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1  Einleitung

1.1 Proteinabbau im Ubiquitin- Proteasom- System

Das Überleben eukaryonter Zellen ist entscheidend vom unverzüglichen Abbau kurzlebiger Proteine abhängig, die in Bereichen wie der Transkription, der Zelldifferenzierung, der Zellzykluskontrolle oder der DNA Fehlerkorrektur zum Einsatz kommen. Auch Proteine, die fehlerhaft sind, müssen erkannt und beseitigt werden. Eine effiziente Vernichtung einer Vielzahl von Proteinen ist ebenfalls wichtig, sobald die Zelle Stresssituationen ausgesetzt ist oder die fehlgesteuerte Proteinproduktion bei der Krebsentstehung bzw. bei viralen Infektionen bekämpfen muss. In höheren Eukaryonten stellt hierbei die Generierung von Antigenen, die an der Zelloberfläche von MHC I (major histocompatibility complex) Molekülen präsentiert werden können, eine wichtige Immunreaktion dar. Nahezu alle diese Aufgaben werden in eukaryonten Zellen ATP abhängig durch einen Multi- Proteinkomplex von ca. 2,5 MDa - das 26S Proteasom - ausgeführt (Ciechanover, 1998).

26S Proteasomen erkennen ubiquitinierte Proteine und zerlegen sie in Peptide einer Länge von 3-22 Aminosäuren (Kisselev et al., 1999). Funktionell und strukturell bestehen sie aus zwei Subkomplexen: dem proteolytisch aktiven, zylinderförmigen 20S Kernpartikel sowie den an einem oder beiden Enden des 20S gebundenen 19S Regulatorkomplexes. Das 20S Proteasom alleine ist lediglich in der Lage, kurze Peptide zu spalten, während den regulatorischen Partikeln die Aufgaben der Erkennung ubiquitinierter Proteine, der Proteinentfaltung, der Abspaltung des Ubiquitinrestes sowie der Übertragung des Polypeptids in das 20S Proteasom zukommen. Für die effiziente Funktion des 19S regulatorischen Partikels sowie für die Zusammenarbeit mit dem 20S Proteasom wird ATP verbraucht (Hershko et al., 1984). Biochemisch kann der Regulatorkomplex in zwei Subkomplexe aufgetrennt werden, die als 19S Base sowie 19S Lid Komplex bezeichnet werden (Glickman et al., 1998a; Saeki et al., 2000).

Die rechtzeitige, substratspezifische Beseitigung von Proteinen bedarf einer hochentwickelten Kontrolle, die im Ubiquitin- Proteasom- System gewährleistet wird. Verschiedene Enzyme sind für die Erkennung des entsprechenden Proteins und dessen Markierung mit kovalent gebundenen Ketten von Ubiquitinresten verantwortlich. Diese Ubiquitinreste dienen anschließend dem Proteasom als Degradationssignal für das markierte Protein. Ubiquitin ist genau wie das Proteasom in Eukaryonten evolutionär hochkonserviert. Das 8,6 kDa Saccharomyces cerevisiae Protein besteht aus 76 Aminosäuren und unterscheidet sich nur in drei Aminosäuren vom humanem Ubiquitin (Özkaynak et al., 1989). Für die Konjugation an das entsprechende Substrat, muss Ubiquitin zunächst ATP abhängig aktiviert werden, indem es mit dem Ubiquitin aktivierenden Enzym (E1; UBA- ubiquitin activating enzyme) ein energiereiches Thiolester- Intermediat bildet. Dieses wird auf ein Ubiquitin konjugierendes Enzym (E2; UBC- ubiquitin conjugating enzyme) übertragen, das den aktivierten Ubiquitinrest unter [Seite 7↓]Anwesenheit einer, das Substrat bindenden Ubiquitin Ligase (E3) auf das zu degradierende Protein transferiert (Hershko & Ciechanover, 1998).

In S. cerevisiae sind bisher zwei UBA Enzyme (UBA1, UBA2), 15 UBCs und ca. 60 E3- Ligasen bekannt (von Arnim, 2001). Die E3 Ligasen nehmen als die größte, stetig wachsende Proteinfamilie in diesem System eine Schlüsselposition ein, indem sie die zu degradierenden Proteine erkennen und den Abbau einleiten. Als Ubiquitinierungssignale dienen den E3 Ligasen einzelne N- terminale Aminosäuren (N-end rule degron; Bachmair & Varshavsky, 1989), kurze Sequenzen wie die destruction box in Cyclinen oder stark hydrophobe Bereiche, die als Membrananker dienen oder im Molekülinneren globulärer Proteine vorkommen (Gilon et al., 1998). Aufgrund struktureller oder funktioneller Ähnlichkeit können die E3 Ligasen in 6 Subtypen unterteilt werden:

und einem SCF ähnlichen Komplex, der das von Hippel- Lindau Tumorsuppressor Protein (pVHL) beinhaltet (zusammengefasst in Ciechanover et al., 2000).

Wenn das zu degradierende Protein durch die E3 Ligase erkannt ist, überträgt die entsprechende E2 den ersten Ubiquitinrest, indem eine Peptidbindung des C- terminalen Glycins (G76) von Ubiquitin entweder an die ε- NH2 Gruppe eines substrateigenen Lysins oder in einigen Fällen auch an die α-NH2 Gruppe des Substrats geknüpft wird (Hershko & Ciechanover, 1998; Breitschopf et al., 1998). Da 19S regulatorische Partikel für die effiziente Erkennung der Ubiquitinmarkierung eine Kette von mindestens vier und für den effizienten Abbau des Substrats mehr als fünf Ubiquitinreste benötigen, werden anschließend weitere Ubiquitinreste, meist bereits in Kettenform, durch Lysin 48- G76 Isopeptidbindungen übertragen (Thrower et al., 2000; Chau et al., 1989).

Bisher sind zwei Untereinheiten des 26S Proteasoms bekannt, die Polyubiquitinketten binden können: Rpn10/ S5a und Rpt5/ S6´ (Deveraux et al., 1994; van Nocker et al., 1996; Lam et al., 2002). S. cerevisiae Rpn10 und humanes S5a interagieren mittels einem bzw. zwei Ubiquitin- interagierenden Motiven (UIM) im C- terminalen bzw. mittleren Bereich des Proteins mit Polyubiquitin (Hofmann & Falquet, 2001). Allerdings ist weder Rpn10 noch sind dessen Homologe in S. pombe oder der Moos Art Physcomitrella patens essentiell (van Nocker et al., 1996; Girod et al., 1999; Wilkinson et al., 2000). Die Tatsache, dass die Rpn10 Deletion in verschiedenen genetischen Hintergründen [Seite 8↓]synthetisch lethal ist, führte zu dem Vorschlag, dass mehrere proteasomale Untereinheiten bei der Bindung der ubiqutinierten Substrate kooperieren (Fu et al., 1998). Rpt5 als potentielle, unterstützende Untereinheit ist zwar eine essentielle 26S Untereinheit, besitzt jedoch keine UIM und bindet die Ubiquitinketten nicht so stark, dass sie mit dem 26S Proteasom im Glyceroldichtegradienten cosedimentieren (Lam et al., 2002). Mit Rad23/ Rhp23 und Dsk2/ Dph1 wurden zwei Adapterproteine gefunden, die in der Lage sind, mit ihrer UBA (ubiquitin pathway associated) Domäne Ubiquitinreste und mit ihrer UBL (ubiquitin like) Domäne die Rpn1 Untereinheit des 26S Proteasoms zu binden (Elsasser et al., 2002). Ubiquitin Ligasen binden ebenfalls transient an das 26S Proteasom, wie Xie und Varshavsky (2000) für Ubr1 und Ufd4 (binden Rpn2, Rpt1 und Rpt6) zeigen konnten, oder copräzipitieren wie Untereinheiten des APC Ubiquitin Ligase Komplex und des SCF Protein Ligase Komplex mit dem 19S Regulator Komplex (Verma et al., 2000). Weitere Möglichkeiten, dem 26S Proteasom Substrate zuzuliefern, sind in Abb. 1 dargestellt.

