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2  Materialien und Methoden

2.1 Oligonukleotide, Vektoren, Stämme und Kultivierung von Mikroorganismen

2.1.1 Oligonukleotide

Tab. 2: Bezeichnungen und Sequenzen der verwendeten Oligonukleotide

Oligonukleotid

Sequenz (5’→ 3’)

Bemerkung

TEV fwd

AAA CAT ATG ACG TAC CTG ACT ATG CAG TCG AGAACC TGT ACT TCC AGG GC

NdeI, TEV Schnittstelle

TEV rev

AAA TCT AGA TCA CGA ATT CGC GTC TAC TTT CGG

XbaI

biNLS Rpn2 fwd

AGC TTA AAA TGA AGG CAA GGG CAA AGA AGA CAA AGA AGG AAA AGG GTC CAA ATG AGG AAG AAA AGA AAA AAG GGT AC

HindIII

KpnI

biNLSRpn2 rev

CCT TTT TTC TTT TCT TCC TCA TTT GGA CCC TTT TCC TTC TTT GTC TTC TTT GCC CTT GCC TTC ATT TTA

 

KEKE fwd

AAA ACT CGA GGA GCT CCA TGT CAG ATG TGG TAC CGC A

XhoI SacI

-KEKE rev

AAA AGG ATC CTG CTT CCT CAT ACA TCC T

BamHI

Rpn2 rev

AAA AGG ATC CAG CAC TAG GGA AGT CGA CA

Primer 8996-29 Enenkel

SV40 fwd

AGC TTA AAA TGG GGC CGA AGA AGA AGA GGA AGG TCG ACG GGT AC

HindIII
KpnI

SV40 rev

CCG TCG ACC TTC CTC TTC TTC TTC GGC CCC ATT TTA

SalI

mSV40 fwd

AGC TTA AAA TGG GGC CGA AGA CGA AGA GGA AGG TCG ACG GGT AC

HindIII
KpnI

mSV40 rev

CCG TCG ACC TTC CTC TTC GTC TTC GGC CCC ATT TTA

SalI

Rpt2 NLS fwd

AAA AAG CTT AAA ATG GAC AAA AAG AAG AAG AAG GGA TCT

HindIII

Rpt2 NLS rev

AAA GGT ACC CTT CGA CTC CCT TTC TTT TCT TAC GAC C

KpnI

Rpt2 D1-43 fwd

AAA AGA GCT CGA AAA ATT ACC CAA CAT ATA T

SacI

Rpt2 D1-43 rev

AAA AGA GCT CCA TTT TAT TTT CTA TTA AAA ACG C

SacI

Rpt2 fwd

AAA AAA CTC GAG GTA TAC AGA ATA CAG CTT CCT

XhoI

Rpt2 rev

AAA AAA GGA TCC CAA GTA TAA ACC TTC TAA ATT

BamHI

CFP fwd

AAA AGG ATC CAC CAT GGT GAG CAA GGG C

BamHI

CFP rev

AAA AGG ATC CCT TGT ACA GCT CGT CCA T

BamHI

Rpt1 NLS fwd

AGC TTA AAA TGG AGC TCA GAG CAC GTA GAA AGG TGG CTA CTG AGA AGG ATT TCC TGA AGG CTG TTG ATA AGG AGC TCG GGT AC

HindIII

KpnI

Rpt1 NLS rev

CCG AGC TCC TTA TCA ACA GCC TTC AGG AAA TCC TTC TCA GTA GCC ACC TTT CTA CGT GCT CTG AGC TCC ATT TTA

 

Rpn1 orf fwd

AAA GTC GAC GAG CTC GGA TGC TAC TAC GGA CGG

SalI SacI

Rpn1 orf rev

AAA GGA TCC CTC CTC TTC ACG ATA GTC AGG

BamHI

Rpn1 3´ fwd

AAA GAA TTC GGC AAT ATC AAC CAG AAT AGG

EcoRI

Rpn1 3´ rev

AAA CTC GAG TTG TGG TAT CGC TGT CGG

XhoI

Rpn11 orf fwd

AAA GTC GAC GAG CTC CCG CGG ACA CCG GCC GTG ACG

SalI SacI

Rpn11 orf rev

AAA GGA TCC TTT AAT TGC CAC TGA ATT AAC

BamHI

Rpn11 3´ fwd

AAA GAA TTC AGA AAG CCC ACT ACA TAT ATA

EcoRI

Rpn11 3´ rev

AAA CTC GAG GAA GCT CCT CTA CTA GCA CCG

XhoI


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2.1.2 Vektoren

Tab. 3: Bezeichnung und Herkunft der verwendeten Plasmide; X in der Plasmidbezeichnung steht für die Proteine Rpn1, Rpn11 und Rpn2

Plasmid

Bemerkungen

Herkunft

pCR2.1-TOPO

lacZ, AmpR, KanR,

Invitrogen

pBKS

lacZ, AmpR, basiert auf pUC19

Stratagen

pBSHU

lacZ, AmpR, HIS3, URA3

C. Enenkel

pBSFlu

lacZ, AmpR, (HA)2

C. Enenkel

pBSFluRpnXHA

basiert auf pBSFlu

diese Arbeit

pBSHURpnX-3’

basiert auf pBSHU

diese Arbeit

pBSHURpnXGFPHA

GFP, basiert auf pBSHU

diese Arbeit

pBSLeuRpnXGFPHA

LEU2, basiert auf pBSHURpnXGFPHA

diese Arbeit

pBSHURpn2-3´HA

lacZ, AmpR, HIS3, URA3 RPN2-3´

C. Enenkel

pPS1890

TRP1, ECFP (pRS304)

P. Silver

Dp42

ARS-CEN, LEU2, rpt2RF (pRS315)

D. Finley (Rubin et al. 1998)

pRE105

ARS-CEN, LEU2, PDR5*-GFP (pRS315)

R. Egner 

pRE104

ARS-CEN, LEU2, PDR5-GFP (pRS315)

R. Egner 

pG

2µ URA3, GAL:GFP-S (pYES)

diese Arbeit

pNLSG

2µ URA3, GAL:SV40NLSGFP-S (pYES)

diese Arbeit

pmNLSG

2µ URA3, GAL:mutSV40NLS-GFP-S (pYES)

diese Arbeit

pRpt1NLSG

2µ URA3, GAL:Rpt1NLS-GFP-S (pYES)

diese Arbeit

pRpt2NLSG

2µ URA3, GAL:Rpt2NLS-GFP-S (pYES)

diese Arbeit

pRpn2NLSG

2µ URA3, GAL:Rpn2NLS-GFP-S (pYES)

diese Arbeit

pRpt2H-16

ARS-CEN, URA3, Rpt2 (pRS316)

diese Arbeit

pRpt2H

ARS-CEN, LEU2, Rpt2-HA (pRS315)

diese Arbeit

pRpt2G

ARS-CEN, LEU2, Rpt2-GFPHA (pRS315)

diese Arbeit

pΔNRpt2H

ARS-CEN, LEU2, ΔN-Rpt2-HA (pRS315)

diese Arbeit

pΔNRpt2G

ARS-CEN, LEU2, ΔN-Rpt2-GFPHA (pRS315)

diese Arbeit

YIplac128

Pre2HA

lacZ, AmpR, LEU2, PRE2-HA

J. Dohmen

YIPlac128 Pre4HA

lacZ, AmpR, LEU2, PRE4-HA

U. Düring

pZZ-HIS5

GAGAGA Linker gefolgt von TEV Schnittstelle und ZZ Domäne aus pEZZ (Pharmacia)

DNA Fragment von M. Seeger

pSW509

Kap95-L63A auf pRS315

Iovine und Wente, 1997

pSW636

ARS-CEN, LEU2, GFP-NUP49 (pRS315)

Bucci und Wente 1998

pRS315SRP1ProA

ARS-CEN, LEU2, SRP1-ProA (pRS315)

Enenkel et al., 1995

2.1.3  Stämme und Kultivierung von Mikroorganismen

Escherichia coli

Für Klonierungen und Präparationen rekombinanter Proteine werden folgende E. coli Stämme verwendet:

Tab. 4: Genotypen und Referenzen der verwendeten E. coli Stämme

Stamm

Genotyp

Referenz

DH5α

F-, ø80dlacZΔM15, Δ(lacZYA-argF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17(rk-, mk+), phoA, supE44, λ-, thi-1, gyrA96, relA1

Sambrook et al., 1989

TOP10F’

F´{lacIq Tn10 (TetR)} mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZ.M15ΔlacX74 deoR recA1 araΔ139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG

Invitrogen

Kultivierungsbedingungen für E. coli

Für die Anzucht von E. coli Zellen wird Luria-Bertani (LB) Medium (10g/L Bacto-Trypton [Applichem, Darmstadt], 5g/L Hefeextrakt [Difco, Heidelberg], 6g/L NaCl [Applichem], pH 7.2) verwendet. Sterilfiltriertes Ampicillin (Applichem) wird nach dem Autoklavieren zu einer Endkonzentration von 50µg/ml ins Medium gegeben, wenn auf die Anwesenheit von Plasmiden selektiert wird. Für feste Nährböden wird Agar-Agar (Applichem) in der Konzentration von 15g/L [Seite 28↓]eingesetzt. Transformanten ohne α-Komplementation werden durch Zugabe von 20 mg/ml X-Gal (American Biorganics ABI, Niagara Falls) und 100mM IPTG (Applichem) pro Platte im Blau Weiß Screening ermittelt. Alle Kulturen werden bei 37°C für 16-20h angezogen. Flüssigkulturen werden bei 160rpm auf einem Rundschüttler inkubiert.

