Präsident der Humboldt- Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek
Das 26S Proteasom führt die letzen Schritte des essentiellen, Ubiquitin abhängigen Proteinabbaus durch, indem es ubiquitinierte und fehlgefaltete Proteine erkennt und eliminiert. Da es in S. cerevisiae während allen Stadien der Zellteilung vornehmlich im Zellkern lokalisiert ist, ist der Importweg dieses 2,5 MDa umfassenden proteolytischen Komplexes in den Zellkern von besonderem Interesse. Das 26S Proteasom unterteilt sich in das katalytisch aktive 20S Proteasom sowie den 19S Regulatorkomplex. Für 20S Proteasomen konnten Lehmann und Mitarbeitende (2002, JMB, 317, 401) zeigen, dass Vorläuferkomplexe über den Karyopherin alpha/beta abhängigen Importweg in den Zellkern gelangen und dort zu 20S Proteasomen heranreifen. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass die nukleäre Lokalisation der 19S Regulatorkomplexe ebenfalls von Karyopherin alpha/beta abhängt. Die Untersuchung der potentiellen klassischen Kernlokalisationssequenzen (cNLS) in den Untereinheiten des 19S Base Subkomplex ergab, dass Rpn2 und Rpt2, eine non-ATPase Untereinheit sowie eine ATPase Untereinheit des Base Komplex, funktionelle cNLS beherbergen. Die Deletion der Rpt2 NLS führte zur wt Lokalisation der proteasomalen Subkomplexe. Die Deletion der NLS in Rpn2 dagegen bewirkte eine verschlechterte proteasomale Funktion und eine Mislokalisation der Komplexe. Unsere Daten unterstützen ein Modell wonach die nukleären 26S Proteasomen aus Subkomplexen zusammengelagert werden, die durch Karyopherin alpha/beta in den Zellkern gelangen.
26S proteasomes fulfil final steps in the ubiquitin-dependent degradation pathway by recognising and hydrolysing ubiquitylated proteins. As the 26S proteasome mainly localises to the nucleus in yeast, we addressed the question how this 2 MDa multisubunit complex is imported into the nucleus. 26S proteasomes consist of 20S proteolytically active core and 19S regulatory particles, the latter composed of two subcomplexes, namely the base and lid complexes. We have shown that 20S core particles are translocated into the nucleus as inactive precursor complexes via the classical karyopherin alpha/beta import pathway (Lehmann et al. 2002; JMB, 317, 401). Here, we provide evidence that nuclear import of base and lid complexes also depends on karyopherin alpha/beta. Potential classical nuclear localisation sequences (NLS) of base subunits were analysed. Rpn2 and Rpt2, a non-ATPase and an ATPase subunit of the base complex, harbour functional NLS. The Rpt2 NLS deletion yielded wild type localisation. However, the deletion of the Rpn2 NLS resulted in improper nuclear proteasome localisation and impaired proteasome function. Our data support the model by which nuclear 26S proteasomes are assembled from subcomplexes imported by karyopherin alpha/beta
Das 26S Proteasom führt die letzen Schritte des essentiellen, Ubiquitin abhängigen Proteinabbaus durch, indem es ubiquitinierte und fehlgefaltete Proteine erkennt und eliminiert. Da es in S. cerevisiae während allen Stadien der Zellteilung vornehmlich im Zellkern lokalisiert ist, ist der Importweg dieses 2,5 MDa umfassenden proteolytischen Komplexes in den Zellkern von besonderem Interesse. Das 26S Proteasom unterteilt sich in das katalytisch aktive 20S Proteasom sowie den 19S Regulatorkomplex. Für 20S Proteasomen konnten Lehmann und Mitarbeitende (2002) zeigen, dass Vorläuferkomplexe über den Karyopherin α/β abhängigen Importweg in den Zellkern gelangen und dort zu 20S Proteasomen heranreifen. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass die nukleäre Lokalisation der 19S Regulatorkomplexe ebenfalls von Karyopherin α/β abhängt. Die Untersuchung der potentiellen klassischen Kernlokalisationssequenzen (cNLS) in den Untereinheiten des 19S Base Subkomplex ergab, dass Rpn2 und Rpt2 cNLS beherbergen, die Karyopherin α binden und in der Lage sind GFP Fusionsproteine in den Zellkern zu dirigieren, wenn diese in S. cerevisiae überexprimiert werden. Der C- terminale Bereich der ATPase Rpt1 ähnelt einer cNLS, zeigt aber nur geringe Bindung an Karyopherin α. Far Western Analysen bestätigen, dass ΔNLS rpn2 und ΔNLS rpt2 im Gegensatz zu Rpn2 und Rpt2 nicht mehr an Karyopherin α binden können und die Kernlokalisation der 19S Komplexe vom klassischen Importweg abhängig ist. Stämme, die eine cNLS Deletion in Rpn2 oder Rpt2 tragen, sind stark temperatursensitiv. Die Deletion der NLS in Rpn2 führt außerdem zu Canavanin Sensitivität und einer herabgesetzten 26S proteasomalen Aktivität. Des weiteren scheint die NLS in Rpn2 für die korrekte Lokalisation der 19S Komplexe kritischer zu sein als die in Rpt2, da 19S regulatorische Komplexe in ΔNLS rpn2 exprimierenden Stämmen im Gegensatz zu ΔNLS rpt2 exprimierenden Stämmen unter restriktiven Temperaturbedingungen im Cytoplasma lokalisiert sind. Die Deletion einer einzelnen cNLS im19S Base Komplex hat unter permissiven Bedingungen keinen Einfluss auf die Lokalisation der 19S Komplexe, so dass unter diesen Bedingungen vermutlich mehrere Karyopherin α/β Transporter kooperativ an die verschiedenen cNLS im 19S Komplex binden und diesen durch die Kernporen leiten. Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen zur molekularen Masse des transportierten Komplexes weisen darauf hin, dass 19S regulatorische Partikel als 19S Base und Lid Subkomplexe in den Zellkern importiert werden.
Das Überleben eukaryonter Zellen ist entscheidend vom unverzüglichen Abbau kurzlebiger Proteine abhängig, die in Bereichen wie der Transkription, der Zelldifferenzierung, der Zellzykluskontrolle oder der DNA Fehlerkorrektur zum Einsatz kommen. Auch Proteine, die fehlerhaft sind, müssen erkannt und beseitigt werden. Eine effiziente Vernichtung einer Vielzahl von Proteinen ist ebenfalls wichtig, sobald die Zelle Stresssituationen ausgesetzt ist oder die fehlgesteuerte Proteinproduktion bei der Krebsentstehung bzw. bei viralen Infektionen bekämpfen muss. In höheren Eukaryonten stellt hierbei die Generierung von Antigenen, die an der Zelloberfläche von MHC I (major histocompatibility complex) Molekülen präsentiert werden können, eine wichtige Immunreaktion dar. Nahezu alle diese Aufgaben werden in eukaryonten Zellen ATP abhängig durch einen Multi- Proteinkomplex von ca. 2,5 MDa - das 26S Proteasom - ausgeführt (Ciechanover, 1998).
26S Proteasomen erkennen ubiquitinierte Proteine und zerlegen sie in Peptide einer Länge von 3-22 Aminosäuren (Kisselev et al., 1999). Funktionell und strukturell bestehen sie aus zwei Subkomplexen: dem proteolytisch aktiven, zylinderförmigen 20S Kernpartikel sowie den an einem oder beiden Enden des 20S gebundenen 19S Regulatorkomplexes. Das 20S Proteasom alleine ist lediglich in der Lage, kurze Peptide zu spalten, während den regulatorischen Partikeln die Aufgaben der Erkennung ubiquitinierter Proteine, der Proteinentfaltung, der Abspaltung des Ubiquitinrestes sowie der Übertragung des Polypeptids in das 20S Proteasom zukommen. Für die effiziente Funktion des 19S regulatorischen Partikels sowie für die Zusammenarbeit mit dem 20S Proteasom wird ATP verbraucht (Hershko et al., 1984). Biochemisch kann der Regulatorkomplex in zwei Subkomplexe aufgetrennt werden, die als 19S Base sowie 19S Lid Komplex bezeichnet werden (Glickman et al., 1998a; Saeki et al., 2000).