Über die zeitliche Reihenfolge der nach der Substraterkennung durch das 26S Proteasom erforderlichen Abbauschritte sowie über die für Proteinerkennung und -abbau erforderlichen, strukturellen Umlagerungen im 26S Proteasomen, ist bisher nur sehr wenig bekannt. Es wurde jedoch gezeigt, dass der effiziente Abbau von Proteinen von der Integrität des gesamten Komplexes abhängig ist (Glickman et al., 1998a). Peptide werden bereits vom 20S Proteasom abgebaut. Diese Aktivität kann aber durch Assoziation des 20S Proteasoms mit dem 19S Base oder mit dem gesamten Regulatorkomplexes erheblich gesteigert werden (Glickman et al., 1998a). Dies geschieht vermutlich, indem die ATPase Untereinheit Rpt2 im 19S Base den Translokationskanal in das 20S Proteasom öffnet und den Zugang der Substrate zu den proteolytischen Untereinheiten erleichtert (Köhler et al., 2001). Da die von den α Untereinheiten gebildete hydrophobe, axiale Öffnung des 20S Proteasoms nur einen Durchmesser von ca. 13 Å hat, muss das zu degradierende Protein vor der Translokation entfaltet werden (Lowe et al., 1995). Diese Aufgabe wird den sechs AAA (ATPases associated with various cellular activities) ATPasen im 19S Base aufgrund von Homologien zu anderen ATPase Komplexen dieser Familie zugeschrieben (Rubin et al., 1998). Alle ATPase Komplexe dieser Familie besitzen hochkonservierte AAA Domänen, die eine Nukleotid abhängige Konformationsänderung der ATPasen induzieren können. Diese Konformationsänderung wirkt sich so auf das gebundene Substrat aus, dass Polypeptide entfaltet werden, Protein- Protein Interaktionen zerstört werden oder eine gerichtete Bewegung ausgeführt werden kann (Vale, 2000). Ein Hinweis darauf, dass die proteasomalen ATPasen Faltungszustände eines Proteins verändern können, stammt aus der Arbeit von Braun et al. (1999), die zeigt, dass sowohl der 19S Base als auch das 26S Proteasom in vitro in der Lage sind, ungefaltete Citratsynthase zu binden und zu reaktivieren.


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Abb. 1: Proteinabbau im Ubiquitin Proteasomen System. Ubiquitin wird durch das Ubiquitin aktivierende Enzym E1 (UBA) aktiviert und auf das Ubiquitin konjugierende Enzym E2 (UBC) übertragen. Von der E2 kann Ubiquitin direkt auf das Substrat übertragen werden, dass an eine Ubiquitin Ligase E3 gebunden ist (Möglichkeit A). Dies geschieht, wenn die E3 Ligase zu der Familie der Ring Finger E3 Ligasen gehört. Enthält die E3 Ligase eine HECT Domäne, wird das aktivierte Ubiquitin zunächst auf die E3 Ligase übertragen, um anschließend mit dem Substrat verknüpft zu werden (Möglichkeit B). Weitere Ubiquitinreste werden an den ersten Ubiquitinrest konjugiert. Die Polyubiquitinkette wird spezifisch von proteasomalen Untereinheiten (Rpn10, Rpt5) sowie von mit dem Proteasomen assoziierten Proteinen (Rad23, Dsk2) erkannt. Das Substrat wird entfaltet und zu kurzen Peptiden degradiert. Wiederverwendbares Ubiquitin wird durch die Aktivität verschiedener deubiquitinierender Proteine freigesetzt. Die Anzahl der in S. cerevisiae bekannten E1, E2 und E3 Enzyme ist angegeben. Alternativ zur Ubiquitinerkennung durch o.g. Proteine kann das ubiquitinierte Substrat durch Cdc48/VCP(valosin containing protein), durch E3 Ligasen (z.B. APC Komplex) oder durch Bag1 (Bcl2 associated athanogene) gekoppeltes Hsp70 direkt an das Proteasomen weitergeleitet werden. Die Ornithin Decarboxylase (ODC) wird Ubiquitin unabhängig durch das Proteasomen erkannt und degradiert. Abbildung nach Ciechanover und Brundin, 2003 sowie Hartmann-Petersen et al., 2003.

Da der Abbau der strukturell sehr stabilen Ubiquitinmarkierung zusammen mit dem zur Degradation gekennzeichneten Protein energetisch verschwenderisch wäre, stellt die Abspaltung bzw. Monomerisierung dieser Markierung eine weitere, essentielle Funktion des 19S Regulators dar. Auch hier sind bereits mehrere deubiquitinierende Enzyme gefunden, die integraler oder peripherer Bestandteil des 26S Proteasoms sind. Fast allen ist zu eigen, dass sie spezifisch die Amidbindung nach dem C- terminalen G76 von Ubiquitin und damit die Peptidbindung zwischen Ubiquitin und Substrat spalten. Die substöchiometrisch mit dem Proteasom interagierenden Proteine Doa4 und Ubp6 besitzen beide eine deubiquitinierende Cysteinprotease- Aktivität. Zellen in denen Doa4 mutiert ist, reichern kurze ubiquitinierte Peptide an und Deletionsstämme von Ubp6 zeigen einen erhöhten Ubiquitinumsatz, da der Ubiquitinrest zusammen mit dem Substrat abgebaut wird (Papa et al., 1999; Leggett et al., 2002). Im Zusammenspiel von Ubp6 mit [Seite 10↓]Rpn11, einer essentiellen Untereinheit des 19S Komplexes, entwickelt sich die volle deubiquitinierende Aktivität des Regulators (Guterman & Glickman, 2004). Im Unterschied zu den bisher beschriebenen Cysteinproteasen handelt es sich bei Rpn11 um eine Zink Metalloprotease, die lediglich im 19S bzw. 26S Komplex eingebunden, nicht aber isoliert, aktiv ist (Yao & Cohen 2002, Verma et al., 2002).

1.2 Aufbau des 20S Proteasoms sowie des 19S regulatorischen Komplexes

Die Struktur des S. cerevisiae 20S Proteasoms wurde mit Hilfe der Röntgenkristallographie in einer Auflösung von 2,4 Å aufgeklärt (Groll et al., 1997). Es besteht -C2 symmetrisch aufgebaut- aus zweimal 14 Untereinheiten mit Massen von 21- 31 kDa, die als heptamere Ringe α1-7 β1-7 β1-7 α1-7 übereinander angeordnet sind und im Inneren des zylinderförmigen Gebildes insgesamt drei Kavitäten bilden (siehe Abb. 2A und B). Die α Untereinheiten bilden die äußeren Ringe und verschließen mit ihren N-Termini das 20S Proteasom, solange kein weiterer Faktor wie zum Beispiel der 19S regulatorische Komplex gebunden wird. Durch die Bindung der ATPase Untereinheit Rpt2 des 19S Komplexes an den N-Terminus von α3 kann der Translokationskanal in das 20S Proteasom geöffnet werden (Köhler et al., 2001). Zwischen den Ringen der β Untereinheiten befindet sich die zentrale Kavität von 5 nm Durchmesser, in der jeweils zwei proteolytisch aktive β1, β2 und β5 Untereinheiten lokalisiert sind. Das katalytisch aktive Threonin dieser β Untereinheiten (Gruppe der N- terminal nukleophilen- Hydrolasen) kann im Prinzip Peptidbindungen nach jeder Aminosäure spalten. Aufgrund der unterschiedlichen lokalen Strukturumgebung der aktiven Untereinheiten werden jedoch Schnitte nach bestimmten Aminosäuren bevorzugt (Groll & Huber, 2003). Die β1 Untereinheit schneidet präferenziell nach sauren Aminosäuren (peptidyl glutamyl peptid hydrolyzing [PGPH] Aktivität), β2 nach basischen Aminosäuren (Trypsin ähnliche Aktivität) und β5 nach hydrophoben Aminosäuren (Chymotrypsin ähnliche Aktivität) (Orlowski, 1990; Heinemeyer et al., 1994). In Mammalia werden Proteasomen, die diese drei konstitutiven Untereinheiten tragen, nach Induktion mit dem Zytokin γ Interferon gegen Proteasomen, die die nicht essentiellen, katalytischen Immunountereinheiten β1i, β2i und β5i (LMP2, MECL-1, LMP7) tragen, ausgetauscht (Frentzel et al., 1994). Die Anwesenheit der sogenannten Immunoproteasomen nach Interferon γ Induktion führt zu einer effizienteren Präsentation der generierten Peptide an der Zelloberfläche durch MHC Klasse I Rezeptoren. Diese Präsentation intrazellulärer Antigene stellt eine essentielle Funktion des Immunsystems dar (zusammengefaßt in Kloetzel 2001).


