischen fibroblastären und endothelialen Zellen lassen sich durch Unterschiede in der Proteinexpression gut erklären. Während CHO-Zellen nach Transfektion von GFP eine starke grüne Fluoreszenz aufweisen, ist die Fluoreszenz GFP-transfizierter Endothelzellen als Ausdruck einer geringeren Proteinexpression eher schwächer und für die Induktion von Effekten in der Übersichtsaufnahme nicht hinreichend.

5.4 Überexpression von RhoAN19, Rac1N17, Cdc42N17 in humanen Endothelzellen

Diese Arbeit hat gezeigt, dass die LPS-induzierte Expression von IL-8/CXCL8 in humanen Endothelzellen durch Überexpression der inaktiven Mutanten von RhoA, Rac1 und Cdc42 inhibiert wird. Damit konnten vorhergehende Ergebnisse über die LPS-induzierte IL-8/CXCL8-Expression, die unter Verwendung der Toxine TcdB-10463 und TcdB-1470 aus Clostridium difficile gewonnen wurden, bestätigt und konkretisiert werden. Während mit Hilfe der inaktivierenden Toxine gezeigt wurde, dass zumindest Rac1 und/oder Cdc42 in der Signaltransduktion beteiligt sein müssen [Hippenstiel, et al., 2000], konnte diese Arbeit mit Hilfe der inaktiven Varianten nachweisen, dass alle drei Proteine beteiligt sind. Neben dieser und der Arbeit von Hippenstiel haben keine weiteren veröffentlichten Arbeiten die Beteiligung kleiner GTP-bindender Proteine in der LPS-induzierten Signal-transduktion in Endothelzellen untersucht. Allerdings wurde in einer Publikation aus dem Jahr 2002 die Beteiligung von RhoA in der LPS-induzierten Expression von IL-8/CXCL8 in monozytären Zellen nachgewiesen [Chen, et al., 2002]. Damit wurde für Monozyten und Endothelzellen übereinstimmend eine Beteiligung von RhoA in der LPS-induzierten Il-8/CXCL8-Expression gezeigt. Die Proteine Rac1 und Cdc42 wurden in der Arbeit von Chen nicht untersucht, aber eine 2003 veröffentlichte Arbeit konnte die LPS-induzierte Aktivierung von Rac1 in der monozytären Zelllinie THP-1 mit Hilfe des Rac-Aktivitätsassay nachweisen [Patel undCorbett, 2003]. Die vorgenannte Arbeit untersuchte allerdings nicht die Wirkung auf die Proteinexpression oder die Aktivierung von Transkriptions-faktoren, aber die hier vorgestellten Endothelzellergebnisse legen nahe, dass auch in Monozyten neben RhoA die Proteine Rac1 und Cdc42 im LPS-induzierten Signalweg stehen.

Die Beteiligung von GTP-bindenden Proteinen in Signalwegen zur Expressions-kontrolle proinflammatorischer Zytokine wurde in weiteren Arbeiten für andere Stimuli untersucht, die ihr Signal nicht wie LPS über den TLR-4-Rezeptor transduzieren. So wurde unter Verwendung inhibierender Toxine gezeigt, dass die durch TNF-α induzierte Expression von IL-8/CXCL8 in Endothelzellen RhoA-abhängig ist [Hippenstiel, et al., 2002].