Die rechtzeitige, substratspezifische Beseitigung von Proteinen bedarf einer hochentwickelten Kontrolle, die im Ubiquitin- Proteasom- System gewährleistet wird. Verschiedene Enzyme sind für die Erkennung des entsprechenden Proteins und dessen Markierung mit kovalent gebundenen Ketten von Ubiquitinresten verantwortlich. Diese Ubiquitinreste dienen anschließend dem Proteasom als Degradationssignal für das markierte Protein. Ubiquitin ist genau wie das Proteasom in Eukaryonten evolutionär hochkonserviert. Das 8,6 kDa Saccharomyces cerevisiae Protein besteht aus 76 Aminosäuren und unterscheidet sich nur in drei Aminosäuren vom humanem Ubiquitin (Özkaynak et al., 1989). Für die Konjugation an das entsprechende Substrat, muss Ubiquitin zunächst ATP abhängig aktiviert werden, indem es mit dem Ubiquitin aktivierenden Enzym (E1; UBA- ubiquitin activating enzyme) ein energiereiches Thiolester- Intermediat bildet. Dieses wird auf ein Ubiquitin konjugierendes Enzym (E2; UBC- ubiquitin conjugating enzyme) übertragen, das den aktivierten Ubiquitinrest unter
In S. cerevisiae sind bisher zwei UBA Enzyme (UBA1, UBA2), 15 UBCs und ca. 60 E3- Ligasen bekannt (von Arnim, 2001). Die E3 Ligasen nehmen als die größte, stetig wachsende Proteinfamilie in diesem System eine Schlüsselposition ein, indem sie die zu degradierenden Proteine erkennen und den Abbau einleiten. Als Ubiquitinierungssignale dienen den E3 Ligasen einzelne N- terminale Aminosäuren (N-end rule degron; Bachmair & Varshavsky, 1989), kurze Sequenzen wie die destruction box in Cyclinen oder stark hydrophobe Bereiche, die als Membrananker dienen oder im Molekülinneren globulärer Proteine vorkommen (Gilon et al., 1998). Aufgrund struktureller oder funktioneller Ähnlichkeit können die E3 Ligasen in 6 Subtypen unterteilt werden:
die E3α Proteine,
die HECT (Homolog zu E6-assoziiertem Protein Carboxylterminus) Domäne tragenden Proteine,
den APC (anaphase promoting complex: Anaphase fördernden Komplex) bzw. das Cyclosom,
den SCF Komplex (Skp1, Cdc53 in S. cerevisiae bzw. Cullin in humanen Zellen, F- box Protein),
Ring Finger Proteine
und einem SCF ähnlichen Komplex, der das von Hippel- Lindau Tumorsuppressor Protein (pVHL) beinhaltet (zusammengefasst in Ciechanover et al., 2000).
Wenn das zu degradierende Protein durch die E3 Ligase erkannt ist, überträgt die entsprechende E2 den ersten Ubiquitinrest, indem eine Peptidbindung des C- terminalen Glycins (G76) von Ubiquitin entweder an die ε- NH2 Gruppe eines substrateigenen Lysins oder in einigen Fällen auch an die α-NH2 Gruppe des Substrats geknüpft wird (Hershko & Ciechanover, 1998; Breitschopf et al., 1998). Da 19S regulatorische Partikel für die effiziente Erkennung der Ubiquitinmarkierung eine Kette von mindestens vier und für den effizienten Abbau des Substrats mehr als fünf Ubiquitinreste benötigen, werden anschließend weitere Ubiquitinreste, meist bereits in Kettenform, durch Lysin 48- G76 Isopeptidbindungen übertragen (Thrower et al., 2000; Chau et al., 1989).
Bisher sind zwei Untereinheiten des 26S Proteasoms bekannt, die Polyubiquitinketten binden können: Rpn10/ S5a und Rpt5/ S6´ (Deveraux et al., 1994; van Nocker et al., 1996; Lam et al., 2002). S. cerevisiae Rpn10 und humanes S5a interagieren mittels einem bzw. zwei Ubiquitin- interagierenden Motiven (UIM) im C- terminalen bzw. mittleren Bereich des Proteins mit Polyubiquitin (Hofmann & Falquet, 2001). Allerdings ist weder Rpn10 noch sind dessen Homologe in S. pombe oder der Moos Art Physcomitrella patens essentiell (van Nocker et al., 1996; Girod et al., 1999; Wilkinson et al., 2000). Die Tatsache, dass die Rpn10 Deletion in verschiedenen genetischen Hintergründen
Über die zeitliche Reihenfolge der nach der Substraterkennung durch das 26S Proteasom erforderlichen Abbauschritte sowie über die für Proteinerkennung und -abbau erforderlichen, strukturellen Umlagerungen im 26S Proteasomen, ist bisher nur sehr wenig bekannt. Es wurde jedoch gezeigt, dass der effiziente Abbau von Proteinen von der Integrität des gesamten Komplexes abhängig ist (Glickman et al., 1998a). Peptide werden bereits vom 20S Proteasom abgebaut. Diese Aktivität kann aber durch Assoziation des 20S Proteasoms mit dem 19S Base oder mit dem gesamten Regulatorkomplexes erheblich gesteigert werden (Glickman et al., 1998a). Dies geschieht vermutlich, indem die ATPase Untereinheit Rpt2 im 19S Base den Translokationskanal in das 20S Proteasom öffnet und den Zugang der Substrate zu den proteolytischen Untereinheiten erleichtert (Köhler et al., 2001). Da die von den α Untereinheiten gebildete hydrophobe, axiale Öffnung des 20S Proteasoms nur einen Durchmesser von ca. 13 Å hat, muss das zu degradierende Protein vor der Translokation entfaltet werden (Lowe et al., 1995). Diese Aufgabe wird den sechs AAA (ATPases associated with various cellular activities) ATPasen im 19S Base aufgrund von Homologien zu anderen ATPase Komplexen dieser Familie zugeschrieben (Rubin et al., 1998). Alle ATPase Komplexe dieser Familie besitzen hochkonservierte AAA Domänen, die eine Nukleotid abhängige Konformationsänderung der ATPasen induzieren können. Diese Konformationsänderung wirkt sich so auf das gebundene Substrat aus, dass Polypeptide entfaltet werden, Protein- Protein Interaktionen zerstört werden oder eine gerichtete Bewegung ausgeführt werden kann (Vale, 2000). Ein Hinweis darauf, dass die proteasomalen ATPasen Faltungszustände eines Proteins verändern können, stammt aus der Arbeit von Braun et al. (1999), die zeigt, dass sowohl der 19S Base als auch das 26S Proteasom in vitro in der Lage sind, ungefaltete Citratsynthase zu binden und zu reaktivieren.