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Abb. 2 : Struktur des 20S Proteasoms aus S. cerevisiae als sphärisches Modell (A) und als GRASP (graphical representation and analysis of structural properties) Modell (B)mit Kennzeichnung der Lage der katalytischen β Untereinheiten (Groll et al., 1997)

Aufgereinigte Proteasomen bestehen immer aus einer Mischung von freien 20S Partikeln und mit einem (RP1CP) oder zwei regulatorischen Partikeln (RP2CP) komplexiertem 20S (Glickman et al., 1998b). In vivo dagegen scheinen Proteasomen mit gleicher Stöchiometrie von 20S und 19S Untereinheiten und ca. 15000- 30000 Molekülen/ Zelle oder ca. 1% des Gesamtproteins vor allem als RP2CP Form vorzuliegen (Russell et al., 1999). Strukturell ist der 19S Komplex (in Säugetieren PA700 und in D. melanogaster µ Partikel genannt) sehr schlecht untersucht. Dreidimensionale Rekonstruktionen elektronenmikroskopischer Aufnahmen von D. melanogaster 19S zeigen, dass es sich um einen ca. 20 x 45 nm großen, asymmetrischen Komplex handelt, der hochbeweglich zu sein scheint (siehe Abb.4 A; Walz et al., 1998). Der 19S besteht aus mindestens 17 verschiedenen Untereinheiten mit Massen von 30 bis 110 kDa und einer Gesamtmasse von ca. 1 MDa (Glickman et al., 1998b). Unter Salzeinwirkung zerfällt der 19S Komplex in den 19S Base Subkomplex, bestehend aus sechs ATPasen (Rpt1-6) und zwei nicht ATPase Untereinheiten (Rpn1, Rpn2), sowie den 19S Lid Subkomplex, bestehend aus den Untereinheiten Rpn3 und Rpn5 – Rpn12 (Saeki et al., 2000). Die Zuordnung von Rpn10 zu einem der beiden 19S Subkomplexen ist dabei uneindeutig. Untersuchungen in ΔRpn10 Stämmen haben ergeben, dass 19S regulatorische Partikel in Abwesenheit von Rpn10 leicht in 19S Lid und Base dissoziieren, so dass Rpn10 vermutlich an der Verbindungsstelle zwischen Base und Lid lokalisiert ist (Glickman et al., 1998a). Aufgereinigte, native 19S Lid Subkomplexe enthalten allerdings in den meisten Präparationen kein Rpn10 (Glickman et al., 1998a; Braun et al., 1999; Hoelzl et al., 2000).

Die im 19S Base lokalisierten AAA ATPasen gehören zu der Familie der Walker ATPasen, deren unveränderbarer Lysinrest im Walker A Motiv mit der Phosphatgruppe des ATPs interagiert (Walker et al., 1982). Sie sind vermutlich ringförmig angeordnet und lagern sich im Kontakt mit dem 20S Proteasom an die α Untereinheiten an. Alle sechs ATPasen sind essentiell, funktionell nicht redundant und mit 66- 76% Sequenzidentität zwischen S. cerevisiae und humanen Varianten evolutionär stark konserviert (Ghislain et al., 1993; Rubin et al., 1998; Glickman et al., 1998b). In Übereinstimmung mit der [Seite 12↓]beobachteten Sensitivität gegenüber Mutationen im ATP bindenden Motiv von Rpt2/Yta5 und Rpt5, konnten für diese Untereinheiten die essentiellen Funktionen des „gatings“ (Öffnen des 20S Translokationskanals) und des Bindens von Multiubiquitinketten nachgewiesen werden (Köhler et al., 2001; Lam et al., 2002). Des weiteren gibt es Hinweise darauf, dass die ATPasen des 19S Komplexes unabhängig vom Proteasom in vitro und in vivo an den aktivierten Promotorbereich sowie die DNA des GAL1 Gens binden können und für eine effiziente Transkriptionselongation durch die RNA II Polymerase benötigt werden (Ferdous et al., 2001; Gonzalez et al., 2002). Mittels der Bindung dieses APIS Komplex (AAA proteins independent of 20S: AAA Proteine unabhängig vom 20S) an die DNA könnte in Analogie zu den Hsp100 Chaperon ATPasen aus Bakterien die Energieversorgung der Transkriptionsmaschinerie gesichert werden.

Rpn1/Hrd2/S2 und Rpn2/Sen3/S1, die beiden nicht zu den ATPasen zählenden Untereinheiten des 19S Base, sind mit Molekulargewichten von 110 bzw. 104 kDa die beiden größten Untereinheiten des 19S Regulators. Sie besitzen ca. 20% Sequenzidentität zueinander und 40% Identität zu ihren humanen Homologen. Je nach genetischem Hintergrund sind Deletionen der Gene als lethal oder nicht lethal beschrieben worden (Yokota et al., 1996; Glickman et al., 1998b; DeMarini et al., 1995). Beide Untereinheiten enthalten mehrere sich wiederholende Leucin reiche Sequenzen (LRR: leucin rich repeat), die als Protein – Protein Interaktionsdomänen vorgeschlagen worden sind (Lupas et al., 1997). Für Rpn1 konnte auch gezeigt werden, dass es über seine Leucin reichen Sequenzen die Ubiquitin ähnlichen Domänen von Dsk2 und Rad23 zu binden vermag (Elsasser et al., 2002). Des weiteren sind die LRR Bestandteile eines von Kajava (2002) definierten Sequenzmotivs, das in verschiedenen proteasomalen und cyclosomalen Untereinheiten gefunden wurde (PC Motiv) und dessen Wiederholungen Rpn1 und Rpn2 in der Strukturvorhersage eine α helicale, torroidartige Struktur geben. In systematischen Ansätzen, die die Interaktionen des Hefe Proteoms zu entschlüsseln versuchen, präzipitieren Rpn1 und Rpn2 mit den 19S regulatorischen Untereinheiten (Ho et al., 2002; Gavin et al., 2002) wie Rpt1 auch mit 3,4- 3,9% aller anderen untersuchten Komplexe und gelten somit als kontaminierende Proteine (Gavin et al., 2002). Diese Interaktionen mit einer Vielzahl von Komplexen spiegeln jedoch möglicherweise nur die große Bedeutung des 19S Base Subkomplex in der Erkennung und Entfaltung von proteasomalen Substraten wieder.


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Abb. 3 : (A) Struktur des 26S Proteasoms von Drosophila melanogaster Embryonen. Abgebildet ist die aus elektronenmikroskopischen Aufnahmen erhaltene Dichteverteilung. Um die wackelnde Bewegung des 19S regulatorischen Komplex auf dem 20S Proteasom zu verdeutlichen, sind Extremstadien gewählt (farbig und grau), aus denen die 5° Rotation an der Berührungsfläche zwischen 19S und 20S ersichtlich wird (Walz et al., 1998). Strukturen des 19S Komplexes sind weiß umrandet. (B)Schematische Darstellung des 19S regulatorischen Komplex mit interagierenden Proteinen. 19S Base Untereinheiten sind in grün, 19S Lid Untereinheiten in orange und interagierende Proteine in gelb dargestellt. Protein- Protein Interaktionen sind durch schwarze Verbindungslinien gekennzeichnet. Proteine, die mit dem 19S Komplex interagieren und deren Interaktionspartner unbekannt sind, sind ohne Verbindungslinie dargestellt. Zahlen kennzeichnen die Veröffentlichungen, in denen die Interaktionen beschrieben sind: (1) Wilkinson et al., 1997; (2) Elsasser et al., 2002; (3) Xie und Varshavsky 2000 sowie 2002; (4) Yen et al., 2003a; (5) Tone et al., 2000; (6) Leggett et al., 2002; (7) Dunand- Sauthier et al., 2002; (8) Papa et al., 1999; (9) Kleijnen et al., 2000; (10) Richmond et al., 1997; (11) Verma et al., 2000 (12) Tabb et al., 2000; (13) Hori et al., 1998; (14) Uetz et al., 2000; (15) Kaiser et al., 1999; (16) Fujimuro et al., 1998

Rpn10/S5a stabilisiert mit dem N- terminalen Bereich (AS 1-61) die Verbindung zwischen 19S Lid und Base (Glickman et al., 1998a), während der Bereich von AS 200- 230 in S. cerevisiae bis H. sapiens mindestens eine konservierte Ubiquitin bindende Domäne (UIM) beherbergt (Voges et al., 1999). Rpn10 ist in S. cerevisiae nicht essentiell (van Nocker et al., 1996). D. melanogaster sowie S. cerevisiae Rpn10 wurden in bedeutsamen Mengen in freier monomerer Form gefunden, so dass es möglicherweise nur transient an das 26S Proteasom bindet und ihm ubiquitinierte Substrate zuliefert (Haracska und Udvardy, 1995; van Nocker et al., 1996).

