[Seite 68↓]

4  Diskussion

4.1 19S Untereinheiten lokalisieren im Zellkern und präzipitieren 19S Komplexe, Ubp6 und Ecm29

Ziel der Arbeit ist die Aufklärung der Transportmechanismen zur nukleären Lokalisation des 19S regulatorischen Partikels des 26S Proteasoms in Saccharomyces cerevisiae. Hinweise darauf, dass 19S Komplexe während der logarithmischen Wachstumsphase in S. cerevisiae im/am Zellkern lokalisiert sind, stammen aus der Arbeit von Enenkel und Mitarbeitenden (1998) mit der GFP markierten ATPase Cim5/ Rpt1. Die Lokalisation der 19S Lid Untereinheit Rpn11 sowie der 19S Base Untereinheit Rpn1 anhand einer funktionellen, C- terminalen Markierung mit GFP in dieser Arbeit bestätigen die früheren Ergebnisse. Rpn1-GFPHA und Rppn11-GFPHA sind in Zellen der logarithmischen Wachstumsphase hauptsächlich nukleär lokalisiert (vgl. Abb. 10). Es lässt sich durch die parallele Betrachtung der fluoreszenzmarkierten 19S Untereinheiten und den Zellkompartimentmarkern Nup49, Pdr5 und Pdr5* eine präzise Bestimmung der Fluoreszenzmarkierung im Zellkern treffen (vgl. Abb. 11), während eine Lokalisation am cytoplasmatischen ER weitestgehend ausgeschlossen werden kann (vgl. Pdr5*GFP und Rpn1/11-GFPHA Lokalisation). Gestützt werden diese Ergebnisse durch Daten von Wilkinson und Mitarbeitenden (1998), die zeigen, dass Immunogold markiertes Pad1/ Rpn11 in elektronenmikroskopischer Analyse an der inneren Kernmembran lokalisiert ist. Auch eine globale Analyse der Lokalisation von S. cerevisiae Proteinen zeigt, dass alle 19S Untereinheiten überwiegend im Zellkern vorliegen (Huh et al., 2003). Zusätzlich lässt die Akkumulation der fluoreszenzmarkierten, proteasomalen Untereinheiten an den Kernporen/ der Kernmembran unter Hungerbedingungen, die einen niedrigen Energiestatus der Zelle zur Folge haben, die Schlussfolgerung zu, dass ein Anteil der Proteasomen ständig energieabhängigen Transportprozessen unterworfen ist (vgl. Abb 11B). Die Co- Sedimentation der GFP markierten 19S Untereinheiten mit der ATPase Rpt6 sowie der 20S Untereinheit α1 in 10- 40% igen Glycerolgradienten als auch die stöchiometrische Copräzipitation aller 19S proteasomalen Untereinheiten mittels der Protein A markierten Untereinheiten Rpn1 und Rpn11 an IgG Sepharose zeigt den vollständigen Einbau der C- terminal veränderten Proteine in 19S Komplexe (Abb. 12 und 13). Da der Austausch von Rpn1 und Rpn11 gegen die GFP-HA und ProA markierten Varianten der Proteine lebensfähige Zellen erbrachte, müssen die veränderten Proteine unter den erfassten Bedingungen funktionell sein. Die Wachstumsraten der Stämme unterscheiden sich bei 28°C und 37°C nicht von denen des entsprechenden Ausgangsstamms, so dass die Markierung der essentiellen Proteine in diesen Zellen auch unter temperaturbedingtem Stress keine phänotypische Ausprägung findet (vgl. Abb. 10). Allerdings ist zu bemerken, dass die Co- Sedimentation der markierten Untereinheiten lediglich zu einer 19S Base sowie zu einer 20S Untereinheit gezeigt wurde. Es ist nicht nachgewiesen, dass alle Untereinheiten des 19S Komplexes mit den markierten Untereinheiten in diesen Stämmen im 10-40% igen Glycerolgradienten cosedimentieren. [Seite 69↓]Wie in den Copräzipitationen mit den Protein A markierten Untereinheiten zu beobachten ist, destabilisiert die eingeführte, C- terminale Markierung bestimmte Interaktionen zwischen 19S Base und 19S Lid Untereinheiten. Rpn1- ProA präzipitiert kaum Ecm29 und in Präzipitationen mit Rpn11- ProA ist kein Rpn12 zu detektieren, so dass zwischen diesen Proteinen eine direkte Interaktion vermutet werden kann. Die mit 30 kDa relativ große Protein A Markierung könnte notwendige Bindungsstellen zwischen angrenzenden 19S Untereinheiten verdecken oder eine korrekte Assoziation sterisch behindern. Es sollte unterschieden werden, ob die Bindung, der in den Copräzipitationen fehlenden 19S Untereinheiten zum Komplex nur geschwächt ist und sich während der Aufarbeitung löst, oder ob es in vivo gar nicht zu einer funktionellen Assoziation der Proteine kommt. Letzteres lässt sich für nicht essentielle Untereinheiten nicht bestimmen. Die Abwesenheit essentieller Untereinheiten wie Rpn12 kann jedoch nur mit der Dissoziation während der Aufarbeitung erklärt werden. Inwieweit Interaktionen mit substöchiometrisch assoziierten Proteinen und Substraten beeinträchtigt werden, lässt sich nicht aussagen. Unter den in dieser Arbeit experimentell erfassten Bedingungen kommt es jedoch durch die verwendeten Markierungen zu keiner erkennbaren funktionellen Beeinträchtigungen der proteasomalen Untereinheiten.

Die nicht essentiellen Proteine Ecm29 und Ubp6 werden nahezu stöchiometrisch in affinitätschromatografischen Aufarbeitungen des 19S Komplexes sowie des 26S Proteasoms detektiert. Das mit naszierenden 20S Proteasomen assoziierte Blm3 konnte in Aufarbeitungen von 19S Komplexen nicht nachgewiesen werden. Für die Assoziation des nicht essentiellen, deubiquitinierenden Enzyms Ubp6 mit 19S Partikeln gibt es bereits Belege, die eine Bindung des Proteins an den 19S Base zeigen (Leggett et al., 2002; Guterman und Glickman, 2004). Copräzipitationen von Ecm29 mit dem 26S Proteasomen wurden ebenfalls schon beschrieben (Leggett et al., 2002; Ho et al., 2002; Gavin et al., 2002). Untersuchungen der Arbeitsgruppe von D. Finley zufolge ist Ecm29 jedoch mit dem 20S Proteasom assoziiert und verbindet dieses mit dem 19S Komplex zum aktiven 26S Proteasom (Leggett et al., 2002). Diese Ergebnisse lassen sich nur mit der in dieser Arbeit gefundenen Assoziation von Ecm29 mit 19S Komplexen in Einklang bringen, wenn Ecm29 sowohl an den 20S als auch an den 19S Komplex binden kann und die Bindung an den ein oder anderen 26S Subkomplex von den in der Aufarbeitung verwendeten Salz- sowie ATP Konzentrationen abhängig ist.

