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3  Ergebnisse

3.1 Funktioneller Austausch endogener 19S proteasomaler Untereinheiten gegen GFPHA, ProA oder HA markierte Varianten

Um den 19 S Regulator in vivo in S. cerevisiae lokalisieren zu können, werden die endogenen Kopien von Rpn1 als repräsentative 19S Lid Untereinheit und Rpn11 als repräsentative 19S Base Untereinheit mittels homologer Rekombination gegen die GFP-HA (green flourescent protein- Haemagglutinin epitop) markierten Varianten ausgetauscht. HIS3 und URA3 werden dabei als Selektionsmarker eingesetzt. Durch Transformation von wt Stämmen werden die RPN1-GFP-HA::URA3::HIS3 und RPN11-GFP-HA::URA3::HIS3 Konstrukte an den gewünschten Stellen des RPN1 bzw. RPN11 Gens eingefügt und die Stämme PWn1GH und PWn11GH erzeugt (vgl. Abb. 7). Da Rpn1 und Rpn11 von essentiellen und einmalig im Genom vorhandenen Genen kodiert werden (Glickman et al., 1998b;Rinaldi et al., 1998), erfolgt der chromosomale Austausch dieser Untereinheiten durch Fusionsproteine nur dann, wenn die Fusionsproteine funktionell sind. Sowohl der Austausch von Rpn1 als auch von Rpn11 durch die GFP-HA oder Protein A markierten Varianten erbrachte lebensfähige Zellen. In der Western Blot Analyse aus Zellaufschlüssen dieser Stämme lassen sich GFP-HA markierte Proteine der molekularen Massen von 137 kDa (Rpn1-GFPHA) sowie 62 kDa (Rpn11-GFPHA) nachweisen (Abb. 10A). Beide Stämme (PWn1GH, PWn11GH) haben mit dem wt (WCGa) vergleichbare Wachstumsraten (Abb. 10B). Die in vivo Lokalisation von Rpn1-GFPHA und Rpn11-GFPHA in Zellen der logarithmischen Wachstumsphase ist sowohl im Temperaturoptimum (28°C), als auch unter Temperaturstress (37°C) vorwiegend nukleär (Abb. 10C). Die beobachtete cytoplasmatische Färbung erreicht nur ca. 1/5 der Intensität der nukleären Färbung.


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Abb. 10 (A) Zellextrakte von PWn1GH (1) und PWn11GH (2) wurden in der SDS PAGE aufgetrennt und in der Western Blot Analyse mit anti- HA Antikörper untersucht. (B) Stämme, die Rpn1-GFPHA (linke Abb.) oder Rpn11-GFPHA (rechte Abb.) exprimieren, wachsen bei 28°C und 37°C mit vergleichbarer Wachstumsrate wie der Wildtyp Stamm WCGa. (C) In vivo Lokalisation von GFPHA markiertem Rpn1 (obere Abb.) sowie Rpn11 (untere Abb.) in PWn1GH und PWn11GH. Die fluoreszierenden Untereinheiten werden in direkter Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht, indem der FITC Filterblock (rechts) oder simultan FITC Filterblock und Normarski Filter (links) verwendet werden.

Enenkel und Mitarbeitende (1998) beschreiben die proteasomale Lokalisation in S. cerevisiae Zellen als Kernmembran/ER assoziiert. Die Färbung von Zellkern und Endoplasmatischem Retikulum (ER) lässt sich aufgrund der geringen Größe von Saccharomyces cerevisiae Zellen in der direkten Fluoreszenzmikroskopie nur schwer auflösen, so dass nicht zu bestimmen ist, ob die markierten Untereinheiten im oder am Zellkern lokalisieren. Deshalb werden Stämme erzeugt, in denen endogenes Rpn1 oder Rpn11 jeweils gegen die CFP-HA (cyan fluorescent protein) markierte Variante ausgetauscht ist und zugleich GFP markiertes Nukleoporin Nup49, ER- ständiges Protein Pdr5* oder Plasmamembranprotein Pdr5 von autonom replizierenden Plasmiden mit Centromer Sequenz exprimiert wird (PWn1Cn49G, PWn1Cp5G, PWn11Cn49G und PWn11Cp5G). Nup49, Pdr5 und Pdr5* dienen dabei als Marker für die beschriebenen Zellstrukturen (Bucci und Wente, 1998; Egner et al., 1995). Durch direkte Fluoreszenzmikroskopie mit Filterblöcken für FITC/ GFP und CFP werden beide mit Fluorophoren markierten Proteine parallel in der gleichen Zelle lokalisiert (Abb. 11A). CFP-HA markierte 19S Untereinheiten colokalisieren in der logarithmischen Wachstumsphase weder eindeutig mit dem ER- ständigen oder Plasmamembran ständigen Protein Pdr5* bzw. Pdr5 noch mit Nukleoporin Nup49, sondern zeigen vorwiegend Kernlokalisation. Eine Colokalisation von Rpn1 und Nup49 wird jedoch beobachtet, wenn die Zellen vor der direkten Fluoreszenzmikroskopie für 45 min in Wasser inkubiert werden (Abb. 11B). Zwei weitere in dieser Arbeit betrachteten 19S Base [Seite 43↓]Untereinheiten (Rpt2 und Rpn2) sind unter Standardbedingungen (28°C) ebenfalls vorwiegend im Zellkern lokalisiert (vgl. Ergebnisse Kap. 3.5 und Kap. 3.6).

Abb. 11:(A) Parallele Fluoreszenzmikroskopie der in vivo Lokalisation von Rpn1-CFPHA oder Rpn11-CFPHA und Markerproteinen bestimmter Zellkompartimente. In Zellen, deren endogenes Rpn1 bzw. Rpn11 gegen die CFPHA markierte Variante ausgetauscht ist, werden die GFP markierten Varianten von Nup49, Pdr5* bzw. Pdr5 als Nukleoporin-, Endoplasmatisches Retikulum- bzw. Zellmembranmarker von Centromer tragenden Plasmiden exprimiert. Fluoreszierende 19S Untereinheiten werden mit dem CFP Filterblock (links), GFP markierte Proteine mit dem FITC Filterblock (rechts) aufgenommen und mit der Software Adobe Photoshop 6.0 ineinander kopiert (Mitte). (B) Zellen, die CFPHA markiertes Rpn1 sowie GFPHA markiertes Nup49 exprimieren, werden aus der logarithmischen Wachstumsphase für 45 min in Wasser inkubiert und die i n vivo Lokalisation der Fluorophore wie unter 11 (A) mittels direkter Fluoreszenzmikroskopie untersucht.

Die Markierung der 19S Untereinheiten mit Proteinen der Größe von GFP (28kDa) [Seite 44↓]könnte den Einbau dieser Untereinheit in den 19S Komplex beeinträchtigen. Um zu belegen, dass die markierten Untereinheiten vollständig im 19S/26S Komplex eingebaut sind, werden PWn1GH und PWn11GH Lysate in 10-40% iger Glycerol- Dichtegradienten Zentrifugation aufgetrennt und alle Fraktionen in der Western Blot Analyse auf Anwesenheit der 19S Base Untereinheit Cim3/Rpt6, der 20S Untereinheit α1/ Scl1 sowie des GFP-HA markierten Proteins überprüft (Abb.12). Rpn1-GFPHA und Rpn11-GFPHA sedimentieren in den Gradienten im wesentlichen wie Cim3/Rpt6 und α1/ Scl1 in den Fraktionen 10 bis 20, sind aber zu geringen Anteilen auch in den Fraktionen 8 und 9 nachweisbar.Es sind keine freien, markierten Untereinheiten in den langsam migrierenden Fraktionen (vgl. Fraktionnr. 1-4) zu detektieren.

Abb. 12: PWn1GH und PWn11GH Lysate werden im Glyceroldichtegradienten sedimentiert und die angegebenen Fraktionen in der SDS PAGE aufgetrennt. In der folgenden Western Blot Analyse werden die HA markierten Untereinheiten, Rpt6 sowie α1 mit den entsprechenden Antikörpern detektiert.

Die Analyse im Glycerolgradienten lässt keine Aussage über die Zusammensetzung des mit den markierten Untereinheiten assoziierten Komplexes zu. Deshalb werden Rpn1 und Rpn11 C- terminal mit Protein A markiert und die Komplexe, in denen diese Untereinheiten inkorporiert sind, in einer Coimmunpräzipitation an IgG Sepharose isoliert. Der Austausch der endogenen Proteine gegen ihre Protein A markierten Varianten erfolgt mit Hilfe der homologen Rekombination von RPN1-ProA::URA3::HIS3 und RPN11-ProA::URA3::HIS3 in die Genloci von RPN1 und RPN11 (PWn1P, PWn11P). Die Protein A Markierung umfasst hierbei fünf IgG bindende Domänen (insgesamt 30 kDa). Rpn1-ProA und Rpn11-ProA assoziierte Komplexe werden mittels Standard IgG Sepharose Affinitätschromatographie aus PWn1P und PWn11P Lysaten aufgearbeitet und in der SDS PAGE aufgetrennt [Abb. 13 (1) und (2)]. Die Coomassie gefärbten Proteine aus PWn1P Lysaten werden in der Analyse durch Fingerprint Massenspektroskopie den 19S regulatorischen Untereinheiten, Ecm29 und Ubp6 zugeordnet. Mit Ausnahme der unterrepräsentierten Untereinheit Rpn10 ist die Stöchiometrie der einzelnen Proteine zueinander nahezu identisch. In Abhängigkeit des gewählten Aufschlusspuffers lässt sich in der IgG Sepharose Affinitätschromatographie der 19S Regulator oder das gesamte 26S Proteasom isolieren. In Puffer PB copräzipitieren mit der Protein A markierten [Seite 45↓]Untereinheit lediglich 19S Untereinheiten, während in dem ATP und MgCl2 enthaltenden Puffer A 26S Proteasomen präzipitiert werden können [Abb. 13 (3)]. Die Funktionalität der markierten Untereinheiten sollte unter Standardbedingungen gegeben sein, da essentielle Untereinheiten ausgetauscht worden sind. Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass die Bindungen dieser Untereinheiten zu anderen 19S Untereinheiten oder Substraten auch unter Standardbedingungen durch die Markierung geschwächt oder verstärkt werden. So ist zum Beispiel zu beobachten, dass Rpn11-ProA in Aufarbeitungen in Puffer PB kaum Rpn12 copräzipitiert sowie Rpn1-ProA kaum Ecm29 präzipitiert, während unter den gleichen Bedingungen Rpn11-ProA Ecm29 und Rpn1-ProA Rpn12 copräzipitieren.