Da der Abbau der strukturell sehr stabilen Ubiquitinmarkierung zusammen mit dem zur Degradation gekennzeichneten Protein energetisch verschwenderisch wäre, stellt die Abspaltung bzw. Monomerisierung dieser Markierung eine weitere, essentielle Funktion des 19S Regulators dar. Auch hier sind bereits mehrere deubiquitinierende Enzyme gefunden, die integraler oder peripherer Bestandteil des 26S Proteasoms sind. Fast allen ist zu eigen, dass sie spezifisch die Amidbindung nach dem C- terminalen G76 von Ubiquitin und damit die Peptidbindung zwischen Ubiquitin und Substrat spalten. Die substöchiometrisch mit dem Proteasom interagierenden Proteine Doa4 und Ubp6 besitzen beide eine deubiquitinierende Cysteinprotease- Aktivität. Zellen in denen Doa4 mutiert ist, reichern kurze ubiquitinierte Peptide an und Deletionsstämme von Ubp6 zeigen einen erhöhten Ubiquitinumsatz, da der Ubiquitinrest zusammen mit dem Substrat abgebaut wird (Papa et al., 1999; Leggett et al., 2002). Im Zusammenspiel von Ubp6 mit
Die Struktur des S. cerevisiae 20S Proteasoms wurde mit Hilfe der Röntgenkristallographie in einer Auflösung von 2,4 Å aufgeklärt (Groll et al., 1997). Es besteht -C2 symmetrisch aufgebaut- aus zweimal 14 Untereinheiten mit Massen von 21- 31 kDa, die als heptamere Ringe α1-7 β1-7 β1-7 α1-7 übereinander angeordnet sind und im Inneren des zylinderförmigen Gebildes insgesamt drei Kavitäten bilden (siehe Abb. 2A und B). Die α Untereinheiten bilden die äußeren Ringe und verschließen mit ihren N-Termini das 20S Proteasom, solange kein weiterer Faktor wie zum Beispiel der 19S regulatorische Komplex gebunden wird. Durch die Bindung der ATPase Untereinheit Rpt2 des 19S Komplexes an den N-Terminus von α3 kann der Translokationskanal in das 20S Proteasom geöffnet werden (Köhler et al., 2001). Zwischen den Ringen der β Untereinheiten befindet sich die zentrale Kavität von 5 nm Durchmesser, in der jeweils zwei proteolytisch aktive β1, β2 und β5 Untereinheiten lokalisiert sind. Das katalytisch aktive Threonin dieser β Untereinheiten (Gruppe der N- terminal nukleophilen- Hydrolasen) kann im Prinzip Peptidbindungen nach jeder Aminosäure spalten. Aufgrund der unterschiedlichen lokalen Strukturumgebung der aktiven Untereinheiten werden jedoch Schnitte nach bestimmten Aminosäuren bevorzugt (Groll & Huber, 2003). Die β1 Untereinheit schneidet präferenziell nach sauren Aminosäuren (peptidyl glutamyl peptid hydrolyzing [PGPH] Aktivität), β2 nach basischen Aminosäuren (Trypsin ähnliche Aktivität) und β5 nach hydrophoben Aminosäuren (Chymotrypsin ähnliche Aktivität) (Orlowski, 1990; Heinemeyer et al., 1994). In Mammalia werden Proteasomen, die diese drei konstitutiven Untereinheiten tragen, nach Induktion mit dem Zytokin γ Interferon gegen Proteasomen, die die nicht essentiellen, katalytischen Immunountereinheiten β1i, β2i und β5i (LMP2, MECL-1, LMP7) tragen, ausgetauscht (Frentzel et al., 1994). Die Anwesenheit der sogenannten Immunoproteasomen nach Interferon γ Induktion führt zu einer effizienteren Präsentation der generierten Peptide an der Zelloberfläche durch MHC Klasse I Rezeptoren. Diese Präsentation intrazellulärer Antigene stellt eine essentielle Funktion des Immunsystems dar (zusammengefaßt in Kloetzel 2001).
Aufgereinigte Proteasomen bestehen immer aus einer Mischung von freien 20S Partikeln und mit einem (RP1CP) oder zwei regulatorischen Partikeln (RP2CP) komplexiertem 20S (Glickman et al., 1998b). In vivo dagegen scheinen Proteasomen mit gleicher Stöchiometrie von 20S und 19S Untereinheiten und ca. 15000- 30000 Molekülen/ Zelle oder ca. 1% des Gesamtproteins vor allem als RP2CP Form vorzuliegen (Russell et al., 1999). Strukturell ist der 19S Komplex (in Säugetieren PA700 und in D. melanogaster µ Partikel genannt) sehr schlecht untersucht. Dreidimensionale Rekonstruktionen elektronenmikroskopischer Aufnahmen von D. melanogaster 19S zeigen, dass es sich um einen ca. 20 x 45 nm großen, asymmetrischen Komplex handelt, der hochbeweglich zu sein scheint (siehe Abb.4 A; Walz et al., 1998). Der 19S besteht aus mindestens 17 verschiedenen Untereinheiten mit Massen von 30 bis 110 kDa und einer Gesamtmasse von ca. 1 MDa (Glickman et al., 1998b). Unter Salzeinwirkung zerfällt der 19S Komplex in den 19S Base Subkomplex, bestehend aus sechs ATPasen (Rpt1-6) und zwei nicht ATPase Untereinheiten (Rpn1, Rpn2), sowie den 19S Lid Subkomplex, bestehend aus den Untereinheiten Rpn3 und Rpn5 – Rpn12 (Saeki et al., 2000). Die Zuordnung von Rpn10 zu einem der beiden 19S Subkomplexen ist dabei uneindeutig. Untersuchungen in ΔRpn10 Stämmen haben ergeben, dass 19S regulatorische Partikel in Abwesenheit von Rpn10 leicht in 19S Lid und Base dissoziieren, so dass Rpn10 vermutlich an der Verbindungsstelle zwischen Base und Lid lokalisiert ist (Glickman et al., 1998a). Aufgereinigte, native 19S Lid Subkomplexe enthalten allerdings in den meisten Präparationen kein Rpn10 (Glickman et al., 1998a; Braun et al., 1999; Hoelzl et al., 2000).
Die im 19S Base lokalisierten AAA ATPasen gehören zu der Familie der Walker ATPasen, deren unveränderbarer Lysinrest im Walker A Motiv mit der Phosphatgruppe des ATPs interagiert (Walker et al., 1982). Sie sind vermutlich ringförmig angeordnet und lagern sich im Kontakt mit dem 20S Proteasom an die α Untereinheiten an. Alle sechs ATPasen sind essentiell, funktionell nicht redundant und mit 66- 76% Sequenzidentität zwischen S. cerevisiae und humanen Varianten evolutionär stark konserviert (Ghislain et al., 1993; Rubin et al., 1998; Glickman et al., 1998b). In Übereinstimmung mit der
Rpn1/Hrd2/S2 und Rpn2/Sen3/S1, die beiden nicht zu den ATPasen zählenden Untereinheiten des 19S Base, sind mit Molekulargewichten von 110 bzw. 104 kDa die beiden größten Untereinheiten des 19S Regulators. Sie besitzen ca. 20% Sequenzidentität zueinander und 40% Identität zu ihren humanen Homologen. Je nach genetischem Hintergrund sind Deletionen der Gene als lethal oder nicht lethal beschrieben worden (Yokota et al., 1996; Glickman et al., 1998b; DeMarini et al., 1995). Beide Untereinheiten enthalten mehrere sich wiederholende Leucin reiche Sequenzen (LRR: leucin rich repeat), die als Protein – Protein Interaktionsdomänen vorgeschlagen worden sind (Lupas et al., 1997). Für Rpn1 konnte auch gezeigt werden, dass es über seine Leucin reichen Sequenzen die Ubiquitin ähnlichen Domänen von Dsk2 und Rad23 zu binden vermag (Elsasser et al., 2002). Des weiteren sind die LRR Bestandteile eines von Kajava (2002) definierten Sequenzmotivs, das in verschiedenen proteasomalen und cyclosomalen Untereinheiten gefunden wurde (PC Motiv) und dessen Wiederholungen Rpn1 und Rpn2 in der Strukturvorhersage eine α helicale, torroidartige Struktur geben. In systematischen Ansätzen, die die Interaktionen des Hefe Proteoms zu entschlüsseln versuchen, präzipitieren Rpn1 und Rpn2 mit den 19S regulatorischen Untereinheiten (Ho et al., 2002; Gavin et al., 2002) wie Rpt1 auch mit 3,4- 3,9% aller anderen untersuchten Komplexe und gelten somit als kontaminierende Proteine (Gavin et al., 2002). Diese Interaktionen mit einer Vielzahl von Komplexen spiegeln jedoch möglicherweise nur die große Bedeutung des 19S Base Subkomplex in der Erkennung und Entfaltung von proteasomalen Substraten wieder.