Der 19S Lid Komplex ist essentiell für den Abbau ubiquitinierter Proteine durch das 26S Proteasom (Glickman et al., 1998a). Bislang konnte jedoch nur einer Untereinheit dieses Subkomplexes eine Funktion zugeordnet werden: die von S. cerevisiae zu humanen [Seite 14↓]Varianten hoch konservierte (66% Sequenzidentität) Untereinheit Rpn11 besitzt im proteasomalen Kontext eine deubiquitinierende Metalloproteaseaktivität (Yao & Cohen, 2002; Maytal- Kivity et al., 2002; Verma et al., 2002). Das für die Isopeptidase Aktivität verantwortliche JAMM (von Jab1/ MPN Domänen assoziiertes Metalloisopeptidase) Motiv EXnHXHX10D beherbergt Histidin Reste, die unter Zusammenarbeit mit Aspartat ein Zink Ionen binden, das zusammen mit dem Glutamat das katalytische Zentrum der Metalloisopeptidase bildet. Interessanterweise tritt diese ATP abhängige Aktivität unter Verwendung von ubiquitiniertem Sic1 als Substrat lediglich bei Anwesenheit vollständig assemblierter 26S Proteasomen auf (Verma et al., 2002), nicht aber bei Anwesenheit von rekombinantem Rpn11 oder dem 19S Lid Komplex alleine. Deshalb wird vermutet, dass andere 19S Lid Untereinheiten bei der Abtrennung der Ubiquitinkette vom Substrat mit Rpn11 kooperieren müssen.

Der Lid Komplex besteht aus acht Untereinheiten, die als Subkomplex vom 26S Proteasom abgelöst und auch wieder angelagert werden können (Glickman et al., 1998a). Alle acht Untereinheiten besitzen eins von zwei strukturellen Motiven, die auch in anderen Multiproteinkomplexen gefunden worden sind (Hofmann & Bucher 1998):

Rpn3, Rpn5-7, Rpn9 und Rpn12 tragen das bis zu 200 Aminosäuren lange PCI Motiv im C- terminalen Bereich, das in den jeweiligen Proteinen für Interaktionen innerhalb des 19S Lids verantwortlich ist (Fu et al., 2001). Rpn8 und Rpn11 tragen das ca. 140 Aminosäuren lange MPN Motiv in ihren N- terminalen Bereichen (Glickman et al., 1998a), das vermutlich die Interaktion zwischen diesen beiden Proteinen vermittelt und in Rpn11 das JAMM Motiv beherbergt. Die Ähnlichkeiten zwischen dem 19S Lid Komplex und dem COP9 Signalosomen bzw. dem eIF3 Komplex gehen soweit, dass Sequenzhomologien zwischen allen acht COP9 Signalosomen sowie drei eIF3 Komplex Untereinheiten zu bestimmten 19S Untereinheiten bestehen (zusammengefasst in Voges et al., 1999). Auch funktionell besteht zwischen dem 19S Lid Komplex und dem COP9 Signalosomen, das im wesentlichen für die Phosphorylierung verschiedener regulatorischer Proteine verantwortlich ist und als negativer Regulator der SCF (E3) Ubiquitin Ligase beschrieben ist, eine Ähnlichkeit. Die COP9 Signalosomen Untereinheit Csn5 forciert die Abspaltung der Ubiquitin ähnlichen Markierung Nedd8 von den Cullin Untereinheiten des SCF Komplexes mit Hilfe des JAMM Motivs seiner MPN Domäne (Cope et al., 2002). Nur Rpn12 scheint kein homologes Protein in anderen Multiproteinkomplexen zu besitzen. Aufgrund dessen und aufgrund der gezeigten Interaktion mit Rpn2, könnte dieses Protein die Verbindung zwischen 19S Lid und 19S Base stabilisieren (Yokota et al.,1996). Rpn12 wurde ursprünglich als Protein beschrieben, das die nukleäre Integrität aufrechterhält und für die Aktivierung der Cdc28 Kinase notwendig ist (Nisogi et al., 1992; Kominami et al., [Seite 15↓]1995). Bis auf Rpn9 sind alle 19S Lid Untereinheiten essentiell (Winzeler et al., 1999; Rpn9: Hori et al., 1998). Die humane, zu Rpn11 sequenzhomologe Untereinheit S12/Rpn8, bietet wie die 19S Base Untereinheiten eine Interaktionsfläche für die Bindung zwischen 19S Partikel und 20S Proteasom (Dubiel et al., 1995).

In Immunpräzipitationen mit 19S Untereinheiten finden sich weitere Proteine, deren Assoziation mit dem 19S Regulator so häufig gefunden wurde, dass eine Unterscheidung in Proteasomen interagierende Proteine (PIP) und proteasomale Untereinheiten nur schwer getroffen werden kann. So schlagen Verma und Mitarbeitende (2000) eine Umbenennung des 17,9 kDa Proteins Daq1 in Rpn13 vor, da dieses Protein stöchiometrisch mit dem 19S Regulator präzipitiert und eine Deletion des entsprechenden Gens in S. cerevisiae zur Anreicherung ubiquitinierter Proteine führt. Das Protein Rpn4 wurde als integraler Bestandteil des Proteasoms postuliert, da es im Glyceroldichtegradienten mit dem 26S Proteasom cofraktioniert, anti Rpn4 Antikörper an aufgereinigtes 26S Proteasom bindet und eine Deletion des entsprechenden Gens in proteasomalen nin1-1 (Rpn12) und ΔRpn10 Mutanten synthetisch lethal ist (Fujimuro et al., 1998). Da die Lebensdauer von Rpn4 sehr viel kürzer ist, als die des 19S Komplexes und gezeigt wurde, dass es vor allem an Transkriptionsprozessen beteiligt ist wird Rpn4 eher als PIP angesehen (Mannhaupt et al., 1999). Die beiden in S. cerevisiae nicht essentiellen Proteine Ubp6 und Nas6 werden ebenfalls oft in Assoziation mit dem 26S Proteasom gefunden, sind aber aufgrund ihres substöchiometrischen Anteils in diesen Präzipitationen als PIPs klassifiziert (Verma et al., 2000). Weitere mit 19S regulatorischen Partikeln interagierende Proteine sind in Abb. 3 B aufgeführt.

1.3  Regulation des Ubiquitin- Proteasom Systems

Das Ubiquitin- Proteasom System bietet der Zelle auf den Ebenen der Ubiquitinierung und der proteasomalen Aktivität verschiedenste regulatorische Eingriffsmöglichkeiten. So kann sowohl die feinabgestimmte Degradation von einzelnen Proteinen als auch eine breite Antwort auf äußere Einflüsse wie z. B. Hitzestress regulatorisch beeinflusst werden. Die Regulation des Abbaus einzelner Proteine geschieht im allgemeinen auf der Ebene der Ubiquitinierung. Dabei wird entweder die Bindung des Substrats an die entsprechende E3 Ligase durch posttranslationale Modifikationen oder strukturelle Veränderungen des Substrats variiert oder die Aktivität des spezifischen E2/E3 Ligase Komplexes moduliert (zusammengefasst in Glickman & Ciechanover, 2002). Der massive Proteinabbau in Folge von äußeren Faktoren, wie oxidativem oder Hitzestress, Hungerbedingungen oder DNA Schädigungen, als auch in höheren Eukaryonten unter pathologischen Bedingungen, wie bei Krebs, schweren Blutvergiftungen oder metabolischer Übersäuerung hat im allgemeinen eine Hochregulierung des gesamten Ubiquitin- Proteasom Systems zur Folge (Lecker et al., 1999). Die konzertierte, transkriptionelle Hochregulierung der entsprechenden Gene dieses Systems wird in S. cerevisiae über das nonamere Proteasomen assoziierte Kontrollelement (proteasome- associated control [Seite 16↓] element; PACE) gesteuert. Es sind 111 Gene bekannt, die innerhalb des Promotorbereichs diese transkriptionsaktivierende PACE Sequenz tragen. Mindestens 30 dieser Gene sind Gene des Ubiquitin- Proteasom Systems (Mannhaupt et al., 1999). Als an diese Sequenz bindender Transkriptionsaktivator, wurde das nicht essentielle Protein Rpn4 identifiziert. Da es sich bei Rpn4 um ein extrem kurzlebiges Protein handelt (t1/2~ 2min), dessen Expression den normalen Expressionslevel der proteasomalen Untereinheiten aufrecht erhält, wurde von Xie und Varshavsky (2001) postuliert, dass die intrazelluläre Proteolyse über einen negativen Feedbackmechanismus durch Rpn4 gesteuert wird: dasselbe Protein, das für die Proteasomensynthese verantwortlich ist, würde vom aktiven Proteasom degradiert werden.