Eine BLASTP 2.2.8 Proteindatenbank Recherche mit der Aminosäuresequenz von Ecm29 ergibt, dass sequenzhomologe Proteine auch in Homo sapiens, Arabidopsis thaliana und Drosophila melanogaster existieren. Das Homo sapiens Homolog von Ecm29, KIAA0368, besitzt 29% Sequenzidentität zu der Aminosäure Sequenz von Ecm29 und hat mit 1441 Aminosäuren ein Molekulargewicht von ca. 160 kDa. Über die Funktion dieses Proteins ist nichts bekannt. Die Homologie zwischen Ecm29 und Proteinen höherer Species könnte auf eine evolutionär konservierte Funktion des Proteins innerhalb des Ubiquitin- [Seite 70↓]Proteasomen Systems hindeuten.

4.2 Kernimport von 19S Partikeln ist abhängig von Karyopherin α/β

Nachdem verifiziert wurde, dass 19S regulatorische Untereinheiten vorwiegend im Zellkern lokalisieren, wurde anhand von Mutationsstämmen überprüft, welche Transportfunktionen für den Kernimport von 19S Partikeln verantwortlich sind. Die verwendeten Mutationsstämme tragen einen beschriebenen Defekt in Genen, deren Proteinprodukte essentielle Funktionen im Kernimportweg ausüben und ermöglichen in Kombination mit den GFP markierten 19S Untereinheiten das Auslesen der verantwortlichen Transportfunktionen. Unter Betrachtung der beiden essentiellen Kernimportrezeptoren Pse1/ Kap121 und Kap95 zeigt sich die nukleäre Lokalisation der 19S Partikel lediglich abhängig vom Srp1/ Kap60- Kap95 vermittelten Import. In der von Seedorf und Silver (1997) generierten pse1-1 Mutante sind Rpn1-GFP und Rpn11-GFP unter restriktiven Bedingungen nicht cytoplasmatisch lokalisiert. Da in dieser Mutante bisher nur für Transkriptionsfaktoren, wie Pdr1 und Spo12, eine cytoplasmatische Delokalisation gefunden wurde und in weiteren Untersuchungen direkte Interaktionen zwischen den Transkriptionsfaktoren Pho4 bzw. Ste12 und Pse1 gezeigt werden konnten, könnten Transkriptionsfaktoren die bevorzugten Importsubstrate von Pse1/ Kap121 darstellen (Chaves und Blobel, 2001; Delahodde et al., 2001; Kaffman et al., 1998; Leslie et al., 2002). Der nukleäre Import von 20S Proteasomen (Lehmann et al., 2002) sowie 19S regulatorischen Komplexen ist dagegen Karyopherin α/β abhängig. Sowohl die 20S proteasomalen Precursorkomplexen als auch die GFP markierten 19S Untereinheiten Rpn1 und Rpn11 delokalisieren nur in srp1-49 Zellen unter restriktiven Bedingungen ins Cytoplasma. Die von Loeb und Mitarbeitenden (1995) in der NLS Bindung und im Protein Import in den Zellkern als defekt beschriebene Mutante srp1-31 zeigt dagegen unter restriktiven Bedingungen keine abweichende Lokalisation der 19S Untereinheiten. Bezüglich der phänotypischen Merkmale dieser beiden Mutanten gibt es in der Literatur widersprüchliche Aussagen (siehe Tab. 8). Der in dieser Arbeit verwendete Stamm trägt, wie ursprünglich von Yano und Mitarbeitenden (1994) beschrieben, eine Glu145à Lys Mutation und zeigt nach 8 stündiger Inkubation unter restriktiven Temperaturbedingungen verlangsamtes Wachstum sowie einen Zellteilungsdefekt beim Übergang von G2 zu M Phase während der Mitose. Weiterhin delokalisieren in diesem Stamm SV40NLS-GFP Fusionsproteine und 20S proteasomale Precursor Komplexe in vivo unter restriktiven Bedingungen aus dem Zellkern ins Cytoplasma, was auf schwere Defekte im cNLS abhängigen Import von Proteinen in den Zellkern hindeutet (Lehmann et al., 2002). Die gleichen Bedingungen, die zur Anreicherung von proteasomalen Precursor Komplexen im Cytoplasma der srp1-49 Mutante führen, bewirken im Vergleich zu permissiven Bedingungen eine quantifizierbare Verstärkung der cytoplasmatischen Pixelintensität von Rpn1-GFPHA und Rpn11-GFPHA in dieser Mutante (vgl. Abb. 14), so dass 19S regulatorische Partikel vermutlich vorwiegend über den cNLS und Karyopherin α/β[Seite 71↓]abhängigen Importweg in den Zellkern gelangen. Es ist nicht auszuschließen, dass Proteasomen in Analogie zum Import von Histonen und ribosomalen Proteinen neben Karyopherin α/β durch mehrere alternative Karyopherine transportiert werden können (Mossammaparast et al., 2001; Rout et al., 1997). 26S Proteasomen Multiproteinkomplexe, die mit der TAP- (tandem- affinity purification) Methode in systematischen Analysen des Hefe Proteoms isoliert wurden, enthalten neben Karyopherin α/β auch Pse1, wodurch die oben genannte These unterstützt wird (Gavin et al., 2002; Ho et al., 2002). Es sollte erwartet werden, dass die alternative Nutzung von Pse1 als Importrezeptor anhand einer cytoplasmatischen Lokalisation der GFP markierten 19S Untereinheiten in pse1-1 Stämmen erkennbar ist. Wie die Untersuchungen von Mossammaparast und Mitarbeitenden (2001) zeigen, werden Fusionsproteine aus Histon NLS und GFP in dieser Mutante nicht delokalisiert, sondern lediglich weniger stark im Kern angereichert. Ist ein Protein in der Lage neben Pse1 mehrere Transportrezeptoren für den Kernimport zu nutzen, kommt es demnach in der pse1-1 Mutante unter restriktiven Bedingungen nicht zur cytoplasmatischen Delokalisation dieses Proteins. Die deutliche cytoplasmatische Lokalisation von Rpn1-GFP und Rpn11-GFP in srp1-49 Zellen unter restriktiven Bedingungen, lässt den Schluss zu, dass 19S regulatorische Komplexe vorwiegend über den Karyopherin α/β abhängigen Importweg transportiert werden und potentielle, alternative Importrouten nicht in der Lage sind den srp1-49 Defekt komplett zu kompensieren.

