1 Einleitung

• 1.1  Endothel

  • 1.1.1 Bedeutung des Endothels für Inflammation und Immunität

  • 1.1.2 Endotheliale Aktivierung und die Sepsis

  • 1.1.3 Die humane mikrovaskuläre Endothelzelllinie HPMEC-ST1.6R

• 1.2 Lipopolysaccharid-induzierter Signalweg in Endothelzellen

  • 1.2.1 Lipopolysaccharid (LPS) gramnegativer Bakterien

    • 1.2.1.1 Struktur von Lipid A und endotoxische Aktivität

    • 1.2.1.2 Lipopolysaccharid von Escherichia coli

  • 1.2.2 Rezeptorbindung von LPS

  • 1.2.3 Humane Toll-like-Rezeptoren

  • 1.2.4 Signalkaskade unterhalb TLR-4 in humanen Endothelzellen

  • 1.2.5 Kleine GTP-bindende Proteine in der LPS-induzierten Signalkaskade

  • 1.2.6 Transkriptionsfaktoren in der Signalkaskade

    • 1.2.6.1 Nukleärer Faktor-κB (NF-κB)

    • 1.2.6.2 Aktivatorprotein-1 (AP-1)

    • 1.2.6.3 Die Lipopolysaccharid-reagible Reporterlinie CHO-3E10

    • 1.2.6.4 CCAAT/Verstärker-bindendes Protein-β (C/EBP-β)

• 1.3 Kleine GTP-bindende Proteine

  • 1.3.1 Die Ras-Superfamilie

  • 1.3.2 Molekulares Funktionsprinzip

  • 1.3.3  Die Rho-Familie

    • 1.3.3.1 RhoA (Ras homologous member A)

    • 1.3.3.2 Rac1 (Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1)

    • 1.3.3.3 Cdc42 (cell division cycle 42)

  • 1.3.4 Bakterielle Toxine modifizieren die Aktivität kleiner GTP-bindender Proteine

  • 1.3.5 Bedeutung für Zytoskelett und Zellmorphologie

  • 1.3.6 Bedeutung für die Transkription

  • 1.3.7 Bedeutung von RhoA, Rac1 und Cdc42 für die Expression von IL-8/CXCL8

  • 1.3.8 Statine und kleine GTP-bindende Proteine

• 1.4 Interleukin-8 (IL-8/CXCL8)