Rpn10/S5a stabilisiert mit dem N- terminalen Bereich (AS 1-61) die Verbindung zwischen 19S Lid und Base (Glickman et al., 1998a), während der Bereich von AS 200- 230 in S. cerevisiae bis H. sapiens mindestens eine konservierte Ubiquitin bindende Domäne (UIM) beherbergt (Voges et al., 1999). Rpn10 ist in S. cerevisiae nicht essentiell (van Nocker et al., 1996). D. melanogaster sowie S. cerevisiae Rpn10 wurden in bedeutsamen Mengen in freier monomerer Form gefunden, so dass es möglicherweise nur transient an das 26S Proteasom bindet und ihm ubiquitinierte Substrate zuliefert (Haracska und Udvardy, 1995; van Nocker et al., 1996).
Der 19S Lid Komplex ist essentiell für den Abbau ubiquitinierter Proteine durch das 26S Proteasom (Glickman et al., 1998a). Bislang konnte jedoch nur einer Untereinheit dieses Subkomplexes eine Funktion zugeordnet werden: die von S. cerevisiae zu humanen
Der Lid Komplex besteht aus acht Untereinheiten, die als Subkomplex vom 26S Proteasom abgelöst und auch wieder angelagert werden können (Glickman et al., 1998a). Alle acht Untereinheiten besitzen eins von zwei strukturellen Motiven, die auch in anderen Multiproteinkomplexen gefunden worden sind (Hofmann & Bucher 1998):
das PCI (Proteasom, COP9 [constitutive photomorphogenesis] Signalosomen, eIf3 [eukaryotischer Initiationsfaktor 3]) oder
das MPN (Mpr1, Pad1, N- terminal) Motiv.
Rpn3, Rpn5-7, Rpn9 und Rpn12 tragen das bis zu 200 Aminosäuren lange PCI Motiv im C- terminalen Bereich, das in den jeweiligen Proteinen für Interaktionen innerhalb des 19S Lids verantwortlich ist (Fu et al., 2001). Rpn8 und Rpn11 tragen das ca. 140 Aminosäuren lange MPN Motiv in ihren N- terminalen Bereichen (Glickman et al., 1998a), das vermutlich die Interaktion zwischen diesen beiden Proteinen vermittelt und in Rpn11 das JAMM Motiv beherbergt. Die Ähnlichkeiten zwischen dem 19S Lid Komplex und dem COP9 Signalosomen bzw. dem eIF3 Komplex gehen soweit, dass Sequenzhomologien zwischen allen acht COP9 Signalosomen sowie drei eIF3 Komplex Untereinheiten zu bestimmten 19S Untereinheiten bestehen (zusammengefasst in Voges et al., 1999). Auch funktionell besteht zwischen dem 19S Lid Komplex und dem COP9 Signalosomen, das im wesentlichen für die Phosphorylierung verschiedener regulatorischer Proteine verantwortlich ist und als negativer Regulator der SCF (E3) Ubiquitin Ligase beschrieben ist, eine Ähnlichkeit. Die COP9 Signalosomen Untereinheit Csn5 forciert die Abspaltung der Ubiquitin ähnlichen Markierung Nedd8 von den Cullin Untereinheiten des SCF Komplexes mit Hilfe des JAMM Motivs seiner MPN Domäne (Cope et al., 2002). Nur Rpn12 scheint kein homologes Protein in anderen Multiproteinkomplexen zu besitzen. Aufgrund dessen und aufgrund der gezeigten Interaktion mit Rpn2, könnte dieses Protein die Verbindung zwischen 19S Lid und 19S Base stabilisieren (Yokota et al.,1996). Rpn12 wurde ursprünglich als Protein beschrieben, das die nukleäre Integrität aufrechterhält und für die Aktivierung der Cdc28 Kinase notwendig ist (Nisogi et al., 1992; Kominami et al.,
In Immunpräzipitationen mit 19S Untereinheiten finden sich weitere Proteine, deren Assoziation mit dem 19S Regulator so häufig gefunden wurde, dass eine Unterscheidung in Proteasomen interagierende Proteine (PIP) und proteasomale Untereinheiten nur schwer getroffen werden kann. So schlagen Verma und Mitarbeitende (2000) eine Umbenennung des 17,9 kDa Proteins Daq1 in Rpn13 vor, da dieses Protein stöchiometrisch mit dem 19S Regulator präzipitiert und eine Deletion des entsprechenden Gens in S. cerevisiae zur Anreicherung ubiquitinierter Proteine führt. Das Protein Rpn4 wurde als integraler Bestandteil des Proteasoms postuliert, da es im Glyceroldichtegradienten mit dem 26S Proteasom cofraktioniert, anti Rpn4 Antikörper an aufgereinigtes 26S Proteasom bindet und eine Deletion des entsprechenden Gens in proteasomalen nin1-1 (Rpn12) und ΔRpn10 Mutanten synthetisch lethal ist (Fujimuro et al., 1998). Da die Lebensdauer von Rpn4 sehr viel kürzer ist, als die des 19S Komplexes und gezeigt wurde, dass es vor allem an Transkriptionsprozessen beteiligt ist wird Rpn4 eher als PIP angesehen (Mannhaupt et al., 1999). Die beiden in S. cerevisiae nicht essentiellen Proteine Ubp6 und Nas6 werden ebenfalls oft in Assoziation mit dem 26S Proteasom gefunden, sind aber aufgrund ihres substöchiometrischen Anteils in diesen Präzipitationen als PIPs klassifiziert (Verma et al., 2000). Weitere mit 19S regulatorischen Partikeln interagierende Proteine sind in Abb. 3 B aufgeführt.
Das Ubiquitin- Proteasom System bietet der Zelle auf den Ebenen der Ubiquitinierung und der proteasomalen Aktivität verschiedenste regulatorische Eingriffsmöglichkeiten. So kann sowohl die feinabgestimmte Degradation von einzelnen Proteinen als auch eine breite Antwort auf äußere Einflüsse wie z. B. Hitzestress regulatorisch beeinflusst werden. Die Regulation des Abbaus einzelner Proteine geschieht im allgemeinen auf der Ebene der Ubiquitinierung. Dabei wird entweder die Bindung des Substrats an die entsprechende E3 Ligase durch posttranslationale Modifikationen oder strukturelle Veränderungen des Substrats variiert oder die Aktivität des spezifischen E2/E3 Ligase Komplexes moduliert (zusammengefasst in Glickman & Ciechanover, 2002). Der massive Proteinabbau in Folge von äußeren Faktoren, wie oxidativem oder Hitzestress, Hungerbedingungen oder DNA Schädigungen, als auch in höheren Eukaryonten unter pathologischen Bedingungen, wie bei Krebs, schweren Blutvergiftungen oder metabolischer Übersäuerung hat im allgemeinen eine Hochregulierung des gesamten Ubiquitin- Proteasom Systems zur Folge (Lecker et al., 1999). Die konzertierte, transkriptionelle Hochregulierung der entsprechenden Gene dieses Systems wird in S. cerevisiae über das nonamere Proteasomen assoziierte Kontrollelement (proteasome- associated control
In humanen Zellen sind bisher keine einheitlichen transkriptionellen Regulationselemente für das Ubiquitin- Proteasom System beschrieben. Zur Optimierung der Antigenprozessierung und Präsentation induziert jedoch das Zytokin Interferon γ in humanen Zellen den Austausch aller proteolytisch aktiven, 20S β Untereinheiten gegen die Immunountereinheiten β1i, β2i und β5i sowie den Austausch des 19S Regulators gegen den proteasomalen Aktivatorkomplex PA28 (zusammengefasst in Kloetzel, 2001).