Die Unterbindung des 19S Kerntransports in srp1-49 Zellen scheint nicht vollständig zu sein. Aus Abb. 14B geht hervor, dass die nukleäre Pixelintensität in srp1-49 Stämmen nach der Inkubation für 4 Stunden bei 37°C im Mittel nahezu den gleichen Wert erreicht, wie in den bei Raumtemperatur gewachsenen Kontrollzellen. Der selbe Wert nimmt während der Inkubation der wt Stämme bei 37°C in der Tendenz ab. Auch wenn die Fluoreszenzaufnahmen der einzelnen Stämme nicht vollständig miteinander vergleichbar sind, weil der Expressionslevel der fluoreszenzmarkierten Untereinheiten in den verschiedenen Stämmen bei den untersuchten Temperaturen unterschiedlich sein kann, ist hier eine Tendenz auszumachen: Die Intensität der nukleären Fluoreszenz nimmt unter restriktiven Bedingungen nicht ab. In Anbetracht dessen, dass sich die S. cerevisiae Zellen während der Inkubationszeit bei 37°C ein- bis zweimal teilen ohne dass sich die Kernmembran wie bei höheren Eukaryonten auflöst, sollten sich die im Kern vorhandenen, fluoreszierenden Untereinheiten erheblich verdünnen, wenn der Kernimport vollständig blockiert wäre. Da dies nicht der Fall ist, kann davon ausgegangen werden, dass die srp1-49 Mutation lediglich zu einem verschlechterten Kernimport der aktiv transportierten Substrate führt. Entweder können - wie oben erwähnt – andere Karyopherine die srp1-49 Mutation kompensieren oder die srp1-49 Mutation bewirkt eine verminderte Karyopherin α Bindungseffizienz. In beiden Fällen wäre der Kernimport in srp1-49 Zellen ineffizienter als in entsprechenden Zellen mit voll funktionsfähigem [Seite 72↓]Karyopherin α. Um den Level an nukleären Proteasomen bei verschlechtertem Kernimport aufrecht zu erhalten, sollte deshalb die cytoplasmatische Substratkonzentration ansteigen. Der beobachtete Anstieg der Pixelintensität der fluoreszenzmarkierten Untereinheiten im Cytoplasma und die Steigerung der absoluten Pixelintensität unter restriktiven Temperaturbedingungen in Abb. 14 könnte darauf hinweisen, dass der Level an generierten 19S bzw. 26S Proteasomen im Kern kontrolliert wird und danach die Expression der Untereinheiten gesteuert wird. Diese Konzentrationserhöhung wäre notwendig, um eine ausreichende Translokation der NLS tragenden Substrate in den Zellkern sicherzustellen und spiegelt den Grad der Beeinträchtigung des Importapparats durch die Mutation wieder. Der proteasomale Transkriptionslevel kann durch die Bindung von Rpn4 an die im Promotorbereich der proteasomalen Gene liegenden PACE Motive gesteigert werden. Da Rpn4 eine NLS besitzt und Karyopherin α/βabhängig in den Zellkern transportiert wird (Mannhaupt et al., 1999), sollte diese Möglichkeit der transkriptionellen Regulation der Proteinexpression proteasomaler Untereinheiten in srp1-49 Zellen ebenfalls beeinträchtigt sein. Die Frage wie es zu der hier beobachteten Fluoreszenzzunahme in srp1-49 Zellen kommt und ob der Level an nukleären Proteasomen tatsächlich Einfluss auf den Transkriptionslevel proteasomaler Untereinheiten hat, bleibt zu untersuchen.

Werden Lysate der srp1-49 und wt Stämme, deren endogenes Rpn11 gegen das GFPHA markierte Protein ausgetauscht ist, nach Wachstum unter restriktiven Bedingungen im Glycerolgradienten aufgetrennt, sedimentieren Anteile der 19S Untereinheiten Rpt6 und Rpn11 aus srp1-49 vor allem im Vergleich zum Laufverhalten des 20S Proteasoms in Fraktionen geringerer Dichte (7-9) als im wt Stamm (vgl. Abb. 14C). Native 19S Komplexe sedimentieren gewöhnlich in den Fraktionen 10- 12 (vgl. Abb. 14D). Daraus kann geschlussfolgert werden, dass das im Cytoplasma des srp1-49 Stamms unter restriktiven Bedingungen angereicherte GFP markierte Rpn11 nicht in freier Form vorliegt, sondern in Komplexe eingebaut ist, die geringfügig langsamer in 10- 40 % igen Glycerolgradienten sedimentieren als 19S Komplexe. Das Sedimentationsverhalten dieser Komplexe entspricht in etwa denen der 19S Base und Lid Subkomplexe.

4.3 Kernlokalisationssequenzen in Rpn2 und Rpt2 binden an Karyopherin α

Die von Srp1/ Karyopherin α erkannten Signalsequenzen, sind im Vergleich zu denen anderer Transportrezeptoren relativ gut charakterisiert. Trotzdem ist eine Vorhersage über die Funktionalität NLS ähnlicher Sequenzen in Proteinen schwer, da vornehmlich die Interaktionen zwischen NLS und NLS- Bindungstasche anhand von kurzen ungefalteten Peptiden mit Srp1/ Karyopherin α untersucht sind (Fontes et al., 2000). Die Struktur von Karyopherin α gebunden an ein Cargo Protein ist bisher nicht aufgeklärt und deshalb sind Protein- Protein Interaktionen, die nicht die NLS- Bindungstasche betreffen, unbekannt. Die Sequenzanalyse der 19S Untereinheiten ergibt, dass 8 der 17 Untereinheiten lysin-/ argininreiche Sequenzen tragen, die mit den Konsensussequenzen der klassischen NLS [Seite 73↓]übereinstimmen. Auffällig ist, dass sich im 19S Base Subkomplex eine höhere Dichte an NLS ähnlichen Sequenzen findet als im 19S Lid Komplex. Daten von Yen und Mitarbeitenden (2003a) zeigen, dass die Lokalisation der 19S Lid Untereinheit Rpn5 in Stämmen, die einen Defekt im 19S Lid tragen, cytoplasmatisch ist, während sie in Stämmen, die einen Defekt im 19S Base tragen, nukleär ist. Die Abhängigkeit der Rpn5 Lokalisation von Mutationen in den 19S Subkomplexen, weist darauf hin, dass 19S Lid und Base unabhängig voneinander in den Zellkern transportiert werden. Ein unabhängiger Transport sollte für beide Subkomplexe mit gleicher Effizienz geschehen, was wiederum eine ähnliche Verteilung der NLS erfordern würde. Potentielle klassische NLS, die den Import über Karyopherin α/β vermitteln, sind jedoch im 19S Lid Komplex deutlich unterrepräsentiert. Möglicherweise assoziieren NLS vermittelnde Proteine für die Dauer des Kernimports mit diesem Subkomplex. Hinweise darauf gibt es in der Arbeit von Yen und Mitarbeitenden (2003b), die zeigt, dass Yin6/Int6 mit Rpn5 interagiert. Int6 wiederum trägt sowohl eine NES als auch eine potentielle bipartite NLS, mit deren Hilfe Rpn5 bzw. der gesamte 19S Lid Komplex in der Kern gelangen könnte (Guo und Sen, 2000). Außerdem konnten Tabb und Mitarbeitende (2000) eine yeast two hybrid Interaktion zwischen Rpn11 und Sts1, das wiederum direkt mit Karyopherin α interagiert, belegen. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass 19S Lid Komplexe nicht direkt mit Karyopherin α interagieren. Der Fokus dieser Arbeit liegt jedoch auf Proteinen des 19S Komplexes, die direkt mit Karyopherin α interagieren und die Sequenzen tragen, die eine auffällige Übereinstimmung mit den NLS Konsensussequenzen zeigen. Das sind insbesondere die 19S Base Untereinheiten Rpn2, Rpt2 und Rpt4. Die potentielle NLS im N- Terminus von Rpt4 wurde von McDonald und Kollegen (2002) deletiert. Die resultierenden Stämme zeigten auch unter Stressbedingungen wt Wachstum, so dass für diese NLS eine essentielle Funktion auszuschließen ist. Da die C- terminalen Bereiche aller ATPase Untereinheiten reich an basischen Aminosäuren und evolutionär stark konserviert sind, wird der C- terminale Bereich von Rpt1 ebenfalls in die Untersuchungen mit einbezogen.