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Das Neuropeptid Substanz P (SP) wirkt als Induktor gastrointestinaler Inflammation, der die IL-8/CXCL8-Expression in epithelialen Zellen der Linie NCM460 nach Transfektion mit dem SP-Rezeptor NK-R1 induziert. Die SP- induzierte IL-8/CXCL8-Expression konnte durch Überexpression von RhoAN19, Rac1N17 und Cdc42N17 mit Hilfe eines retroviralen Vektorsystems je nach transfizierter Mutante um 30–40 % reduziert werden [Zhao, et al., 2002]. Das proinflammatorisch wirksame intestinale Neuropeptid Neurotensin (NT) ist ein weiterer Mediator gastrointestinaler Inflammation und erhöht die Expression von IL-8/CXCL8 in Zellen der aus Colonmukosa abstammenden humanen epithelialen Zelllinie NCM460, die mit dem Neurotensinrezeptor NTR-1 transfiziert wurde. Auch die NT-induzierte IL-8/CXCL8-Expression in NTR-1-transfizierten Zellen der Linie NCM460 konnte durch Überexpression von RhoAN19, Rac1N17 und Cdc42N17 jeweils um etwa 40 % vermindert werden [Zhao, et al., 2003]. Die Experimente mit SP- und NT-stimulierten Colonepithelzellen zeigen eine stärkere quantitative Minderung der IL-8/CXCL8-Expression nach Überexpression von RhoAN19, Rac1N17 und Cdc42N17 als die in dieser Arbeit vorgestellten Experimente mit LPS-stimulierten Endothelzellen. Wenn auch stimulus- und zelltypspezifische Besonderheiten zu diesem Unterschied beitragen können, ist ein Grund möglicherweise die Verwendung des retroviralen Transfersystems und eine dadurch bedingte stärkere Überexpression der inaktiven Mutanten von RhoA/Rac1/Cdc42, denn die Koexpression eines GFP fällt weg.

5.5 Überexpression von Rac1N17 und Cdc42N17, aber nicht von RhoAN19 reduziert die Aktivierung von NF-κB in HPMEC-ST1.6R

Wie bereits unter 1.4.4 erläutert, weist die Verstärkerregion des Gens für IL-8/CXCL8 Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren , C/EBP-β und AP-1, auf [Kunsch, et al., 1994]. Die zell- und stimulusspezifische Regulation der Genexpression wird durch ein Zusammenwirken der verschiedenen Transkriptionsfaktoren erreicht, wobei dem Transkriptionsfaktor für die Transkription von IL-8/CXCL-8 besondere Bedeutung zukommt. Diese Arbeit zeigte unter Verwendung des Reporterplasmids pGL3.BG.6κB die Hemmung der NF-κB-Aktivierung durch Rac1N17 und Cdc42N17, aber nicht durch RhoAN19, obwohl die Zytokinexpression auch durch RhoAN19 vermindert wurde. In der Arbeit von Hippenstiel wurden die LPS-induzierte Aktivierung von und deren Inhibition durch TcdB-10463 mit Hilfe desselben Reporterplasmids pGL3.BG.6κB nachgewiesen [Hippenstiel, et al., 2000]. Die ausbleibende Hemmung der LPS-induzierten -Aktivierung unter RhoAN19 lässt sich mit den von Hippenstiel berichteten Ergebnissen der Hemmung durch Toxin TcdB10463 vereinbaren, da das Toxin auch Rac1 und Cdc42 inhibiert. Trotzdem stellt sich die Frage, wie die Überexpression von RhoAN19 die unter 4.3 gezeigte Minderung der Proteinexpression von IL-8/CXCL8 bewirkt, ohne die -abhängige Luziferaseaktivität zu beeinflussen.