Damit funktionelle 26S Proteasomen entstehen, müssen 62 proteasomale Untereinheiten zusammenfinden. Der zeitliche und strukturelle Verlauf dieses Prozesses ist jedoch nur bruchstückhaft bekannt und beschränkt sich im wesentlichen auf die isolierbaren Vorläuferkomplexe des 20S Proteasoms. Da 20S Proteasom und 19S Regulatorkomplex in Zelllysaten in freier Form vorkommen können und unter Inkubation mit ATP wieder zum 26S Proteasom reassoziieren (DeMartino et al., 1996), wird davon ausgegangen, dass diese Subkomplexe stabile Vorläuferkomplexe des Proteasoms darstellen. Die Aktivität gegen fluorogene Peptide dient dabei im allgemeinen zur Unterscheidung zwischen reifen 20S Proteasomen und deren Vorläuferkomplexen. Da fünf der sieben β Untereinheiten als Proprotein synthetisiert werden und deshalb Propeptide tragen, die erst in späten Assemblierungsstadien der 20S Biogenese autokatalytisch prozessiert werden, sind Vorläuferkomplexe des 20S Proteasoms proteolytisch inaktiv (Chen & Hochstrasser, 1996; Schmidtke et al., 1996) .
Die frühsten, aus S. cerevisiae isolierbaren Vorläuferkomplexe des 20S Proteasoms sind die sogenannten „15S precursor Komplexe“ oder halbe Kernpartikel (hCP: half core particle), die vermutlich aus den ringförmig angeordneten α Untereinheiten, den katalytischen, unprozessierten β Untereinheiten sowie dem proteasomalen Maturierungsfaktor Ump1 (ub- mediated proteolysis) bestehen (Chen & Hochstrasser, 1996; Ramos et al., 1998). Anhand der Coimmunpräzipitation von halben Kernpartikeln mit Hilfe des Protein A markierten Ump1 aus S. cerevisiae Lysaten, konnte gezeigt werden, dass diese Komplexe alle 20S proteasomalen Untereinheiten mit Ausnahme von
Die Biogenese des 19S Partikels ist weitestgehend ungeklärt. Da mit Hilfe von yeast two- hybrid Untersuchungen keine Interaktionen zwischen 19S Base und 20S Proteasom bzw. zwischen 19S Lid und 19S Base gefunden werden konnten, wird angenommen, dass diese Subkomplexe sich vor der 19S bzw. 26S Assemblierung stabil formieren müssen (Fu et al., 2001). Bisher sind lediglich Proteine bekannt, die für die Stabilität des 19S Lid Komplexes verantwortlich sind. So destabilisiert die Depletion der essentiellen Rpn6 Untereinheit 19S Regulatoren derart, dass über Affinitätschromatographie aufgereinigte Proteasomen nahezu keine 19S Lid Untereinheiten mehr enthalten (Santamaria et al., 2003). Eine ähnliche destabilisierende Wirkung auf den 19S Komplex hat wie bereits erwähnt die Deletion von Rpn10 (Glickman et al., 1998a). Die Deletion von Rpn9, der zweiten nicht essentiellen Untereinheit des 19S Lid Komplexes, führt dazu, dass kein Rpn10 in Proteasomen dieser Zellen inkorporiert wird (Takeuchi et al., 1999). Während die Deletionen von Rpn10 und Rpn9 nur unter Stressbedingungen signifikanten Einfluss auf die Aktivität des 19S Komplexes zeigen, geht die Depletion von Rpn6 mit massiven Zellzyklusdefekten, Anreicherung ubiquitinierter Substrate sowie Aktivitätsverlusten einher. Des weiteren wurden zwei nicht proteasomale Proteine gefunden, die an der Assemblierung des 19S Komplexes beteiligt sind: In Schizosaccharomyces pombe konnte gezeigt werden, dass Yin6, dessen Mammalia Homolog Int6 an der Tumorgenese von Brustkrebs beteiligt ist, für die korrekte nukleäre Lokalisation von Rpn5 und damit für die korrekte Assemblierung des 19S Lids verantwortlich ist (Yen et al., 2003). Und Tone und Toh-e (2002) postulieren ein Model wonach das essentielle Protein Nob1 (für „nin one binding protein“ = Rpn12 bindendes Protein) in Analogie zu Ump1 zunächst an die neu generierten 19S Komplexe gebunden vorliegt, im Zellkern die Assemblierung zum 26S Proteasom katalysiert und anschließend vom aktiven 26S Proteasom degradiert wird. Gestützt wird diese Hypothese durch Untersuchungen, die zeigen, dass das Protein in yeast two hybrid Experimenten mit Rpn12 interagiert, dass eine temperatursensitive Mutation in diesem Gen unter restriktiven Bedingungen zu einer Delokalisation proteasomaler Untereinheiten ins Cytoplasma führt und die proteasomale Aktivität stark abnimmt sowie dass das Protein mit Rpt1 coimmunpräzipitiert (Tone und Toh-e, 2002;
Die geregelte Assoziation und Dissoziation von 19S Komplexen an 20S Proteasom ist bisher nur in Mammalia Zellen gezeigt worden. So steuert bei 26S Proteasomen, die aus Herzmuskelzellen vom Schwein isoliert wurden, die Phosphorylierung bzw. Dephosphorylierung der ATPase Rpt6 die Assoziation bzw. Dissoziation des 19S Komplexes an das 20S Proteasom (Satoh et al., 2001). Die von einer mit dem 19S assoziierten Kinase phosphorylierte Rpt6 Untereinheit des 19S Komplexes bindet direkt an die α2 sowie α1 Untereinheit des 20S Proteasoms und wird erst nach der Dephosphorylierung wieder abgelöst. In Erythrozyten des Schweins wird die Assoziation des 19S Komplex mit dem 20S Proteasom durch die Anwesenheit des Modulatorkomplex bestehend aus p42/ Rpt4, p50/ Rpt5 sowie p27 um das achtfache stimuliert (DeMartino et al., 1996). Der Modulatorkomplex vermittelt dabei die Assoziation der proteasomalen Subkomplexe, ist aber nicht mehr mit den aktiven 26S Proteasomen assoziiert (Adams et al., 1997).
In S. cerevisiae wird dem nicht essentiellen, 210 kDa Protein Ecm29 (extracellular mutant 29) eine ähnliche Funktion zugeschrieben. Leggett und Mitarbeitende (2002) konnten zeigen, dass Ecm29 mit 20S Proteasomen verbunden ist und dass die Assoziation von 19S Partikeln mit 20S Proteasomen in Δecm29 Stämmen gestört ist.
Abgesehen davon, dass Proteasomen sowohl in Mammalia als auch in S. cerevisiae Zellen in Zytoplasma und Zellkern lokalisieren, unterscheiden sich die Ergebnisse der zahlreichen Untersuchungen zur proteasomalen Verteilung erheblich in Abhängigkeit von der Untersuchungsmethode, des untersuchten Zelltyps, der Zellzyklusphase und den Wachstumsbedingungen der untersuchten Zellen. Nach einheitlicher Aussage verschiedener Arbeitsgruppen sind Proteasomen jedoch mit Ausnahme der Vakuole gleichmäßig über das Zytoplasma verteilt und zeigen außerdem eine etwas stärkere Lokalisation im Zellkern mit Ausnahme der Nukleoli (zusammengefasst in Gordon, 2002, Wojcik und DeMartino, 2003).