Abb. 13: Rpn1-ProA und Rpn11-ProA präzipitieren 19S und 20S proteasomale Untereinheiten. 19S Komplexe aus PWn1P (2) und PWn11P (1) Lysaten werden in der Standard IgG Affinitätschromatographie aufgereinigt und im SDS PAGE aufgetrennt. In der Coomassie Färbung sichtbare Proteine aus (2) werden in der Massen Fingerprint Analyse bestimmt. IgG Affinitätschromatographie unter Anwesenheit von Puffer A präzipitiert aus PWn11P Lysaten 26S proteasomale Untereinheiten (3). Molekulargewichtsmarker in kDa sind angegeben.

3.2 Untersuchung klassischer Kerntransportmutanten

Der 19S regulatorische Komplex besteht aus mindestens 17 Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von insgesamt ca. 1 MDa. Allein die 19S Base Untereinheiten ergeben ein Gesamtmolekulargewicht von ca. 500 kDa. Für die, in die Kernmembran eingebetteten Kernporen wurde gezeigt, dass ab einer Partikelgröße von 9 nm bzw. einem Molekulargewicht von 40 kDa freie Diffusion in den Zellkern sehr ineffizient wird (Paine et al., 1975) und selbst kleinere Proteine, wie z. B. Histone, aktiv in den Zellkern gelangen [Seite 46↓](Jakel et al., 1999). Die Kernlokalisation der 19S regulatorischen Komplexe sollte dementsprechend auf einen Transporter- vermittelten Kernimport zurückzuführen sein und der verantwortliche Transporter über die Analyse von S. cerevisiae Mutationsstämmen, die einen Defekt im Kernimportweg zeigen, bestimmt werden können. Aus diesem Grund werden die GFP-HA markierten Varianten von Rpn1 und Rpn11 in Stämme mit Mutationen in folgenden Genen sowie deren entsprechende wt Stämme eingeführt: srp1-49, srp1-31, rat2-1, nup133, pse1-1, kap95. Eine Beschreibung der jeweiligen Mutation der Stämme ist in Tab. 8 dargestellt; der Genotyp und die Herkunft in Tab. 5. Die srp1-49 Mutation wurde anhand der durch die Mutation eingeführten XbaI Schnittstelle in einer Restriktion des srp1-49 PCR- Produkts verifiziert. Die Lokalisation der fluoreszenzmarkierten 19S Untereinheiten in Zellen der logarithmischen Wachstumsphase nach 4 Stunden Inkubation bei permissiven (28°C) und restriktiven (37°C) Temperaturbedingungen wird in den resultierenden Stämmen (Tabelle 5) über direkte Fluoreszenzmikroskopie bestimmt. Alle Stämme zeigen bei permissiver Temperatur eine überwiegende Kernlokalisation der 19S Untereinheiten. Bei restriktiver Temperatur zeigt sich lediglich in srp1-49 Zellen im Vergleich zu den entsprechenden wt Zellen eine signifikante Veränderung des Fluoreszenzsignals, insofern dass die cytoplasmatische Fluoreszenz von GFP markiertem Rpn1 und Rpn11 deutlich ansteigt (Abb. 13A). In allen anderen Mutationsstämmen werden durch die Inkubation bei restriktiver Temperatur keine signifikanten Änderungen in der Verteilung des Fluoreszenzsignals ausgelöst. Die in dieser Arbeit angestrebte Charakterisierung der 19S Kernimportkomplexe setzt voraus, dass diese Komplexe in der Zelle angereichert vorliegen. In wt Zellen sind GFP markierte 19S Untereinheiten vorwiegend nukleär lokalisiert und Kernimportkomplexe nicht von 19S Komplexen unterscheidbar. Die deutliche cytoplasmatische Delokalisation der 19S Untereinheiten in srp1-49 Zellen weist auf einen Anstau von Kernimportkomplexen in dieser Mutante hin. Deshalb wird nachfolgend untersucht, ob die GFP markierten 19S Untereinheiten in den srp1-49 Stämmen frei oder komplexiert vorliegen.


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Tab. 8: Beschreibung der in dieser Arbeit verwendeten S. cerevisiae Mutationsstämme, die einen Defekt im Kernimportweg zeigen. Die gekennzeichneten (*) Autoren haben die temperatursensitiven Mutanten generiert. Wenn die publizierten Ergebnisse aus gleichen Arbeitsgruppen stammen, sind die Zitate mit (O ) markiert.

Stamm

Eigenschaft

Referenz

srp1-49
(Kar α)

Defekt in Ub- Pro- β gal Degradation; G2/M Arrest; Sts1 und

Rpn11 sind high- dosage Suppressoren der Mutation; kein

Defekt in cNLS Bindung

Tabb et al., 2000O

Glu-145 →Lys → Lokalisation der Mutation in der 1. Armadillo Sequenz; Zellzyklusdefekte; verlangsamtes Wachstum; Phänotyp ähnelt dem von Srp1 depletierten Zellen; Temperatursensitivität

Yano et al., 1994O*

G2/M Arrest; in vivo Importdefekt von SV40NLS-GFP und
Histon;Glu-145 →Lys ; Temperatursensitivität

Enenkel, unveröffentlicht

srp1-31
(Kar α)

Defekt in cNLS Bindung und Protein Import; G2/M Arrest aufgrund defekter Cyclin Proteolyse

Loeb et al., 1995

Verlust der NLS Bindungsaktivität in vitro

Shulga et al., 1996O

Ser-116 →Phe → Lokalisation der Mutation vor der 1. Armadillo Sequenz; Ser116 ist konservierte Aminosäure in Karyopherin α Isoformen; Chromosomeninstabilität; normales Wachstum

Yano et al., 1994O*

rat2-1
(Nup120)

Defekt im Boten- RNA (mRNA) Export aus dem Zellkern ins Cytoplasma; Anhäufungen von Kernporenkomplexen in wenigen Regionen der Kernmembran; kein Defekt im NLS abhängigen Import

Heath et al., 1995*

nup133

Anhäufungen von Kernporenkomplexen

Belgareh und Doye, 1997*

pse1-1

Temperatursensitivität; Normale Verteilung nukleärer Proteine; mRNA Export Defekt

Seedorf und Silver, 1997*

cytoplasmatische Lokalisation von Pdr1; Hypersensitivität gegen Cycloheximid und 4- Nitroquinolin- N- Oxid

Delahodde et al., 2001

cytoplasmatische Lokalisation von Spo12; Sporulationsdefekt in pse1-1/ pse1-1 Stämmen

Chaves und Blobel, 2001

kap95

NES Mutation in Karyopherin β; kein Export von Kap95 und Karyopherin α aus dem Zellkern; kein Import von NLS Reporterprotein nach 3 Stunden Inkubation bei 37°C

Iovine und Wente, 1997*

Zunächst soll jedoch die subjektive Abschätzung der Pixelintensitäten der GFP markierten Untereinheiten in srp1-49 Zellen durch eine Quantifizierung aus digitalen Aufnahmen im MetaVue- Programm ersetzt werden. Aus Aufnahmen identischer Belichtungszeiten wird, wie in Materialien und Methoden beschrieben, die cytoplasmatische zur nukleären Fluoreszenzintensität ins Verhältnis gesetzt. Ist der Import der markierten Untereinheit gestört (restriktive Temperatur), sollte eine Zunahme der cytoplasmatischen Färbung und eine Abnahme der Kernfärbung im Vergleich zu ungestörtem Import (permissive Temperatur) zu beobachten sein. Das Verhältnis von cytoplasmatischer zu nukleärer Pixelintensität sollte unter restriktiven Bedingungen zunehmen. Die Quantifizierung der Pixelintensitäten in srp1-49 Zellen sowie SRP1 wt Zellen ergibt, dass das Verhältnis der cytoplasmatischen zur nukleären Pixelintensität für Rpn1-GFPHA und Rpn11-GFPHA unter restriktiven Bedingungen in der Mutante deutlich (um 18% bzw. 14%) und im wt nur leicht (um 6% bzw. 5%) ansteigt (Abb. 14B). Die Pixelintensität im Zellkern der srp1-49 Zellen bleibt dabei nahezu konstant, während die der wt Zellen abnimmt. Die cytoplasmatische Pixelintensität dagegen steigt in srp1-49 Zellen deutlich an, während die der wt Zellen konstant bleibt.