In der Sequenz der IL-8/CXCL8-Verstärkerregion liegt unmittelbar neben der Bindungsstelle für eine Bindungsstelle für den Transkriptionsfaktor C/EBP-β, und die Mutation jeweils einer der beiden Bindungsstellen reduzierte in Zellen der Linien Jurkat T und Caco-2 die Promotoraktivität [Kunsch, et al., 1994;Wu, et al., 1997]. Mutation der Bindungsstelle für reduzierte das IL-1β-stimulierte Reportersignal in Caco-2-Zellen gegenüber der Wildtypsequenz auf 1 % und Mutation der Bindungsstelle für C/EBP-β reduzierte das Reportersignal auf 11 % [Wu, et al., 1997]. Weiter wurde von Wu und Kunsch gezeigt, dass p65 und C/EBP-β in der Transaktivierung von IL-8/CXCL8 in Zellen der Linien Caco-2 und Jurkat unmittelbar miteinander wechselwirken [Kunsch, et al., 1994]. Das synergistische Wirken verschiedener Transkriptionsfaktoren im IL-8/CXCL8-Promotor könnte die Wirkung von RhoAN19 auf die Expression des Proteins in Zellen der Linie HPMEC-ST1.6R bei fehlender Wirkung auf die Aktivität des Reporterkonstrukts für erklären. Die Arbeit von Chen et al. über die LPS-induzierte RhoA-vermittelte Induktion von IL-8/CXCL8 in Monozyten konnte die Aktivierung von durch LPS in Monozyten mittels Gel-Retentionsanalyse (EMSA) ebenso wie die Inhibition der LPS-induzierten Aktivierung von NF-κB durch die Transferase C3 aus Clostridium botulinum nachweisen. Die Autoren folgerten, dass die vermehrte IL-8/CXCL8-Expression durch eine RhoA-vermittelte Aktivierung von bewirkt wird [Chen, et al., 2002]. Einerseits kann die berichtete Hemmung der Aktivierung von NF-κB auf zellspezifische Unterschiede in der intrazellulären Signaltransduktion in Endothelzellen und Monozyten hindeuten, andererseits ist zu bedenken, dass die Transferase C3 von Clostridium botulinum nach neueren Erkenntnissen auch in Wechselwirkung mit der GTPase RalA tritt und die Inhibition der -Aktivierung durch die Transferase C3 nicht mehr als RhoA-spezifisch betrachtet werden kann [Wilde, et al., 2002]. Die Wirkung von RhoAN19 auf die Expression eines -spezifischen Reporterkonstruktes, wie sie in dieser Arbeit getestet wurde, ist von Chen et al. nicht untersucht worden.

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Weitere Arbeiten haben die Wirkung der Überexpression von Rho-Mutanten auf -abhängige Reporterkonstrukte untersucht. Perona zeigte 1996, dass die Überexpression des Wildtyps von RhoA, Rac1 und Cdc42 und aktiver Mutanten der jeweiligen Gene in Zellen der Linien COS-7, NIH-3T3 und Jurkat jeweils das kotransfizierte -abhängige Reporterkonstrukt HIV-Luc aktiviert. Außerdem wurde gezeigt, dass die inaktiven Mutanten Cdc42N17 und RhoAN19, aber nicht Rac1N17 die durch induzierte Luziferaseexpression des Reporter-konstruktes HIV-Luc in COS-7-Zellen vermindern [Perona, et al., 1997]. Einerseits wurden von Perona andere Zelllinien verwandt und überwiegend aktive Varianten ohne Stimulus überexprimiert, andererseits wurde auch ein anderes Reporter-konstrukt verwandt. Der von Perona eingesetzte Reporter HIV-Luc wurde 1993 von Devary aus dem Plasmid HIV-CAT generiert, indem die für die Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) codierende Sequenz durch eine für die Luziferase (Luc) codierende Sequenz ersetzt wurde, wobei Verstärker- und Promotorregion erhalten blieben [Devary, et al., 1993]. HIV-CAT selbst wurde 1984, also zwei Jahre vor der Erstbeschreibung von NF-κB durch Sen und Baltimore, von Sodroski unter dem Namen pU3R-III konstruiert, indem die gesamte Verstärker- und Promotorregion (gesamte U3- und 80 bp der R-Region aus dem LTR des HIV-Provirus, damals HTLV-III genannt) als regulatorische Sequenz in ein CAT-Expressionsplasmid eingebaut wurde [Sodroski, et al., 1984]. Tatsächlich enthält die ungefähr 450 bp lange Regulatorregion zwei Bindungsstellen für , aber darüber hinaus noch weitere Bindungsstellen für andere Transkriptionsfaktoren, wie 1985 von Rosen gezeigt wurde [Rosen, et al., 1985]. Außerdem erfolgt die Expression der Luziferase in HIV-Luc unter dem viralen HIV-Promotor, während im Plasmid pGL3.BG.6κB ein eukaryotischer β-Globin-Promotor Verwendung findet [Schwarzer, et al., 1998]. Ein Vergleich der Ergebnisse von Perona mit den Ergebnissen dieser Arbeit, die mit dem für spezifischen Reporterplasmid pGL3.BG.6kB gewonnen wurden, muss die gravierenden Unterschiede der jeweils verwendeten Reporterkonstrukte berücksichtigen.