Untersuchungen in S. cerevisiae zeigen, dass weniger als 20% der 26S Proteasomen cytoplasmatisch lokalisiert sind (Russell et al., 1999; Enenkel et al., 1998). Vielmehr lokalisieren sie über den gesamten Zellzyklus, der in S. cerevisiae ohne das Auflösen der
Die Lokalisation der Proteasomen ist in humanen Fibrosarkoma Zellen, solange die Kernmembran intakt ist, nukleär. Löst sich die Membran während der Metaphase/ Anaphase auf, verteilen sich die Proteasomen in der gesamten Zelle, um mit der Formation der neuen Kernmembran in den Tochterzellen wieder in den Zellkern aufgenommen zu werden (Reits et al., 1997).
Da S. cerevisiae Zellen eine geschlossene Mitose vollziehen, können Proteasomen nicht durch den Aufbau einer neuen Kernmembran in den Zellkern eingeschlossen werden, sondern müssen über die Kernporen importiert werden. Für das 20S Proteasom konnte gezeigt werden, dass die für den Kerntransport verantwortlichen Transportrezeptoren an halbe Kernpartikel binden und mit deren Hilfe über die Kernmembran in den Zellkern gelangen (Lehmann et al., 2002). Erst im Zellkern findet die Assoziation zum 20S Proteasom unter Assistenz von Blm3 und Abbau von Ump1 statt (Fehlker et al., 2003). Die N- terminalen Sequenzen der 20S α Untereinheiten beherbergen Kernlokalisationssignale, die vermutlich nach der Formierung des 20S Proteasoms durch strukturelle Umlagerungen unzugänglich sind, so dass bisher kein Kernimport von reifen 20S Proteasomen bzw. keine Bindung der Transportrezeptoren an das reife 20S gezeigt werden konnten.
Der Zellkern eukaryonter Lebewesen enthält die DNA als Heterochromatin in räumlicher Trennung zum Cytoplasma. Hier findet u. a. die Verdopplung des Genoms (Replikation), das Ablesen (Transkription) der Strukturgene in mRNA und die Assemblierung der Ribosomen statt. Das Zellkerninnere ist durch die doppelschichtige Kernmembran, die sich in das Membransystem des rauen endoplasmatischen Retikulums fortsetzt, vom Cytoplasma getrennt. Um einen geregelten Stoffaustausch zwischen den Kompartimenten zu gewährleisten, ist die Kernmembran mit ca. 100 nm breiten Kernporen (nuclear pore complex, NPC) durchsetzt, die eine achtfache Rotationssymmetrie aufweisen und in S.
Alle Transportrezeptoren haben gemeinsam, dass sie direkt mit den Kernporen
Die Familie der Karyopherin Transportrezeptoren umfasst in S. cerevisiae 14 Proteine mit Molekulargewichtsgrößen von 90- 130 kDa (Görlich et al., 1997). Karyopherin β (auch Kapβ1, Importin β oder kap95 genannt) ist das als erstes entdeckte und am besten charakterisierte Protein. Die Karyopherine werden auch Importin- β ähnliche Proteine genannt, obgleich die Sequenzähnlichkeit der Karyopherin Transportrezeptoren in vielen Fällen noch unter 20% Aminosäureidentität liegt und meistens nur auf die aminoterminale, RanGTP bindende Domäne begrenzt ist. Trotzdem zeigen alle Rezeptoren eine starke Strukturhomologie. Charakteristisch sind sich wiederholende, α- helicale HEAT Strukturen, die aus einer gebogenen sowie einer geraden Helix bestehen und parallel zueinander angeordnet eine spiralförmige Proteinstruktur ergeben, wie Kristallstrukturen von Karyopherin β (vgl. Abb. 5A) und Transportin zeigen (Cingolani et al., 1999 und Chook & Blobel 1999). Unter den 14 Karyopherinen sind 3 Exportine (Crm1/ Xpo1, Cse1, Los1) und 10 Importine (Kap95, Kap104, Kap108, Kap111/ Mtr10, Kap114, Kap119/ Nmd5, Kap121/ Pse1, Kap122/ Pdr6, Kap123/ Yrb4, Lph2), die unterschiedliche Substrate binden können (Görlich et al., 1997; Wozniak et al., 1998). Kap142 fungiert als Im- und Exportin (Yoshida & Blobel, 2001). Bis heute wurden für die 10 bekannten Importine jeweils ca. 2-4 Cargosubstrate gefunden. Da 1000 bis 2000 Proteine permanent oder zeitweise kernlokalisiert sind, wird vermutet, dass jedes Importin mehrere Substrate bindet (Mosammaparast et al., 2001). Für humanes Karyopherin β wurde gezeigt, dass es eine Reihe verschiedener Cargo Substrate direkt bindet, wie z.B. ribosomale Proteine, virale Proteine, Cyclin B1 und die T- Zell Protein Tyrosin Phosphatase (Übersicht in Ström & Weis, 2001). Die meisten Substrate, die über Karyopherin β importiert werden, sind jedoch Kernlokalisationssignale (NLS; nuclear localisation signal) tragende Proteine.
Die Erkennung zwischen Substrat und Transporter geschieht mittels Kernlokalisationssignalen (NLS) bzw. Kernexportsignalen (NES= nuclear export signal) im Falle des Kernimports bzw. -exports. Beispiele für beide Signalsequenzen sind in Tab. 1 dargestellt. Die sogenannten klassischen NLS (cNLS) binden an Kapα/ Srp1 und lassen sich anhand der Anzahl, der in die Bindung involvierter, lysinreicher Sequenzen in
Das Adapterprotein Srp1 ist das Produkt eines essentiellen Gens in S. cerevisiae und wurde ursprünglich als der Suppressor von temperatursensitiven RNA Polymerase I Mutationen gefunden (Yano et al., 1992). Das 60 kDa Protein beherbergt im wesentlichen zwei Interaktionsdomänen: eine große NLS bindende Region, die aus Armadillo Motiven besteht, und eine stark basische, aminoterminale IBB Domäne, die in der Lage ist, sich autoinhibitorisch an die NLS bindende Region anzulagern (vgl. Abb. 7) (Conti et al., 1998; Kobe 1999). In vitro konnte gezeigt werden, dass die Affinität von Karyopherin α zur NLS unter Bindung von Karyopherin β drastisch ansteigt (Rexach & Blobel, 1995). Im Cytoplasma ist die autoinhibitorische Sequenz durch die Assoziation von Karyopherin α mit Karyopherin β maskiert und dies führt zu einer starken Bindung des Substrats an das Adapterprotein. Im Zellkern führt vermutlich das Ablösen von Karyopherin β zu einer Verdrängung des Substrats durch die autoinhibitorische Sequenz von Karyopherin α (Harreman et al., 2003).
Die Zelle ist in der Lage die Effizienz des Kerntransports sowohl auf quantitativer als auch auf qualitativer Ebene zu regulieren. So werden in differenzierten humanen Leukämie Zelllinien Karyopherin α1 und α2 etwa gleich stark exprimiert, während schlecht differenzierte Zelllinien nur eine Isoform und diese in geringerer Menge enthalten (Nadler et al., 1997). Ebenso kann sich der Level der mRNA Expression der Karyopherin α Isoformen in verschiedenen Geweben unterscheiden, was zu der Annahme führte, dass die verschiedenen Karyopherin α Isoformen in höheren Eukaryonten differenziell exprimiert werden (Köhler et al., 1997; Nachury et al., 1998). Eine generelle Herabregulation der Karyopherin β und Transportin vermittelten Kernimportmaschinerie in permeabilisierte HeLa Zellen wurde in vitro außerdem durch Gabe von Phosphatase Inhibitoren gezeigt (Kehlenbach und Gerace, 2000). Auf qualitativer Ebene stellt die Erkennung bzw. Zugänglichkeit der NLS eines Proteins durch Karyopherin α einen kritischen Parameter in der Effizienz des Imports in den Zellkern dar. Variationen der Importrate bestimmter Proteine können z. B. durch Phosphorylierungen oder inter- bzw. intramolekulare Maskierungen der NLS erzielt werden. In Fusionsproteinen, in denen die SV40 NLS von Proteinkinase 2 Erkennungssequenzen flankiert wird, steigt die Erkennung der SV40 NLS durch Karyopherin α/β um den Faktor 100, wenn die benachbarten Serinreste phosphoryliert vorliegen (Xiao et al.,1997 und 1998). Der Kernimport von Pho4 über Pse1 ist blockiert, wenn Serin 152 phosphoryliert ist und erst der Proteasomen abhängige Abbau des NF- κB p65 maskierenden Proteins I-κBα im Cytoplasma gibt die NLS von NF-κB p65 für den Kernimport frei (Traencker et al., 1994). Ein ähnlicher Mechanismus wurde bei dem p50 Precursor NF- κB p105 beobachtet, dessen C- terminaler Bereich die eigene p50/p105 NLS verdeckt (Henkel et al., 1992).