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Abb. 14:(A) Rpn1 und Rpn11 sind in srp1-49 und SRP1 Zellen gegen die GFPHA markierten Varianten ausgetauscht. Die in vivo Lokalisation der fluoreszierenden Untereinheiten wird nach 3 Stunden Wachstum bei 28°C bzw. 37°C mittels direkter Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht. (B) Die nukleäre und cytoplasmatische GFP Pixelintensität der digitalen Aufnahmen von wenigstens 20 Zellen der in A abgebildeten Stämme wird quantifiziert, um die durchschnittliche Pixelintensität zu erhalten. Die mittlere Standardabweichung ist für alle Werte angegeben. Das Verhältnis von durchschnittlicher cytoplasmatischer zu nukleärer Pixelintensität für alle Stämme bei permissiver und restriktiver Temperatur ist in Prozent dargestellt. (C) Wild Typ und srp1-49 Zellen, die Rpn11-GFPHA anstelle des endogenen Proteins exprimieren, werden für 4 Stunden bei 37°C inkubiert und die Lysate dieser Zellen im Puffersystem ohne ATP Zusatz in der Glycerolgradientenzentrifugation aufgetrennt. Aus allen Fraktionen wird der Proteingehalt sowie die Protease- Aktivität gegen Suc- Leu- Leu- Val- Tyr- 7- Amino- 4- Methyl- Coumarin bestimmt und die relative proteasomale Aktivität pro mg Protein als prozentualer Wert des Maximalwerts errechnet. In der Western Blot Analyse werden die HA markierten Proteine, Rpt6 und β5 aller Fraktionen mittels entsprechender Antikörper nachgewiesen. Das Signal der prozessierten β5 Untereinheiten deckt sich mit der proteasomalen Aktivität und zeigt damit die 20S enthaltenden Fraktionen an. Nicht prozessierte β5 Untereinheiten zeigen die Fraktionen des 13-16S Vorläuferkomplex des 20S Proteasoms an. (D) 26S Proteasomen werden aus PCE6 Lysaten in Puffer A an IgG Sepharose gebunden, 19S Komplexe mit 600mM NaCl nativ eluiert und in 10- 40% igen Glycerolgradienten sedimentiert. Proteine aller Fraktionen werden im SDS PAGE aufgetrennt und mit Coomassie Färbelösung visualisiert.

In Untersuchungen zum Kerntransport von 20S Proteasomen zeigt der srp1-49 Stamm nach vierstündiger Inkubation unter restriktiven Temperaturbedingungen eine Anreicherung von Ump1 assoziierten, halben proteasomalen Core- Partikeln (hCP) im Cytoplasma (Lehmann et al., 2002). Die cytoplasmatische Anreicherung der markierten 19S Untereinheiten erfolgt unter den gleichen Bedingungen. Deshalb sollten PWn11srp1-49 Zellen nach Inkubation bei 37°C für 4 Stunden ebenfalls 20S proteasomale Vorläuferkomplexe anreichern. Um dies zu belegen und um zu erfahren, ob die [Seite 49↓]cytoplasmatisch lokalisierten 19S Untereinheiten frei oder komplexiert vorliegen, werden Lysate der Stämme PWn11srp1-49 und PWn11SRP1 in einer 10-40% igen Glycerolgradienten Dichtezentrifugation aufgetrennt. Aus allen Fraktionen wird eine Proteinbestimmung, eine Analyse der chymotrypsinähnlichen, proteasomalen Aktivität sowie eine Western Blot Analyse mit Antikörpern gegen HA, Cim3/Rpt6 und Pre2 durchgeführt (Abb. 14C). Das Maximum der proteasomalen Aktivität gegen fluorogenes Substrat fällt zusammen mit dem Signal für reifes Pre2/β5 (mβ5) in der schnell sedimentierenden Fraktion 14. 19S proteasomale Untereinheiten dagegen lassen sich im wt schon in Fraktion 10 und 11 nachweisen und cosedimentieren damit nicht nur mit der 20S proteasomalen Aktivität. In srp1-49 Zellen finden sich Rpn11-GFPHA und Cim3/Rpt6 schon in den langsam migrierenden Fraktionen 8 und 9, ein geringer Anteil Cim3/Rpt6 sogar in Fraktion 4 und 5. Außerdem ist in Fraktion 9-11 sowie 13-15 unprozessiertes pro-Pre2 zu detektieren, das auf die Anwesenheit von hCP bzw. naszierenden Core- Partikeln hinweist.

Das Laufverhalten der 20S Proteasomen im Glycerol- Dichtegradienten lässt sich anhand der in den einzelnen Fraktionen messbaren Proteaseaktivität gegenüber fluorogenen Substraten gut abschätzen. Demnach sedimentiert freies 20S Proteasom in den Fraktionen 12-16, während 26S Proteasomen in den schneller migrierenden Fraktionen 14-20 zu erwarten sind, wie aus Messung der Proteaseaktivität unter Anwesenheit von ATP in der Glycerol- Dichtegradienten Zentrifugation hervorgeht (vgl. Abb. 28). Die 26S Aktivität gegen fluorogenes Substrat unter Anwesenheit von ATP ist dabei ca. dreimal so hoch wie die der 20S Proteasomen. 19S proteasomale Aktivität lässt sich unter diesen Assaybedingungen nicht messen. Aufgrund dessen wird das Laufverhalten von 19S Proteasomen im 10-40% igen Glycerol- Dichtegradienten aufgeklärt, indem der aufgereinigte 19S Komplex einer Dichtegradientenzentrifugation unterzogen wird. Für die Aufreinigung von nativen 19S Komplexen nach Saeki und Mitarbeitenden (2000) werden zunächst 26S Proteasomen aus PCE6 Lysaten über Pre6-ProA unter Verwendung von Puffer A an IgG- Sepharose gebunden. Der native 19S Regulator wird mit PufferB600 (600mM NaCl) von den IgG gebundenen 20S Proteasomen abgelöst und über Glycerol- Dichtegradienten aufgetrennt. Im Coomassie gefärbten Gel sind die Untereinheiten des 19S Regulators in nahezu stöchiometrischer Verteilung jeweils in den Fraktionen 10-13 zu erkennen (Abb. 14D). Die höchste Proteinmenge findet sich in Fraktion 10. Der Vergleich des Laufverhaltens der 19S Untereinheiten in den Glycerolgradienten in Abbildung 14C und 14D zeigt, dass die 19S Untereinheiten im Srp1 wt Stamm PWn11SRP1 vorwiegend in 19S Partikel eingebaut sind (Sedimentation ab Fraktion 10), während die 19S Untereinheiten in der Mutante PWn11srp1-49 in Komplexe geringerer Dichte inkorporiert sind (Sedimentation ab Fraktion 8).

3.3 Klassische Kernlokalisationssequenzen im 19S Base sowie Lid Komplex

Da sich Rpn1 und Rpn11 in der Kerntransportmutante mit mutiertem Srp1/Kap60 unter [Seite 50↓]restriktiven Bedingungen cytoplasmatisch anreichern, lässt sich vermuten, dass 19S regulatorische Komplexe aktiv und signalvermittelt über Karyopherin α/β in den Zellkern transportiert werden. Der Karyopherin α/β abhängige Kernimport wird durch Kernlokalisationssequenzen vermittelt, die aus ein (monopartite) oder zwei (bipartite) Regionen basischer Aminosäuren bestehen. Obwohl die Variabilität verschiedener NLS hoch ist, konnten anhand der Kristallstrukturen von mono- sowie bipartite NLS enthaltenden Peptiden gebunden an Karyopherin α Konsensussequenzen für beide NLS bestätigt werden (Fontes et al., 2000 und 2003). Die monopartite NLS Konsensussequenz ist K R/K X R/K, die der bipartite cNLS K R X10-12 K R X K. Der Karyopherin α/β abhängige Kernimport der 19S Regulatoren, lässt vermuten, dass die Untereinheiten des 19S Komplexes klassische Kernlokalisationssequenzen aufweisen. Die in der Sequenzanalyse aller 19S Untereinheiten detektierten, potentiellen cNLS der 19S Lid sowie Base Untereinheiten sind in Abb. 15 zusammengefasst. Die C- terminalen Bereiche aller ATPase Untereinheiten sowie Rpn8 enthalten keine potentiellen NLS in Übereinstimmung mit den Konsensussequenzen, sind aber auffällig basisch und deshalb ebenfalls abgebildet. Mit der Konsensussequenz für bipartite NLS übereinstimmende Peptidsequenzen finden sich in Rpt4 und Rpn2, während monopartite NLS Peptidsequenzen in Rpn1 und Rpt2 sowie den 19S Lid Untereinheiten Rpn5, Rpn6, Rpn9 und Rpn12 lokalisiert sind. Es sollte jedoch beachtet werden, dass sich nicht alle Lysin- reichen Sequenzen in vivo als funktionelle Kernlokalisationssignale erweisen, ebenso wie in vivo funktionelle cNLS nicht zwangsläufig mit einer der Konsensussequenzen übereinstimmen müssen.

Abb. 15: Potentielle Kernlokalisationssequenzen der 19S Untereinheiten sind grau unterlegt. Sequenzen, die mit den Konsensussequenzen übereinstimmen, sind unterstrichen. Die Position der Aminosäuresequenz in den jeweiligen Proteinen ist angegeben.

3.4 19S Base NLS- GFPS Fusionsprodukte lokalisieren im Zellkern und copräzipitieren Kar α/β in vivo

Unter der Annahme, dass die potentiellen cNLS des 19S regulatorischen Komplexes in vivo als Kernlokalisationssequenz für Karyopherin α/β abhängigen Import fungieren, sollten diese Sequenzen in der Lage sein ein Reporterprotein in lebenden Zellen in den [Seite 51↓]Zellkern zu dirigieren. Deshalb werden potentielle NLS aus Rpt2 (DKKKKKGSNQKPKYEPPVQSKFGRKKRK), Rpn2 (KARAKKTKKEKGPNEEEKKK) sowie Rpt1 (RARRKVATEKDFLKAVDK), wie in Abb. 9 dargestellt, als Fusionsprotein mit GFP und dem Strep- tag II (S) unter dem Galaktose Promotor induzierbar exprimiert und die in vivo Lokalisation dieser Fusionsproteine bestimmt. Als Kontrollen dienen die monopartite cNLS des SV40 T- Antigen (PKKKRKV) sowie deren nicht funktionelle, mutierte Variante (PKTKRKV) (Kalderon et al., 1984 a und b). Die Rpt1 und Rpn2 Sequenzen sowie die der Kontrollen werden als komplementäre Oligonukleotidstränge miteinander hybridisiert und in den linearisierten pYESGFPS Vektor ligiert. Der N- terminale Bereich von Rpt2 wird mittels PCR amplifiziert und über die entsprechenden Schnittstellen in pYESGFPS ligiert (siehe Materialien und Methoden). Durch Transformation von wt Zellen mit den erzeugten Vektoren entstehen die Stämme PWRpt1G, PWRpn2G, PWRpt2G, PWSV40G und PWmSV40G.

