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Anhang A. Anhang: Probleme durch die Tangentialflow-Filtration für die Fettsäureanalytik von Seston

Die Tangentialflow-Filtration ist eine häufig eingesetzte Methode zur Anreicherung feinster Partikel in Flüssigkeiten. Ihr Vorteil liegt in der sehr schonenden Art mit der Suspensionen auf kleine Volumina eingeengt werden können. Durch relativ große Filterflächen kann die Zeit für die Filtration kurz gehalten werden. Für die Sestonfiltration aus dem GV war lediglich ein Druck von < 0,1 bar erforderlich. Dieses sind eigentlich günstige Konditionen, die den Einsatz der Tangentialflow-Filtration zur Anreicherung von Seston für die Fettsäureanalytik als geeignet erscheinen lassen.

Jedoch sind es die chemischen Eigenschaften der Kunststoffe, aus der die Filtrationsapparatur besteht und mit denen die Sestonpartikel zwangsläufig in Berührung kommen, die diese Art der Partikelanreicherung dann doch als unzweckmäßig erscheinen lassen. Die Kunststoffe geben Phthalate (Weichmacher) ab. Phthalate sind Ester bzw. Salze der Phthalsäure und sind hydrophob. Diese Phthalate assoziieren offenbar an Sestonpartikel. Die Sestonpartikel kommen während des Filtrationsvorgangs immer wieder mit dem Kunststoff in Berührung, währenddessen sie mit Phthalaten kontaminiert werden können.

Die Sestonproben aus dem GV wurden 1998 vom 14.5.-30.7. durch Tangentialflow-Filtration (Pellicon HMVP, Millipore, Eschborn) eingeengt. Dazu wurden 20 l vorfiltriertes Seewasser auf ein Volumen von ca. 250 ml eingeengt, indem sich sämtliche Partikel > 0,45 µm befanden. Das Retentat wurde der Filtrationsanlage entnommen. Um eventuell in Filter und Schlauchsystem zurückgehaltene Sestonpartikel vollständig zu entnehmen, wurde die Anlage je einmal mit 1 l und 2 l Filtrat gespült. Das Retentat und das "Spülwasser" wurden vollständig über Glasfaserfilter (GMF 5) filtriert.

Die Fettsäuren der Sestonprobe vom 18.6.98 wurde wurden unter anderem einer Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS)-Analyse unterzogen. Die Analyse wurde von Dr. Eric von Elert (Limnologisches Institut, Universität Konstanz) durchgeführt. Dabei ergab sich, dass einige, z. T. sehr große Peaks keine Fettsäuren sondern Phthalate waren. Dies war umso aufschlussreicher, als dass ein Phthalat zeitgleich mit der Fettsäure 20:33 eluierte. Die anderen gefundenen Phthalate eluierten mit zu den Fettsäuren verschiedenen Retentionszeiten, so dass sie bei der Identifizierung und Quantifizierung der Fettsäurepeaks nicht störten.

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Abb. a1: Chromatogramme der Fettssäuremethylester vom Seston (< 30 µm) im Großen Vätersee am 12.5.99. mit (a) und ohne (b) Tangentialflow-Filtration; IS: interner Standard (23:0); Pfeile: Phthalat-Peaks.

Im Jahr 1999 wurden sechs Vergleichsmessungen zwischen durch Tangentialflow-Filtration und nur durch "Glasfaser"-Filtration aufbereitetes Seston durchgeführt. Mit dem Ergebnis, dass die beiden größten der durch die GC-MS-Analyse identifizierten Phthalat-Peaks nur in den Fettsäureproben eluierten, die mit Hilfe der Tangentialflow-Filtration aufbereitet wurden. Das war in allen Vergleichsmessungen der Fall. Exemplarisch sind die beiden Chromato

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Abb. a2: Clusteranalyse der Seston-Fettsäuremuster aus dem Großen Vätersee von 1999. Die mit * gekennzeichneten Termine sind die mit Tangentialflow-Filtration angereicherten Proben. Die Termine der nur über Glasfaserfilter angereicherten Proben sind nicht gekennzeichnet.

Die Tangentialflow-Filtrationsanlage ist offenbar die Quelle der störenden Phthalate. Diese Phthalate werden nur langsam abgegeben, wodurch sich das Problem nicht zeitlich begrenzen lässt. Die Hauptquelle der Phthalate dürften die sehr flexiblen und deshalb mit entsprechenden Weichmachern versehenen Pump- und Verbindungsschläuche (Silikon, Masterflex^®) sein, durch die das sestonhaltige Seewasser beständig zirkuliert. Da es zu diesem Material keine Alternativen gibt, lässt sich die Phthalatquelle nicht beseitigen. Aufgrund ihrer lipophilen Eigenschaften ist zu erwarten, dass auch die Analyse anderer Lipide als die Fettsäuren durch die Phthalate gestört werden dürfte. Da nur mit diesem Schlauchtyp gearbeitet

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Den Vergleichsmessungen von 1999 zufolge konnte lediglich die Herkunft zweier Phthalate der Tangentialflow-Filtrationsanlage zugeschrieben werden. Die anderen, weitaus kleineren, Phthalat-Peaks der GC-MS-Analyse sind offenbar anderer Herkunft. Sie sind schon im Freiland vorhanden und/oder rühren von den Probenentnahme- oder Transportgefäßen her, mit denen das Wasser vom See ins Labor gebracht wurde. Im Labor kamen die Proben, wenn sie nicht über Tangentialflow-Filtration angereichert wurden, nur bei einem Arbeitsschritt mit Kunststoff in Berührung. Ansonsten kamen im Labor nur Glasbehältnisse zu Einsatz.

Auch wenn es kaum praktikabel ist, sollte man versuchen von der Probenentnahme bis zur Analyse auf Kunststoffe als Behälter und Transportmedium zu verzichten.

Durch den Arbeitsschritt Tangentialflow-Filtration kam es zu keinem wesentlichen Substanzverlust und mit Ausnahme der Fettsäure 20:33 konnte keine Beeinflussung des Fettsäuremusters festgestellt werden. Außer der Anreicherung der Sestonpartikel mit Phthalaten blieben Qualität und Quantität der Proben, soweit feststellbar, von dieser Art der Filtration unberührt.

Damit scheint die Tangentialflow-Filtration eine geeignete Methode zur Partikelanreicherung zu sein, jedoch nicht, wenn die Lipide dieser Partikel Untersuchungsgegenstand sind.

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