Auch in den beiden unter 5.4 zitierten Arbeiten von Zhao über die Hemmung der durch Substanz P (SP) und Neurotensin (NT) stimulierten IL-8/CXCL8-Expression durch inaktive Rho-GTPasen wurde die Wirkung der Mutanten auf die Expression eines kotransfizierten -abhängigen Reporterplasmids untersucht und eine Minderung des Reportersignals unter allen drei inaktiven Mutanten gezeigt [Zhao, et al., 2002;Zhao, et al., 2003]. Das von Zhao in der SP-stimulierten Luziferaseexpression benutzte Reporterplasmid geht zurück auf das von A. S. Baldwin konstruierte Plasmid MHC--CAT [Baldwin, et al., 1991], aus dem Mitchell 1995 durch Austausch der codierenden Sequenz für die Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) gegen eine für die Luziferase (Luc) codierende Sequenz unter Beibehaltung der regulatorischen Sequenzen einen -abhängigen Luziferasereporter generiert hat [Mitchell undSugden, 1995]. Beide Plasmide weisen als regulatorisches Element ein Triplett der aus dem MHC-I-Verstärker kopierten Sequenz TGGGGATTCCCCA auf. Baldwin zeigte 1991 unter anderem mit Hilfe dieses Plasmids, dass oder ein -ähnlicher Faktor durch Stimulation ruhender Fibroblasten mit Serum induziert wird. In der Diskussion zu dieser Veröffentlichung weist Baldwin darauf hin, dass ein weiteres Reporterkonstrukt, κB2-CAT, das eine Duplett einer sehr ähnlichen Sequenz aus der Verstärkerregion der Immunglobulin-κ-Leichtkette enthält, sich unter gleichen Bedingungen nicht durch Serum induzieren ließ [Baldwin, et al., 1991]. Das genannte Plasmid wurde von Pierce konstruiert und war das erste -spezifische Reporterplasmid. Es enthält die Sequenz GGGACTTTCC [Pierce, et al., 1988]. Diese Sequenz von 11 Nukleotiden entspricht der von Sen und Baltimore in der Erstbeschreibung von angegebenen Sequenz für die Bindungsstelle in der Verstärkerregion der Immunglobulin-κ-Leichtkette [Sen undBaltimore, 1986]. Schon die Arbeit von Baldwin weist also nach, dass sehr ähnliche Reporterkonstrukte unterschiedliche Ergebnisse liefern können. Das in dieser Arbeit verwendete von Robert Newton konstruierte Plasmid pGL3.BG.6κB enthält 6x die Bindungssequenz GGGGACTTTCCCT, entsprechend der Originalsequenz aus dem κB-Verstärkerelement [Schwarzer, et al., 1998]. Neben der Möglichkeit stimulus- und zellspezifischer Faktoren kann eine weitere Erklärung für die verschiedenen Ergebnisse im Reporterassay zwischen LPS-stimulierten Endothelzellen und SP-stimulierten Colonepithelzellen also die Verwendung der ungleichen Reporterkonstrukte sein. Bemerkenswert ist, dass Baldwin als Kontrollplasmid zum Nachweis der Spezifität der Transkriptionsfaktorbindung ein Plasmid mit der Sequenz TGCGGATTCCCGA, also mit Mutationen von Nukleotiden in zwei getrennten Bereichen der Bindungssequenz, verwendet hat [Baldwin, et al., 1991]. Die Spezifität des in dieser Arbeit verwendeten Plasmids pGL3.BG.6κB wurde dagegen mit einem Plasmid der Sequenz GGCCACTTTCCCT, also mit einer Mutation nur im Sequenzbereich der vier G, nachgewiesen [Schwarzer, et al., 1998]. Das Gleiche gilt für das Plasmid κB2-CAT mit der mutierten Sequenz ATTCACTTTCC [Pierce, et al., 1988]. Diese Vergleiche und schon die Ergebnisse von Baldwin zeigen, welche Bedeutung der genauen Bindungssequenz eines Reporterplasmids zukommt. Hinzu kommen die zum Teil erheblichen Variationen der Bindungssequenzen in der Verstärkerregion des jeweils untersuchten Gens gegenüber der Bindungssequenz des Reporters. Dementsprechend kommt der Messung des tatsächlich exprimierten Proteins die entscheidende Bedeutung zu.