Saccharomyces cerevisiae


[Seiten 29 - 30↓]

Tab. 5: Genotypen und Referenzen der verwendeten S. cerevisiae Stämme

Stamm

Bemerkungen

Genotyp

Herkunft

WCGa

 

MATa his3-11,15 leu2-3,112 ura3 can GAL

Heinemeyer et al., 1994

PWn1C

Rpn1CFP

MATa his3-11,15 leu2-3,112 ura3 RPN 1-CFPHA::LEU

diese Arbeit

PWn1Cn49G

Rpn1CFPHA NUP49GFP

MATa his3-11,15 leu2-3,112 ura3 RPN 1-CFPHA::LEU (pSW636)

diese Arbeit

PWn1Cp5G

Rpn1CFPHA PDR5*GFP

MATa his3-11,15 leu2-3,112 ura3 RPN 1-CFPHA::LEU (p105)

diese Arbeit

PWn11C

Rpn11CFP

MATa his3-11,15 leu2-3,112 ura3 RPN 11-CFPHA::LEU

diese Arbeit

PWn11Cn49G

Rpn11CFPHA NUP49GFP

MATa his3-11,15 leu2-3,112 ura3 RPN11-CFPHA::LEU (pSW636)

diese Arbeit

PWn11Cp5G

Rpn11CFPHA PDR5*GFP

MATa his3-11,15 leu2-3,112 ura3 RPN 11-CFPHA::LEU (p105)

diese Arbeit

PWn11P

Rpn11ProA

MATa his3-11,15 leu2-3,112 ura3 RPN 11-ProteinA::HIS ::URA

diese Arbeit

PWn1P

Rpn1ProA

MATa his3-11,15 leu2-3,112 ura3 RPN 1-ProteinA::HIS ::URA

diese Arbeit

srp1-49

srp1-49

MATa ade2-1 trp1- Δ 63 his3-11,15 leu2-3,112 ura3 –1 can1-100 srp1-49

G. Fink

PWn11G1-49

srp1-49 Rpn11GFP

MATa ade2-1 trp1- Δ 63 his3-11,15 leu2-3,112 ura3 –1 can1-100 srp1-49
RPN 11-GFPHA::HIS3 ::URA3

diese Arbeit

SRP1

SRP1

MATa ade2-1 trp1- Δ 63 his3-11,15 leu2-3,112 ura3 –1 can1-100

G. Fink

PWn11GSrp

SRP1 Rpn11GFP

MATa ade2-1 trp1- Δ 63 his3-11,15 leu2-3,112 ura3 –1 can1-100
RPN 11-GFPHA::HIS3 ::URA3

diese Arbeit

PWn1G1-49

srp1-49 Rpn1 GFP

MATa ade2-1 trp1- Δ 63 his3-11,15 leu2-3,112 ura3 –1 can1-100 srp1-49
RPN 1-GFPHA::HIS3 ::URA3

diese Arbeit

PWn1GSrp

SRP1 Rpn1GFP

MATa ade2-1 trp1- Δ 63 his3-11,15 leu2-3,112 ura3 –1 can1-100
RPN 1-GFPHA::HIS3 ::URA3

diese Arbeit

CEY1b

SRP1-ProA

MATa his3-11,15 leu2-3,112 ura3 Δ srp1::URA3 pRS315.SRP1-ProA

Enenkel et al., 1995

PWG

pYESGFPS

MATa his3-11,15 leu2-3,112 ura3 (pG)

diese Arbeit

PWNLSG

pYES SV40NLS

MATa his3-11,15 leu2-3,112 ura3 (pNLSG)

diese Arbeit

PWmNLSG

pYES mSV40NLS

MATa his3-11,15 leu2-3,112 ura3 (pmNLSG)

diese Arbeit

PWRpt1NLSG

pYES Rpt1NLS

MATa his3-11,15 leu2-3,112 ura3 (pRpt1NLSG)

diese Arbeit

PWRpt2NLSG

pYES Rpt2NLS

MATa his3-11,15 leu2-3,112 ura3 (pRpt2NLSG)

diese Arbeit

PWRpn2NLSG

pYES Rpn2NLS

MATa his3-11,15 leu2-3,112 ura3 (pRpn2NLSG)

diese Arbeit

DY62

Rpt2

Mata his3- Δ 200 lys2-801 leu2-3,112 trp1-1 ura3-52 Δ rpt2::TRP (Dp42)

D. Finley ; (Rubin et al., 1998)

PWt2H16

Rpt2HA

Mata his3- Δ 200 lys2-801 leu2-3,112 trp1-1 ura3-52 Δ rpt2::TRP (pRpt2H16)

diese Arbeit

PWt2H

Rpt2HA

Mata his3- Δ 200 lys2-801 leu2-3,112 trp1-1 ura3-52 Δ rpt2::TRP (pRpt2H)

diese Arbeit

PWΔNt2H

ΔNLS rpt2HA

Mata his3- Δ 200 lys2-801 leu2-3,112 trp1-1 ura3-52 Δ rpt2::TRP (pΔNRpt2H)

diese Arbeit

PWn2H

Rpn2HA

MATa his3-11,15 leu2-3,112 ura3 RPN2-HA::HIS::URA

diese Arbeit

PWΔCn2H

ΔNLS rpn2HA

MATa his3-11,15 leu2-3,112 ura3 RPN2- Δ C-HA::HIS::URA

diese Arbeit

PWβ5H

Pre2HA

MATa his3-11,15 leu2-3,112 ura3 PRE2-HA::LEU

diese Arbeit

PWn2Hβ5H

Rpn2HA Pre2HA

MATa his3-11,15 leu2-3,112 ura3 RPN2-HA::HIS::URA PRE2-HA::LEU

diese Arbeit

PWΔCn2Hβ5H

ΔNLS rpn2HA Pre2HA

MATa his3-11,15 leu2-3,112 ura3 RPN2- Δ C-HA::HIS::URA PRE2HA::LEU

diese Arbeit

PWβ7H

Pre4HA

MATa his3-11,15 leu2-3,112 ura3 PRE4-HA::LEU

diese Arbeit

PWn2Hβ7H

Rpn2HA Pre4HA

MATa his3-11,15 leu2-3,112 ura3 RPN2-HA::HIS::URA PRE4-HA::LEU

diese Arbeit

PWΔCn2Hβ7H

ΔNLS rpn2HA Pre4HA

MATa his3-11,15 leu2-3,112 ura3 RPN2- Δ C-HA::HIS::URA PRE4HA::LEU

diese Arbeit

PWn2Hn11P

Rpn2HA Rpn11Pro

MATa his3-11,15 leu2-3,112 ura3 RPN2-HA::HIS::URA RPN11-ProteinA::LEU

diese Arbeit

PWΔCn2Hn11P

ΔNLS rpn2HA Rpn11ProA

MATa his3-11,15 leu2-3,112 ura3 RPN2- Δ C-HA::HIS::URA RPN11-ProteinA::LEU

diese Arbeit

PWt2Hn11P

Rpt2HA Rpn11ProA

Mata his3- Δ 200 lys2-801 leu2-3,112 trp1-1 ura3-52 Δ rpt2::TRP RPN11-ProteinA::HIS::URA (pRpt2H)

diese Arbeit

PWΔNt2Hn11P

ΔNLS rpt2 Rpn11ProA

Mata his3- Δ 200 lys2-801 leu2-3,112 trp1-1 ura3-52 Δ rpt2::TRP RPN11-ProteinA::HIS::URA (pΔNRpt2H)

diese Arbeit

Kap95

 

Mata ade2-1 ura3-1 his3-11,15 trp1-1 leu2-3,112 can1-100 kap95::HIS3 pSW509(LEU2)

Iovine und Wente, 1997

Kap95n1G

Rpn1GFPHA

Mata ade2-1 ura3-1 his3-11,15 trp1-1 leu2-3,112 can1-100 kap95::HIS3pSW509(LEU2) RPN1-GFP-HA::HIS::URA

diese Arbeit

Kap95n11G

Rpn11GFPHA

Mata ade2-1 ura3-1 his3-11,15 trp1-1 leu2-3,112 can1-100 kap95::HIS3 pSW509(LEU2) RPN11-GFP-HA::HIS::URA

diese Arbeit

pse1-1, PSY1201

 

MATa, ura3-52, leu2 Δ 1, trp1- Δ 63, GAL, pse1-1

Seedorf und Silver, 1997

pse1-1n1G

Rpn1GFPHA

MATa, ura3-52, leu2 Δ 1, trp1- Δ 63, GAL, pse1-1 RPN1-GFP-HA::HIS::URA

diese Arbeit

pse1-1n11G

Rpn11GFPHA

MATa, ura3-52, leu2 Δ 1, trp1- Δ 63, GAL, pse1-1RPN11-GFP-HA::HIS::URA

diese Arbeit

Pse1n1G

Rpn1GFPHA

MATa, ura3-52, leu2 Δ 1, trp1- Δ 63, GAL, RPN1-GFP-HA::HIS::URA

 