  • 1.4.1 Chemokine

  • 1.4.2 Zielzellen und Wirkungen von IL-8/CXCL8 in vitro

  • 1.4.3 Wirkungen von IL-8/CXCL8 in vivo und klinische Bedeutung

  • 1.4.4 Die Expressionskontrolle von IL-8/CXCL8

• 1.5 DNA-Transfer in humane Endothelzellen

  • 1.5.1 Das Grüne Fluoreszenzprotein (GFP) als Reporter der Transfektion

  • 1.5.2 Selektion transformierter Zellen

• 1.6 Zielsetzung der Arbeit

2  Materialien

• 2.1 Plasmide, Bakterienkultur, Transformation, Plasmidpräparation

• 2.2 Molekularbiologie

• 2.3 Zelllinien und Zellkultur

• 2.4 Transfektion

• 2.5 Flusszytometrie

• 2.6 Biolumineszenzassay

• 2.7 Western-Blot

• 2.8 Phasenkontrast-, Fluoreszenz- und Konfokalmikroskopie

• 2.9 Spezielle Software und Statistik

3  Methoden

• 3.1 Transformation, Bakterienkultur und Präparation von Plasmid-DNA

  • 3.1.1 Transformation

  • 3.1.2 Bakterienkultur

  • 3.1.3 Plasmidpräparation

• 3.2 Subklonierung der Genvarianten aus pRK5 in pIRES2-EGFP

  • 3.2.1 Spezifische Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen

  • 3.2.2 Aufreinigen von DNA aus enzymatischen Reaktionen

  • 3.2.3 Auffüllen überhängender 5'-DNA-Enden mit Klenow-Polymerase

  • 3.2.4 Agarosegelelektrophorese

  • 3.2.5 Elution elektrophoretisch aufgetrennter DNA-Fragmente aus Agarosegelen

  • 3.2.6 Ligation von einseitig glatt beendeten DNA-Fragmenten und Transformation

  • 3.2.7 Identifizierung geeigneter Subklone und DNA-Sequenzierung

• 3.3 Zellkultur

  • 3.3.1 Zellkultur der humanen mikrovaskulären Endothelzelllinie HPMEC-ST1.6R

  • 3.3.2 Zellkultur der LPS-reagiblen Reporterzelllinie CHO-3E10

• 3.4 Transfektion und transiente Überexpression inaktiver Genvarianten

  • 3.4.1 Transfektion humaner Endothelzellen mit dem Transfektionsreagenz Superfect

  • 3.4.2 Transfektion von CHO-3E10-Zellen mit dem Transfektionsreagenz Effectene

• 3.5 GFP-assoziierte selektive durchflusszytometrische Messung

  • 3.5.1 Selektive Bestimmung von intrazellulärem IL-8/CXCL8 in transfizierten Endothelzellen

  • 3.5.2 Selektive Bestimmung der Reporter-Aktivierung in transfizierten CHO-3E10-Zellen

• 3.6 Luziferasebiolumineszenzassay zur Bestimmung der Aktivierung von NF-κB

• 3.7 Selektion stabil transfizierter Zellen

• 3.8 Western-Blot

  • 3.8.1 Proteinextraktion

  • 3.8.2 Konzentrationsbestimmung des Proteins im Lysat

  • 3.8.3 Sodium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

  • 3.8.4 Protein-Blot und Antikörperexposition

  • 3.8.5 Detektion des IRDye800-assoziierten Zielproteins mit dem Odyssey- Scanner

• 3.9 Phasenkontrast-, Fluoreszenz- und Konfokalmikroskopie

  • 3.9.1 Phasenkontrastmikroskopie und Fluoreszenzmikroskopie

  • 3.9.2 Konfokalmikroskopie

4 Ergebnisse

• 4.1 Subklonierung von RhoAN19, Rac1N17 und Cdc42N17

  • 4.1.1 pRhoAN19-IRES-EGFP

  • 4.1.2 pRac1N17-IRES-EGFP

  • 4.1.3 pCdc42N17-IRES-EGFP

• 4.2 Zellmorphologie nach Expression von RhoAN19, Rac1N17, Cdc42N17

  • 4.2.1 Humane mikrovaskuläre Endothelzellen der Linie HPMEC-ST1.6R

  • 4.2.2 Zellen der LPS-reagiblen Reporterlinie CHO-3E10

• 4.3 Überexpression von RhoAN19, Rac1N17, Cdc42N17 und Expression von IL-8/CXCL8 in Endothelzellen der Linie HPMEC-ST1.6R

• 4.4 Überexpression von RhoAN19, Rac1N17, Cdc42N17 und Aktivierung von NF-κB in Endothelzellen der Linie HPMEC-ST1.6R

• 4.5 Überexpression von RhoAN19, Rac1N17, Cdc42N17 und Aktivierung des LPS-reagiblen Reporters in Zellen der Linie CHO-3E10

  • 4.5.1 Die Minderung des LPS-reagiblen Reportersignals ist abhängig vom Ausmaß der Rac1N17-Überexpression

• 4.6 Generation der stabilen Zelllinien CHO-RhoAN19 und CHO-Cdc42N17

  • 4.6.1 Nachweis der Expression von Myc-RhoAN19 und Myc-Cdc42N17

  • 4.6.2 Zytomorphologie der Linien CHO-3E10, CHO-RhoAN19 und CHO-Cdc42N17

5  Diskussion

• 5.1 Methodik der Überexpression inaktiver Mutanten GTP-bindender Proteine

• 5.2 Methoden zur Identifikation der transfizierten Subpopulation

  • 5.2.1 Intrazelluläre IL-8/CXCL8-Messung versus ELISA aus dem Überstand

  • 5.2.2 Andere Reporter der Transfektion bei flusszytometrischer Bestimmung

  • 5.2.3 Detektion GFP-positiver Zellen in den Kanälen Fl-1 bis Fl-4 des Facscalibur