Die Untersuchung, der aus dem Proteinzusammenhang isolierten NLS ähnlichen Sequenzen von Rpn2, Rpt2 und Rpt1 zeigt, dass die mit der NLS Konsensussequenz übereinstimmende Rpn2 sowie Rpt2 Sequenz in der Lage ist, das GFP Reporterprotein in den Zellkern zu leiten, während die lysinreiche Region im Rpt1 C- Terminus zu keiner deutlichen Kernfärbung führt. Die Immunpräzipitation der Kernimportrezeptoren Karyopherin α/βund die in vitro Bindung der Rezeptoren an die Rpn2 und Rpt2 Sequenz in der Far Western Analyse bestätigt die Funktion dieser Sequenzen als NLS. Die Rpt1 Sequenz zeigt unter diesen Versuchsbedingungen dagegen nur eine sehr schwache (Lokalisation von GFP; Präzipitation von Karyopherin α/β) bzw. keine (Far Western) Qualität als NLS.

4.4 Mehrere NLS im 19S Komplex sind am effizienten Kernimport beteiligt

Um die Relevanz der identifizierten NLS in vivo zu untersuchen, werden sie aus den [Seite 74↓]essentiellen, einmalig im Genom vorkommenden RPT2 und RPN2 Genen deletiert. In beiden Fällen führt dies zu lebensfähigen Zellen, in denen sowohl die veränderten Untereinheiten als auch Rpn1 und Rpn11 unter Standardbedingungen korrekt im Zellkern lokalisiert sind. Das heißt, dass diese NLS weder für das Überleben der Hefen noch für die Lokalisation der entsprechenden Untereinheit essentiell sind. Die Auswirkungen dieser Deletion sind in beiden Stämmen erst unter Stressbedingungen zu beobachten und in ΔNLS rpn2HA exprimierenden Stämmen deutlich stärker als in ΔNLS rpt2-HA exprimierenden. Letztere zeigen eine eindeutige Temperatursensitivität unter Wachstum bei 37°C, die vermutlich auf die mit der Deletion einhergehenden Zellzyklusdefekte zurückzuführen ist. Da gezeigt werden konnte, dass die stark positiv geladenen NLS in DNA bindenden Proteinen mit DNA/ RNA bindenden Domänen überlappen (LaCasse und Lefebvre, 1995) und die Einbindung der ATPasen Rpt4 und Rpt6 in Transkriptionsprozesse bereits gezeigt wurde (Ferdous et al., 2002), überlagern sich in der lysinreichen Sequenz in Rpt2 möglicherweise NLS und DNA/ RNA bindende Strukturen. In der Far Western Analyse der 19S Base Komplexe aus PWt2Hn11HTP sowie PWΔNt2Hn11HTP kann gezeigt werden, dass diese Sequenz an die Kerntransportrezeptoren Karyopherin α/β bindet und damit als NLS im Proteinzusammenhang dienen kann (vgl. Abb. 30). Die nukleäre Lokalisation von ΔNLS rpt2 in PWΔNt2GH Zellen auch unter Temperaturstress bedeutet, dass die identifizierte Karyopherin α bindende Sequenz in vivo nicht als NLS funktioniert oder die Deletion durch die Anwesenheit multipler NLS im 19S Komplex kompensiert werden kann. Da die Sequenz in vitro eine starke Bindung an Karyopherin α zeigt und GFP Reporterproteine effizient in den Zellkern transferiert, scheint es unwahrscheinlich, dass sie in vivo nicht funktionell ist. Da zusätzlich mehrere 19S Base Untereinheiten NLS tragen, von denen zumindest die NLS in Rpt4 ebenfalls nicht essentiell ist (McDonald et al., 2002), sind vermutlich mehrere NLS am effizienten Transport des 19S Komplexes in den Zellkern beteiligt. In PWΔNt2GH Zellen kann die Deletion der Rpt2 NLS aufgewogen werden, so dass der Stamm betreffs proteasomaler Lokalisation und Funktion nur eine schwache phänotypische Ausprägung zeigt. Die Verwendung mehrerer NLS wurde bereits für den Kernimport des Nucleoplasmin Homoheptamers beschrieben. Erst wenn vier der fünf klassischen Kernlokalisationssequenzen deletiert sind, ist der Kernimport von Nucleoplasmin beeinträchtigt (Dingwall und Laskey, 1991).