Ziel der Arbeit ist die Untersuchung der Transportwege und Assemblierungsprozesse zur nukleären Lokalisation des 19S regulatorischen Partikels des 26S Proteasoms in der Sprosshefe Saccharomyces cerevisiae.
Mit Beginn der Arbeit war betreffs der zellulären Lokalisation des 19S Komplexes lediglich bekannt, dass GFP markiertes Cim5/ Rpt1 in S. cerevisiae vorwiegend an Kernmembran/ ER und GFP markiertes Mts4/ Rpn1 sowie Pad1/ Rpn11 in S. pombe vorwiegend an der nukleoplasmatischen Seite der Kernmembran lokalisieren (Enenkel et al., 1998; Wilkinson et al., 1998). Beide Studien belegen, dass die markierten Proteine im Glycerolgradienten in proteolytisch aktiven Fraktionen bzw. mit 20S Proteasomen cosedimentieren und deshalb vermutlich in aktive 26S Proteasomen eingebaut vorliegen. Rout und Mitarbeitende (2000) haben die 19S Base Untereinheit Rpn1 in Assoziation mit präparierten Kernporen gefunden, was darauf hindeutet, dass 19S Untereinheiten Transportprozessen über die Kernporen unterworfen sind.
Bis auf Rpn10 - 12 besitzen alle 19S Untereinheiten Molekulargewichtsgrößen ab 45 kDa und sind damit vom diffusiven Transport über die Kernporen ausgeschlossen. Unklar bleibt jedoch mit Hilfe welcher Transporter die Proteine in/an den Kern gelangen, welche Signalsequenzen dafür verantwortlich sind und ob der 19S Komplex als gesamter Komplex oder in Subkomplexen transportiert wird. Mit einer Größe von ca. 20 x 45 nm und nahezu 1 MDa erreicht der 19S Komplex fast die Ausschlussgrenze des 50 nm breiten Kernporenkanals, so dass der Transport möglicherweise in Subkomplexen stattfinden muss. In diesem Zusammenhang ist interessant, ob 19S Komplexe in Analogie zum 20S Proteasom auf dem Weg in den Zellkern koordiniert assemblieren und ob Assemblierungsintermediate dieses Komplexes zu isolieren sind. Sollte die Reifung des 26S Proteasoms aus 20S und 19S Vorläuferkomplexen im Zellkern stattfinden, könnte ein Defekt im Import des 19S Komplex aufgrund der feinabgestimmten Regulation der Expression aller 26S Untereinheiten einen Einfluss auf die Biogenese des 20S Proteasom zeigen.
In der Ausführung soll der für den Kernimport des 19S regulatorischen Partikels verantwortliche Transporter anhand ausgesuchter Kerntransportmutanten bestimmt werden, die mit dem Transporter interagierenden Signalsequenzen lokalisiert werden und die Transporterbindung in vivo und in vitro gezeigt werden. Des weiteren soll der Transportkomplex wenn möglich isoliert und näher charakterisiert werden. Die Signifikanz der Signalsequenzen für die korrekte Lokalisation des 19S regulatorischen Partikels soll anhand von Mutations- oder Deletionsstämmen bestimmt werden.
Für Klonierungen und Präparationen rekombinanter Proteine werden folgende E. coli Stämme verwendet:
Für die Anzucht von E. coli Zellen wird Luria-Bertani (LB) Medium (10g/L Bacto-Trypton [Applichem, Darmstadt], 5g/L Hefeextrakt [Difco, Heidelberg], 6g/L NaCl [Applichem], pH 7.2) verwendet. Sterilfiltriertes Ampicillin (Applichem) wird nach dem Autoklavieren zu einer Endkonzentration von 50µg/ml ins Medium gegeben, wenn auf die Anwesenheit von Plasmiden selektiert wird. Für feste Nährböden wird Agar-Agar (Applichem) in der Konzentration von 15g/L
YPD Medium (Difco) dient als Flüssigmedium für die Anzucht von Hefen.
Synthetisches Selektionsmedium (Complete Minimal) Medium wird mit 1,7g/L YNB-AA/AS (yeast nitrogen base without aminoacids and amonium sulphate, Difco), 5g/L (NH4)2SO4, 20g/L Glucose und 1,3g/L Dropout Pulver ohne Uracil, Histidin, Leucin oder Arginin hergestellt. Es werden nach Bedarf zusätzliche Aminosäuren zugesetzt (30mg/L L- Histidin, 60mg/L L- Leucin, 30mg/L Uracil, 20mg/L Arginin), wenn bestehende Selektionen aufgehoben werden sollen.
Feste Nährböden enthalten 20g/L BactoTM Agar (Difco).
Für die Expression von Genen hinter dem Galaktose Promoter werden S. cerevisiae Zellen aus der logarithmischen Wachstumsphase in synthetisches Galaktose Selektionsmedium überführt, das statt 20g/L Glucose 20g/L Galaktose als Kohlenstoffquelle enthält. Die Induktion der Galaktose abhängigen Gene findet für 4-8 Stunden bei 28°C statt.
Zur Selektion mittels FOA (5-Flouroorotic Acid; BTS, St. Leon Rot) wird ein 2x CM Medium mit 60mg/L Uracil und 40g/L Agar-Agar autoklaviert. Nach dem Abkühlen auf etwa 55°C wird ein gleiches Volumen sterilfiltrierter FOA- Lösung (2g/L) zugegeben. Somit stellt sich im fertigen Festmedium eine FOA Konzentration von 1g/L ein.
Die Kultivierungen erfolgen auf einem Rundschüttler bei 28°C oder bei Raumtemperatur bis eine Zelldichte (OD600nm) von 1-7x 107 Zellen/ml erreicht ist.
Gefrierkulturen werden sowohl bei E. coli Zellen als auch bei S. cerevisiae Zellen hergestellt, indem 1ml Vorkultur mit 400µl 80% Glycerin sorgfältig vermischt und anschließend bei -70°C gelagert wird.
Für Canavanin- Sensitivitätsbestimmungen werden CM Agar-Agar Platten ohne Arginin 0,6µg/ml Canavanin (Stammlösung: 3 mg/ml in H2O sterilfiltriert) zugesetzt. Als Referenz werden CM Platten mit 20 mg/ml Arginin Zusatz verwendet. Jeweils 4µl einer dekadischen Verdünnungsreihe einer Hefekultur mit einer optischen Dichte von ca. 1x 107 Zellen/ml werden auf die Platten aufgetropft und nach 3 tägiger Inkubation bei 28°C die relative Lebendkeimzahl bestimmt.
Für Temperatur- Sensitivitätsbestimmungen werden zwei YPD Agar-Agar Platten analog zu Canavanin Platten mit Hefezellen beimpft und für 3 Tage bei 28°C bzw. 37°C inkubiert und die Lebendkeimzahl gleicher Verdünnungsstufen miteinander verglichen.