Die Expression der Fusionsproteine in diesen Stämmen wird aus der logarithmischen Wachstumsphase durch Inkubation für 4 Stunden in synthetischem Galaktose Selektionsmedium induziert. Abb. 16 A zeigt die in vivo Lokalisation der 19S NLS- GFPS Fusionsproteine in direkter Fluoreszenzmikroskopie. Die NLS ähnliche Sequenz aus Rpt2 wird dabei nahezu so effizient wie die SV40 NLS in den Zellkern transportiert, während die Kernfärbung in Zellen, die das Rpn2 NLS Fusionsprotein exprimieren etwas schwächer erscheint. Die Arginin- und Lysinreiche Sequenz im Rpt1 C- terminalen Bereich führt im Gegensatz zur mutierten SV40 NLS zu einer erkennbaren Lokalisation der Fusionsproteine im Zellkern, ist darin aber sehr viel ineffizienter als die anderen 19S Sequenzen.

Da die ausgewählten 19S Sequenzen GFPS in den Zellkern leiten, sollte es möglich sein, die verantwortlichen Kerntransporter aus Lysaten der oben genannten Stämme über Strep- tag II Affinitätschromatographie in Bindung an die jeweilige cNLS zu präzipitieren. Dazu werden ca. 2 x 1010 Zellen aus der logarithmischen Wachstumsphase 6 Stunden in Galaktose Selektionsmedium induziert, in der French Press Zelle aufgeschlossen und über Strep- tag II Affinitätschromatographie gereinigt. Gleiche Proteinmengen aller Eluate werden in der SDS PAGE aufgetrennt und in der Western Blot Analyse mit Antikörpern gegen Karyopherin α und β sowie GFP untersucht (Abb. 16 B). Die ECL Signale der GFP Fusionsproteine sind in allen Eluaten nahezu gleich intensiv, während sich die Signalstärken für die assoziierten Kerntransporter deutlich unterscheiden. So sind nur wenig Karα/ Karβ in den Eluaten der mutierten SV40 NLS- GFPS sowie der Rpt1 NLS- GFPS Konstrukte zu detektieren. Etwa gleiche Mengen Transporter sind dagegen mit den Fusionsproteinen aus SV40 NLS, Rpn2 NLS als auch Rpt2 NLS und GFP assoziiert.


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Abb. 16: (A) Die in Abb. 9 dargestellten Fusionsproteine aus potentiellen 19S Kernlokalisationssequenzen bzw. Kontrollsequenzen und GFP werden für 4 Stunden durch Galaktose Induktion der Stämme PWRpt2NLSG (1), PWRpt1NLSG (2), PWRpn2NLSG (3), PWNLSG (4) bzw. PWmNLSG (5) überexprimiert und die in vivo Lokalisation der fluoreszierenden Fusionsproteine durch direkte Fluoreszenzmikroskopie mit dem FITC Filterblock sichtbar gemacht. (B) Gleiche Mengen der NLS- GFPS Fusionsproteine, die mit Hilfe der StrepTactin Affinitätschromatographie aus den unter (A) beschriebenen Kultivierungsbedingungen und Stämmen isoliert sind, werden in der SDS PAGE aufgetrennt und einschließlich assoziierter Proteine mit Coomassie Lösung angefärbt (obere Abb.). In der parallel durchgeführten Western Blot Analyse werden Karyopherin α und Karyopherin β sowie die GFP Fusionsproteine mit entsprechenden Antikörpern nachgewiesen (untere Abb.). Das mit einem * markierte Signal ist unspezifisch.

Die Bindung zwischen Transporter und NLS ist nur vorrübergehend und der Komplex in der Affinitätschromatographie damit sehr instabil. Aus diesem Grund sollen diese Daten in einer Far Western Analyse abgesichert werden, deren Prinzip auf der in vitro Bindung des Transporters mit den auf einer Membran renaturierten Substraten beruht. In diesem Fall ist Protein A markiertes Karyopherin α der Bindungspartner der NLS Fusionsproteine und wird über Peroxidase gekoppelten Kaninchen- anti- Maus IgG Antikörper in der ECL Reaktion nachgewiesen. Karyopherin α- ProA wird dafür unter dem endogenen Promoter vom Centromer Plasmid pRS315 in einem Stamm exprimiert, in dem das chromosomale Karyopherin α Gen deletiert wurde (CEY1b, Enenkel et al., 1995) . Ca. 5 x 1010 Zellen werden unter Anwesenheit von EDTA freiem Protease Inhibitoren Cocktail (CompleteTM, Roche)in der French Press aufgeschlossen und Zellbruchstücke aus dem Lysat abzentrifugiert. Für die Far Western Analyse werden gleiche Proteinmengen Strep- tag II gereinigter Fusionsproteine in der SDS PAGE aufgetrennt, auf PVDF- Membran transferiert und über Nacht renaturiert. Die Membran wird für vier Stunden in Blockierungslösung mit 20% CEY1b Lysat inkubiert, um Protein A markiertes Karyopherin α aus dem Lysat an die cNLS Fusionsproteine zu binden. Als Kontrolle dafür, dass keine unspezifische Bindung zwischen der Protein A Domäne und den NLS Substraten auftritt, wird eine zweite, gleich behandelte Membran für vier Stunden in Blockierungslösung mit [Seite 53↓]300mM Protein A (ICN) inkubiert. Abb. 17 zeigt die Amidoblack gefärbten Membranen sowie die Filme des Far Westerns und der Kontrolle. Protein A gekoppeltes Karyopherin α wird in der ECL Reaktion an Rpt2NLS-GFPS, Rpn2NLS-GFPS und SV40NLS-GFPS gebunden nachgewiesen. Die mutierte SV40NLS sowie die Rpt1NLS-GFPS zeigen in dieser Analyse keine Bindung an Karyopherin α und auch Protein A alleine kann keines der Fusionsproteine binden, um damit ein Signal in der ECL Reaktion hervorzurufen. Es ist zu beachten, dass die Proteinmenge von Rpt2NLS-GFPS in Spur 4geringer ist als die der anderen Fusionsproteine, da sich die Gesamtproteinmenge in dieser Spur auf das vollständig exprimierte Produkt als auch verschiedene Degradationsprodukte aufteilt.

Abb. 17: Gleiche Proteinmengen der NLS- Fusionsproteine werden, wie zu Abb. 14B beschrieben, aufgearbeitet und mittels Far Western Analyse untersucht (+: SV40NLS; -: mutierte SV40NLS). Der Amidoblack gefärbte Blot (links) wird mit Lysaten von Zellen inkubiert, die anstatt des endogenen Karyopherin α Karyopherin α- ProA exprimieren. Die auf dem im Far Western erzeugten Film (rechts) ersichtlichen Signale, stammen von Karyopherin α- ProA, das an Kernlokalisationssequenzen gebunden ist und von anti- IgG Antikörpern erkannt wird. Bei der mit einem * markierten Proteinbande handelt es sich um ein Degradationsprodukt des Rpt2NLS-GFP Fusionsproteins.

3.5 Charakterisierung der ΔNLS Mutation in Rpt2

Ob die in vitro gezeigte Bindung der Rpt2 NLS an Karyopherin α in vivo bedeutsam ist, lässt sich klären, indem der N- terminale, NLS tragende Bereich von Rpt2/ Yta5 in S. cerevisiae deletiert wird. In einem Stamm, dessen chromosomale RPT2 Kopie deletiert ist, wird mit Hilfe der Plasmid- shuffling (5´FOA) Methode das RPT2 Gen gegen das Δ 1-43 rpt2HA Allel ausgetauscht (vgl. Abb. 6; Materialien und Methoden). Zunächst wird der shuffle Stamm PWt2H16 generiert, indem Dp42 aus DY62 (Rubin et al., 1998) durch mehrfache Selektion auf Minimalmedium, das 60µg/ml Leucin und kein Uracil enthält, gegen pRpt2H-16 verdrängt wird. Die Zellen, die nach Selektion auf das URA3 tragende Plasmid nicht mehr auf Minimalmedium ohne Leucin Zusatz wachsen können, stellen den gewünschten shuffle Stamm dar. Die Verdrängung wird neben dem Einsatz einer Western Blot Analyse mit Antikörpern gegen humanes Rpt2 (PW8305; Affiniti) sowie den HA tag überprüft, indem die Plasmide aus S. cerevisiae isoliert und einer Restriktionsanalyse unterzogen werden. Unveröffentlichte Daten von B. Braun zeigen, dass der Antikörper gegen humanes Rpt2 (hRpt2) S. cerevisiae Rpt2 erkennt. Da kein Antikörper gegen S. cerevisiae Rpt2 verfügbar ist, soll nicht markiertes Rpt2 mit dem anti- hRpt2 Antikörper [Seite 54↓]nachgewiesen werden. Die aus der Western Blot Analyse resultierenden Filme sind in Abb. 18 dargestellt.

Abb. 18: Zellextrakte von DY62 und PWt2H16 werden im SDS PAGE aufgetrennt und in der Western Blot Analyse mit Antikörpern gegen humanes Rpt2 (links) sowie gegen die HA Markierung (rechts) untersucht. Größenmarker in kDa sind angegeben.

Der anti- hRpt2 Antikörper erkennt das nicht markierte S. cerevisiaeRpt2 ungefähr in der Größe des erwarteten Molekulargewichts (48,8 kDa) in DY62, nicht aber Rpt2-HA in PWt2H16. Unmarkiertes Rpt2, wie es im Ausgangsstamm zu detektieren ist, wird in PWt2H16 durch den humanen Rpt2 Antikörper nicht nachgewiesen. Der Antikörper gegen das HA Epitop erkennt lediglich das im SDS PAGE langsamer migrierende Rpt2-HA Fusionsprotein (erwartetes MW: 51,5 kDa). In der Restriktionsanalyse der isolierten Plasmide wird pRpt2H-16 aus PWt2H16 und Dp42 in DY62 nachgewiesen. PWt2H16 dient nun als Ausgangsstamm für Mutationen und Markierungen des RPT2 Gens. Dazu werden Plasmide, die das RPT2 Gen, das Δ 1-43 rpt2HA Allel oder deren GFPHA markierte Varianten sowie das LEU2 Gen tragen, in PWt2H16 eingeführt (Abb. 6;Materialien und Methoden). Mit Hilfe der 5´FOA- shuffling Methode entstehen die Stämme PWt2H, PWt2G, PWΔNt2H und PWΔNt2G, in denen die chromosomale Rpt2 Deletion allein durch das LEU2 tragende Plasmid ersetzt ist. LEU2 tragende Plasmide, von denen die HA bzw. GFP-HA markierte wt oder mutierte Untereinheit exprimiert wird, können nur dann die chromosomale Deletion der Untereinheit komplementieren, wenn die exprimierten Untereinheiten funktionell sind.