Rpt2 ist in der ATP Bindungsdomäne die mutationssensibelste ATPase und der C- terminale Bereich des Proteins wird für die ATP abhängige Öffnung des Translokationskanals im 20S Proteasom verantwortlich gemacht (Rubin et al., 1998; Köhler et al., 2001). Dementsprechend sind die in dieser Arbeit verwendeten C- terminalen HA bzw. GFPHA Markierungen kritisch zu betrachten. Wie in den Untersuchungen zur Temperatursensibilität erkennbar ist, führt schon das Anhängen des zweifachen HA Epitops (22 Aminosäuren) an Rpt2 zu leichter Temperatursensitivität des [Seite 75↓]wt Stamms. Mit der wesentlich größeren GFPHA Markierung an dieser Stelle sind die Zellen schon stark temperatursensitiv. Interessanterweise zeigt keiner der HA markierten Stämme einen Defekt in der Degradation ubiquitinierter Proteine (CanS), so dass die Funktion dieser ATPase auch unter Stressbedingungen im Ubiquitin- Proteasom System gegeben scheint. Schon die Markierung der ATPase mit 2x HA scheint vielmehr zu einer Destabilisierung des ATPase Rings zu führen, wie unter Behandlung des 19S Base Komplex aus PWt2H und PWΔNt2H mit 600mM NaCl im Glycerolgradienten ersichtlich ist. Mindestens die ATPase Rpt6 löst sich hier zu gewissem Anteil aus dem Komplex und sedimentiert in Fraktionen geringerer Dichte. Werden die Komplexe unter schonenderen Bedingungen aufgetrennt (vgl. Abb. 22) oder ist die HA Markierung nicht vorhanden (vgl. Abb. 29) geschieht das nicht. Untersuchungen zur quaternären Struktur des ATPase Komplexes durch chemisches Cross- linking ergaben, dass Rpt6 und Rpt2 im ATPase Ring benachbart sind (Hartmann- Petersen et al., 2001). Die Einführung der HA Markierung an Rpt2 beeinträchtigt deshalb möglicherweise nur die Bindung zwischen diesen beiden Untereinheiten. Der Vergleich der proteasomalen Aktivitäten in den 10-40% igen Glycerolgradienten mit Rpt2/ ΔNLS rpt2 (Abb. 22) bzw. Rpn2/ ΔNLS rpn2 (Abb. 28) enthaltenden Lysaten verdeutlicht einen weiteren Effekt der HA Markierung. Trotz mehrfacher Wiederholung der Gradienten gelingt es nicht 26S proteasomale Aktivität zu detektieren, sondern es wird die Aktivität, der in den Fraktionen 10- 16 sedimentierenden, 20S Proteasomen gemessen. Das heißt die HA Markierung destabilisiert die Assoziation des 19S Komplex mit dem 20S Komplex insofern, dass 26S Proteasomen schon während der Aufarbeitung zerfallen können. Diese Daten sind konsistent mit Ergebnissen, die zeigen, dass der C- Terminus von Rpt2 den Kontakt zur α3 Untereinheiten des 20S Proteasomens herstellt und Ergebnissen, wonach die Phosphorylierung der ATPase Rpt6, deren Assoziation mit Rpt2 durch die Markierung beeinträchtigt wird, die Assemblierung von 19S Regulator und 20S Proteasomen reguliert (Köhler et al., 2001; Satoh et al., 2001). Diese Destabilisierung der 26S Proteasomen aufgrund der Rpt2 Markierung könnte die Ursache der beobachteten Temperatursensitivität sein, scheint aber wie oben erwähnt keine Auswirkung auf die proteasomale Proteindegradation unter Stressbedingungen zu besitzen.

Zellen, die eine Deletion der NLS in RPN2 tragen, sind drastisch temperatur- sowie canavaninsensitiv und reichern im Vergleich zu isogenen wt Stämmen ubiquitinierte Proteine an. Da Mutationen in den Untereinheiten des 19S Komplexes häufig zu Defekten in der proteasomalen Degradation führen (zusammengefasst in Voges et al., 1999; Hilt und Wolf, 2000), lässt sich nicht zwangsläufig schlussfolgern, dass die phänotypischen Merkmale der Mutante auf einen Verlust der NLS Funktion in Rpn2 zurückzuführen sind. Die untersuchte Rpn2 NLS ist in eine KEKE Region (Lysin-/ Glutamat reiche Sequenzen) eingebettet. Realini und Mitarbeitende (1994) postulieren, dass KEKE Motive in verschiedenen Multiproteinkomplexen (Proteasomen, Chaperonen) Protein-Protein [Seite 76↓]Interaktionsflächen bieten, so dass neben der Funktion als NLS an einer disponierten Position für Proteininteraktionen wie den Untereinheiten des 19S Komplex eine Vielzahl von Interaktionspartnern denkbar sind. Strukturvorhersagen zufolge ist die lysinreiche KEKE Region in Rpn2 nicht in die torroidartige Struktur des Proteins eingebunden, sondern könnte als herausragende Domäne eine Interaktionsfläche für verschiedene Proteine bilden (Kajava, 2002). Die untersuchte Sequenz könnte somit sowohl für die Funktion des 19S Regulators als auch als NLS bedeutsam sein.

Es könnten mehrere, durch die Deletion der Rpn2 NLS hervorgerufene Funktionsverluste zu den beobachteten Merkmalsausprägungen führen. Dass Rpn2 für das Überleben der Zellen essentiell ist und Mutationen in diesem Protein die proteasomale Degradation beeinträchtigen, wurde bereits von DeMarini und Mitarbeitenden (1995) gezeigt. Für den Nachweis der Assoziation von Rpn2 mit dem 26S Proteasom haben DeMarini und Kollegen (1995) eine N- terminale Markierung an Rpn2 verwendet und fanden, dass bei dem Großteil des in den Zellen entstandenen Rpn2 diese HA Markierung proteolytisch abgespalten wurde. Auch die in dieser Arbeit verwendete C- terminale Markierung von ΔNLS rpn2 mit dem HA Epitop lässt sich in Zelllysaten nur in geringem Maß nachweisen (vgl. Abb. 25A und 26B). Vielmehr geht aus der Aufreinigung proteasomaler Komplexe in Coimmunpräzipitationen hervor, dass der größte Anteil des in die Proteasomen eingebauten ΔNLS rpn2-HA die HA Markierung nicht mehr trägt, sondern ein einheitliches Molekulargewicht von ca. 75 kDa besitzt (vgl. Abb. 29). Offenbar wird jedoch nur ΔNLS rpn2-HA partiell degradiert, denn in Stämmen, die Rpn2-HA exprimieren, konnte keine verkürzte Form des Proteins nachgewiesen werden. Die Struktur des Rpn2 Proteins scheint für die reibungslose Funktion des 19S Partikels äußerst wichtig zu sein und die durch die Deletion der KEKE Region bzw. durch eine N- terminale HA Markierung hervorgerufenen strukturellen Veränderungen in dem essentiellen Protein können durch partielle Degradation teilweise kompensiert werden. Die in dieser Arbeit verwendete C- terminale HA Markierung an Rpn2 dagegen ist strukturell und funktionell nicht hinderlich.