Weiter ist auch denkbar, dass bei Kotransfektion von drei einzelnen Plasmiden in Endothelzellen die Normalisierung der Luziferaseaktivität durch Abgleich auf die β-Galaktosidaseaktivität nicht zuverlässig funktioniert. Denn schon bei gleichzeitiger Transfektion zweier Plasmide im Verhältnis 1:1 exprimiert eine Teilpopulationen der transfizierten Zellen von bis zu 30% nur eines der beiden Plasmide [Trouet, et al., 1997]. Es erscheint deshalb sinnvoll, die Frage nach der Aktivierung von NF-κB nach Überexpression von RhoAN19 durch eine andere Methode zu überprüfen. Möglich wäre hier zum Beispiel der intrazelluläre Nachweis von IκB

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nach LPS-Stimulation, der methodisch analog dem intrazellulären Nachweis von IL-8/CXCL8 durchzuführen wäre.

5.6 Überexpression von Rac1N17, Cdc42N17 und von RhoAN19 reduziert die Aktivierung des Reporters in CHO-3E10

Vorhergehende Arbeiten mit anderen Stimuli in anderen Zelllinien zeigten, dass die Aktivierung der IL-8/CXCL8-Transkription neben unter anderem auch durch den Transkriptionsfaktor AP-1 gesteuert wird [Wu, et al., 1997]. Diese Arbeit untersuchte deshalb die Wirkung der Mutanten RhoAN19, Rac1N17 und Cdc42N17 auf die Aktivierung der LPS-reagiblen Reporterlinie CHO-3E10, deren Reporterkonstrukt ein Fragment aus der Verstärkerregion des Gens für ELAM-1/CD62E mit Bindungsstellen für und AP-1 enthält [Delude, et al., 1998;Jensen undWhitehead, 2003].

5.6.1 Die Reporterexpression in CHO-3E10 zeigt das gleiche quantitative Muster wie die Expression von IL-8/CXCL8 in Endothelzellen

Rac1N17 und Cdc42N17 inhibieren die Expression des Reporterproteins in CHO-3E10, wie auch die Expression der Luziferase im für -spezifischen Reportersystem pGL3.BG.6κB in Endothelzellen. Die Mutante RhoAN19 inhibiert den LPS-reagiblen Reporter der Linie CHO-3E10 ebenfalls, genau wie auch die Proteinexpression von IL-8/CXCL8 in Endothelzellen, obwohl keine inhibierende Wirkung auf den für spezifischen Reporter vorhanden war. Zunächst ist zu bedenken, dass die zwei Reportersysteme in verschiedenen Zelllinien genutzt wurden und ein Unterschied in der Hemmung der LPS-induzierten Aktivierung auf zellspezifischen Unterschieden in der LPS-induzierten Signaltransduktion zwischen Endothel- und CHO-Zellen beruhen kann. Da aber schon für die Stimulation von Caco-2- und Jurkat-Zellen mit IL-1ß gezeigt wurde, dass mit Faktoren aus der C/EBP-Familie und der AP-1-Familie bei der Verstärkung der IL-8/CXCL8-Transkription zusammenwirkt [Kunsch, et al., 1994;Wu, et al., 1997], ist denkbar, dass ähnliche synergistische Effekte bei der LPS-induzierten Signal-transduktion wirksam werden und Ursache für die unterschiedliche Hemmung der beiden Reporter durch RhoAN19 sind. Bemerkenswert ist in diesem Zusammenhang, dass das quantitative Muster der Hemmung der Reporter-expression in CHO-3E10 genau dem Muster der Expression von IL-8/CXCL8 in Endothelzellen mit der stärksten Reduktion unter Rac1N17 entspricht.