Auch hier wird der Austausch des URA3 tragenden Plasmids gegen das LEU2 tragende Plasmid mittels Western Blot Analyse der Lysate gegen den HA Antikörper (Abb. 19) sowie Restriktionsanalyse der aus PWt2H, PWt2G, PWΔNt2H und PWΔNt2G isolierten Plasmide bestätigt. Das um 43 Aminosäuren (ca. 5 kDa) verkürzte Rpt2 wird in beiden Deletionsstämmen, soweit die aus der ECL Reaktion hervorgegangenen Filme eine Quantifizierung der detektierten Proteine zulassen, mit dem gleichen Expressionslevel wie die wt Variante gebildet.

Die generierten Stämme werden zunächst näher charakterisiert, indem sie auf Temperatur- und Canavanin- Sensitivität untersucht werden; denn sollte die NLS Deletion in Rpt2 einen Effekt auf die Lokalisation bzw. das Zusammenfinden der 19S Untereinheiten haben, müsste dies Auswirkungen auf die proteasomale Aktivität und damit auf die Überlebensrate der Zellen unter Stressbedingungen haben.

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Abb. 19: Identische Proteinmengen der Zellextrakte aus PWt2H (1), PW Δ Nt2H (2), PWt2G (3) und PW Δ Nt2G (4) werden im SDS PAGE aufgetrennt und in der Western Blot Analyse mit Antikörpern gegen das HA Epitop untersucht. Molekulargewichtsgrößen in kDa sind angegeben.

Der Test auf Canavanin- Sensitivität wird nur mit PWt2H und PWΔNt2H durchgeführt, der Test auf Temperatursensitivität auch mit PWt2G und PWΔNt2G (Abb. 20). Es zeigt sich, dass die Rpt2 NLS Deletionsstämme gegenüber den entsprechenden wt Stämmen eindeutig temperatursensitiv sind. Das Wachstum von PWt2H bei restriktiver Temperatur (37°C) unterscheidet sich nur geringfügig von dem bei permissiver Temperatur (28°C), während PWΔNt2H bei restriktiver Temperatur völlig im Wachstum gestoppt wird. Auch PWt2G Zellen, die wt Rpt2 mit einer C- terminalen GFP-HA Markierung exprimieren, sind temperatursensitiv. Nur eine von tausend Zellen überlebt die Temperaturumstellung von 28°C auf 37°. Ist zusätzlich zur GFP-HA Fusion die NLS von Rpt2 deletiert, sind auch diese Zellen (PWΔNt2G) nicht mehr fähig zu wachsen. Eine Sensitivität auf das Arginin Analog Canavanin kann weder bei PWt2H noch bei PWΔNt2H festgestellt werden.

Abb. 20: Stämme, die Rpt2-HA (PWt2H), ΔNLS rpt2-HA (PWΔNt2H), Rpt2-GFPHA (PWt2G) oder ΔNLS rpt2-GFPHA (PWΔNt2G) anstatt des endogenen Rpt2 exprimieren werden auf Temperatursensitivität und Canavanin Sensitivität (nur PWt2H und PWΔNt2H) untersucht. Die für die Canavanin- Sensitivitätsbestimmungen verwendeten CM Agar- Platten ohne Arginin enthalten 0,6µl/ml Canavanin, die Referenzplatten ohne Canavanin 20 mg/ml Arginin. Die Platten werden für 3 Tage bei 28°C bzw. bei 37°C inkubiert.

Um den Effekt der NLS Deletion in Rpt2 auf die Verteilung der 19S Untereinheit in der Zelle zu betrachten, werden PWt2G und PWΔNt2G aus derlogarithmischen Wachstumsphase für drei Stunden bei 37° sowie 28°C angezogen und die Lokalisation [Seite 56↓]der GFP markierten Untereinheit mit direkter Fluoreszenzmikroskopie betrachtet (Abb. 21A). Alle Zellen zeigen sowohl bei restriktiver als auch permissiver Temperatur eine außerordentlich starke Kernlokalisation von Rpt2 bzw. ΔNLS rpt2. Ein Anstieg der cytoplasmatischen Färbung in PWΔNt2G im Vergleich zu PWt2G lässt sich nicht beobachten. Auffällig ist, dass bei einem Großteil der PWΔNt2G Zellen die Tochterzellen nach dem Sprossen mit den Mutterzellen verbunden bleiben und damit Zellzyklusdefekte zeigen (Abb. 21B).

Welchen Effekt die Deletion der Rpt2 NLS auf die Lokalisation anderer 19S Untereinheiten zeigt, wird untersucht, indem die endogenen Kopien von Rpn1 sowie Rpn11 durch GFPS markierten Varianten in PWΔNt2H ersetzt werden und die in vivo Lokalisation dieser Untereinheiten in den resultierenden Stämmen PWΔNt2H11GS und PWΔNt2H1GS geprüft wird. Zellen aus der logarithmischen Wachstumsphase werden dazu für 3 Stunden bei 28°C sowie 37°C inkubiert und die GFP Fluoreszenz mittels direkter Fluoreszenzmikroskopie bestimmt (Abb. 21C). Die Lokalisation der 19S Base Untereinheit Rpn1- GFPS ist sowohl bei 28°C als auch bei 37°C nukleär und unterscheidet sich damit nicht von der der ATPase. Auch die 19S Lid Untereinheit Rpn11-GFPS ist unter den beobachteten Bedingungen nukleär lokalisiert, wird aber im Vergleich zu Rpn1-GFPS in PWΔNt2H, als auch im Vergleich zu PWn11GH nur schwach exprimiert.

Abb. 21: (A) In vivo Lokalisation von ΔNLS rpt2- GFPHA bzw. Rpt2- GFPHA in PWΔNt2GH bzw. PWt2GH Zellen nach Inkubation für drei Stunden bei 28°C bzw. 37°C. (B) Zellteilungsdefekt der PWΔNt2GH Zellen. Das Fluoreszenzsignal stammt von ΔNLS rpt2- GFPHA nach Inkubation der Zellen für eine Stunde bei 37°C. (C) In vivo Lokalisation von Rpn1- GFPS (oben) bzw. Rpn11- GFPS (unten) in PWΔNt2H Zellen nach Inkubation für drei Stunden bei 28°C bzw. 37°C. Die Zellen sind jeweils mit dem FITC Filterblock (links) und FITC sowie Normarski Filterblock simultan (rechts) aufgenommen.

Die Deletion der NLS in Rpt2 könnte dazu führen, dass das gebildete Rpt2 nicht vollständig in den 19S regulatorischen Komplex eingebaut wird, oder dass der Komplex an sich bzw. in Verbindung mit dem 20S Proteasom an Stabilität verliert. Der vollständige, funktionelle Einbau der verkürzten Rpt2 Untereinheit in den 19S Komplex wird mit Hilfe des Glycerol- Dichtegradienten gezeigt. PWt2H und PWΔNt2H werden in der logarithmischen Wachstumsphase für eine Stunde bei restriktiver Temperatur inkubiert, die Lysate mit Zusatz von ATP sowie MgCl2 in der 10-40% igen Glycerol- [Seite 57↓]Dichtegradientenzentrifugation aufgetrennt und aus jeder Fraktion eine Bestimmung der prozentualen chymotrypsin ähnlichen Aktivität pro mg Protein durchgeführt. Die Proteine aller Fraktionen werden gefällt und der SDS PAGE mit anschließender Western Blot Analyse mit Antikörpern gegen das HA Epitop, Rpt6/ Cim3 sowie Pre2/ β5 zugeführt (Abb. 22). Proteasomale Aktivität kann in den Fraktionen 11- 18 gemessen werden, wobei die höchste Aktivität bei beiden Stämmen in der Fraktion Nummer 13 erreicht wird und damit 20S Proteasomen zugeordnet werden kann. Entsprechend der Aktivität gegen fluorogenes Substrat kann reifes Pre2/ β5 in der Western Blot Analyse in den Fraktionen 11-18 nachgewiesen werden. Unprozessiertes pro-Pre2 lässt sich in diesen Stämmen nicht detektieren. Die 19S Base Untereinheit Rpt6/ Cim3 ist in beiden Stämmen von Fraktion 10- 17 nachweisbar und sowohl Rpt2 als auch ΔNLS rpt2 comigrieren im wesentlichen mit dieser ATPase in Fraktionen 9-18. Freie, nicht in den Komplex eingebaute ΔNLS rpt2 Untereinheiten, die in den langsam migrierenden Fraktionen 1-3 auftreten sollten, sind nicht zu detektieren.

Abb. 22:PWt2H und PWΔNt2H Zellen werden für eine Stunde bei 37°C inkubiert und die Lysate im Puffersystem mit Zusatz von ATP und MgCl in der 10- 40% igen Glycerolgradientenzentrifugation aufgetrennt. Aus allen Fraktionen wird der Proteingehalt sowie die Protease- Aktivität gegen Suc- Leu- Leu- Val- Tyr- 7- Amino- 4- Methyl- Coumarin bestimmt und die relative proteasomale Aktivität pro mg Protein als prozentualer Wert des Maximalwerts errechnet. In der Western Blot Analyse aller Fraktionen werden die HA markierten Proteine, Rpt6 und β5 mittels entsprechender Antikörper nachgewiesen. Das Signal der prozessierten β5 Untereinheiten deckt sich mit der proteasomalen Aktivität und zeigt damit die 20S enthaltenden Fraktionen an.