In humanen Zellen sind bisher keine einheitlichen transkriptionellen Regulationselemente für das Ubiquitin- Proteasom System beschrieben. Zur Optimierung der Antigenprozessierung und Präsentation induziert jedoch das Zytokin Interferon γ in humanen Zellen den Austausch aller proteolytisch aktiven, 20S β Untereinheiten gegen die Immunountereinheiten β1i, β2i und β5i sowie den Austausch des 19S Regulators gegen den proteasomalen Aktivatorkomplex PA28 (zusammengefasst in Kloetzel, 2001).

1.4  Biogenese des 26S Proteasoms in S. cerevisiae

Damit funktionelle 26S Proteasomen entstehen, müssen 62 proteasomale Untereinheiten zusammenfinden. Der zeitliche und strukturelle Verlauf dieses Prozesses ist jedoch nur bruchstückhaft bekannt und beschränkt sich im wesentlichen auf die isolierbaren Vorläuferkomplexe des 20S Proteasoms. Da 20S Proteasom und 19S Regulatorkomplex in Zelllysaten in freier Form vorkommen können und unter Inkubation mit ATP wieder zum 26S Proteasom reassoziieren (DeMartino et al., 1996), wird davon ausgegangen, dass diese Subkomplexe stabile Vorläuferkomplexe des Proteasoms darstellen. Die Aktivität gegen fluorogene Peptide dient dabei im allgemeinen zur Unterscheidung zwischen reifen 20S Proteasomen und deren Vorläuferkomplexen. Da fünf der sieben β Untereinheiten als Proprotein synthetisiert werden und deshalb Propeptide tragen, die erst in späten Assemblierungsstadien der 20S Biogenese autokatalytisch prozessiert werden, sind Vorläuferkomplexe des 20S Proteasoms proteolytisch inaktiv (Chen & Hochstrasser, 1996; Schmidtke et al., 1996) .

Die frühsten, aus S. cerevisiae isolierbaren Vorläuferkomplexe des 20S Proteasoms sind die sogenannten „15S precursor Komplexe“ oder halbe Kernpartikel (hCP: half core particle), die vermutlich aus den ringförmig angeordneten α Untereinheiten, den katalytischen, unprozessierten β Untereinheiten sowie dem proteasomalen Maturierungsfaktor Ump1 (ub- mediated proteolysis) bestehen (Chen & Hochstrasser, 1996; Ramos et al., 1998). Anhand der Coimmunpräzipitation von halben Kernpartikeln mit Hilfe des Protein A markierten Ump1 aus S. cerevisiae Lysaten, konnte gezeigt werden, dass diese Komplexe alle 20S proteasomalen Untereinheiten mit Ausnahme von [Seite 17↓]β6 und β7 beherbergen (Lehmann et al., 2002). Im weitern Verlauf der Biogenese lagern sich nach dem Modell von Chen und Hochstrasser (1996) zwei halbe Kernpartikel zu einem instabilen Vorläuferkomplex, dem sogenannten Pre- holo- Proteasom oder naszierenden Kernpartikeln (n- CP: nascent core particle), zusammen. Ump1 wird dabei im Inneren des Komplexes eingeschlossen und beeinflusst die koordinierte Prozessierung der Propeptide der β Untereinheiten, bevor es vom aktiven 20S Proteasom abgebaut wird (Ramos et al., 1998; Witt et al., 2000). In diesem späten Stadium der Assemblierung assoziiert Blm3 mit den naszierenden Kernpartikeln und verhindert vermutlich die vorzeitige Prozessierung der β Untereinheiten (Fehlker et al., 2003). Sowohl Ump1 als auch Blm3 sind in S. cerevisiae nicht essentiell.

Die Biogenese des 19S Partikels ist weitestgehend ungeklärt. Da mit Hilfe von yeast two- hybrid Untersuchungen keine Interaktionen zwischen 19S Base und 20S Proteasom bzw. zwischen 19S Lid und 19S Base gefunden werden konnten, wird angenommen, dass diese Subkomplexe sich vor der 19S bzw. 26S Assemblierung stabil formieren müssen (Fu et al., 2001). Bisher sind lediglich Proteine bekannt, die für die Stabilität des 19S Lid Komplexes verantwortlich sind. So destabilisiert die Depletion der essentiellen Rpn6 Untereinheit 19S Regulatoren derart, dass über Affinitätschromatographie aufgereinigte Proteasomen nahezu keine 19S Lid Untereinheiten mehr enthalten (Santamaria et al., 2003). Eine ähnliche destabilisierende Wirkung auf den 19S Komplex hat wie bereits erwähnt die Deletion von Rpn10 (Glickman et al., 1998a). Die Deletion von Rpn9, der zweiten nicht essentiellen Untereinheit des 19S Lid Komplexes, führt dazu, dass kein Rpn10 in Proteasomen dieser Zellen inkorporiert wird (Takeuchi et al., 1999). Während die Deletionen von Rpn10 und Rpn9 nur unter Stressbedingungen signifikanten Einfluss auf die Aktivität des 19S Komplexes zeigen, geht die Depletion von Rpn6 mit massiven Zellzyklusdefekten, Anreicherung ubiquitinierter Substrate sowie Aktivitätsverlusten einher. Des weiteren wurden zwei nicht proteasomale Proteine gefunden, die an der Assemblierung des 19S Komplexes beteiligt sind: In Schizosaccharomyces pombe konnte gezeigt werden, dass Yin6, dessen Mammalia Homolog Int6 an der Tumorgenese von Brustkrebs beteiligt ist, für die korrekte nukleäre Lokalisation von Rpn5 und damit für die korrekte Assemblierung des 19S Lids verantwortlich ist (Yen et al., 2003). Und Tone und Toh-e (2002) postulieren ein Model wonach das essentielle Protein Nob1 (für „nin one binding protein“ = Rpn12 bindendes Protein) in Analogie zu Ump1 zunächst an die neu generierten 19S Komplexe gebunden vorliegt, im Zellkern die Assemblierung zum 26S Proteasom katalysiert und anschließend vom aktiven 26S Proteasom degradiert wird. Gestützt wird diese Hypothese durch Untersuchungen, die zeigen, dass das Protein in yeast two hybrid Experimenten mit Rpn12 interagiert, dass eine temperatursensitive Mutation in diesem Gen unter restriktiven Bedingungen zu einer Delokalisation proteasomaler Untereinheiten ins Cytoplasma führt und die proteasomale Aktivität stark abnimmt sowie dass das Protein mit Rpt1 coimmunpräzipitiert (Tone und Toh-e, 2002; [Seite 18↓]Tone et al., 2000). Es gibt jedoch widersprüchliche Veröffentlichungen, nach denen Nob1 18S rRNA 3´Endonukleaseaktivität besitzt und auf dem Weg aus dem Zellkern ins Cytoplasma an die 40S ribosomalen Vorläuferpartikel gebunden vorliegt (Schäfer et al., 2003; Fatica et al., 2003). Demnach ist das evolutionär konservierte Nob1 vorwiegend cytoplasmatisch lokalisiert und trägt in seinem C- Terminus eine RNA bindende Domäne und an seinem N- Terminus eine PIN Domäne, für die eine RNAse Aktivität postuliert wurde. Fatica und Mitarbeitende konnten in ihren Untersuchungen keine Assoziation oder Cosedimentation von Nob1 mit den 26S proteasomalen Untereinheiten feststellen.

Die geregelte Assoziation und Dissoziation von 19S Komplexen an 20S Proteasom ist bisher nur in Mammalia Zellen gezeigt worden. So steuert bei 26S Proteasomen, die aus Herzmuskelzellen vom Schwein isoliert wurden, die Phosphorylierung bzw. Dephosphorylierung der ATPase Rpt6 die Assoziation bzw. Dissoziation des 19S Komplexes an das 20S Proteasom (Satoh et al., 2001). Die von einer mit dem 19S assoziierten Kinase phosphorylierte Rpt6 Untereinheit des 19S Komplexes bindet direkt an die α2 sowie α1 Untereinheit des 20S Proteasoms und wird erst nach der Dephosphorylierung wieder abgelöst. In Erythrozyten des Schweins wird die Assoziation des 19S Komplex mit dem 20S Proteasom durch die Anwesenheit des Modulatorkomplex bestehend aus p42/ Rpt4, p50/ Rpt5 sowie p27 um das achtfache stimuliert (DeMartino et al., 1996). Der Modulatorkomplex vermittelt dabei die Assoziation der proteasomalen Subkomplexe, ist aber nicht mehr mit den aktiven 26S Proteasomen assoziiert (Adams et al., 1997).