Aus Abbildung 28 geht hervor, dass ΔNLS rpn2-HA trotz der Deletion in proteolytisch aktive 26S Proteasomen eingebaut wird. Diese 26S Proteasomen zeigen jedoch im Vergleich zu wt Proteasomen eine um 40% verringerte Aktivität gegenüber fluorogenen Substraten. Da die 20S proteasomale Aktivität in wt Zellen und ΔNLS rpn2-HA exprimierenden Zellen nahezu identisch ist, scheint die 19S Regulator Aktivität in den ΔNLS rpn2-HA exprimierenden Zellen beeinträchtigt zu sein. Genauer gesagt muss die Effizienz der Proteintranslokation (gating) in das katalytisch aktive 20S Proteasom gestört sein, da bei einer Hydrolyse von fluorogenen Peptiden keine Ubiquitin abhängige Erkennung, Entfaltung oder Deubiquitinierung des Substrats vonnöten ist. Eine geringere Effizienz der Translokation von Substraten ins 20S Proteasom könnte auf eine strukturelle Destabilisation des 19S Base Komplexes durch die Deletion der KEKE Region in Rpn2 hindeuten. Dies zeigt sich tatsächlich bei Behandlungen des isolierten 26S Proteasoms [Seite 77↓]mit 600mM NaCl. Unter diesen Bedingungen wird das mutierte Rpn2 aus dem 19S Subkomplex herausgelöst (vgl. Abb. 29). Eine weitere Erklärungsmöglichkeit der verringerten Aktivität ergibt sich aus der Überlegung, dass in diesen Zellen aufgrund der Deletion der NLS in Rpn2 der Kernimport der 19S Komplexe geschwächt sein könnte. Sollte nämlich in Analogie zu 20S Proteasomen die Biogenese des 19S Regulatorkomplexes an den Kernimport gekoppelt sein, könnte unter den in diesem Versuch geltenden restriktiven Bedingungen ein Mangel an funktionsfähigen 19S Komplexen entstehen und damit der Anteil an aktiven 26S Proteasomen abnehmen. Die in diesem Ansatz bestimmte relative proteolytische Aktivität der 26S Proteasomen lässt keine Aussage darüber zu, ob die generierten 26S Proteasomen aufgrund eines Defekts weniger aktiv sind oder ob der Anteil an aktiven Proteasomen in Bezug auf die Gesamtproteinmenge in den einzelnen Fraktionen der untersuchten Lysate unterschiedlich ist. Die Untersuchung der proteasomalen Untereinheiten in der Western Blot Analyse mit ECL Reagenz lässt sich nur sehr ungenau quantifizieren und eignet sich nicht zur Klärung dieser Fragestellung.

Die leichte Veränderung im Sedimentationsverhalten der ATPase Rpt6 in Glyceroldichtegradienten mit Lysaten von ΔNLS rpn2-HA exprimierenden Zellen im Vergleich zu Lysaten aus Rpn2- HA exprimierenden Zellen (Abb. 28) ist konsistent mit dem in den Glycerolgradienten mit srp1-49/ Srp1 Lysaten beobachteten Effekt. Offenbar kommt es durch das Fehlen der NLS in Rpn2 unter restriktiven Bedingungen zu einem Anstau von Rpt6 enthaltenden Komplexen, die geringfügig langsamer sedimentieren als Rpt6 enthaltende Komplexe im vergleichbaren Experiment mit wt Lysaten. Unter Berücksichtigung der Lokalisation der ΔNLS rpn2 Untereinheit in der indirekten Immunfluoreszenz im Cytoplasma, die unter den gleichen Bedingungen durchgeführt wurde wie der Glyceroldichtegradient, scheint die Rpn2 NLS zumindest unter restriktiven Bedingungen für die korrekte Lokalisation des 19S Base notwendig zu sein (vgl. Abb. 27). Die Deletion der Rpn2 NLS kann unter diesen Bedingungen nicht mehr durch die Anwesenheit anderer Kernlokalisationssequenzen kompensiert werden. Leider kann aufgrund der Instabilität der HA Markierung an ΔNLS rpn2-HA keine Aussage über ein verändertes Sedimentationsverhalten dieser Untereinheit getroffen werden, da die Signalstärke im Western Blot nicht mit der von Rpn2- HA vergleichbar ist. Die exakte Größe und Zusammensetzung des im Cytoplasma angereicherten Komplex lässt sich anhand der Ergebnisse dieser Arbeit nicht ableiten. Aufgrund der Verteilung der 19S Untereinheiten im Glycerolgradienten lässt sich jedoch aussagen, dass der cytoplasmatische Komplex nicht langsamer sedimentiert als 19S Base und Lid Komplexe.

Die Far Western Analyse der 19S Base Komplexe aus Stämmen deren NLS in Rpn2 oder Rpt2 deletiert sind, zeigt eindeutig, dass wenigstens in diesem Subkomplex mehrere Karyopherin α bindende Domänen vorhanden sind. In den 19S Lid Untereinheiten konnten mit dieser Methode allerdings keine Kernlokalisationssequenzen nachgewiesen [Seite 78↓]werden. Dies kann auf ungenügende Sensitivität der verwendeten Methode zurückzuführen sein oder aber heißen, dass der 19S Lid Komplex mit Hilfe von NLS vermittelnden Adapterproteinen oder mit Hilfe des 19S Base in den Zellkern gelangt. Ungeklärt ist leider auch, ob die gefundenen NLS in Rpn2, Rpt2 sowie Rpt6 alle in vivo funktionell sind. Es ist durchaus denkbar, dass einzelne Kernlokalisationssequenzen im Gesamtkomplex verdeckt sind und damit für Karyopherin α nicht zugänglich sind. Genauso ist vorstellbar, dass auch schwache Kernlokalisationssignale, die nicht in der Far Western Analyse erfasst werden konnten, in vivo an der hohen Effizienz des 19S Imports in den Zellkern beteiligt sind. So präzipitiert auch die Rpt1 NLS Kernimportrezeptoren und vermag GFP zumindest in geringen Anteilen im Zellkern zu lokalisieren (vgl. Abb. 16). Fraglich bleibt welche Domäne in Rpt6 die in der Far Western Analyse detektierte Kernlokalisationssequenz kodiert. Eine Kernlokalisationssequenz in Übereinstimmung mit der NLS Konsensussequenz konnte hier nicht gefunden werden.

4.5 Die Biogenese des 20S Proteasomens ist unabhängig von der 19S Lokalisation

Eine Abhängigkeit der 20S Proteasomen Biogenese vom Kernimport der 19S regulatorischen Partikel konnte in dieser Arbeit nicht festgestellt werden. Wie Abb. 26B zeigt, ist weder die Prozessierung von Pro β5 noch von Pro β7 unter Bedingungen, bei denen 19S Komplexe im Cytoplasma angereichert werden, beeinträchtigt. Diese Beobachtung ist in Übereinstimmung mit der Annahme, dass halbe Kernpartikel im Zellkern mit Blm3 assoziieren und unter Anwesenheit dieses Proteins koordiniert maturieren (Fehlker et al., 2003). Der 19S Regulatorkomplex bindet erst an reifes 20S Proteasom, so dass die Biogenese des 20S Proteasoms aber nicht die Assoziation der im Kern lokalisierten 26S Proteasomen unabhängig von der Lokalisation der 19S Komplexe ist.