Die Stabilität des Komplexes wird überprüft, indem wt bzw. mutierte 26S Proteasomen, die über Rpn11ProA an eine IgG Sepharose Matrix gebunden sind, einer 600mM Natrium- Chlorid (NaCl) Lösung ausgesetzt und anschließend im 10-40% igen Glycerol- Dichtegradienten aufgetrennt werden. Die für diesen Versuch benötigten Stämme werden [Seite 58↓]erzeugt, indem PWt2H und PWΔNt2H mit dem RPN11-HA-TEV-ProA::URA3::HIS3 Konstrukt transformiert werden und nach homologer Rekombination des linearen DNA Fragmentsin den Genlocus von RPN11die Stämme PWt2Hn11HTP sowie PWΔNt2Hn11HTP entstehen. Die Protein A Markierung umfasst in diesem Fall zwei IgG bindende Domänen und lässt sich von Rpn11-HA an der TEV Protease Schnittstelle abtrennen (vgl. Abb. 8; Materialien und Methoden).

Mit Hilfe der abspaltbaren Protein A Markierung lassen sich 26S Proteasomen in der sequenziellen IgG Sepharose Affinitätschromatographie in die nativen Subkomplexe 20S, 19S Base und 19S Lid zerlegen (Abb. 23). Das Prinzip dieser sequenziellen Affinitätschromatographie ist, die Bindung der einzelnen Subkomplexe zueinander anhand steigender NaCl Konzentrationen zu lösen und lediglich die an die IgG Sepharose verankerten 19S Lid Komplexe zurückzubehalten, um sie durch eine TEV Protease Spaltung nativ zu eluieren. Die 20S- 19S Base Bindung wird dabei bei 300mM NaCl getrennt und die 19S Base- 19S Lid Bindung bei 600mM NaCl. Eine weitere Erhöhung der Salzkonzentration auf 1M NaCl führt zu keiner stärkeren Auftrennung des IgG gebundenen Komplexes.

Abb. 23: Elution proteasomaler Subkomplexe aus PWn11HTP Lysaten in der sequenziellen Affinitätschromatographie durch Bindung von Rpn11-HA-TEV-ProA an IgG Sepharose. Die 300mM NaCl Fraktion enthält 20 S Proteasom und geringe Mengen an 19S Base Komplex sowie assoziierten Proteinen. Mit 600mM NaCl werden 19S Base Komplexe eluiert und in der TEV Protease Abspaltung werden die noch an die Matrix gebundenen 19S Lid Komponenten freigesetzt. Der Größenmarker in kDa ist angegeben.

In einer geringfügig abgewandelten Aufarbeitung wird die Stabilität der proteasomalen Komplexe aus PWt2Hn11HTP sowie PWΔNt2Hn11HTP überprüft. 26S Proteasomen aus Zelllysaten werden über Rpn11-HA-TEV-ProA an IgG Sepharose gebunden, 19S Base sowie 20S Komplex mit 600mM NaCl eluiert und in der 10-40% igen Glycerol- Dichtegradientenzentrifugation aufgetrennt. Die Verteilung der Subkomplexe beider Stämme kann bereits anhand der Amidoschwarz gefärbten PVDF Membran verglichen [Seite 59↓]werden. Die Verteilung von Rpt6/ Cim3, Pre6/ α4 sowie Rpt2-HA bzw. ΔNLS rpt2-HA wird in der Western Blot Analyse mit entsprechenden Antikörpern aufgeklärt (Abb. 24). Freier 19S Base Komplex sedimentiert danach vor allem in Fraktion 9 und 10, ist in Spuren allerdings sogar bis in Fraktion 14 auf der Amidoschwarz gefärbten Membran zu erkennen. Anteile davon könnten noch mit dem 20S Proteasom assoziiert sein, das vor allem in Fraktion 11 bis 13 sedimentiert, aber auch bis in die Fraktion 15 zu erkennen ist. Werden die einzelnen Untereinheiten betrachtet, fällt auf, dass die beiden ATPase Untereinheiten Rpt6/ Cim3 und Rpt2-HA unabhängig von der Deletion der NLS in Rpt2 in den Fraktionen 8- 15 comigrieren, Rpt6/ Cim3 aber zusätzlich in den langsam sedimentierenden Fraktionen 2- 6 nachzuweisen ist. Pre6/ α4 ist in den Fraktionen 11- 17 zu detektieren, wobei das stärkste ECL- Signal in den Fraktionen 11- 13 auftritt.

Abb. 24: 600mM NaCl Elution, die 19S Base und 20 S Komplexe aus PWt2Hn11HTP (rechts) sowie PWΔNt2Hn11HTP (links) enthalten, werden im 10- 40% igen Glycerolgradienten aufgetrennt, alle Fraktionen gefällt und in der Western Blot Analyse untersucht. Amidoblack gefärbte Membranen (oben) und ECL Signale (unten) aus der Immunreaktion mit Antikörpern gegen das HA Epitop, Rpt6/ Cim3 und α4 sind abgebildet. Die markierten Signale (*) stammen von Rpn11-ProA, das mit den 600mM NaCl Elutionen von der IgG Matrix abgelöst wird und im Glycerolgradienten in den Fraktionen 7-14 sedimentiert.

3.6 Charakterisierung der ΔNLS Mutation in Rpn2

Eine weitere potentielle NLS im 19S Base Komplex ist die in vitro mit Karyopherin α interagierende lysinreiche Sequenz im KEKE Motiv von Rpn2. Auch hier wird die in vivo Relevanz der in vitro erzielten Ergebnisse durch die Deletion der NLS in Rpn2 überprüft. Dazu werden WCGa wt Zellen mit den Rpn2-HA::URA3::HIS3 bzw. Rpn2ΔC-HA::URA3::HIS3 Konstruktentransformiert und mittels homologer Rekombination im Rpn2 Genlocus die Stämme PWn2H und PWΔCn2H geschaffen. In PWn2H ist endogenes Rpn2 durch die HA markierte Variante ersetzt, während in PWΔCn2H ein C- terminal um 155 Aminosäuren (entspricht 465 Basenpaare bzw. ca. 17 kDa) verkürztes RPN2 mit HA Markierung abgelesen wird. Der Austausch wird auf Proteinebene mittels Western Blot Analyse mit Antikörpern gegen das HA Epitop und auf DNA Ebene mittels PCR sowie Sequenzierung überprüft. Die Western Blot Analyse ergibt für Rpn2-HA sowie für ΔNLS rpn2-HA zwar Signale auf Höhe des erwarteten Molekulargewichts (106 kDa bzw. 89 kDa), die Intensität bei gleicher Proteinmenge des Gesamtlysats ist jedoch für Rpn2-HA ca. fünfmal so stark wie für ΔNLS rpn2-HA (Abb. 25A). Die PCR Analyse der [Seite 60↓]aus PWn2H und PWΔCn2H isolierten chromosomalen DNA mit Primern, die gegen verschiedene Bereiche des 3´- Endes von RPN2 gerichtet sind, ergibt, dass RPN2 in PWΔCn2H mit verkürztem C- Terminus exprimiert wird (Abb. 25B).

Abb. 25: (A) Zellextrakte aus PWΔCn2H (1) und PWn2H (2) werden im SDS PAGE aufgetrennt und in der Western Blot Analyse mit Antikörpern das HA Epitop untersucht. Größenmarker in kDa sind angegeben. (B) Ergebnisse der PCR Analyse aus PWΔCn2H (1-3) und PWn2H (4-6). Die für den jeweiligen Ansatz verwendeten Primer sind schematisch dargestellt. DNA Größenmarker in kbp ist angegeben. (C) Zellextrakte aus PWΔCn2H (1), PWn2H (2), PWΔn2ΔCn2H (3) und PWΔn2n2H (4) werden wie unter (A) beschrieben untersucht.

Eine nähere Charakterisierung der Mutanten in Bezug auf Temperatur- und Canavanin- Sensitivität ergibt, dass PWΔCn2H Zellen in beiden Tests starke Sensitivität zeigen, während PWn2H keinerlei Wachstumseinschränkungen aufweist (Abb. 26A). Nur eine von tausend PWΔCn2H Zellen überlebt Wachstumsbedingungen mit 0,6µg/ml Canavanin als Argininersatz, während unter restriktiven Temperaturbedingungen sogar nur eine von zehntausend Zellen zu wachsen vermag. Die Canavanin Sensitivität beruht auf einem Defekt im Abbau fehlgefalteter Proteine durch das Proteasom und deutet auf einen erhöhten Anteil ubiquitinierter Proteine in diesen Zellen hin (Heinemeyer et al., 1991). Um zu belegen, dass die Deletion des C- terminalen Bereichs in Rpn2 tatsächlich zu einem Anstau ubiquitinierter Proteine führt, aber keinen Einfluss auf die Prozessierung der 20S β Untereinheiten β5 und β7 hat, werden Stämme auf Grundlage von WCGa, PWn2H und PWΔCn2H erzeugt, bei denen jeweils eine der beiden β Untereinheiten HA markiert ist. Dazu werden YIplac128

Pre2HA bzw. YIplac128Pre4HA genomisch in die o.g. Stämme integriert und die Stämme PWβ5H, PWn2Hβ5H und PWΔCn2Hβ5H bzw. PWβ7H, PWn2Hβ7H und PWΔCn2Hβ7H erzeugt. Alle Stämme werden aus der logarithmischen Wachstumsphase für eine Stunde bei 37°C inkubiert und gleiche Proteinmengen der Gesamtlysate in der SDS PAGE aufgetrennt. Im Immunoblot gegen Ubiquitin Antikörper zeigt sich in PWΔCn2H Lysaten im Vergleich mit den wt Lysaten eine deutliche Anreicherung des Ubiquitin Signals für Proteinmassen von 48 bis 200 kDa (Abb. 26B). Der Immunoblot gegen das HA Epitop zeigt nahezu äquivalente Mengen der unprozessierten β5 sowie β7 Untereinheit in allen Lysaten. Des weitern wird aus den Western Analysen gegen die Untereinheiten Rpt6 und Rpn2-HA bzw. ΔNLS rpn2-HA mit den entsprechenden Antikörpern ersichtlich, dass, [Seite 61↓]trotzdem gleiche Mengen Rpt6 in allen Stämmen detektiert werden, das Signal für ΔNLS rpn2-HA nach subjektiver Abschätzung ca. fünfmal schwächer ist, als für Rpn2-HA. Die Ergebnisse zur Anreicherung ubiquitinierter Proteine in PWΔCn2H Lysaten werden durch dreimalige Wiederholung mit jeweils drei verschiedenen Proteinmengen in der SDS PAGE reproduziert.