Pse1n11G

Rpn11GFPHA

MATa, ura3-52, leu2 Δ 1, trp1- Δ 63, GAL, RPN11-GFP-HA::HIS::URA

 

rat2-1

 

Mat α his3- Δ 200 ura3-52 leu2 Δ 1rat2- 1

Heath et al., 1995

rat2-1n1G

Rpn1GFPHA

Mat α his3- Δ 200 ura3-52 leu2 Δ 1rat2-1
RPN1-GFP-HA::HIS::URA

diese Arbeit

rat2-1n11G

Rpn11GFPHA

Mat α his3- Δ 200 ura3-52 leu2 Δ 1rat2-1
RPN11-GFP-HA::HIS::URA

diese Arbeit

nup133

 

Mata ade2 his3 leu2 trp1 ura3 nup133::HIS3

Belgareh und Doye, 1997

nup133n1G

Rpn1GFPHA

Mata ade2 his3 leu2 trp1 ura3 nup133::HIS3
RPN1-GFP-HA::HIS::URA

diese Arbeit

nup133n11G

Rpn11GFPHA

Mata ade2 his3 leu2 trp1 ura3 nup133::HIS3
RPN11-GFP-HA::HIS::URA

diese Arbeit

srp1-31

 

MATa ade2-1 trp1- Δ 63 his3-11,15 leu2-3,112 ura3 –1 can1-100 srp1-31

G. Fink

srp1-31n1G

Rpn1GFPHA

MATa ade2-1 trp1- Δ 63 his3-11,15 leu2-3,112 ura3 –1 can1-100 srp1-31 RPN1-GFP-HA::HIS::URA

diese Arbeit

srp1-31n11G

Rpn11GFPHA

MATa ade2-1 trp1- Δ 63 his3-11,15 leu2-3,112 ura3 –1 can1-100 srp1-31 RPN11-GFP-HA::HIS::URA

diese Arbeit

Δrpn2

 

MAT α leu2 his3 trp1 ura3 ade2 sen3::LEU2

YAT1886 ; Yokota et al., 1996

PWΔn2ΔCn2H

Δrpn2 ΔNLSrpn2HA

MAT α leu2 his3 trp1 ura3 ade2 sen3::LEU2 RPN2- Δ C-HA::HIS::URA

diese Arbeit

PWΔn2n2H

Δrpn2 Rpn2HA

MAT α leu2 his3 trp1 ura3 ade2 sen3::LEU2 RPN2-HA::HIS::URA

diese Arbeit

PCE6

Pre6 ProA

MATa his3-11,15 leu2-3,112 ura3 PRE6-ProteinA::HIS::URA

C. Enenkel

Kultivierungsbedingungen für S. cerevisiae

YPD Medium (Difco) dient als Flüssigmedium für die Anzucht von Hefen.

Synthetisches Selektionsmedium (Complete Minimal) Medium wird mit 1,7g/L YNB-AA/AS (yeast nitrogen base without aminoacids and amonium sulphate, Difco), 5g/L (NH4)2SO4, 20g/L Glucose und 1,3g/L Dropout Pulver ohne Uracil, Histidin, Leucin oder Arginin hergestellt. Es werden nach Bedarf zusätzliche Aminosäuren zugesetzt (30mg/L L- Histidin, 60mg/L L- Leucin, 30mg/L Uracil, 20mg/L Arginin), wenn bestehende Selektionen aufgehoben werden sollen.

Feste Nährböden enthalten 20g/L BactoTM Agar (Difco).

Für die Expression von Genen hinter dem Galaktose Promoter werden S. cerevisiae Zellen aus der logarithmischen Wachstumsphase in synthetisches Galaktose Selektionsmedium überführt, das statt 20g/L Glucose 20g/L Galaktose als Kohlenstoffquelle enthält. Die Induktion der Galaktose abhängigen Gene findet für 4-8 Stunden bei 28°C statt.

Zur Selektion mittels FOA (5-Flouroorotic Acid; BTS, St. Leon Rot) wird ein 2x CM Medium mit 60mg/L Uracil und 40g/L Agar-Agar autoklaviert. Nach dem Abkühlen auf etwa 55°C wird ein gleiches Volumen sterilfiltrierter FOA- Lösung (2g/L) zugegeben. Somit stellt sich im fertigen Festmedium eine FOA Konzentration von 1g/L ein.

Die Kultivierungen erfolgen auf einem Rundschüttler bei 28°C oder bei Raumtemperatur bis eine Zelldichte (OD600nm) von 1-7x 107 Zellen/ml erreicht ist.

Kryokonservierung

Gefrierkulturen werden sowohl bei E. coli Zellen als auch bei S. cerevisiae Zellen hergestellt, indem 1ml Vorkultur mit 400µl 80% Glycerin sorgfältig vermischt und anschließend bei -70°C gelagert wird.

2.1.3.1 Untersuchung auf Canavanin- und Temperatur Sensitivität

Für Canavanin- Sensitivitätsbestimmungen werden CM Agar-Agar Platten ohne Arginin 0,6µg/ml Canavanin (Stammlösung: 3 mg/ml in H2O sterilfiltriert) zugesetzt. Als Referenz werden CM Platten mit 20 mg/ml Arginin Zusatz verwendet. Jeweils 4µl einer dekadischen Verdünnungsreihe einer Hefekultur mit einer optischen Dichte von ca. 1x 107 Zellen/ml werden auf die Platten aufgetropft und nach 3 tägiger Inkubation bei 28°C die relative Lebendkeimzahl bestimmt.

Für Temperatur- Sensitivitätsbestimmungen werden zwei YPD Agar-Agar Platten analog zu Canavanin Platten mit Hefezellen beimpft und für 3 Tage bei 28°C bzw. 37°C inkubiert und die Lebendkeimzahl gleicher Verdünnungsstufen miteinander verglichen.

2.2 Molekularbiologische Methoden

2.2.1 DNA Amplifikation durch PCR (polymerase chain reaction)

Die Amplifikation von DNA Fragmenten erfolgt entweder ausgehend von aufgereinigter Vektor DNA oder chromosomaler S. cerevisiae DNA als Vorlage. Alle Oligonukleotide werden bei Biotez, Berlin bestellt. In einem PCR Ansatz werden 1µl DNA, 10µl 10x PCR Puffer mit MgCl2 (Roche, Mannheim), 0,8µl 25mM dNTPs und jeweils 1µl sense und antisense Oligonukleotid Primer (50 pmol/µl) in einem 0,5ml Eppendorfgefäß mit sterilem H2O auf 100µl Endvolumen aufgefüllt. 0,4µl Taq-Polymerase (Roche, Mannheim) werden erst unmittelbar vor Start der PCR Reaktion zum Ansatz gegeben. Die PCR Bedingungen ergeben sich aus einer einminütigen Denaturierung der Primer bei 95°C, gefolgt von 30 Amplifikationszyklen bestehend aus Denaturierung bei 95°C für 45 Sekunden, Primeranlagerung bei 45-50°C für 1 min und DNA Polymerisation bei 72°C für eine der [Seite 31↓]Größe des zu amplifizierenden DNA Fragment angepassten Zeitspanne von ca. 1kb = 1min. Abschließend findet die Endpolymerisation aller amplifizierten DNA Fragmente bei 95°C, 5 min statt.

Jeweils 2µl des amplifizierten Fragments werden nach Angaben des Herstellers mittels TOPO TA Cloning® Kit (Invitrogen) in den Vektor pCR 2.1®- TOPO®ligiert und sequenziert.

2.2.2 Gelelution und Reinigung von DNA Fragmenten

Die Extraktion von DNA aus Agarosegelstücken sowie die Reinigung von DNA nach Restriktionen erfolgt mit dem Qiaquick® Gel Extraction Kit (Qiagen) gemäß Herstellerangaben.

2.2.3 Dephosphorylierung

Die Selbstligation dephosphorylierter Vektor- DNA Enden wird mittels Alkalischer Phosphatase, durch die Entfernung der Phosphatgruppe vom 5’ Ende des dsDNA Strangs, unterbunden. In einem Ansatz werden 44µl gereinigte DNA (ca. 0.5µg) mit 5µl 10 x Alkalische Phosphatase Puffer und 1µl Alkalischer Phosphatase (Boehringer Mannheim) vermischt und 30 min bei 37°C inkubiert. Es folgt eine Hitzeinaktivierung des Enzyms für 15 min bei 65°C.

2.2.4 Ligation

Für die Ligation dephosphorylierter Vektoren mit DNA-Fragmenten (insert) beträgt das Verhältnis der molaren Massen beider DNA Moleküle 3:1, während für die Ligation phosphorylierter Vektoren ein Verhältnis von 1:3 zum Insert besteht. Im Ligationsansatz wird ca. 50 ng Vektor- DNA mit der entsprechenden Menge Insert- DNA, 2µl T4-DNA-Ligase (1.2 U, New England Biolabs) sowie 2µl 10x T4-DNA-Ligase Puffer zu einem Endvolumen von 20µl vereinigt und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert.