In S. cerevisiae wird dem nicht essentiellen, 210 kDa Protein Ecm29 (extracellular mutant 29) eine ähnliche Funktion zugeschrieben. Leggett und Mitarbeitende (2002) konnten zeigen, dass Ecm29 mit 20S Proteasomen verbunden ist und dass die Assoziation von 19S Partikeln mit 20S Proteasomen in Δecm29 Stämmen gestört ist.

1.5  Intrazelluläre Lokalisation von Proteasomen

Abgesehen davon, dass Proteasomen sowohl in Mammalia als auch in S. cerevisiae Zellen in Zytoplasma und Zellkern lokalisieren, unterscheiden sich die Ergebnisse der zahlreichen Untersuchungen zur proteasomalen Verteilung erheblich in Abhängigkeit von der Untersuchungsmethode, des untersuchten Zelltyps, der Zellzyklusphase und den Wachstumsbedingungen der untersuchten Zellen. Nach einheitlicher Aussage verschiedener Arbeitsgruppen sind Proteasomen jedoch mit Ausnahme der Vakuole gleichmäßig über das Zytoplasma verteilt und zeigen außerdem eine etwas stärkere Lokalisation im Zellkern mit Ausnahme der Nukleoli (zusammengefasst in Gordon, 2002, Wojcik und DeMartino, 2003).

Untersuchungen in S. cerevisiae zeigen, dass weniger als 20% der 26S Proteasomen cytoplasmatisch lokalisiert sind (Russell et al., 1999; Enenkel et al., 1998). Vielmehr lokalisieren sie über den gesamten Zellzyklus, der in S. cerevisiae ohne das Auflösen der [Seite 19↓]Kernmembran einhergeht, an Kernmembran und assoziiertem ER (Enenkel et al., 1998). In S. pombe Zellen dagegen, die hinsichtlich verschiedener Aspekte der chromosomalen Struktur, der Genregulation, des Zellzyklus und der Signalweiterleitung höheren Eukaryonten evolutionär ähnlicher sind als S. cerevisiae Zellen, verteilen sich die Proteasomen im Endstadium der Meiose II kurzzeitig über die gesamte Zelle bevor sie in den neu formierten Sporen wieder in der nukleären Peripherie relokalisieren (Wilkinson et al., 1998). Die Kernmembran und assoziiertes ER bzw. die nukleäre Peripherie lässt sich durch in vivo fluoreszenzmikroskopische Methoden in Hefen nicht auflösen, so dass die Frage, ob Proteasomen hauptsächlich im oder am Zellkern lokalisiert sind, nicht eindeutig geklärt war. Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Immunogold markiertem Rpn11 an der inneren Kernmembran in S. pombe Zellen konnten jedoch belegen, dass ein großer Anteil der Proteasomen nukleär lokalisiert ist (Wilkinson et al, 1998).

Die Lokalisation der Proteasomen ist in humanen Fibrosarkoma Zellen, solange die Kernmembran intakt ist, nukleär. Löst sich die Membran während der Metaphase/ Anaphase auf, verteilen sich die Proteasomen in der gesamten Zelle, um mit der Formation der neuen Kernmembran in den Tochterzellen wieder in den Zellkern aufgenommen zu werden (Reits et al., 1997).

Da S. cerevisiae Zellen eine geschlossene Mitose vollziehen, können Proteasomen nicht durch den Aufbau einer neuen Kernmembran in den Zellkern eingeschlossen werden, sondern müssen über die Kernporen importiert werden. Für das 20S Proteasom konnte gezeigt werden, dass die für den Kerntransport verantwortlichen Transportrezeptoren an halbe Kernpartikel binden und mit deren Hilfe über die Kernmembran in den Zellkern gelangen (Lehmann et al., 2002). Erst im Zellkern findet die Assoziation zum 20S Proteasom unter Assistenz von Blm3 und Abbau von Ump1 statt (Fehlker et al., 2003). Die N- terminalen Sequenzen der 20S α Untereinheiten beherbergen Kernlokalisationssignale, die vermutlich nach der Formierung des 20S Proteasoms durch strukturelle Umlagerungen unzugänglich sind, so dass bisher kein Kernimport von reifen 20S Proteasomen bzw. keine Bindung der Transportrezeptoren an das reife 20S gezeigt werden konnten.

1.6  Allgemeine Mechanismen des Kerntransports

Der Zellkern eukaryonter Lebewesen enthält die DNA als Heterochromatin in räumlicher Trennung zum Cytoplasma. Hier findet u. a. die Verdopplung des Genoms (Replikation), das Ablesen (Transkription) der Strukturgene in mRNA und die Assemblierung der Ribosomen statt. Das Zellkerninnere ist durch die doppelschichtige Kernmembran, die sich in das Membransystem des rauen endoplasmatischen Retikulums fortsetzt, vom Cytoplasma getrennt. Um einen geregelten Stoffaustausch zwischen den Kompartimenten zu gewährleisten, ist die Kernmembran mit ca. 100 nm breiten Kernporen (nuclear pore complex, NPC) durchsetzt, die eine achtfache Rotationssymmetrie aufweisen und in S. [Seite 20↓] cerevisiae einen Proteinkomplex von ca. 30 verschiedenen Nukleoporinen mit einer Gesamtmasse von 50 MDa ausmachen (Rout et al., 2000). Der vermutlich effektive Durchmesser des Transportkanals durch eine Xenopus Oozyten Kernpore beträgt lediglich 50 nm (Stoffler et al., 2003). Die Nukleoporine erfüllen nicht nur eine strukturgebende Aufgabe, sondern dienen auch als Interaktionsfläche für Transportrezeptoren (Rout et al., 2003). Für den Transport durch die Kernporen wird unterschieden zwischen dem aktiven Transport und der freien Diffusion von Ionen und Metaboliten. Makromoleküle, die nicht mit der Kernpore interagieren, können ebenfalls durch Diffusion in den/ aus dem Zellkern gelangen. Die Effizienz der diffusiven Translokation ist jedoch nur für Proteine mit einem Durchmesser bis zu 9 nm hoch und ist darüber hinaus umgekehrt proportional zur Größe des Moleküls (Paine et al., 1975). Die obere Ausschlussgrenze für einen diffusiven Transport über die Kernmembran in weniger als 24 Stunden scheint bei ca. 50 kDa zu liegen. Dagegen erreichen Proteinkomplexe, die mit Hilfe eines Transporters durch die Kernporen gelangen, Größen von bis zu 39 nm oder 2,5 MDa (z.B. Export von pre 60S ribosomalen Komplexen) (Pante und Kann, 2002). Allein die Betrachtung der Ribosomen Biogenese einer schnell wachsenden S. cerevisiae Kultur veranschaulicht die hohe Bedeutung des aktiven Kerntransports für die Zelle. Für die Verdopplung der Ribosomenanzahl innerhalb eines 1,5 stündigen Zellzyklus müssen ca. 150000 Proteine pro Minute in den Zellkern gelangen und gleichzeitig ca. 4000 ribosomale Untereinheiten aus dem Zellkern hinaus transportiert werden (Warner 1999). Diese Transportvorgänge werden vornehmlich durch die für die Zelle lebensnotwendigen Transportrezeptoren ausgeführt. Je nach Richtung des Transports, werden die Transporter in Importine (auch Karyopherine genannt) und Exportine unterteilt.