5.6.2 Minderung des Reportersignals mit steigender Überexpression von Rac1N17

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Die überexprimierte inaktive Mutante einer GTPase konkurriert mit dem zelleigenen Wildtyp um flussaufwärts stehende Bindungspartner, die jeweiligen GEFs der GTPase, und bindet diese GEFs ohne Konformationsänderung, so dass das Signal nicht weitergeleitet wird [Feig, 1999]. Um eine effektive Blockade der Signalweiterleitung zu bewirken, muss eine hinreichende Menge an inaktivem Protein exprimiert werden. Diese Menge ist abhängig von der jeweiligen GTPase, dem jeweiligen biologischen Effekt, den sie vermittelt, und dem Zelltyp [Feig, 1999]. Für RasN17 wird diese Menge von Feig mit dem 2–3fachen des zellulären Wildtypproteins für eine komplette Inhibition angegeben. Dementsprechend sollte vor Erreichen einer kompletten Inhibition eine „Dosisabhängigkeit“ von der Menge an überexprimierter Proteinvariante nachzuweisen sein. Diese Dosisabhängigkeit konnte für die Reporterexpression in CHO-3E10 unter Rac1N17 gezeigt werden, aber nicht für RhoA und Cdc42. Erklärend für die nicht gezeigte Dosisabhängigkeit bei RhoAN19 und Cdc42N17 kann also ein niedrigeres Expressionsniveau an Wildtypprotein von RhoA und Cdc42 sein, so dass schon eine relativ geringe Expression der Mutanten komplett inhibierend wirkt. Speziell für die in dieser Arbeit verwendete inaktive Mutante von RhoA kommt hinzu, dass diese Mutante RhoAN19 eine weitere Mutation (F25N) zur Erhöhung der Proteinstabilität aufweist [Self undHall, 1995], so dass möglicherweise aufgrund unterschiedlicher Kinetik des Proteinumsatzes für EGFP und RhoAN19 gar kein proportionales Verhältnis zwischen EGFP-bedingter Fluoreszenzintensität und der Masse an zellulärem RhoAN19 besteht. Unabhängig von den Gründen für die fehlende Dosisabhängigkeit der Reportersignalreduktion unter RhoAN17 und Cdc42N17 ist bemerkenswert, dass für die Zellen mit maximaler Überexpression von Rac1N17 eine Signalreduktion bis auf 33 % des Kontrollwerts gegenüber einem mittleren Wert von 49 % für alle Rac1N17 überexprimierenden Zellen gemessen wurde. Das deutet darauf hin, dass der Inhibition von Rac1 in der LPS-induzierten Signalkaskade im Vergleich zu RhoA und Cdc42 eine herausragende Bedeutung zukommt. Jüngst wurde ein für Rac spezifischer biochemischer Inhibitor identifiziert [Gao, et al., 2004]. Dieser kann möglicherweise auch für die Modulation der inflammatorischen Signalwege eingesetzt werden.