2.2.5 Restriktionsansätze

In einem analytischen Restriktionsansatz mit einem Endvolumen von 20µl sind nicht mehr als 1µg QIAGEN Mini Präp DNA, 2µl 10 x Restriktionspuffer, 0,2µl BSA (10 mg/ml;New England Biolabs, Schwalbach) und 0,5µl Restriktionsendonuklease (bis zu 10 U/µl) enthalten. In einem präparativen Restriktionsansatz mit einem Endvolumen von 300µl sind bis zu 20µg DNA, 30µl 10x Restriktionspuffer, 3µl BSA und 3µl Restriktionsendonuklease enthalten. Die Wahl des Inkubationspuffers ist abhängig vom verwendeten Enzym. Die Restriktion erfolgt bei 37°C für maximal 2 Stunden. Die Restriktionsendonukleasen wurden von den Firmen New England Biolabs (Schwalbach) oder Boehringer Mannheim bezogen.

2.2.6 Plasmidisolation aus E. coli

Zur DNA Schnellaufarbeitung werden die Kolonien ü/N bei 37°C in 3ml LB+ Ampicillin Medium auf dem Rundschüttler bei 120 rpm in sterilen Reagenzgläsern angezogen. Die Plasmidisolation erfolgt gemäß Vorschrift mit dem Qiaprep® Spin Miniprep Kit der Firma QIAGEN. Plasmid- DNA aus 1,5ml Kultur wird in 50µl Elutionspuffer aufgenommen.

2.2.7 Annealing von Oligonukleotiden

Sehr kurze dsDNA Fragmente von 30 bis hinzu 150 bp können erzeugt werden, indem komplementäre Oligonukleotidstränge miteinander hybridisiert werden. In dem Hybridisierungsansatz werden jeweils 50µl Oligonukleotid (75µg/ml in H2O) mit 10µl 1M NaCl vermischt und für 10 min bei 95°C erhitzt. Nach dem Abkühlen bei RT oder auf Eis kann die dsDNA in der Ligation eingesetzt werden. Der Anteil der hybridisierten Primer in der Annealingreaktion wird überprüft, indem ein Aliquot des Hybridisierungsansatzes in einer 5% igen Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennt wird.

2.2.8 DNA Fällung und Sequenzierung

DNA- Sequenzierungen werden von der Firma Agowa, Berlin durchgeführt. Dazu werden 50µl Vektor- DNA aus der Plasmidisolierung mit 1/10 Volumen 3M Na- Acetat pH 4,8 und 2,5fachem Volumen Ethanol versetzt und entweder sofort verschickt oder zuvor vollständig gefällt. Das heißt der Ansatz wird 30 min auf Eis inkubiert und die DNA anschließend durch Zentrifugation bei 14000xg 15 min pelletiert und getrocknet.

2.2.9 Agarose- Gelelektrophorese

Die Auftrennung von DNA Molekülen erfolgt mit Hilfe der Agarose- Gelelektrophorese. Die Beweglichkeit der DNA Moleküle in der Agarosematrix ist abhängig von der Porengröße des Gels und damit von der Agarosekonzentration. Alle Gelelektrophoresen werden mit 0,8-4% igen Agarosegelen durchgeführt.

Für ein 1%iges Minigel (50ml) werden 0,5 g Seakem LE Agarose (Biozym, Hess. Oldendorf) in 50ml 1x TBE Laufpuffer (90mM Tris- Base, 90mM Borsäure, 2mM EDTA, pH 8,0) durch Aufkochen gelöst und auf ca. 60°C abgekühlt. Der Agarose werden 0,25µg/ml Ethidiumbromid (Applichem) zugesetzt und anschließend wird der Ansatz in einen Gelträger gegossen. Nach dem Erstarren wird das Gel in die Elektrophoreseapparatur (Biorad, München) überführt und die DNA Proben [Seite 32↓]nach Zugabe von 1x Probepuffer (0,25% Bromphenolblau, 0,25% Xylen Cyanol FF, 10% Glycerol in 1x TBE) aufgetragen. Die Elektrophorese findet bei 150-200 V in 1 x TBE Laufpuffer für 10 min statt. Die Emission (λ560nm) des in die DNA interkalierten Fluoreszenzmittels unter der Anregung von UV Licht (λ300nm, Appligene UV Tisch) wird photographiert (Dokumentationssystem Intas, Göttingen). Zur Größenbestimmung der DNA Fragmente werden 0,5µg/ Spur 1kb ladder DNA Marker (Invitrogen) verwendet.

2.2.10 Polyacrylamid- Gelelektrophorese

Um DNA Fragmente der Größe von 40-150 bp zu trennen, wird anstelle eines Agarosegels ein Polyacrylamid-Gel (PAA- Gel) verwendet. 50ml eines 5%igen PAA- Gels werden durch Mischen von 8,3ml einer 30%igen Acrylamidlösung (Vernetzungsverhältnis 29:1) mit 5ml 10xTBE- Puffer und der entsprechenden Menge H2O hergestellt. Die Polymerisierung wird mit 500µl einer 10%igen APS Lösung und 33µl TEMED gestartet. Die Elektrophorese findet in 1x TBE Puffer für 2h bei 75V statt. Zur Größenbestimmung wird der 1kb Marker von Invitrogen verwendet.

2.2.11 DNA Isolation aus S. cerevisiae (verändert nach Kaiser et. al, 1994)

5ml einer Hefekultur aus der logarithmischen Wachstumsphase werden abzentrifugiert (2000xg, 3min) und das Pellet wird in 0,5ml 1M Sorbitol aufgenommen. Zu der Suspension wird eine Spatelspitze Zymolyase 20T (ICN, Eschwege) gegeben und der Ansatz für 60 min bei 37°C inkubiert. Die Protoplastierung wird mikroskopisch kontrolliert. Die Protoplasten werden bei 600xgfür 5 min pelletiert und zügig in 0,5ml 50mM Tris- HCl, 20mM EDTA (pH 7,4) und 0,05ml 100g/L SDS aufgenommen. Das Lysat wird schnell in ein Wasserbad überführt und bei 65°C unter gelegentlichem Schütteln für 30 min inkubiert. Anschließend werden 0,2ml einer 5M Kaliumacetatlösung zugegeben und der Ansatz für 60 min auf Eis gehalten. Die Proben werden bei 14000xg für 30 min zentrifugiert und der Überstand in ein mit 0,7ml Isopropanol gefülltem, neuem Eppendorfgefäß überführt. Die DNA wird für 5 min bei Raumtemperatur ausgefällt und anschließend für 10 s durch Zentrifugation bei 14000xg pelletiert. Das DNA Pellet wird in 300µl TE (10mM Tris- HCl pH 8,0, 1mM EDTA) mit 0,3µl RNAse A (Qiagen) versetzt resuspendiert, 10 min bei Raumtemperatur inkubiert und mit 30µl 3M Natriumacetat (pH4,8) und 0,2ml Isopropanol gemischt. Die DNA wird wiederum kurz abzentrifugiert und bei Raumtemperatur getrocknet. Abschließend wird die DNA in 100µl TE aufgenommen und bei –20°C gelagert.

2.2.12 Herstellung kompetenter E. coli Zellen

Der zu transformierende E.coli Stamm wird über Nacht bei 37°C in 5ml LB-Medium angezogen. Eine Hauptkultur von 100ml LB wird mit 2ml der Vorkultur beimpft und für etwa 2h bei 37°C inkubiert. Das Wachstum der Zellen wird bei einer Wellenlänge von 600nm über die optische Dichte (OD) kontrolliert. Bei einer OD von 0,4 wird das Wachstum gestoppt indem die Kultur für 5 min auf Eis gekühlt wird und die Zellen werden anschließend bei 2000xg in sterilen Greiner Röhrchen 10 min abzentrifugiert. Das Pellet wird in 40ml eiskaltem, sterilfiltriertem TFB1 (100mM RbCl, 50mM MnCl2, 30mM KAc, 10mM CaCl2, 15% [v/v] Glycerol, ad pH 5,8 mit 0,2M Essigsäure) resuspendiert und 5 min auf Eis inkubiert. Nach erneutem Pelletieren der Zellen wird der Überstand sorgfältig entfernt und die E. coli in 4ml eiskaltem, sterilfiltriertem TFB2 (10mM MOPS, 10mM RbCl, 75mM CaCl2, 15% [v/v] Glycerol, ad pH 6,5 mit KOH) aufgenommen. Abschließend werden die Zellen in 105µl Aliquots in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -70°C gelagert.

2.2.13 Transformation von E. coli

50µl kompetenter E.coli Zellen werden mit der zu transformierenden DNA vermischt und 15 min auf Eis inkubiert. Anschließend werden die Zellen für 2 min einem Hitzeschock von 42°C ausgesetzt und zügig in 0,5ml LB Medium aufgenommen. Zur Regeneration werden die E. coli 1 h bei 37°C inkubiert, bevor sie pelletiert und auf Selektivmedium ausplattiert werden. Die Inkubation erfolgt bei 37°C über Nacht.