4.6 Ausblick

Die mit srp1-49 durchgeführten Untersuchungen deuten darauf hin, dass 19S Lid und Base unabhängig in den Kern transportiert werden. Im wesentlichen basieren diese Vermutungen jedoch auf dem im Glyceroldichtegradienten gezeigten Sedimentationsverhalten einzelner 19S Untereinheiten. Auch wenn die Abgrenzung zwischen aufgereinigtem 19S Base und 19S Regulatorkomplex im Glycerolgradienten gut ausgemacht werden kann, muss beachtet werden, dass in Glycerolgradienten aus Zelllysaten alle in der Zelle vorhandenen, bekannten oder nicht bekannten Subpopulationen des 19S Komplexes aufgetrennt werden und sich auch überlagern können. Eine wirklich befriedigende Antwort auf die Frage der Zusammensetzung des Transportkomplexes kann im Prinzip nur erreicht werden, wenn eine Coimmunpräzipitation dieser 19S Subpopulation mit Karyopherin α/β gezeigt werden kann und dieser Komplex in ausreichenden Mengen vorhanden ist, um alle interagierenden Proteine zu charakterisieren. Da die Verbindung zwischen Kerntransportern und Substrat [Seite 79↓]nur transient ist, ist dieser Versuchsansatz auch in Hefezellen schwer zu verwirklichen. Ein sicher einfacherer Weg umfasst die Präzipitation der in den srp1-49 Zellen angestauten, cytoplasmatischen Komplexe mit Hilfe von Rpn1- ProA bzw. Rpn11- ProA. Um hier eine erkennbare Trennung der Transportkomplexe von bereits bestehenden 19S Regulatoren zu erreichen, muss dieser Versuch im Pulse Chase Experiment durchgeführt werden. Wirklich erfolgreich kann dieses Experiment nur dann sein, wenn der srp1-49 Mutationsstamm tatsächlich keinen Kerntransport der 19S Untereinheiten zulässt und die Zeitspanne in der die Biogenese von 19S regulatorischen Komplexen geschieht, in Pulse Chase Analysen erfassbar ist. Pulse Chase Untersuchungen mit wt Stämmen, aus denen 19S Untereinheiten mit Hilfe von Rpn11- ProA copräzipitiert wurden, ergaben allerdings, dass nahezu der gesamte 19S regulatorische Komplex nach 3min Pulse copräzipitiert werden kann (nicht gezeigt).

Um zu klären, ob der 19S Regulator als gesamter Komplex oder nur in Subkomplexen an Karyopherin α/β binden kann, müssten in vitro Bindungsstudien durchgeführt werden. Leider konnte während der Dauer dieser Arbeit kein funktionsfähiger Ansatz gefunden werden, der eine vertrauenswürdige Bindung der Transportrezeptoren Karyopherin α/βzum 19S Regulator bzw. zu dessen Subkomplexen in vitro rekonstituieren ließe. Alle Kontrollen, die zu den in der Literatur beschriebenen Kernimportuntersuchungen etabliert worden sind, stellten die Aussage der Rekonstitutionsversuche in Frage.

Die sehr interessante Frage, ob nur 19S regulatorische Komplexe in den Zellkern transportiert werden, die neu entstehen, oder ob 19S Komplexe generell zwischen Cytoplasma und Zellkern hin und her transportiert werden können, konnte bisher nicht geklärt werden. In Analogie zur Kernimport verknüpften Biogenese von 20S Proteasomen, scheint es naheliegend, dass lediglich neu entstehende 19S Komplexe in den Zellkern transportiert werden müssen. Ein Nachweis für diese These ist jedoch schwierig, da im 19S Komplex keine zu prozessierenden Untereinheiten existieren, die verschiedene Biogenesestadien kennzeichnen würden und da somit eine Trennung der neu synthetisierten Komplexe von bestehenden 19S Komplexen nahezu unmöglich ist. Insbesondere die Kopplung der Biogenese mit dem Kerntransport ist schwer nachweisbar, da möglicherweise nur strukturelle Umlagerungen im 19S Komplex zu einer Unterscheidung zwischen reifen und maturierenden 19S Regulatoren führen und zur Erkennung oder Maskierung der NLS beitragen. Für zukünftige Arbeiten wäre es deshalb sehr hilfreich eine verbesserte biochemische Trennung der einzelnen 19S Subkomplexe innerhalb der Gesamtpopulation zu erreichen sowie exakte strukturelle Daten über diesen Komplex zu erhalten. Die bei 20S Proteasomen und deren Vorläuferkomplexen erfolgreich angewendete Methode der nativen Elution der Komplexe mit Hilfe einer Strep- Tag II Markierung und deren Auftrennung in der Nativ- Gelelektrophorese ließ sich bei 19S Regulatoren nicht anwenden, da weder Rpn1-GFP-S noch Rpn11-GFP-S Untereinheiten des 19S Komplexes copräzipitieren (nicht gezeigt). Diese Markierung [Seite 80↓]konnte sowohl in der 19S Base als auch 19S Lid Untereinheit unter verschiedenen Pufferbedingungen keine Bindung der fluoreszierenden Untereinheit an die Streptactin Matrix herstellen, obwohl keine Probleme in Coimmunpräzipitationen mit HA oder ProA Markierungen in diesen Untereinheiten aufgetreten waren. Eine weitere Möglichkeit, die gesamte Population nativer 19S Komplexe aus S. cerevisiae zu isolieren, besteht, indem 19S Komplexe oder auch 26S Proteasomen aus Rpn11-HA-TEV-ProA exprimierenden Zellen an IgG Sepharose gebunden werden und nachfolgend mit Hilfe der TEV Protease nativ eluiert werden. Die Effizienz dieser Spaltung ist vermutlich aufgrund schlechter Zugänglichkeit der TEV- Protease Schnittstelle nur sehr gering. Lediglich die Abspaltung des 19S Lid Subkomplexes in der sequentiellen IgG Sepharose Affinitätschromatographie ergibt eine befriedigende Ausbeute.

