Aus der Medizinischen Klinik mit Schwerpunkt Infektiologie
der Medizinischen Fakultät der Charité –
Universitätsmedizin Berlin

Dissertation

Endothel und Regulation der Inflammation

Überexpression inaktiver Mutanten der kleinen GTP-bindenden Proteine RhoA/Rac1/Cdc42 inhibiert die LPS-induzierte Expression von Interleukin-8/CXCL8 in humanen mikrovaskulären Endothelzellen

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité –
Universitätsmedizin Berlin

von
Rolf Günter Weidmann
aus Detmold

Dekan: Prof. Dr. med. Martin Paul

Gutachter/innen:
1. Prof. Dr. med. Norbert Suttorp
2. Prof. Dr. med. Michael Kracht
3. Prof. Dr. rer. nat. Stefan Ludwig

Datum der Promotion: 23.09.2005

Zusammenfassung

Die durch Lipopolysaccharid (LPS) induzierte frühe Immunantwort ist ein wesentlicher Mechanismus der Infektabwehr durch die angeborene Immunität. Bei starker LPS-Exposition kann es andererseits zur Ausbildung eines septischen Syndroms kommen. Der endothelialen Sekretion von Interleukin-8 (IL-8/CXCL8), das als Chemokin die Migration neutrophiler Granulozyten vermittelt, kommt dabei herausragende Bedeutung zu. Zielsetzung dieser Arbeit war es, die Relevanz der Rho-Proteine RhoA, Rac1 und Cdc42 für die LPS-induzierte intrazelluläre Signaltransduktion mittels Überexpression inaktiver Mutanten dieser Proteine zu untersuchen.

Diese Untersuchung wurde erschwert durch die schlechte Transfizierbarkeit primärer Endothelzellen und der Endothelzelllinie HPMEC-ST1.6R, die nahezu alle Charakteristika primärer Endothelzellen aufweist. Deshalb wurde eine Methode etabliert, die durch Kotransfektion des Grünen Fluoreszenzproteins (GFP) die flusszytometrische Selektion der transfizierten Zellen anhand ihrer GFP-bedingten Fluoreszenz und die Messung der Expression von IL-8/CXCL8 allein in dieser Population ermöglicht. Damit wurde nachgewiesen, dass die inaktiven Mutanten RhoAN19, Rac1N17 und Cdc42N17 jeweils die LPS-induzierte Expression von IL-8/CXCL8 vermindern. Der quantitative Vergleich zeigte die größte Reduktion nach Transfektion von Rac1N17 um 38 % der Positivkontrolle. Nach Transfektion von RhoAN19 und Cdc42N17 reduzierte sich die LPS-induzierte Expression von IL-8/CXCL8 jeweils um 15 %.

Um zu klären, über welche Transkriptionsfaktoren die untersuchten GTP-bindenden Proteine ihre Wirkung auf die Expression von IL-8/CXCL8 vermitteln, wurde das -Reporterplasmid pGL3.BG.6κB mit den inaktiven Mutanten RhoAN19, Rac1N17 und Cdc42N17 in Zellen der Endothelzelllinie kotransfiziert. Diese Experimente zeigten eine Verminderung der LPS-induzierten Aktivierung von durch Rac1N17 und Cdc42N17, aber nicht durch RhoAN19.

Die Zelllinie CHO-3E10 exprimiert einen artifiziellen Reporter unter der Kontrolle eines Fragments aus der Verstärkerregion des Gens für das Endotheliale Leukozyten-Adhäsionsmolekül ELAM-1 (CD62E). Dieses Fragment weist als cis-reaktive Elemente Bindungsstellen für und AP-1 auf. Die Transfektion jeder einzelnen der inaktiven Varianten der drei GTP-bindenden Proteine in Zellen der Linie CHO-3E10 reduzierte die Expression des Reporterproteins nach Stimulation mit LPS signifikant. Die stärkste Reduktion der Reporterexpression um 51 % der Kontrolle ergab sich unter Rac1N17. Nach Transfektion von RhoAN19 reduzierte sich die Reporterexpression um 25 % und nach Transfektion von Cdc42N17 um 24 %. Damit zeigte sich das gleiche quantitative Muster wie für die Reduktion der Expression von IL-8/CXCL8 in Zellen der Endothelzelllinie HPMEC-ST1.6R.

Zusammengefasst deuten die mit den inaktiven Mutanten RhoAN19, Rac1N17 und Cdc42N17 gewonnenen Ergebnisse darauf hin, dass alle drei GTP-bindenden Proteine an der LPS-induzierten Expression von IL-8/CXCL8 in Endothelzellen mitwirken, wobei Rac1 die größte Bedeutung zukommt. Die Wirkung der einzelnen Proteine auf die Transkriptionsfaktoren, die IL-8/CXCL8 regulieren, sollte genauer untersucht werden.