2.2.14 Transformation von S. cerevisiae

Der zu transformierende S. cerevisiae Stamm wird über Nacht in 50ml YPD angezogen und bei einer Zelldichte von ca. 5x 107 Zellen/ml steril abzentrifugiert (2000xg, 5 min). Das Zellpellet wird einmal mit 10ml eiskaltem, sterilem H2O sowie einmal in 10ml eiskaltem 1M Sorbitol gewaschen und mit 1ml eiskaltem 1M Sorbitol in ein 1,5ml Eppendorfgefäß überführt. Nach kurzem Abzentrifugieren (30 Sekunden, 17900xg)wird das Zellpellet in 1 Vol eiskaltem 1M Sorbitol resuspendiert. 40µl dieser Zellsuspension werden für eine Elektroporation mit 2-5µl der zu transformierenden DNA in EQUIBIO Elektroporationsküvetten (2mm Elektrodenabstand, PeqLab, Erlangen) vermischt und 5 min auf Eis inkubiert. Die Elektroporation erfolgt bei 1500 V, 25 µF und 200 Ohm im Gene Pulser® (Biorad, München). Sofort anschließend werden die Zellen in 1ml eiskaltem 1M Sorbitol aufgenommen, in ein Eppendorfgefäß überführt und kurz abzentrifugiert (30 Sekunden, 17900xg).Der Überstand wird bis auf ca. 100µl Sorbitol entfernt, das Zellpellet resuspendiert und auf Selektivmedium ausplattiert. Die Inkubation erfolgt für 3-5 Tage bei 28°C.


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2.2.15  5´Fluoroorotsäure- shuffling (nach Boeke et al., 1987)

Die 5´Fluoroorotsäure (5´FOA; fluoro orotic acid)- shuffling Methode erlaubt, auf schnellem Weg ein essentielles, plasmidständiges Gen gegen eine mutierte Variante auszutauschen und konditional letale Mutationen festzustellen. Dazu wird die chromosomale Kopie des essentiellen Gens deletiert und die Überlebensfähigkeit des Stamms durch die Anwesenheit eines autonom replizierenden Plasmids sichergestellt, das sowohl eine intakte Kopie des essentiellen Gens als auch den URA3 Selektionsmarker trägt. Dieser sogenannte shuffle Stamm wird transformiert und ein zweites autonom replizierendes Plasmid, das die mutierte Genvariante und den LEU2 Selektionsmarker trägt, in die Zellen eingeführt. Mit Hilfe der negativen Selektion von 5´FOA wird das URA3 tragende Plasmid verdrängt, indem die LEU2 / URA3 prototrophen Stämme zweifach auf Selektionsmedium, das 1g/L 5´FOA enthält, überstempelt werden. Kolonien, die nach der 5´FOA Selektion Uracil bedürftig und Leucin prototroph sind, enthalten nur noch Plasmide, die die mutierte Genkopie tragen, und werden weiter untersucht. Das Prinzip der negativen Selektion basiert auf der Toxizität von 5´ Fluoroorotsäure für Uracil prototrophe Stämme. URA3 kodiert für die Orotidin- 5´Phosphat Decarboxylase, die in der Uracil Biosynthese benötigt wird, aber unter Anwesenheit von 5´FOA, dieses in das Zellgift 5- Fluorouracil umwandelt. Eine Schematische Darstellung der Generierung von PWt2G aus PWT2H16 mit Hilfe der Plasmid shuffling Methode zeigt Abb. 6A. Die Erzeugung der auf diese Weise in PWt2H16 eingeführten Plasmide beschreibt Abb. 6B.

Abb. 6: (A)Schematische Darstellung der Erzeugung von PWt2G aus PWT2H16 mit Hilfe der Plasmid shuffling Methode. Leucin tragende Plasmide, die auf diese Weise in PWt2H16 eingeführt werden, sind pRpt2H, pRpt2G, pΔNRpt2H sowie pΔNRpt2G (B)pRpt2H entsteht aus pRS315-H, indem das ca. 1,8 kbp RPT2 Gen einschließlich des 482 bp langen Promotorbereichs als XhoI- BamHI Fragment in pRS315-H ligiert wird. Mit Hilfe der angegebenen PCR Primer werden XhoI/ SacI und SacI/ XbaI Fragmente aus pRpt2H amplifiziert und in pRS315 ligiert. In pΔNRpt2H sind somit bp 1- 129 des RPT2 Gens deletiert. Das GFP Gen wird für die Erzeugung von pRpt2G sowie pΔNRpt2G als BamHI Fragment in pRpt2H bzw. pΔNRpt2H eingesetzt. pRpt2H-16 gleicht pRpt2H, trägt aber statt des LEU2 Gens das URA3 Gen und basiert damit auf dem pRS316 Vektor.

2.2.16 Markierung von Genen mit Hilfe der Homologen Rekombination

Die Insertion einer linearisierten DNA Sequenz erlaubt, essentielle Gene an ihrem 3´ Ende um eine beliebige Markierung zu verlängern (tagging) ohne das Gen dabei zu duplizieren. Dazu wird ein DNA Fragment, das die C- terminalen 200- 400 Basenpaare des zu markierenden Gens ligiert an die gewünschte Markierung, mindestens einen Selektionsmarker sowie eine beliebige 200-400 Basenpaare umfassende DNA Sequenz abwärts des zu markierenden Gens trägt, in Wildtyp Zellen eingebracht. Mittels homologer Rekombination zwischen 5´ bzw. 3´Bereich des DNA Fragments und den homologen Sequenzen des chromosomalen Genlocus findet bei Selektion auf das eingebrachte Markerprotein die Insertion des DNA Fragments statt. Die zur Herstellung der in dieser Arbeit verwendeten, linearisierten DNA Fragmente notwendigen Klonierungsschritte sowie die verwendeten Gene, Markierungen und selektierbaren Marker sind in Abb.7 und 8 dargestellt. Da es nicht zu einer Integration der eingeführten DNA kommt, sondern der Bereich zwischen den homologen Rekombinationsstellen ersetzt wird, werden mit dieser Technik keine DNA Bereiche dupliziert. Wird anstelle des DNA Fragments ein linearisiertes, integratives Plasmid eingesetzt, gibt es nur einen Bereich an dem die homologe Rekombination stattfindet und das gesamte Plasmid integriert am chromosomalen Genlocus ins Genom.


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Abb. 7: Insertion linearisierter DNA Fragmente durch homologe Rekombination. Das SacI/XhoI linearisierte Genfragment (1) wird mittels homologer Rekombination in den chromosomalen Genlocus von Rpn11 insertiert. Weitere in dieser Arbeit verwendete Markierungen und Gene sind in grauer Schrift angezeigt. Die zur Herstellung des Fragments notwendigen Klonierungsschritte verlaufen über pBSFlu (6), pBSFluRpn11HA (5), pBSFluRpn11GFPHA (4), pBSHU (7), pBSHURpn11-3´ (3) und pBSHURpn11GFPHA (2).


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Abb. 8: Struktur des RPN11-HA-TEV-ProA::URA3::HIS3 Fragment (1), das mit SacI/ XhoI linearisiert wird und mittels homologer Rekombination in den chromosomalen Genlocus von Rpn11 insertiert wird. Die zur Herstellung des Fragments notwendigen Klonierungsschritte verlaufen über pBSFluRpn11HA (4), pBSFluRpn11HATEVProA (2) und pBSHURpn11-3´ (3). Das NdeI/ XbaI Fragment (5), das für die TEV Schnittstelle und die zwei IgG bindenden Domänen codiert, wird mit Hilfe entsprechender Primer aus pZZ-HIS5 amplifiziert.

2.2.17 Erzeugung der NLS-GFPS Fusionsproteine

Potentielle NLS aus Rpt2, Rpt1 und Rpn2 sowie die Kontroll- NLS des SV40 T-Antigens und deren mutierte Variante werden mit GFP und dem Strep- tag II (S) fusioniert (Abb. 9). Der N- terminale Bereich von Rpt2 wird mittels PCR amplifiziert und über die HindIII und KpnI Schnittstellen in pYESGFPS ligiert. Alle anderen Konstrukte werden als komplementäre Oligonukleotidstränge miteinander hybridisiert und an den Restriktionsschnittstellen für HindIII und KpnI in den linearisierten pYESGFPS Vektor ligiert. Alle Konstrukte werden durch Sequenzierung der DNA überprüft. Die Transkription findet unter Kontrolle des GAL1 Promotors (PGAL1) und der Terminationssequenz CYC1 (TTCYC1) vom episomalen Vektor pYES statt.

Abb. 9: Potentielle cNLS der 19S Untereinheiten Rpt2 (1), Rpn2 (2) und Rpt1 (3) sowie die funktionelle SV40 NLS (4) und die mutierte SV40 NLS (5) werden wie abgebildet als GFP Fusionsprotein mit Strep- tag II Markierung (S) exprimiert.

2.3 Proteinbiochemische Methoden

2.3.1 Aufschlussverfahren von Hefezellen

Abgesehen von der Hefeprotein Schnellaufarbeitung nach Yaffe und Schatz, 1984 werden Hefezellen je nach den Anforderungen der darauffolgenden Anwendungen in einem Puffersystem mit oder ohne ATP und MgCl2 aufgearbeitet. Der ATP enthaltende Puffer A nach Saeki et al. (2000) besteht aus 50mM Tris- HCl (pH 7,5), 0,5mM EDTA (pH 7,75), 100mM NaCl, 10% Glycerol, 0,5mM Dithiothreitol, 2mM ATP, 10mM MgCl2, 20 U DNAseI (Roche, 10U/µl), EDTA free Complete Protease Inhibitor cocktail (Roche) und 0,25mM Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF). Der PB Puffer ohne ATP enthält 20mM Tris- HCl (pH 7,5), 150mM NaCl, 0,25mM PMSF, 20 U DNAseI sowie 10% Glycerol.