Abb. 26: (A) Stämme, die Rpn2-HA (PWn2H) und ΔNLS rpn2-HA (PWΔCn2H) anstatt des endogenen Rpn2 exprimieren, werden auf Temperatursensitivität und Canavanin Sensitivität untersucht. Die für die Canavanin- Sensitivitätsbestimmungen verwendeten CM Agar- Agar Platten ohne Arginin enthalten 0,6µl/ml Canavanin, die Referenzplatten ohne Canavanin 20 mg/ml Arginin. (B) PWβ5H (1), PWn2Hβ5H (2) und PWΔCn2Hβ5H (3) bzw. PWβ7H (4), PWn2Hβ7H (5) und PWΔCn2Hβ7H (6) werden aus der logarithmischen Wachstumsphase für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Lysate der Zellen werden in der SDS PAGE aufgetrennt und in der Western Blot Analyse gegen die HA markierten Untereinheiten Rpn2, ΔNLS rpn2, β5 sowie β7 und gegen Rpt6 mit den entsprechenden Antikörpern untersucht (oben). Ubiquitinierte Proteine werden parallel in der Western Blot Analyse mit einem gegen Ubiquitin gerichteten Antikörper detektiert (unten).

Da keine Transformanten erzeugt werden konnten, die funktionelles Rpn2-GFPHA oder ΔNLS rpn2-GFPHA exprimieren, wird die Lokalisation von Rpn2-HA und ΔNLS rpn2-HA in der indirekten Immunfluoreszenz betrachtet. PWΔCn2H und PWn2H Zellen werden aus der logarithmischen Wachstumsphase für eine Stunde bei restriktiver Temperatur gehalten, fixiert und die Lokalisation der HA markierten Proteine mit Antikörpern gegen das HA- Epitop visualisiert (Abb. 27). Parallel wird die DNA in diesen Zellen mit DAPI angefärbt, um die Lage des Zellkerns anzuzeigen. Die Lokalisation von Rpn2-HA ist sowohl unter permissiven als auch unter restriktiven Temperaturbedingungen nukleär, während ΔNLS rpn2-HA lediglich bei 28°C im Zellkern lokalisiert ist. Wenn die Zellen eine Stunde bei 37°C inkubiert werden, ist das ΔNLS rpn2-HA Signal deutlich verringert und in punktartiger Struktur über die Zelle verteilt. Als Kontrolle dafür, dass die Zellstrukturen unter den Fixierungsbedingungen nicht zerstört wurden, werden Zellen beider Stämme nach der Fixierung mit Antikörpern gegen Kernporenproteine immungefärbt. Die ring- und punktartigen „Nuclear Pore Complex“ (NPC) Signale an der Kernmembran sind in allen [Seite 62↓]Zellen deutlich zu erkennen und weisen auf die intakte Kompartimentierung des Zellkerns hin.

Abb. 27: HA markiertes Rpn2 und ΔNLS rpn2 aus PWn2H bzw. PWΔCn2H Stämmen, die bei 28°C oder 37°C für eine Stunde gewachsen sind, werden mittels indirekter Immunfluoreszenz unter Verwendung des mAB12CA5 Antikörpers lokalisiert. Kontrollzellen werden mit dem Antikörper mAb414 gegen Kernporenproteine behandelt. Nukleäre und mitochondriale DNA aller Ansätze wird mit DAPI angefärbt.

Die cytoplasmatische Lokalisation von ΔNLS rpn2-HA in PWΔCn2H nach Inkubation des Stamms bei 37°C, könnte darauf hindeuten, dass Rpn2 unter diesen Bedingungen nicht korrekt in den 19S Komplex eingebaut wird. Unter der Annahme, dass Rpn2 kein essentielles Protein in S. cerevisiae ist (Yokota et al., 1996), scheint diese Hypothese sehr wahrscheinlich. Da widersprüchliche Veröffentlichungen über die Letalität der Rpn2 Deletion publiziert sind, wird die Disruption des RPN2 Gens in dem von Yokota und Mitarbeitenden generierten Stamm überprüft, indem dieser Stamm mit dem Rpn2-HA::URA3::HIS3 bzw. Rpn2ΔC-HA::URA3::HIS3 Konstrukt transformiert wird. Es entstehen die Stämme PWΔn2ΔCn2H und PWΔn2n2H. Lysate dieser Stämme zeigen in der Western Blot Analyse mit Antikörpern gegen das HA Epitop Signale bei Molekulargewichtsgrößen von 60 kDa bzw. 80 kDa für ΔRpn2 ΔNLS rpn2-HA bzw. ΔRpn2 Rpn2-HA (Abb. 25C). Die Disruption von RPN2, die durch Integration des LEU2 Gens in die HindIII Schnittstelle von Rpn2 (Bp 437 von 2838) durchgeführt wurde, führt demnach nicht wie von Yokota und Mitarbeitenden (1996) beschrieben zu einem vollständigen Verlust des Rpn2 Proteins. Die funktionelle Markierung des von diesem Gen- Locus entstehenden ca. 80 kDa Proteins, weist darauf hin, dass 4/5 des Rpn2 Gens abgelesen wird (vgl. Abb.25 C). Könnte das auf die HindIII Schnittstelle folgende ATG als Startcodon genutzt werden, würde ein 81kDA Protein gebildet werden. Der vollständige Verlust der [Seite 63↓]Rpn2 Untereinheit ist demnach wie publiziert wurde lethal und diese Untereinheit essentiell (DeMarini et al., 1995).

Der korrekte Einbau der mutierten Rpn2 Untereinheit in 19S Komplexe unter restriktiven Temperaturbedingungen wird untersucht, indem PWΔCn2Hβ5H und PWn2Hβ5H Zellen für eine Stunde bei 37°C inkubiert werden und die Lysate der Stämme mit und ohne ATP Zusatz einer 10-40% igen Glycerol- Dichtegradienten Zentrifugation unterzogen werden. In allen Fraktionen der Gradienten wird der Proteingehalt und die proteasomale PGPH Aktivität gemessen, bevor die Verteilung von Rpn2, Rpt6/ Cim3 und β5/ Pre2 im Immunoblot mit entsprechenden Antikörpern überprüft wird (Abb. 28).

Abb. 28:PWn2Hβ5H und PWΔCn2Hβ5H Zellen aus der exponentiellen Wachstumsphase werden für eine Stunde bei 37°C inkubiert und die Lysate mit und ohne ATP Zusatz werden einer 10-40 %igen Glycerolgradientenzentrifugation unterzogen. Alle Fraktionen werden mit dem Substrat Z-leu- leu- glu- βNaphthylamid auf proteasomale PGPH Aktivität untersucht. Die ATP enthaltenden Fraktionen werden gefällt, in der SDS PAGE aufgetrennt und im Immunoblot mit den Antikörpern gegen das HA Epitop und Rpt6 analysiert.

In den ATP enthaltenden Lysaten von PWΔCn2Hβ5H und PWn2Hβ5H sedimentiert reifes β5/ Pre2 deckungsgleich in den Fraktionen 12 bis 20, in denen auch die Proteaseaktivität gegen fluorogenes Substrat festgestellt wird. In fünf unabhängigen Aufarbeitungen war der Anteil und die Verteilung von nicht prozessiertem Pro- β5/ Pre2 in den Gradienten nicht reproduzierbar und es konnte kein Einfluss der Mutation in ΔNLS rpn2-HA auf die Prozessierung von β5/ Pre2 beobachtet werden. Die Signale für Pro- β5/ Pre2 werden deshalb nicht gezeigt. Rpt6 Signale finden sich in den ATP enthaltenden Lysaten für PWn2H in den Fraktionen 13- 20 während die ATPase in PWΔCn2H Lysaten bereits in Fraktion 11 und 12 nachgewiesen wird. Die Migration von Rpn2-HA sowie ΔNLS rpn2-HA im Glycerolgradienten lässt sich aufgrund der stark unterschiedlichen Erkennung [Seite 64↓]der HA markierten Proteine durch den Antikörper nur schwer vergleichen. Rpn2-HA wird in den Fraktionen 11-20 nachgewiesen und zeigt die intensivste ECL Färbung genau wie Rpt6 in den Fraktionen 15 und 16. ΔNLS rpn2-HA kann mit erheblich schwächerer Färbung von Fraktion 13 bis 20 detektiert werden. Die Proteinmenge in den einzelnen Fraktionen korreliert dabei mit der von Rpt6 und ist der ECL Färbung nach zu urteilen in Fraktion 16 am höchsten. In beiden Stämmen sedimentiert keines der betrachteten Proteine in Fraktionen geringer Dichte, sondern scheint auch nach einer Stunde Wachstum der Stämme bei 37°C komplexiert vorzuliegen. Die PGPH Aktivität des 26S Proteasoms gegen fluorogenes Substrat teilt sich für die unter Anwesenheit von ATP durchgeführten Gradienten in jeweils zwei Maxima auf, die für PWΔCn2H Lysate bei Fraktion Nummer 15 sowie 18 und für PWn2H Lysate bei 16 sowie 18 zu unterscheiden sind. Die in den PWΔCn2H Lysaten erreichte Aktivität pro mg Protein beträgt jedoch für beide Maxima nur ca. 60% der im entsprechenden wt Stamm gemessenen Aktivität. Werden die 20S Aktivitäten in den Gradienten ohne ATP Zusatz betrachtet, befindet sich das Maximum für beide Stämme bei Fraktion 14 und beläuft sich auf 35% bzw. 25% der maximalen Aktivität für PWΔCn2H bzw. PWn2H Lysate.