Um Hilfsmittel für die weitere Klärung des LPS-induzierten Signalweges zu gewinnen, wurden stabil mit den inaktiven Mutanten RhoAN19 und Cdc42N17 transfizierte Zellen der Linie CHO-3E10 selektioniert. Die Expression der Myc-markierten Mutanten in den neu generierten Linien CHO-RhoAN19 und CHO-Cdc42N17 wurde mittels Western-Blot nachgewiesen. Die funktionelle Wirksamkeit der Überexpression wurde anhand der zytomorphologischen Veränderungen fluoreszenz- und konfokalmikroskopisch gezeigt. Die Zelllinien stellen ein Werkzeug für die weitere Klärung der Stellung der GTP-bindenden Proteine RhoA und Cdc42 in der LPS-induzierten Signalkaskade dar.

Schlagworte: Endothel, Rho-Proteine, Lipopolysaccharid, Flusszytometrie, GFP

Abstract

The early immune response induced by Lipopolysaccaride (LPS) is a crucial mechanism in fighting off infections by the innate immunity. On the other side high amounts of LPS can lead to the development of a sepsis. In this process the endothelial secretion of interleukin-8 (IL-8/CXCL8), which causes the migration of neutrophilic granulocytes to the site of infection is highly important. The aim of this study was to analyze the relevance of each of the three Rho-proteins RhoA, Rac1 and Cdc42 for the intracellular signal transduction resulting in CXCL8-expression by means of overexpressing inactive mutants of these proteins.

Cells of the human microvascular endothelial cell line HPMEC-ST1.6R show most characteristics of primary endothelial cells and are extremely difficult to transfect. Therefore a method was established, which allowed sorting of successfully transfected cells by cotransfecting a gene encoding for green fluorescence protein (GFP). This method permitted measuring intracellular expression of CXCL8 in the population successfully transfected with plasmids encoding for RhoAN19, Rac1N17 or Cdc42N17 mutants. This experiments demonstrated that the inactive mutants RhoAN19, Rac1N17 and Cdc42N17 each decreased the LPS-induced expression of IL-8/CXCL8. Quantitative comparision showed the greatest reduction of 38 % in CXCL8-expression due to transfection of the Rac1N17 mutant. A decrease of 15 % in CXCL8-expression was found due to transfection of the Cdc42N17 mutant or the RhoAN19 mutant.

In order to analyze which transcription factors are employed by the examined GTP-binding proteins to convey their effect on the expression of IL-8/CXCL8, the –reporterplasmid pGL3.BG.6κB was co-transfected with RhoAN19, Rac1N17 or Cdc42N17 into endothelial cells. These experiments showed a decrease of LPS-induced activation of due to Cdc42N17 and Rac1N17, but not RhoAN19.

The LPS-induciblereporter cell line CHO-3E10 used in this study expresses the human CD25-antigene as an artificial reporter protein under the control of a fragment from the enhancer region of the gene for the human endothelial leukocytic adhesionmolecule ELAM-1 (CD62E). The cis-reactive elements in this fragment are the binding sites for the transcription factors NF- κ B and AP-1. Transfecting each of the inactive mutants RhoAN19, Rac1N17 or Cdc42N17 in CHO-3E10 cells significantly reduced the LPS-induced expression of the reporter protein. The greatest reduction in reporter expression of 51 % resulted from transfection with the Rac1N17 mutant. A reduction of 25 % and 24 % resulted from overexpression of the RhoAN19 mutant and the Cdc42N17 mutant respectively.Consequently the same quantitative pattern as in the reduction of endothelial CXCL8-expression was found.

In conclusion, this study demonstrates that overexpression of nonfunctional GTP-binding proteins RhoAN19, Rac1N17 or Cdc42N17 leads to a decrease in endothelial CXCL8-expression. Moreover, CXCL8-expression in endothelial cells transfected with the Rac1N17 mutant was most efficiently reduced when compared to the other mutants. The influence of each of the three Rho-proteins regulating transcription factors have requires further investigation.

In order to create tools to further examine LPS-induced signalling, the CHO-3E10 cell line was stably transfected to express the mutant RhoAN19 or the mutant Cdc42N17. Expression of myc-tagged mutants was proven by using western blot analysis. Overexpression of the mutants was functionally effective and the characteristic morphological changes caused by RhoAN19 and Cdc42N17 could be shown by using fluorescence- and confocal microscopy. Therefore, these cell lines may serve as tools to further investigate the role of GTP-binding proteins in the LPS-induced signalling cascade.

Keywords: Endothelium, Rho-proteins, Lipopolysaccharide, Flow Cytometry, GFP

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21.11.2005