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2.3.1.1  Hefeprotein Schnellaufarbeitung nach Yaffe und Schatz, 1984

Zur analytischen Proteinaufarbeitung werden bis zu 1x 109 Zellen einer Hefekultur abzentrifugiert (30 Sekunden, 17900xg), das Pellet in 1ml H2O resuspendiert und die Zellen unter Zugabe von 160µl 1,85M NaOH und 85µl 2-β Mercaptoethanol 10 min auf Eis aufgeschlossen. Zur Fällung der Proteine wird der Ansatz mit 160µl 50% Trichloressigsäure (TCA) versetzt und weitere 10 min auf Eis inkubiert. Nach dem Zentrifugieren für 3 min bei 17900xg wird das Pellet mit 800µl eiskaltem Aceton gewaschen (3 Sekunden, 17900xg) und in entsprechendem Volumen 1x Proteinprobenpuffer (Laemmli, 1970) resuspendiert. Der pH-Wert wird mit 0,5M Tris (ungepuffert) auf ca. pH 6,8 eingestellt, die Proben 4 min bei 95°C erhitzt und unlösliches Material vor der Auftrennung in SDS PAGE abzentrifugiert (3 Sekunden, 17900xg).

2.3.1.2 Glasperlenaufschluss

Für präparative Proteinaufarbeitungen kleinen Maßstabs werden 300µl Zellpellet (ca. 5 x 109 Zellen) in 500µl des gewünschten Aufschlusspuffers resuspendiert, mit 300µl silikonisierter Glasperlen (425-600 µm Durchmesser, Sigma) versetzt und sieben Mal je eine Minute bei maximaler Leistung gevortextund dazwischen jeweils eine Minute auf Eis inkubiert. Um die Effizienz des Aufschlusses zu steigern kann der Ansatz dabei mehrfach in flüssigem Stickstoff schockgefroren und wieder aufgetaut werden. Abschließend werden die Zellreste bei 17000xg für 10 Minuten bei 4°C zusammen mit den Glasperlen pelletiert und die löslichen Proteine im Überstand bis zur weiteren Verwendung auf Eis gehalten.

2.3.1.3 Aufschluss unter flüssigem Stickstoff

Für präparative Proteinaufarbeitungen größeren Maßstabs werden bis zu 1,5 x 1010 Zellen einer Hefekultur für 3 min bei 5000 rpm (Beckman Avanti J-25, GS3) geerntet, einmal in dem gewünschten Puffer gewaschen (3 min, 5000 rpm Beckman Avanti J-25) und das Pellet anschließend in 1 Vol Puffer resuspendiert. Bevor die Zellen in flüssigem Stickstoff schockgefroren werden, werden Mörser und Stößel in flüssigem Stickstoff vorgekühlt. Der Aufschluss erfolgt unter ständiger Stickstoffzugabe bis das Zellpellet pulverisiert ist. Nach dem Auftauen auf Eis oder bei Raumtemperatur wird der Zellextrakt für 20 min bei 14000 rpm (Beckman Avanti J-25, SS34) und 4°C zentrifugiert. Bis zur weiteren Verwendung wird der Überstand auf Eis aufbewahrt.

2.3.1.4 French- Press Aufschluss

Die höchste Proteinextraktausbeute wird mit dem Aufschluss in der French® Pressure cell (AMINCO, 40000 psi Zelle) erreicht. Dazu werden bis zu 6 x 1010 Zellen wie zum Aufschluss unter flüssigem Stickstoff, pelletiert, gewaschen und in 1 Vol Puffer resuspendiert. Bei 1000psi werden die Zellen bis zu dreimal in der French Press Zelle aufgeschlossen. Die Lysate werden für 20 min bei 14000 rpm (Beckman Avanti J-25, SS34) und 4°C zentrifugiert und der Überstand bis zur weiteren Verwendung auf Eis gehalten.

2.3.2 Immunpräzipitation

2.3.2.1 HA Tag

Immunpräzipitationen von HA Fusionsproteinen werden in Puffer PB durchgeführt. 2ml Zellextrakt eines French Press Zellaufschlusses werden mit 200µl Protein A- Sepharose CL-4B (Pharmacia) für 3 Stunden bei 4°C inkubiert, um unspezifisch an die Sepharose bindende Proteine zu entfernen. Die Protein A Sepharose wird abzentrifugiert (2000xg, 2 min), dreimal mit Puffer PB gewaschen und in 1 x Proteinprobenpuffer aufgekocht. Das vorgeklärte Lysat wird mit 10µl mAb12CA5 (4µg Protein, Boehringer Mannheim) versetzt und über Nacht bei 4°C rollierend inkubiert. 100µl Protein A- Sepharose wird zum Zellextrakt gegeben und der Ansatz für 4 Stunden bei 4°C rolliert, um die HA Immunpräzipitate zu binden. Die Protein A- Sepharose wird durch Zentrifugation sedimentiert (2000xg, 2 min), dreimal mit 1,5ml Puffer PB gewaschen und in 1 vol einmal Probenpuffer aufgekocht. Die gebundenen Proteine werden durch SDS PAGE und Immunoblot identifiziert.

2.3.2.2 Standard IgG Sepharose Affinitätschromatographie

Für die Standard IgG Sepharose Affinitätschromatographie wird der Zellextrakt bei Raumtemperatur zweimal über 1/ 25 Zelllysatvolumen IgG Sepharose (6 Fast Flow/ Amersham Bioscience oder Cappel/ ICN, Eschwege) gegeben. Das Säulenmaterial wird mit 50 vol des verwendeten Aufschlusspuffers gewaschen und gebundene Proteine werden mit viermal 1ml 0,5M HOAc/NH4Oac (pH 3,4) eluiert.


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2.3.2.3  Sequenzielle IgG Sepharose Affinitätschromatographie

Die sequentielle IgG Sepharose Affinitätschromatographie wird verwendet, um einzelne 26S Subkomplexe nativ aus PWn11HTP Lysaten zu gewinnen. Bis zur Elution der gebundenen Proteine wird das Protokoll der Standard Affinitätschromatographie verfolgt. Dabei wird als Aufschluss- und Waschpuffer immer Puffer A verwendet. Zur Elution werden zunächst alle assoziierten Proteine mit 4ml Puffer B (Puffer A ohne MgCl2 und ATP) abgelöst. Das 20S Proteasom eluiert vom 19S Regulatorkomplex mit 4ml Puffer B300 (Puffer B mit 300mM NaCl) und der 19S Base löst sich vom Lid Komplex mit 4ml Puffer B600 (Puffer B mit 600mM NaCl). Nach einem Waschschritt mit 10ml Puffer B wird der 19S Lid Komplex mit 10U TEV Protease (Invitrogen) pro 100µl Säulenmaterial für 3 Stunden bei Raumtemperatur eluiert.

2.3.2.4 Strep- tag II Affinitätschromatographie

Strep markierte Proteine werden über Strep-Tactin® Sepharose (Institut für Bioanalytik GmbH) eluiert. Zellaufschluss und Waschschritte finden bei diesem Aufschluss in Puffer W (0,1M Tris- HCl pH 8,0; 1mM EDTA pH 8,0) statt. Um biotinylierte Proteine, die unspezifisch an Strep tag II binden, aus dem Lysat zu entfernen, wird es für 30 Minuten bei 4°C mit ca. 40µg Avidin (Sigma) pro ml Lysat vorgeklärt. Vor Inkubation des Säulematerials mit ca. 40 vol Zellextrakt für 2 Stunden bei 4°C wird die StrepTactin Matrix mit 20 vol Puffer W gespült und der pH Wert des Zelllysats mit ungepuffertem 0,5M Tris auf pH 8,0 eingestellt. Die beladene Strep-Tactin® Sepharose wird in Poly- Prep® Chromatographie Säulen (Biorad) transferiert und zweimal mit 10 Bettvolumen Puffer W gewaschen. Die Elution der Strep markierten Proteine oder Komplexe erfolgt mit 6 x 0,5ml 5mM Desthiobiotin in Puffer W.

2.3.3 Proteinfällung und Proteinbestimmung

Die Fällung nativer Proteine erfolgt durch Zugabe von 1/10 Vol 72% (w/v) TCA sowie 1/10 Vol 0,15% (w/v) Natriumdesoxycholat bei 4°C für 20 min. Zum Einengen werden die Proteine 15 min bei 17900xg zentrifugiert. Das Pellet wird einmal mit 100% Aceton gewaschen und in 1x Proteinprobenpuffer resuspendiert.

Proteinkonzentrationen werden mit Hilfe des Protein Assay Konzentrats von Biorad (München) nach Bradford (1976) bestimmt. Die Verdünnung des Bradford Reagenz und der Probe erfolgen nach Herstellerangaben. Die Komplexierung von Protein mit Coomassie Blue G250 wird nach 15 min Inkubation bei Raumtemperatur anhand der Extinktion bei 595nm im Photometer (UltraspecIII, Pharmacia) gegen einen Nullwert gemessen. Zur Erstellung einer Eichkurve werden BSA Lösungen definierter Konzentrationen (1-10µg/ml) verwendet.