  • 5.2.4 Verhältnis zwischen GFP und Gen von Interesse bei der Überexpression

• 5.3 Zytomorphologie nach Überexpression von RhoAN19, Rac1N17, Cdc42N17

• 5.4 Überexpression von RhoAN19, Rac1N17, Cdc42N17 in humanen Endothelzellen

• 5.5 Überexpression von Rac1N17 und Cdc42N17, aber nicht von RhoAN19 reduziert die Aktivierung von NF-κB in HPMEC-ST1.6R

• 5.6 Überexpression von Rac1N17, Cdc42N17 und von RhoAN19 reduziert die Aktivierung des Reporters in CHO-3E10

  • 5.6.1 Die Reporterexpression in CHO-3E10 zeigt das gleiche quantitative Muster wie die Expression von IL-8/CXCL8 in Endothelzellen

  • 5.6.2 Minderung des Reportersignals mit steigender Überexpression von Rac1N17

• 5.7 Generation der Linien CHO-RhoAN19 und CHO-Cdc42N17

Literaturverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

Danksagung

Erklärung an Eides statt

Abb. 1: LPS-induzierter Signalweg in Endothelzellen

Abb. 2 : Aktivierung von Rho-Proteinen, modifiziert nach [Ridley, 1997]

Abb. 3: Aminosäuresequenzen für RhoA, Rac1 und Cdc42 (Genbank, NCBI) Identische Aminosäuren (AS) sind eingerahmt, RhoA teilt mit Rac1, Cdc42 zu ≈ 45 % gemeinsame AS-Sequenzen, Rac1 und Cdc42 zu ≈ 70 %. Hoch konserviert ist unter anderem der Bereich der inaktivierenden Mutationen RhoAT19N und Rac1/Cdc42T17N, die der inaktivierenden Mutation RasS17N entsprechen. Darstellung der Sequenzen mit SeqVu Alignment Software (Garvan Institute of Medical Research).

Abb. 4 : Transkription von IL-8/CXCL8 modifiziert nach [Wu, et al., 1997]

Abb. 5: Subklonierung der inaktiven Mutanten in pIRES2-EGFP

Abb. 6: Vektorkarte pRhoAN19-IRES-EGFP

Abb. 7: Vektorkarte pRac1N17-IRES-EGFP

Abb. 8: Vektorkarte pCdc42N17-IRES-EGFP

Abbildung 9: Endothelzellen der Linie HPMEC-ST1.6R 24 Stunden nach Transfektion

Abbildung 10: Zellen der Linie CHO-3E10 24h nach Transfektion

Abb. 11: Gating der transfizierten Endothelzellen anhand ihrer GFP- bedingten Fluoreszenz in Fl-1

Abb. 12: Fluoreszenz GFP-transfizierter Zellen in den einzelnen Kanälen

Abb. 13: Histogrammdarstellung der für IL-8/CXCL8 repräsentativen in Fl-4 gemessenen Fluoreszenzwerte

Abb. 14: Expression von IL-8/CXCL8 in humanen mikrovaskulären Endothelzellen

Abb. 15: Aktivierung von NF-κB in humanen mikrovaskulären Endothelzellen

Abb. 16: Gating der transfizierten CHO-3E10-Zellen anhand des EGFP

Abb. 17: Histogrammdarstellung der für den LPS-reagiblen Reporter CD25 repräsentativen Fluoreszenzwerte

Abb. 18: Expression von CD25 als LPS-reagiblem Reporter in Zellen der Linie CHO-3E10

Abb. 19: Änderung des Reportersignals in Abhängigkeit der Stärke der Überexpression

Abb. 20: Abfall des Reportersignals für drei Populationen steigender Überexpression von Rac1N17

Abb. 21: Western-Blot zum Nachweis der Myc-markierten Proteine RhoAN19 und Cdc42N17 in den Linien CHO-RhoAN19 und CHO-Cdc42N17

Abb. 22 : CHO-Phasenkontrastmikroskopie

Abb. 23 : CHO-Fluoreszenzmikroskopie

Abb. 24: CHO-Konfokalmikroskopie