4.7 Spekulationen über den biologischen Sinn der nukleären 19S Lokalisation

Über den biologischen Sinn der nukleären Lokalisation von 19S Komplexen sowie 20S Proteasomen kann nur spekuliert werden. Die naheliegenste Erklärung ist, dass im Zellkern funktionelle 26S Proteasomen benötigt werden, um die Vielzahl der dort vorhandenen proteasomalen Substrate, wie Transkriptionsfaktoren, Tumor Suppressor Proteine oder Cycline, abzubauen. Insbesondere Prozesse, die die Chromosomen Erhaltung (chromosome maintenance), die DNA Reparatur (DNA repair), die Transkriptionsaktivierung und den Zellzyklus steuern, werden vom Ubiquitin- Proteasomen System reguliert (zusammengefasst in McBride et al., 2003). Da bereits mehrfach eine Assoziation von ribosomalen Protein und Ribosomen interagierenden Proteinen mit Proteasomen beschrieben wurde (Verma et al., 2000; Nop1: Tone und Toh-e (2002); Sum1: Dunand- Sauthier et al., 2002) und durch Studien mit Mutationsstämmen eine genetische Verbindung zwischen Ribosomen und Proteasomen postuliert wurde (Gerlinger et al., 1997), sind 26S Proteasomen im Zellkern möglicherweise für den Abbau einiger der ca. 60 trans aktiven Proteine in der Ribosomenbiogenese verantwortlich. Vornehmlich im Zellkern bietet sich ein breites Spektrum an kurzlebigen Proteinen, die sehr effizient vom Ubiquitin- Proteasomen System vernichtet werden müssen, um das Überleben der Zelle zu garantieren. Einige Komponenten des für die Markierung der Substrate benötigten Ubiquitin Systems, wie zum Beispiel das Ubiquitin aktivierende Enzym UBA1 oder das F-box Protein Cdc4, sind ähnlich in der Zelle verteilt wie 26S proteasomale Untereinheiten und damit auch im Zellkern lokalisiert (Huh et al., 2003). Für das S. cerevisiae Zellzyklusprotein Far1 sowie die Xenopus Proteine p27 und MyoD konnte tatsächlich die Degradation im Zellkern bewiesen werden. Die Untersuchung des proteasomalen Abbaus von p53, β- Catenin und p27Kip1 in Mammalia Zellen hat allerdings erbracht, dass diese Proteine abhängig vom nukleären Export degradiert werden und demnach nicht im Zellkern abgebaut werden (zusammengefasst in Glickman und Ciechanover, 2002). Sowohl die Kernexport abhängige als auch die nukleäreDegradation von Proteinen scheint damit die Stabilität von proteasomalen Substraten zu regulieren.


[Seite 81↓]

Würden 26S Proteasomen mit ihrer interzellulären Lokalisation ihren Substraten folgen, müsste geschlussfolgert werden, dass die höchste proteolytische Aktivität in der Zelle im Zellkern zu messen wäre. Bisher gibt es für diese Annahme keinen Beleg in der Literatur, so dass die 26S Subkomplexe im Zellkern auch nicht proteolytische Aufgaben haben könnten oder inaktiv sein könnten. Für 19S regulatorische Base Partikel konnte gezeigt werden, dass sie neben der proteasomalen Aktivität eine Funktion in der effizienten Transkriptionselongation durch die RNA Polymerase II besitzen (Ferdous et al., 2001). Wie hoch der Anteil des in Transkriptionsprozesse involvierten 19S Komplexes am gesamten 19S Pool in der Zelle ist, ist unklar, so dass unsicher ist, welchen Anteil diese Komplexe an der nukleären Lokalisation der 19S Partikel tragen. In logarithmisch wachsenden S. cerevisiae Zellen ist ein großer Anteil der nukleären 20S proteasomalen Untereinheiten in inaktive Vorläuferkomplexe eingebaut (Lehmann et al., 2002; Fehlker et al., 2003). In Anbetracht dessen, dass für die Assemblierung von 19S Komplexen 17 neu synthetisierte Proteine koordiniert zusammenfinden müssen, könnte die Translokation dieser Untereinheiten in den Zellkern garantieren, dass die Proteine durch die Assoziation der lysinreichen Proteininteraktionsdomänen mit Karyopherin α vor unerwünschten Interaktionen bewahrt werden und dass die lokale Konzentration der Proteine mit Erreichen des Zellkerns ihr Maximum erlangt und das Zusammenfinden der Untereinheiten erleichtert wird. Demnach könnten auch 19S regulatorische Partikel aus inaktiven Vorläuferkomplexen entstehen, die vorwiegend im Zellkern lokalisiert sind.

Eine vom 20S Proteasomen unabhängige Funktion des 19S Partikels im Zellkern kann nicht ausgeschlossen werden. Auch wenn die meisten biochemischen Nachweise auf eine weitgehende Assoziation von 19S und 20S Komplex schließen lassen, existiert bisher kein einfach handhabbarer Nachweis für die 19S Aktivität. Vom 20S Proteasomen unabhängige 19S Aktivität kann in vivo nicht gemessen werden. So ist denkbar, dass 19S Regulatoren in vivo Chaperon ähnliche Aktivität zeigen und - wie in vitro Daten belegen - denaturierte Proteine reaktivieren können (Braun et al., 1999). Auch eine Kontrollfunktion für die Ubiquitinierung von Proteinen könnte insbesondere den bisher funktionell kaum charakterisierten19S Lid Untereinheiten beigemessen werden. Die frappierende strukturelle Homologie dieses Subkomplexes zu COP9 Signalosomen könnte auf eine Ähnlichkeit in den regulatorischen Funktionen der Komplexe hindeuten (Kapelari et al., 2000).

4.8 Importmodell für 19S regulatorische Partikel

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, dass 19S regulatorische Komplexe des 26S Proteasoms in S. cerevisiae durch Karyopherin α/β abhängigen Import in den Zellkern gelangen. Es sind drei 19S Base Untereinheiten identifiziert worden, die Karyopherin α bindende Kernlokalisationssequenzen tragen (Rpn2, Rpt2, Rpt6). Unterschiede in der Relevanz der einzelnen Kernlokalisationssequenzen für den Import von 19S Komplexen in den Zellkern konnten [Seite 82↓]ebenfalls gezeigt werden. So ist die Rpn2 NLS zumindest für die Lokalisation des 19S Base Komplex unter restriktiven Temperaturbedingungen entscheidend. Aufgrund des Sedimentationsverhaltens von 19S Lid sowie Base Untereinheiten in Glyceroldichtegradienten, die mit srp1-49 oder PWΔCn2H Lysaten durchgeführt worden sind, kann vermutet werden, dass 19S Lid und Base Subkomplexe unabhängig in den Zellkern transportiert werden. In dem aus dieser Arbeit resultierenden Modell des 19S Importmechanismus in den Zellkern von S. cerevisiae werden demnach multiple Kernlokalisationssequenzen in 19S Base sowie Lid Komplexen von den Kerntransportrezeptoren Karyopherin α/β gebunden und die Subkomplexe aktiv durch die Kernporen geleitet (vgl. Abb. 31).


[Seite 83↓]

Abb. 31: Modell für den Karyopherin α/β abhängigen Import von 19S Komplexen. 19S Base Untereinheiten sind grün, 19S Lid Untereinheiten sind orange angefärbt. Die NLS tragenden Untereinheiten in 19S Base und Lid Komplex sind blau hervorgehoben. Das Größenverhältnis von proteasomalen Subkomplexen zum Kernporenkomplex ist für eine bessere Übersichtlichkeit verzerrt dargestellt.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 3.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
29.09.2004