2.3.4 SDS PAGE

Die Auftrennung von Proteinen nach ihrem Molekulargewicht erfolgt durch SDS PAGE (Sodiumdodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis) nach Laemmli (1970). Standardmäßig werden 0,75mm dicke Gele mit einer Lauflänge von ca. 6 cm in dem Protean- Mini II sowie III System von Biorad verwendet. Für zwei 12% ige Trenngele werden 4ml 30% ige Acrylamidlösung (Vernetzungsverhältnis 37,5:1; Applichem), 2,5ml 1,5M Tris- HCl pH 8,8, 100µl 10% w/v SDS und 3,5ml H2O mit 50µl 10% Ammoniumpersulfatlösung (APS) und 5µl N,N,N´,N´- Tetramethylethylendiamid (TEMED) vermischt und zügig in die Gelkammern gegossen. Zur Herstellung zweier 4% iger Sammelgele werden 650µl 30% Acrylamid, 1,25ml 0,5M Tris- HCl pH 6,8, 50µl 10% w/v SDS, 3,05ml H2O, 25µl 10% APS sowie 5µl TEMED vermengt. Die elekrophoretische Auftrennung erfolgt in 1x Laufpuffer ( 25mM Tris; 192mM Glycin; 0,1% w/v SDS) für ca. 45 min bei 200 V. Als Proteingrößen- Marker dient entweder der RainbowTM Proteinmarker (Amersham) mit den Proteinen der Größen 200 kDa, 97,4 kDa, 69 kDa, 46 kDa, 30 kDa, 21,5 kDa und 14,3 kDa oder der low range Marker (NEB) mit Proteinen der Größen 175 kDa, 83 kDa, 62 kDa, 47,5 kDa, 32,5 kDa, 25 kDa, 16,5 kDa und 6,5 kDa.

2.3.5 Coomassie Färbung

Das Gel wird in die Färbelösung (0,2% [w/v] Coomassie- Brilliant- Blue R250, 30% [v/v] Methanol und 10% [v/v] Essigsäure in H2O; zuerst Farbstoff in Methanol über Nacht lösen) kurz in der Mikrowelle aufgekocht und für ca. eine Stunde bei Raumtemperatur abgekühlt oder über Nacht gefärbt. Zur Entfärbung wird das Gel entnommen und in mehrfach gewechselter Entfärbelösung (45% [v/v] Methanol, 10% [v/v] Essigsäure in H2O) solange entfärbt, bis der nicht proteingebundene Farbstoff entfernt ist. Um die Gele zu konservieren werden sie zwischen Geltrocknungsfolie (Promega), die von Geltrocknungspuffer (40% [v/v] Methanol, 7,5% [v/v] Essigsäure, 10% [v/v] Glycerol) durchnässt ist, in eine Geltrocknungsapparatur gespannt und für 3-4 Tage getrocknet.

2.3.6 Western Blot Analyse

Zunächst werden die Proteine mittels Nass- Blot- System (Biorad) oder Semi- dry- blotting Apparatur (PeqLab) nach einer SDS- PAGE auf Nitrocellulose (NC)- Membran (Optitran BA-S, Schleicher & Schuell) transferiert. Das Nass- Blot- System wird nach Angaben des Herstellers [Seite 38↓]luftblasenfrei und mit jeweils drei Lagen 3MM Whatman Papier zwischen Blotschwämmen und dem Gel-/ NC-Membran Sandwich zusammengebaut. Der Proteintransfer aus dem Gel erfolgt in Transferpuffer (12,5mM Tris, 95mM Glycin, 0,1% SDS, 20% [v/v] Methanol) für eine Stunde bei 70 V und ca. 300 mA bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 25 V und ca. 75 mA bei 4°C. Im Semi- dry- blotting System werden drei Lagen 3 MM Whatman Papier gefolgt von NC Membran, Gel, und weiteren drei Lagen Whatman Papier blasenfrei auf die Graphit Anode geschichtet und nachdem die Kathode aufgelegt ist, wird mit einer Stromstärke von ca. 2 mA/ cm2 Filterfläche für eine Stunde geblottet. Anschließend wird der Proteinmarker auf der Membran mit Kugelschreiber nachgezeichnet und der Blot zur Kontrolle der Effizienz des Proteintransfers in Amidoschwarzlösung (30% [v/v] Methanol, 10% Essigsäure, 0,1% Amidoschwarz) angefärbt und nicht gebundener Farbstoff mit H2O abgespült.

Für die Immunfärbung wird der Western Blot für 30 min in 5% w/v Magermilchlösung bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert und anschließend über Nacht in dem gegen das zu detektierende Protein oder Peptid gerichtetem Primär- Antikörper in 5% w/v Magermilchlösung bei 4°C schüttelnd inkubiert. Der Blot wird bei Raumtemperatur dreimal für ca. 15 min in TST (50mM Tris- HCl pH 7,4, 150mM NaCl, 0,1% Tween 20) gewaschen und mit dem gegen den Primär- Antikörper gerichteten Sekundär- Antikörper in 5% w/v Magermilchlösung für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. In der Arbeit verwendete Primär- und Sekundär- Antikörper sind in Tab.6 zusammengefasst. Die sekundären Antikörper- Peroxidase- Konjugate werden in der Chemolumineszenz Detektion sichtbar gemacht. Dazu wird der Blot für eine Minute in ca. 20ml ECL Reagenz (100mM Tris pH 8,5; 1,25mM Aminophtalhydrazide (Luminol, Fluka), 0,2mM Coumarinsäure; 0,01% H2O2) bei Raumtemperatur inkubiert und danach luftblasenfrei in durchsichtige Folien gelegt. In einer Expositionskassette wird ein UV- Film (X-OMAT UV Film, Kodak) auf den Blot gelegt und der Film exponiert (maximal 5 Minuten). Die Entwicklung des Films erfolgt in der Entwicklermaschine CAWOMAT 2000 IR (CAWO GmbH).

Tab. 6: Im Western Blot verwendete primäre und sekundäre Antikörper

Primäre Antikörper

Spezies

Eingesetzte Verdünnung

Referenz

anti- HA.11 16B12

Maus

1:1000

Babco

anti- Pre2/ β5

Kaninchen

1:1000

Heinemeyer et al., 1997

anti- Cim3/ Rpt6

Kaninchen

1:5000

Ghislain et al., 1993

anti- GFP

Kaninchen

1:500

Clontech

anti- Karyopherin α

Kaninchen

1:3000

Enenkel et al., 1995

anti- Karyopherin β

Kaninchen

1:3000

G. Blobel

anti- Ubiquitin

Kaninchen

1:3000

DAKO

anti- Rpt2 (human)

Kaninchen

1:500

PW8305, Affiniti

Sekundäre Antikörper

Spezies

Eingesetzte Verdünnung

Referenz

anti- Kaninchen IgG- POD

Ziege

1:10000

DIANOVA

anti- Maus IgG- POD

Kaninchen

1:10000

DIANOVA

2.3.7 Proteaseassay mit fluorogenen Substraten

10µl einer Dichtegradientenzentrifugationsfraktion oder eines verdünnten Zelllysats wird mit 100µl Substratpuffer (50mM Tris- HCl pH 7,5; 5mM MgCl2; 0,05mM Peptidsubstrat) werden in 96-Loch- Mikrotiterplatten (Greiner) vermischt und für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Bei Aufarbeitungen unter Anwesenheit von ATP enthält der Substratpuffer ebenfalls ATP in einer Konzentration von 2mM. Werden die Aktivitäten mehrerer Gradienten verglichen, findet die Messung in der gleichen Mikrotiterplatte statt. Als fluorogene Substrate werden Z- leu- leu- glu- β Naphthylamid (Bachem) und Z- leu- leu- glu- 7- amino- 4- methyl- Coumarin (Calbiochem) als Test auf PGPH (peptyl- glutamyl- peptide bond hydrolyzing)- Aktivität sowie Suc- leu- leu- val- tyr- 7- amino- 4- methyl- Coumarin (Bachem) als Test auf chymotrypsinähnliche Aktivität des Proteasoms verwendet. Die Fluoreszenz der abgespaltenen fluorogenen Gruppen wird im Fluorostar Fluorimeter (SLT) mit Easy Software bei einer Anregungswellenlänge von 390nm bzw. 355nm und einer Abstrahlungswellenlänge von 460nm bzw. 405nm für die Abgangsgruppen 7-amino-4-methyl Coumarin (AMC) bzw. β- Naphthylamid gemessen.

2.3.8 Dichtegradientenzentrifugation

Die in Dichtegradienten aufgetrennten Lysate stammen vorwiegend aus Zellaufschlüssen unter flüssigem Stickstoff. 10-40% ige Glycerolgradienten werden im Gradientenmischer aus 5,7ml 10% iger Glycerollösung (10% [v/v] Glycerol in PB oder Puffer A) und 5,9ml 40% iger Glycerollösung (40% [v/v] Glycerol in PB oder Puffer A) in TH-641 oder SW40 Zentrifugenröhrchen (Beckman) vom Grund des Zentrifugenröhrchens gegossen. Der Gradient wird mit maximal 800µl Zelllysat überschichtet und für 16 Stunden bei 40.000 rpm im SW40 Rotor (Beckman) oder im TH-641 Rotor (Sorvall) bei 4°C zentrifugiert. 600µl Fraktionen werden von der Öffnung des Röhrchens beginnend abpipettiert und auf Eis gehalten. Soll die relative proteasomale Aktivität gemessen werden, wird aus allen Fraktionen der Proteingehalt nach Bradford sowie die Proteaseaktivität gegen das [Seite 39↓]entsprechende fluorogene Substrat bestimmt. Aus dem Rest der Fraktion werden die Proteine über TCA ausgefällt und mittels SDS PAGE und Westernblot Analyse untersucht.