Abb. 4: Transportvorgänge über die Kernmembran aus Görlich, 1998

Alle Transportrezeptoren haben gemeinsam, dass sie direkt mit den Kernporen [Seite 21↓]interagieren können, ein N- terminales, RanGTP (Gsp1GTP in S. cerevisiae) bindendes Motiv tragen und eine Verwandtschaft zu Karyopherin β zeigen (Görlich et al., 1997). Das generelle Prinzip des aktiven Transports beruht auf der starken Affinität der Transporter zu der GTP gebundenen Form der GTPase Ran und einem RanGTP Gradienten zwischen Cytoplasma und Kern, der die Im- und Exportvorgänge antreibt. Abb. 4 zeigt ein Schema dieser Prozesse. Der bestehende RanGTP Gradient wird aufrecht erhalten, indem Ran in der GDP gebundenen Form mit Hilfe des 15 kDa großen, Homodimer bildenden Importrezeptors NTF2 (nuclear transport factor 2) über die Kernporen geleitet wird und im Kern unter Stimulation des Nukleotid Austausch Faktors (RanGEF, nucleotide exchange factor: RCC1 in humanen Zellen, Prp20 in S. cerevisiae) in RanGTP überführt wird. Als GTP assoziierte Form verliert Ran seine Affinität zu NTF2, besitzt aber eine hohe Affinität zu den Transportrezeptoren. Auf der cytoplasmatischen Seite wird die GTPase Aktivität von Ran durch RanBP1 (Ran binding protein 1, Yrb1 in S. cerevisiae) und RanGAP1 (Ran GTPase activating protein 1, Rna1 in S. cerevisiae) stimuliert und der Exportkomplex aufgespalten, indem RanGTP beim Austritt aus der Kernpore zu RanGDP konvertiert wird (Görlich & Kutay, 1999).

Die Familie der Karyopherin Transportrezeptoren umfasst in S. cerevisiae 14 Proteine mit Molekulargewichtsgrößen von 90- 130 kDa (Görlich et al., 1997). Karyopherin β (auch Kapβ1, Importin β oder kap95 genannt) ist das als erstes entdeckte und am besten charakterisierte Protein. Die Karyopherine werden auch Importin- β ähnliche Proteine genannt, obgleich die Sequenzähnlichkeit der Karyopherin Transportrezeptoren in vielen Fällen noch unter 20% Aminosäureidentität liegt und meistens nur auf die aminoterminale, RanGTP bindende Domäne begrenzt ist. Trotzdem zeigen alle Rezeptoren eine starke Strukturhomologie. Charakteristisch sind sich wiederholende, α- helicale HEAT Strukturen, die aus einer gebogenen sowie einer geraden Helix bestehen und parallel zueinander angeordnet eine spiralförmige Proteinstruktur ergeben, wie Kristallstrukturen von Karyopherin β (vgl. Abb. 5A) und Transportin zeigen (Cingolani et al., 1999 und Chook & Blobel 1999). Unter den 14 Karyopherinen sind 3 Exportine (Crm1/ Xpo1, Cse1, Los1) und 10 Importine (Kap95, Kap104, Kap108, Kap111/ Mtr10, Kap114, Kap119/ Nmd5, Kap121/ Pse1, Kap122/ Pdr6, Kap123/ Yrb4, Lph2), die unterschiedliche Substrate binden können (Görlich et al., 1997; Wozniak et al., 1998). Kap142 fungiert als Im- und Exportin (Yoshida & Blobel, 2001). Bis heute wurden für die 10 bekannten Importine jeweils ca. 2-4 Cargosubstrate gefunden. Da 1000 bis 2000 Proteine permanent oder zeitweise kernlokalisiert sind, wird vermutet, dass jedes Importin mehrere Substrate bindet (Mosammaparast et al., 2001). Für humanes Karyopherin β wurde gezeigt, dass es eine Reihe verschiedener Cargo Substrate direkt bindet, wie z.B. ribosomale Proteine, virale Proteine, Cyclin B1 und die T- Zell Protein Tyrosin Phosphatase (Übersicht in Ström & Weis, 2001). Die meisten Substrate, die über Karyopherin β importiert werden, sind jedoch Kernlokalisationssignale (NLS; nuclear localisation signal) tragende Proteine. [Seite 22↓]Diese binden nicht direkt an Karyopherin β sondern an das Adapterprotein Karyopherin α (auch Kap α, Kap60, Importin α oder Srp1), dessen stark basische Importin β bindende (IBB; Importin β binding) Domäne Karyopherin β an dessen konkaver Seite erkennt und bindet (Abb. 5). S. cerevisiae besitzt nur Kap α als Adapterprotein, in humanen Zellen dagegen sind bislang 6 verschiedene Karyopherin α Varianten gefunden worden. Keine dieser Isoformen kann eine S. cerevisiae SRP1 Mutation komplementieren, so dass davon ausgegangen wird, dass die Karyopherin α Isoformen in höheren Eukaryonten spezialisierte Aufgaben übernehmen und nur bestimmte Zielproteine binden (Nachury et al., 1998; zusammengefasst in Jans et al., 2000). Nur vier der 14 Karyopherine sind in S. cerevisiae in den verschiedenen untersuchten Stammhintergründen lebensnotwendig: die Importine Kap95/ Karyopherin β und Kap121/ Pse1 sowie die Exportine Cse1 und Crm1 (zusammengefasst in Görlich & Kutay, 1999). Die Tatsache, dass nicht essentielle Karyopherine für den Import essentieller Proteine verantwortlich sind [z.B. Kap114 für TATA binding protein (TBP)- Import], legt nahe, dass einige Proteine der Karyopherin Familie überlappende Funktionen besitzen (Pemberton et al., 1999). Für bestimmte Importwege, wie z. B. dem der ribosomalen Proteine und dem der Histone, sind sogar mehrere Karyopherine verantwortlich (Kap121, Kap123, Kap108 bzw. Kap114, Kap121, Kap123, Kap95) und untereinander austauschbar (Rout et al., 1997; Mosammaparast et al, 2001).

Abb. 5 : (A) Struktur von Importin β gebunden an die IBB Domäne von Importin α (Ström & Weis, 2001). Importin β (gelb) bildet mit den 19 HEAT Sequenzen eine schneckenartige Struktur um die IBB Domäne von Importin α (blau). Helices, die wichtig für die Interaktion mit den Nukleoporinen und RanGTP sind, sind in grün bzw. rot dargestellt. Der weiße Pfeil kennzeichnet den Bereich saurer Aminosäuren, der sowohl zu RanGTP als auch zur IBB Domäne Kontakt hat. (B) Struktur von Maus Importin α mit der autoinhibitorischen N- terminalen IBB Domäne in Magenta und den verschiedenen Armadillo Motiv Wiederholungen in unterschiedlichen Farben dargestellt (Kobe, 1999).

Die Erkennung zwischen Substrat und Transporter geschieht mittels Kernlokalisationssignalen (NLS) bzw. Kernexportsignalen (NES= nuclear export signal) im Falle des Kernimports bzw. -exports. Beispiele für beide Signalsequenzen sind in Tab. 1 dargestellt. Die sogenannten klassischen NLS (cNLS) binden an Kapα/ Srp1 und lassen sich anhand der Anzahl, der in die Bindung involvierter, lysinreicher Sequenzen in [Seite 23↓]monopartite und bipartite NLS unterscheiden. Kristallstrukturen von Peptiden beider Varianten mit Karyopherin α konnten die in Tab. 1abgebildeten Konsensussequenzen für die Bindung zwischen Karyopherin α und cNLS bestätigen (vgl.Abb. 7) (Fontes et al., 2000 und 2003). Bisher untersuchte NLS, die an Kap121/ Pse1 binden, sind alle basisch, zeigen aber keine offensichtliche Sequenz- Übereinstimmung (Leslie et al.,2002; Chaves & Blobel, 2001; Delahodde et al., 2001; Kaffman et al.,1998; Mosammaparast et al., 2001; Rout et al., 1997). In einigen Untersuchungen wurden sehr große, mit dem Karyopherin interagierende NLS Bereiche gefunden, die zu der Annahme führten, dass die Erkennung der NLS durch Kap121/ Pse1 in ihrer Sekundärstruktur begründet liegt. Typische NES sind durch hydrophobe, leucinreiche Bereiche gekennzeichnet. Als Konsensussequenz ist 1997 von Iovine und Wente folgende Sequenz aufgrund des Vergleich verschiedener NES postuliert worden: L (X)n L X X L X L/I.