5.7 Generation der Linien CHO-RhoAN19 und CHO-Cdc42N17

Für die neu generierten Linien CHO-RhoAN19 und CHO-Cdc42N17 wurde zunächst mittels Western-Blot die Expression der jeweiligen inaktiven Mutanten nachgewiesen. Anschließend wurde die funktionelle Wirksamkeit der exprimierten inaktiven Mutanten gezeigt, indem in der Phasenkontrast- und Fluoreszenzmikros-kopie jeweils eine charakteristische Zellmorphologie gezeigt wurde. Konfokal-mikroskopisch konnte als Ursache der jeweiligen Morphologie eine unterschiedliche Kondensation von Aktinfilamenten zu Stressfasern nachgewiesen werden. Die jeweils gezeigten Veränderungen des Zytoskeletts gegenüber der Referenzlinie CHO-3E10 stimmen mit den in der Literatur für ähnliche Zelllinien beschriebenen Veränderungen weitgehend überein. Qui und Chen haben die Ratten-Fibroblastenlinie Rat1 mit inaktivem RhoAN19, aktivem RhoAV14 und Leervektor stabil transfiziert [Qiu, et al., 1995]. Nach Anfärbung der Aktinfilamente mit FITC-Phalloidin berichten die Autoren eine Zunahme an Stressfasern für die RhoAV14-Linie und eine Abnahme an Stressfasern für die RhoAN19-Linie im Vergleich zur mit Leervektor transfizierten Linie in der Immunfluoreszenz-mikroskopie [Qiu, et al., 1995]. Die gleiche Veränderung – Abnahme an Stressfasern – konnte unter 4.6.2 in Abbildung 24 für CHO-RhoAN19 gezeigt werden. Für CHO-RhoAN19 wurden zusätzlich auch geringere Zell-Zell-Kontakte als für CHO-3E10 gezeigt, was durch die in der Literatur beschriebene Hemmung von Fokalen Adhäsionen erklärt werden kann. Ebenfalls von Qiu wurden stabil mit Cdc42N17 und aktivem Cdc42 transfizierte Zelllinien generiert [Qiu, et al., 1997]. Für die mit aktivem Cdc42 transfizierte Linie beschreibt Qiu eine Abnahme an Stressfasern im Vergleich zur mit Leervektor transfizierten Kontrolllinie und der mit Cdc42N17 transfizierten Linie. Für die Cdc42N17-Linie wären gegenteilig zur mit aktivem Cdc42 transfizierten Linie ausgeprägte Stressfasern zu erwarten. Der Autor berichtet allerdings, dass der entsprechende Klon die inaktive Proteinvariante nur in sehr geringer Menge überexprimiert, und führt die fehlende Veränderung gegenüber der Kontrolllinie in seiner Diskussion darauf zurück, dass die geringe Überexpression von Cdc42N17 für eine funktionelle Wirksamkeit nicht hinreichend ist [Qiu, et al., 1997]. Die in dieser Arbeit generierte Linie CHO-Cdc42N17 überexprimiert das inaktive Cdc42N17 sehr stark, wie an einer ausgeprägten Fluoreszenz des unter dem IRES-Element im Verhältnis 1 : 2,5 [Mizuguchi, et al., 2000] gegenüber Cdc42N17 exprimierten EGFP zu sehen ist. Die im FACS gemessene Fluoreszenzintensität lag im Bereich und damit am oberen Rand der Skala. Dementsprechend zeigt die Linie auch ausgeprägte, kabelförmige Stressfasern.

Die Diskussion der stabil transfizierten Linien zusammengefasst, wurden sowohl die Proteinexpression von RhoAN19 und Cdc42N17 als auch deren funktionelle Wirksamkeit auf die Zytomorphologie gezeigt. Nachdem in dieser Arbeit die Wirkung der Überexpression inaktiver Mutanten von RhoA, Rac1 und Cdc42 nach transienter Transfektion in Endothel- und CHO-Zellen auf den LPS-induzierten Signalweg nachgewiesen wurde, stellen die stabil transfizierten Linien möglicher-weise ein Werkzeug zum weiteren Studium des untersuchten Signalwegs dar.


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21.11.2005