2.3.9 Far Western Analyse

NLS enthaltende Proteine werden mit Hilfe der Far Western Analyse mit Karyopherin α- ProA als Bindungspartner detektiert. Dazu werden MFY Zellen aus der logarithmischen Wachstumsphase unter Verwendung von Puffer PB mit EDTA freiem Complete Protease Inhibitor Cocktail (Roche) in der French Pressure Cell aufgeschlossen. Die Zellreste werden entfernt (14000xg, 20 min) und das Lysat in flüssigem Stickstoff und anschließend bei –80°C bis zum Gebrauch tiefgefroren. Proteine oder Proteinkomplexe, die in der Far Western Analyse untersucht werden, werden im SDS PAGE Verfahren aufgetrennt und im Semi- dry- blot Verfahren unter Verwendung von Aminocapronsäurepuffer (10mM Aminocapronsäure, 10% Methanol) auf PVDF- Membran transferiert. Die PVDF- Membran wird vor dem Transfer in 100% Methanol aktiviert. Ohne vorherige Amidoschwarzfärbung wird der Blot direkt nach dem Transfer in Renaturierungspuffer (50mM HEPES pH 7,3; 100mM KOAc; 5mM MgOAc; 0,3% Tween; 0,5% BSA) bei 4°C über Nacht inkubiert. Die Membran wird für 30 Minuten in Blocking- Lösung (5% Magermilchpulver in PBST [80g/L NaCl; 2g/L KCl; 14,4g/L Na2HPO4; 2,4g/L KH2PO4; pH 7,4 mit HCl; 0,1% v/v Tween20]) bei Raumtemperatur geschwenkt. Werden NLS-GFPS Konstrukte untersucht erfolgt anschließend eine Inkubation in 10ml Blocking- Lösung die 20% CEY1b Lysat enthält, während bei der Untersuchung von Kernlokalisationssequenzen in 19S proteasomalen Untereinheiten 100% CEY1b Lysat verwendet wird. Als Kontrolle werden identisch behandelte Membranen in 10ml Blocking- Lösung mit 10µg Protein A inkubiert. Nach der Inkubation für 4 Stunden bei 4°C werden die Membranen dreimal 15 Minuten in PBST gewaschen, anschließend für eine Stunde in 5% Magermilchpulver mit Peroxidase gekoppeltem anti- Maus IgG Antikörper (1:10000) bei Raumtemperatur geschwenkt und danach wiederum dreimal 15 Minuten in PBST gewaschen. Mittels ECL Detektion werden NLS beinhaltende Proteine, die an Karyopherin α- ProA gebunden sind, nachgewiesen.

2.3.10 Direkte Fluoreszenzmikroskopie

Für die in vivo Lokalisation fluoreszenter Proteine werden die Zellen aus Selektivmedium soweit nicht anders angegeben bis zur frühen logarithmischen Wachstumsphase in YPD bei 28°C oder 37°C angezogen, einmal mit sterilem Wasser gewaschen und bis zur Mikroskopie auf Eis gehalten.

In der Fluoreszenzmikrokopie wird das Leica DMR Mikroskop mit Quecksilberlampe HBO 50 W (Osram) und einem 100 x Ölimmersions- Objektiv (PL Fluotar) mit einer maximalen numerischen Appertur von 1,4 verwendet. Die für das jeweilige Fluorophor benutzten Filterblöcke sind in Tab. 7 zusammengefasst. Die Dokumentation erfolgt mit der Hamamatsu C5985 CCD Kamera in Verbindung mit der MetaVue Software (Visitron Systems, Puchheim) bei identischen Belichtungszeiten für alle Aufnahmen (2 sec, 2 fach gain). Zur Bestimmung der Pixelintensität von Rpn1-GFP und Rpn11-GFP in srp1-49 und SRP1 Zellen wird in Aufnahmen gleicher Belichtungszeit mit Hilfe des MetaVue Systems eine quadratische Fläche von etwa der Größe eines Fünftels des Zellkerns im Zytoplasma sowie im Zellkern gewählt und die durchschnittliche Pixelintensität dieser immer gleich großen Flächen berechnet. Mindestens 20 cytoplasmatische und nukleäre Werte von verschiedenen Aufnahmen werden gemittelt und das Verhältnis der Pixelintensitäten dieser Mittlungen für jeden Stamm berechnet, indem der Quotient aus der durchschnittlichen cytoplasmatischen und der durchschnittlichen nukleären Pixelintensität gebildet wird.

Tab. 7: In der direkten und indirekten Fluoreszenzmikroskopie verwendete Filterblöcke

Fluorophor

Wellenlänge (λmax)

Wellenlänge Filterblock

Filterblock

EGFP

488nm Exitation

507nm Emission

495nm Exitation
425nm Emission

FITC/ L4

ECFP

433nm Exitation

475nm Emission

440nm/ 20nm Exitation

480nm/ 30nm Emission

CFP

EYFP

513nm Exitation

527nm Emission

500nm/ 25nm Exitation
545nm/ 35nm Emission

YFP

Cy3™

552nm Exitation

568nm Emission

535nm/ 25nm Exitation
610nm/ 38nm Emission

Cy3™/ TRITC N2.1

DAPI

365nm Exitation

418nm Emission

340nm/ 80nm Exitation

425nm Emission

UV

2.3.11 Immunfluoreszenz

Für die indirekte Immunfluoreszenz werden ca. 100ml Zellen einer Zelldichte von ca. 1 x 107 Zellen/ml pelletiert und zweimal in PBS gewaschen. Durch Inkubation in 1ml Formaldehydlösung (3,7% Paraformaldehyd in PBS) für 3 Minuten bei Raumtemperatur werden die Zellen fixiert und anschließend zügig abzentrifugiert, um sie in zweimal 10ml PBS zu waschen. Das Pellet wird in 1 [Seite 40↓]Vol Protoplastierungspuffer (218,6g/L Sorbitol, 17,4g/L KH2PO4, 7,0g/L Citrat) aufgenommen und mit 1/10 vol Glusulase sowie 1/100 Vol 1% Zymolyaselösung (Zymolyase 20T [ICN] in Protoplastierungspuffer) versetzt. Der Ansatz wird 90 Minuten bei 37°C inkubiert und dabei mehrfach invertiert. Die Protoplasten werden dreimal in 1,1M Sorbitol gewaschen (5 min, 2000xg) und das Pellet anschließend in 200 Vol Protoplastierungspuffer resuspendiert. Je ein Tropfen Protoplastenlösung wird in jede Vertiefung eines 15 well multitest Objektträgers gegeben, der zuvor mit 0,1% Poly- L- Lysin Lösung (MW 400 kDa, Sigma) beschichtet wurde. Nach 3-5 Minuten wird der Überstand vorsichtig entfernt und der Objektträger für 5 min in eiskaltes, sauberes Methanol getaucht bevor er für 30 Sekunden in sauberem Aceton inkubiert wird. Zum Trocknen wird der Objektträger kurz an der Luft geschwenkt. Zum Blockieren unspezifischer Bindungsstellen wird in jede Vertiefung für 10 Minuten ein Tropfen einer 1% igen BSA (bovine serum albumin)- Lösung in PBS gegeben. Nach Entfernung der Lösung wird sofort die Primärantikörperlösung wie folgt aufgetragen und über Nacht bei 4°C in einer feuchten Kammer auf dem Objektträger inkubiert: für den Nachweis HA markierter Proteine wird mAb12CA5 (Boehringer Mannheim) in einer Verdünnung von 1:100 und für den Nachweis verschiedener Nukleoporine wird der mAB414 Antikörper in einer Verdünnung von 1:500 in 1% BSA/ PBS eingesetzt. Der Primärantikörper wird entfernt und alle Vertiefungen dreimal mit 1% BSA/ PBS gewaschen, wobei jeder Waschgang 2 min einwirken gelassen wird. Als Sekundärantikörper wird Cy3™ gekoppelter Esel anti Maus IgG Antikörper (1:100 Verdünnung in 1% BSA/ PBS, Dianova) für mAb12CA5 und FITC gekoppelter Ziege anti Kaninchen IgG für mAB414 Antikörper (1:50 Verdünnung in1% BSA/ PBS, R. Schekman, Berkeley) verwendet und für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Es folgen sechs Waschgänge in1% BSA/ PBS, wobei nach dem dritten Waschgang für 20 min DAPI (4,6- Diamino- 2- phenylindol) Färbelösung (1%) aufgetragen wird. Abschließend werden die Zellen in Moviol eingebettet und mit einem Deckglas abgedeckt. Die Mikroskopie erfolgt mit den in Tabelle beschriebenen Filterblöcken.


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29.09.2004