Tab. 1: Substrate und deren Signalsequenzen der Importin- β ähnlichen Proteine. Die unterstrichene Sequenz in Spo12 ist ausreichend für die Translokation des Proteins in den Zellkern. Abkürzungen: HTLV-1: human T-cell leukemia virus type 1; Mouse importin-α IARS: autoinhibitorische pseudo- NLS von Importin α

Protein

Kernlokalisationssignal Srp1

Referenz

SV40 large- T antigen

P K K K R K V

Kalderon et al., 1984b

H2B

G K K R S K V

Moreland et al., 1987

Mouse importin- α IARS

D E Q M L K R R N V S

Kobe & Kemp, 1999

Monopartite NLS Konsensus

K R/K x R/K

Chelsky et al., 1989

Nucleoplasmin

K R P A A T K K A G Q A K K K K

Dingwall & Laskey, 1991

c- Myc

K R V K L P A A K R V K

Fontes et al., 2003

Gcn4

K R A R N T E A A R R S R A R K L Q R

Pries et al., 2003

Bipartite NLS Konsensus

K R x10-12K R x K

Fontes et al., 2003

   
 

Kernlokalisationssignal Kap95

 

IBB Domäne von Srp1

Y R R T N F K N K G R F S A D E L R R R R D T Q Q V E L R K A K R D E A L A K R R N F I

Görlich et al., 1996; Weis et al., 1996

Rex Protein des HTLV-1

M P K T R R R P R R S Q R K R P P T

Palmeri & Malim, 1999

   
 

Kernlokalisationssignal Kap108

 

Lhp1

AS 112- 224 (RNA bindenden Domäne)

Rosenblum et al., 1997 und 1998

   
 

Kernlokalisationssignal Kap111

 

Npl3

AS 283- 414 (RNA bindende Domäne)

Senger et al., 1998

   
 

Kernlokalisationssignal Pse1

 

Pho4

P Y L N K R K G K P

Kaffman et al., 1998

Pdr1

I Y K S W T D M N K I L L D F D N D Y S V Y R S F A H Y S I S C I I L V S Q A F S V A E

Delahodde et al., 2001

Spo12

K K S T S N L K S S H T T S N L V K K T M F K R D L L K Q D P K R K L Q LQ Q R F A S P T D

Chaves & Blobel, 2001

   
 

Kernexportsignal Crm1

 

Nmd3

I N I DE L L D E L

Ho et al., 2000

Inhibitor der cAMP abhängigen Protein Kinase

L A LKL AGLDI

Wen et al., 1995

Kap95

L E G R I L A A L T L

Iovine und Wente, 1997

HIV Rev

L P P L E R L T L

Fischer et al., 1995


[Seite 24↓]

Das Adapterprotein Srp1 ist das Produkt eines essentiellen Gens in S. cerevisiae und wurde ursprünglich als der Suppressor von temperatursensitiven RNA Polymerase I Mutationen gefunden (Yano et al., 1992). Das 60 kDa Protein beherbergt im wesentlichen zwei Interaktionsdomänen: eine große NLS bindende Region, die aus Armadillo Motiven besteht, und eine stark basische, aminoterminale IBB Domäne, die in der Lage ist, sich autoinhibitorisch an die NLS bindende Region anzulagern (vgl. Abb. 7) (Conti et al., 1998; Kobe 1999). In vitro konnte gezeigt werden, dass die Affinität von Karyopherin α zur NLS unter Bindung von Karyopherin β drastisch ansteigt (Rexach & Blobel, 1995). Im Cytoplasma ist die autoinhibitorische Sequenz durch die Assoziation von Karyopherin α mit Karyopherin β maskiert und dies führt zu einer starken Bindung des Substrats an das Adapterprotein. Im Zellkern führt vermutlich das Ablösen von Karyopherin β zu einer Verdrängung des Substrats durch die autoinhibitorische Sequenz von Karyopherin α (Harreman et al., 2003).

Die Zelle ist in der Lage die Effizienz des Kerntransports sowohl auf quantitativer als auch auf qualitativer Ebene zu regulieren. So werden in differenzierten humanen Leukämie Zelllinien Karyopherin α1 und α2 etwa gleich stark exprimiert, während schlecht differenzierte Zelllinien nur eine Isoform und diese in geringerer Menge enthalten (Nadler et al., 1997). Ebenso kann sich der Level der mRNA Expression der Karyopherin α Isoformen in verschiedenen Geweben unterscheiden, was zu der Annahme führte, dass die verschiedenen Karyopherin α Isoformen in höheren Eukaryonten differenziell exprimiert werden (Köhler et al., 1997; Nachury et al., 1998). Eine generelle Herabregulation der Karyopherin β und Transportin vermittelten Kernimportmaschinerie in permeabilisierte HeLa Zellen wurde in vitro außerdem durch Gabe von Phosphatase Inhibitoren gezeigt (Kehlenbach und Gerace, 2000). Auf qualitativer Ebene stellt die Erkennung bzw. Zugänglichkeit der NLS eines Proteins durch Karyopherin α einen kritischen Parameter in der Effizienz des Imports in den Zellkern dar. Variationen der Importrate bestimmter Proteine können z. B. durch Phosphorylierungen oder inter- bzw. intramolekulare Maskierungen der NLS erzielt werden. In Fusionsproteinen, in denen die SV40 NLS von Proteinkinase 2 Erkennungssequenzen flankiert wird, steigt die Erkennung der SV40 NLS durch Karyopherin α/β um den Faktor 100, wenn die benachbarten Serinreste phosphoryliert vorliegen (Xiao et al.,1997 und 1998). Der Kernimport von Pho4 über Pse1 ist blockiert, wenn Serin 152 phosphoryliert ist und erst der Proteasomen abhängige Abbau des NF- κB p65 maskierenden Proteins I-κBα im Cytoplasma gibt die NLS von NF-κB p65 für den Kernimport frei (Traencker et al., 1994). Ein ähnlicher Mechanismus wurde bei dem p50 Precursor NF- κB p105 beobachtet, dessen C- terminaler Bereich die eigene p50/p105 NLS verdeckt (Henkel et al., 1992).


[Seite 25↓]

1.7  Zielsetzung der Arbeit

Ziel der Arbeit ist die Untersuchung der Transportwege und Assemblierungsprozesse zur nukleären Lokalisation des 19S regulatorischen Partikels des 26S Proteasoms in der Sprosshefe Saccharomyces cerevisiae.

Mit Beginn der Arbeit war betreffs der zellulären Lokalisation des 19S Komplexes lediglich bekannt, dass GFP markiertes Cim5/ Rpt1 in S. cerevisiae vorwiegend an Kernmembran/ ER und GFP markiertes Mts4/ Rpn1 sowie Pad1/ Rpn11 in S. pombe vorwiegend an der nukleoplasmatischen Seite der Kernmembran lokalisieren (Enenkel et al., 1998; Wilkinson et al., 1998). Beide Studien belegen, dass die markierten Proteine im Glycerolgradienten in proteolytisch aktiven Fraktionen bzw. mit 20S Proteasomen cosedimentieren und deshalb vermutlich in aktive 26S Proteasomen eingebaut vorliegen. Rout und Mitarbeitende (2000) haben die 19S Base Untereinheit Rpn1 in Assoziation mit präparierten Kernporen gefunden, was darauf hindeutet, dass 19S Untereinheiten Transportprozessen über die Kernporen unterworfen sind.

Bis auf Rpn10 - 12 besitzen alle 19S Untereinheiten Molekulargewichtsgrößen ab 45 kDa und sind damit vom diffusiven Transport über die Kernporen ausgeschlossen. Unklar bleibt jedoch mit Hilfe welcher Transporter die Proteine in/an den Kern gelangen, welche Signalsequenzen dafür verantwortlich sind und ob der 19S Komplex als gesamter Komplex oder in Subkomplexen transportiert wird. Mit einer Größe von ca. 20 x 45 nm und nahezu 1 MDa erreicht der 19S Komplex fast die Ausschlussgrenze des 50 nm breiten Kernporenkanals, so dass der Transport möglicherweise in Subkomplexen stattfinden muss. In diesem Zusammenhang ist interessant, ob 19S Komplexe in Analogie zum 20S Proteasom auf dem Weg in den Zellkern koordiniert assemblieren und ob Assemblierungsintermediate dieses Komplexes zu isolieren sind. Sollte die Reifung des 26S Proteasoms aus 20S und 19S Vorläuferkomplexen im Zellkern stattfinden, könnte ein Defekt im Import des 19S Komplex aufgrund der feinabgestimmten Regulation der Expression aller 26S Untereinheiten einen Einfluss auf die Biogenese des 20S Proteasom zeigen.

In der Ausführung soll der für den Kernimport des 19S regulatorischen Partikels verantwortliche Transporter anhand ausgesuchter Kerntransportmutanten bestimmt werden, die mit dem Transporter interagierenden Signalsequenzen lokalisiert werden und die Transporterbindung in vivo und in vitro gezeigt werden. Des weiteren soll der Transportkomplex wenn möglich isoliert und näher charakterisiert werden. Die Signifikanz der Signalsequenzen für die korrekte Lokalisation des 19S regulatorischen Partikels soll anhand von Mutations- oder Deletionsstämmen bestimmt werden.


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29.09.2004