Dissertation

Nukleärer Import von 19S regulatorischen Komplexen in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)

im Fach Biologie

eingereicht an der Mathematisch- Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt- Universität zu Berlin

von Diplom Ingenieurin Petra Wendler

geb. 09.05.1972 in Gehrden, Hannover

Präsident der Humboldt- Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan: Dekan der Mathematisch- Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Michael Linscheid

Gutachter:
1. Prof. Dr. P.-M. Kloetzel
2. Prof. Dr. W. Dubiel
3. Prof. Dr. H. Holzhütter

eingereicht: 12.03.2004

Datum der Promotion: 28.05.2004


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Abstract

Das 26S Proteasom führt die letzen Schritte des essentiellen, Ubiquitin abhängigen Proteinabbaus durch, indem es ubiquitinierte und fehlgefaltete Proteine erkennt und eliminiert. Da es in S. cerevisiae während allen Stadien der Zellteilung vornehmlich im Zellkern lokalisiert ist, ist der Importweg dieses 2,5 MDa umfassenden proteolytischen Komplexes in den Zellkern von besonderem Interesse. Das 26S Proteasom unterteilt sich in das katalytisch aktive 20S Proteasom sowie den 19S Regulatorkomplex. Für 20S Proteasomen konnten Lehmann und Mitarbeitende (2002, JMB, 317, 401) zeigen, dass Vorläuferkomplexe über den Karyopherin alpha/beta abhängigen Importweg in den Zellkern gelangen und dort zu 20S Proteasomen heranreifen. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass die nukleäre Lokalisation der 19S Regulatorkomplexe ebenfalls von Karyopherin alpha/beta abhängt. Die Untersuchung der potentiellen klassischen Kernlokalisationssequenzen (cNLS) in den Untereinheiten des 19S Base Subkomplex ergab, dass Rpn2 und Rpt2, eine non-ATPase Untereinheit sowie eine ATPase Untereinheit des Base Komplex, funktionelle cNLS beherbergen. Die Deletion der Rpt2 NLS führte zur wt Lokalisation der proteasomalen Subkomplexe. Die Deletion der NLS in Rpn2 dagegen bewirkte eine verschlechterte proteasomale Funktion und eine Mislokalisation der Komplexe. Unsere Daten unterstützen ein Modell wonach die nukleären 26S Proteasomen aus Subkomplexen zusammengelagert werden, die durch Karyopherin alpha/beta in den Zellkern gelangen.

Eigene Schlagworte: Kerntransport, 19S Regulator, Proteasom, S. cerevisiae


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Abstract

26S proteasomes fulfil final steps in the ubiquitin-dependent degradation pathway by recognising and hydrolysing ubiquitylated proteins. As the 26S proteasome mainly localises to the nucleus in yeast, we addressed the question how this 2 MDa multisubunit complex is imported into the nucleus. 26S proteasomes consist of 20S proteolytically active core and 19S regulatory particles, the latter composed of two subcomplexes, namely the base and lid complexes. We have shown that 20S core particles are translocated into the nucleus as inactive precursor complexes via the classical karyopherin alpha/beta import pathway (Lehmann et al. 2002; JMB, 317, 401). Here, we provide evidence that nuclear import of base and lid complexes also depends on karyopherin alpha/beta. Potential classical nuclear localisation sequences (NLS) of base subunits were analysed. Rpn2 and Rpt2, a non-ATPase and an ATPase subunit of the base complex, harbour functional NLS. The Rpt2 NLS deletion yielded wild type localisation. However, the deletion of the Rpn2 NLS resulted in improper nuclear proteasome localisation and impaired proteasome function. Our data support the model by which nuclear 26S proteasomes are assembled from subcomplexes imported by karyopherin alpha/beta

Keywords: Nuclear import, 19S regulatory complex, proteasome, S. cerevisiae


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Zusammenfassung

Das 26S Proteasom führt die letzen Schritte des essentiellen, Ubiquitin abhängigen Proteinabbaus durch, indem es ubiquitinierte und fehlgefaltete Proteine erkennt und eliminiert. Da es in S. cerevisiae während allen Stadien der Zellteilung vornehmlich im Zellkern lokalisiert ist, ist der Importweg dieses 2,5 MDa umfassenden proteolytischen Komplexes in den Zellkern von besonderem Interesse. Das 26S Proteasom unterteilt sich in das katalytisch aktive 20S Proteasom sowie den 19S Regulatorkomplex. Für 20S Proteasomen konnten Lehmann und Mitarbeitende (2002) zeigen, dass Vorläuferkomplexe über den Karyopherin α/β abhängigen Importweg in den Zellkern gelangen und dort zu 20S Proteasomen heranreifen. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass die nukleäre Lokalisation der 19S Regulatorkomplexe ebenfalls von Karyopherin α/β abhängt. Die Untersuchung der potentiellen klassischen Kernlokalisationssequenzen (cNLS) in den Untereinheiten des 19S Base Subkomplex ergab, dass Rpn2 und Rpt2 cNLS beherbergen, die Karyopherin α binden und in der Lage sind GFP Fusionsproteine in den Zellkern zu dirigieren, wenn diese in S. cerevisiae überexprimiert werden. Der C- terminale Bereich der ATPase Rpt1 ähnelt einer cNLS, zeigt aber nur geringe Bindung an Karyopherin α. Far Western Analysen bestätigen, dass ΔNLS rpn2 und ΔNLS rpt2 im Gegensatz zu Rpn2 und Rpt2 nicht mehr an Karyopherin α binden können und die Kernlokalisation der 19S Komplexe vom klassischen Importweg abhängig ist. Stämme, die eine cNLS Deletion in Rpn2 oder Rpt2 tragen, sind stark temperatursensitiv. Die Deletion der NLS in Rpn2 führt außerdem zu Canavanin Sensitivität und einer herabgesetzten 26S proteasomalen Aktivität. Des weiteren scheint die NLS in Rpn2 für die korrekte Lokalisation der 19S Komplexe kritischer zu sein als die in Rpt2, da 19S regulatorische Komplexe in ΔNLS rpn2 exprimierenden Stämmen im Gegensatz zu ΔNLS rpt2 exprimierenden Stämmen unter restriktiven Temperaturbedingungen im Cytoplasma lokalisiert sind. Die Deletion einer einzelnen cNLS im19S Base Komplex hat unter permissiven Bedingungen keinen Einfluss auf die Lokalisation der 19S Komplexe, so dass unter diesen Bedingungen vermutlich mehrere Karyopherin α/β Transporter kooperativ an die verschiedenen cNLS im 19S Komplex binden und diesen durch die Kernporen leiten. Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen zur molekularen Masse des transportierten Komplexes weisen darauf hin, dass 19S regulatorische Partikel als 19S Base und Lid Subkomplexe in den Zellkern importiert werden.

Inhaltsverzeichnis

Tabellen

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29.09.2004