Abb. 29: 600mM NaCl Elution, die 19S Base und 20 S Komplexe aus PWn2Hn11P (rechts) sowie PWΔCn2Hn11P (links) enthalten, werden im 10- 40% igen Glycerolgradienten aufgetrennt, alle Fraktionen gefällt und in der Western Blot Analyse untersucht. Amidoblack gefärbte Membranen (oben) und ECL Signale (unten) aus der Immunreaktion mit Antikörpern gegen das HA Epitop, Rpt6/ Cim3 und α4 sind abgebildet.

Die Stabilität der proteasomalen Komplexe wird auch hier überprüft, indem die 600mM NaCl Elutionen der sequentiellen Affinitätschromatographie aus PWn2Hn11P sowie PWΔCn2Hn11P Lysaten im 10- 40% igen Glycerolgradienten aufgetrennt werden. Um zunächst die erforderliche Protein A Markierung an Rpn11 in PWn2H sowie PWΔCn2H einzuführen, werden die Stämme mit Rpn11-ProA::LEU2 Konstrukten transformiert und damit PWn2Hn11P und PWΔCn2Hn11P erzeugt. Ein Teil der 600mM NaCl Elution aus beiden Stämmen wird in der SDS PAGE aufgetrennt und das restliche Eluat im Glycerolgradienten analysiert. Die in der SDS PAGE separierten Proteine werden in Coomassie Lösung angefärbt und copräzipitiertes ΔNLS rpn2-HA massenspektrometrisch nachgewiesen. Aus allen Fraktionen des Glycerolgradienten werden die Proteine gefällt und in der Western Blot Analyse untersucht. Anhand der Amidoblack gefärbten [Seite 65↓]Nylonmembran lässt sich bereits erkennen, dass ΔNLS rpn2-HA unter den beschriebenen Bedingungen aus dem 19S Base Komplex herausgelöst wird und in Fraktionen geringerer Dichte (2-7) sedimentiert (Abb. 29). Die restlichen Untereinheiten des Subkomplexes sedimentieren geschlossen in den Fraktionen 8 bis 13, wobei der größte Proteingehalt in den Fraktionen 9 und 10 nachzuweisen ist. Der größte Anteil des 20S Proteasoms aus PWΔCn2Hn11P Lysaten ist in den Fraktionen 12-14 zu detektieren und nur geringe Mengen sedimentieren in den Fraktionen 15-17. Anhand der erkennbaren Proteinverteilung scheinen nur wenige 19S Base Komplexe mit dem 20S Proteasom assoziiert zu sein. Glycerolgradienten von Lysaten des korrespondierenden wt Stamms PWn2Hn11P zeigen keinen Zerfall des 19S Base Komplexes, der als vollständiger Komplex vor allem in den Fraktionen 11 und 12 sedimentiert, aber auch schon in Fraktionen 9 und 10 sowie in Spuren von Fraktion13 bis 16 zu erkennen ist. Das 20S Proteasom ist in den Fraktionen 13 bis 16 nachzuweisen. Der größte Anteil sedimentiert allerdings in Fraktion 14. Interessanterweise ist auch der Anteil an 19S Base Komplex in dieser Fraktion im Vergleich zu den benachbarten Fraktionen leicht erhöht, was darauf hindeutet, dass hier assoziierte 19S- 20S Komplexe vorliegen. In der Western Blot Analyse werden Rpt6, β5 sowie die HA Markierung an Rpn2 mittels entsprechender Antikörper nachgewiesen. Dabei fällt zunächst auf, dass das vom HA Antikörper erkannte ΔNLS rpn2-HA ein höheres Molekulargewicht aufweist, als das auf der Amidoblack gefärbten Membran sichtbare und in der Massenanalytik untersuchte Protein, das vom Antikörper nicht erkannt wird. Im Immunoblot nachweisbares ΔNLS rpn2-HA sedimentiert jedoch in den gleichen Fraktionen geringer Dichte wie ΔNLS rpn2, das offensichtlich keine HA Markierung mehr trägt (Fraktionen 2-7). Das Signal für Rpn2-HA, dessen Molekulargewichtsgröße in ECL Reaktion und Amidoblack gefärbter Membran übereinstimmt, ist in den Fraktionen 7 bis 20 detektierbar. Da die ECL Signale für Rpn2-HA sowie ΔNLS rpn2-HA auf dem gleichen UV- Film festgehalten werden und damit gleichen Expositionszeiten entsprechen, wirken die Signale für Rpn2-HA überexponiert. In ihrer Intensitätsverteilung korrelieren sie aber mit der Rpn2-HA Verteilung auf der Amidoblack gefärbten Membran. Der Nachweis von Rpt6 sowie β5 in der Western Blot Analyse stimmt überein mit der auf der Amidoblack gefärbten Membran beobachteten Verteilung der 19S Base sowie 20S Subkomplexe im Gradienten.

3.7 Far Western Untersuchungen zur Bindung von 19S proteasomalen Untereinheiten an Kar α/β

Die Funktionalität der lysinreichen Sequenzen aus Rpt2 und Rpn2 als Kernlokalisationssignal wurde anhand von in vivo Lokalisation und Far Western Analyse unter 3.4 gezeigt. Die Sequenzen wurden für diese Untersuchungen aus ihrer Proteinumgebung isoliert. Das heißt sie unterliegen im Fusionskonstrukt mit GFPS keiner festen tertiären Struktur, sondern nehmen neben der räumlichen Struktur von GFP eine ungeordnete Form ein, die für die Transportrezeptoren leicht zugänglich ist. Ob die NLS in den nativ gefalteten Rpt2 und Rpn2 Proteinen ebenfalls für Karyopherin α/β zugänglich [Seite 66↓]sind, und ob die um die NLS verkürzten Proteine noch von Karyopherin α/β erkannt werden, soll in der Far Western Analyse abgeklärt werden. Dazu werden 19S Base Subkomplexe in der sequentiellen Affinitätschromatographie nativ aus PWn2Hn11P, PWΔCn2Hn11P, PWt2Hn11HTP sowie PWΔNt2Hn11HTP isoliert und gleiche Mengen dieser Komplexe in der Far Western Analyse mit Karyopherin α- ProA als Bindungspartner untersucht (Abb. 30). Karyopherin α Lysate werden für die Bindungsreaktion unter Anwesenheit von Protease- Inhibitoren unverdünnt für vier Stunden mit den Blotmembranen bei 4°C inkubiert. Als Kontrollen werden die Fusionsproteine von GFPS mit der SV40NLS und der mutierten SV40NLS sowie GFPS alleine auf jeder Blotmembran mitgeführt (Abb. 30D). Die Inkubation eines Kontrollblots in Blockierungslösung mit 300mM Protein A ergibt lediglich Signale für das eluierte Rpn11- ProA Protein, jedoch keine unspezifische Bindung von Protein A an eine der 19S Untereinheiten. Rpn2 zeigt in allen Far Western Analysen mit Karyopherin α- ProA sowohl als HA markierte als auch als endogene Variante ein starkes ECL Signal. Ohne die C- terminale NLS dagegen reagiert ΔNLS rpn2 nicht mehr mit Karyopherin α- ProA. Das gleiche lässt sich für Rpt2 beobachten. Das Protein gibt nur ein Signal in der Far Western Analyse, wenn die N- terminale NLS im Protein vorhanden ist. In diesen Analysen lässt sich mit Rpt6/ Cim3 eine weitere 19S Base Untereinheit ausmachen, die mit Karyopherin α- ProA interagiert und somit vermutlich eine Kernlokalisationssequenz trägt. 19S Lid Komplexe, die in der sequentiellen Affinitätschromatographie aus PWt2Hn11HTP mit TEV Protease von der IgG Sepharose abgespalten werden können, reagieren in der Far Western Analyse nicht mit Karyopherin α- ProA (Abb. 30C). Wie in allen anderen Fraktionen der sequentiellen Affinitätschromatographie eluiert auch hier ein geringer Anteil an Protein A gekoppeltem Rpn11 (54 kDa) von der Säule und ergibt im Kaninchen anti Maus IgG Immunoblot der Far Western Analyse ein starkes Signal.


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Abb. 30: (A) Nativ eluierte 19S Base Subkomplexe, die Rpn2-HA (wt) oder ΔNLS rpn2-HA (Δ) enthalten, werden in der SDS PAGE aufgetrennt, auf PVDF Membran übertragen und der Far Western Analyse unterzogen. Signale, die im Far Western (FW) zu erkennen sind, stammen aus der Immunreaktion des Protein A markierten Karyopherin α mit NLS tragenden Proteinen. Die * markierten Signale werden von Rpn11ProA Fusionsproteinen hervorgerufen, die in den 600mM NaCl Elutionen von der Matrix abgelöst werden und mit den Peroxidase gekoppelten Kaninchen anti Maus IgG, die in der Far Western Analyse das Karyopherin α- ProA erkennt, interagieren. Nach der Far Western Analyse werden die Membranen mit pH 3,0 gewaschen, in Amidoblack (AB) gefärbt und in der Western Analyse mit Antikörpern gegen das HA Epitop und Rpt6 untersucht. (B)Nativ eluierte 19S Base Subkomplexe aus PWt2H (wt) und PWΔNt2H (Δ) werden den unter (A) beschrieben Analysen unterzogen (C) Der 19S Lid Komplex wird aus PWn11HTP isoliert und wie unter (A) beschrieben untersucht (D)GFP markierte SV40 NLS, mutierte SV40 NLS sowie das GFP Reporterprotein allein werden als Kontrollen bei allen Far Western Analysen auf dem selben Blot mitgeführt.


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29.09.2004