Die Amplifikation von DNA Fragmenten erfolgt entweder ausgehend von aufgereinigter Vektor DNA oder chromosomaler S. cerevisiae DNA als Vorlage. Alle Oligonukleotide werden bei Biotez, Berlin bestellt. In einem PCR Ansatz werden 1µl DNA, 10µl 10x PCR Puffer mit MgCl2 (Roche, Mannheim), 0,8µl 25mM dNTPs und jeweils 1µl sense und antisense Oligonukleotid Primer (50 pmol/µl) in einem 0,5ml Eppendorfgefäß mit sterilem H2O auf 100µl Endvolumen aufgefüllt. 0,4µl Taq-Polymerase (Roche, Mannheim) werden erst unmittelbar vor Start der PCR Reaktion zum Ansatz gegeben. Die PCR Bedingungen ergeben sich aus einer einminütigen Denaturierung der Primer bei 95°C, gefolgt von 30 Amplifikationszyklen bestehend aus Denaturierung bei 95°C für 45 Sekunden, Primeranlagerung bei 45-50°C für 1 min und DNA Polymerisation bei 72°C für eine der
Jeweils 2µl des amplifizierten Fragments werden nach Angaben des Herstellers mittels TOPO TA Cloning® Kit (Invitrogen) in den Vektor pCR 2.1®- TOPO®ligiert und sequenziert.
Die Extraktion von DNA aus Agarosegelstücken sowie die Reinigung von DNA nach Restriktionen erfolgt mit dem Qiaquick® Gel Extraction Kit (Qiagen) gemäß Herstellerangaben.
Die Selbstligation dephosphorylierter Vektor- DNA Enden wird mittels Alkalischer Phosphatase, durch die Entfernung der Phosphatgruppe vom 5’ Ende des dsDNA Strangs, unterbunden. In einem Ansatz werden 44µl gereinigte DNA (ca. 0.5µg) mit 5µl 10 x Alkalische Phosphatase Puffer und 1µl Alkalischer Phosphatase (Boehringer Mannheim) vermischt und 30 min bei 37°C inkubiert. Es folgt eine Hitzeinaktivierung des Enzyms für 15 min bei 65°C.
Für die Ligation dephosphorylierter Vektoren mit DNA-Fragmenten (insert) beträgt das Verhältnis der molaren Massen beider DNA Moleküle 3:1, während für die Ligation phosphorylierter Vektoren ein Verhältnis von 1:3 zum Insert besteht. Im Ligationsansatz wird ca. 50 ng Vektor- DNA mit der entsprechenden Menge Insert- DNA, 2µl T4-DNA-Ligase (1.2 U, New England Biolabs) sowie 2µl 10x T4-DNA-Ligase Puffer zu einem Endvolumen von 20µl vereinigt und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert.
In einem analytischen Restriktionsansatz mit einem Endvolumen von 20µl sind nicht mehr als 1µg QIAGEN Mini Präp DNA, 2µl 10 x Restriktionspuffer, 0,2µl BSA (10 mg/ml;New England Biolabs, Schwalbach) und 0,5µl Restriktionsendonuklease (bis zu 10 U/µl) enthalten. In einem präparativen Restriktionsansatz mit einem Endvolumen von 300µl sind bis zu 20µg DNA, 30µl 10x Restriktionspuffer, 3µl BSA und 3µl Restriktionsendonuklease enthalten. Die Wahl des Inkubationspuffers ist abhängig vom verwendeten Enzym. Die Restriktion erfolgt bei 37°C für maximal 2 Stunden. Die Restriktionsendonukleasen wurden von den Firmen New England Biolabs (Schwalbach) oder Boehringer Mannheim bezogen.
Zur DNA Schnellaufarbeitung werden die Kolonien ü/N bei 37°C in 3ml LB+ Ampicillin Medium auf dem Rundschüttler bei 120 rpm in sterilen Reagenzgläsern angezogen. Die Plasmidisolation erfolgt gemäß Vorschrift mit dem Qiaprep® Spin Miniprep Kit der Firma QIAGEN. Plasmid- DNA aus 1,5ml Kultur wird in 50µl Elutionspuffer aufgenommen.
Sehr kurze dsDNA Fragmente von 30 bis hinzu 150 bp können erzeugt werden, indem komplementäre Oligonukleotidstränge miteinander hybridisiert werden. In dem Hybridisierungsansatz werden jeweils 50µl Oligonukleotid (75µg/ml in H2O) mit 10µl 1M NaCl vermischt und für 10 min bei 95°C erhitzt. Nach dem Abkühlen bei RT oder auf Eis kann die dsDNA in der Ligation eingesetzt werden. Der Anteil der hybridisierten Primer in der Annealingreaktion wird überprüft, indem ein Aliquot des Hybridisierungsansatzes in einer 5% igen Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennt wird.
DNA- Sequenzierungen werden von der Firma Agowa, Berlin durchgeführt. Dazu werden 50µl Vektor- DNA aus der Plasmidisolierung mit 1/10 Volumen 3M Na- Acetat pH 4,8 und 2,5fachem Volumen Ethanol versetzt und entweder sofort verschickt oder zuvor vollständig gefällt. Das heißt der Ansatz wird 30 min auf Eis inkubiert und die DNA anschließend durch Zentrifugation bei 14000xg 15 min pelletiert und getrocknet.
Die Auftrennung von DNA Molekülen erfolgt mit Hilfe der Agarose- Gelelektrophorese. Die Beweglichkeit der DNA Moleküle in der Agarosematrix ist abhängig von der Porengröße des Gels und damit von der Agarosekonzentration. Alle Gelelektrophoresen werden mit 0,8-4% igen Agarosegelen durchgeführt.
Für ein 1%iges Minigel (50ml) werden 0,5 g Seakem LE Agarose (Biozym, Hess. Oldendorf) in 50ml 1x TBE Laufpuffer (90mM Tris- Base, 90mM Borsäure, 2mM EDTA, pH 8,0) durch Aufkochen gelöst und auf ca. 60°C abgekühlt. Der Agarose werden 0,25µg/ml Ethidiumbromid (Applichem) zugesetzt und anschließend wird der Ansatz in einen Gelträger gegossen. Nach dem Erstarren wird das Gel in die Elektrophoreseapparatur (Biorad, München) überführt und die DNA Proben
Um DNA Fragmente der Größe von 40-150 bp zu trennen, wird anstelle eines Agarosegels ein Polyacrylamid-Gel (PAA- Gel) verwendet. 50ml eines 5%igen PAA- Gels werden durch Mischen von 8,3ml einer 30%igen Acrylamidlösung (Vernetzungsverhältnis 29:1) mit 5ml 10xTBE- Puffer und der entsprechenden Menge H2O hergestellt. Die Polymerisierung wird mit 500µl einer 10%igen APS Lösung und 33µl TEMED gestartet. Die Elektrophorese findet in 1x TBE Puffer für 2h bei 75V statt. Zur Größenbestimmung wird der 1kb Marker von Invitrogen verwendet.
5ml einer Hefekultur aus der logarithmischen Wachstumsphase werden abzentrifugiert (2000xg, 3min) und das Pellet wird in 0,5ml 1M Sorbitol aufgenommen. Zu der Suspension wird eine Spatelspitze Zymolyase 20T (ICN, Eschwege) gegeben und der Ansatz für 60 min bei 37°C inkubiert. Die Protoplastierung wird mikroskopisch kontrolliert. Die Protoplasten werden bei 600xgfür 5 min pelletiert und zügig in 0,5ml 50mM Tris- HCl, 20mM EDTA (pH 7,4) und 0,05ml 100g/L SDS aufgenommen. Das Lysat wird schnell in ein Wasserbad überführt und bei 65°C unter gelegentlichem Schütteln für 30 min inkubiert. Anschließend werden 0,2ml einer 5M Kaliumacetatlösung zugegeben und der Ansatz für 60 min auf Eis gehalten. Die Proben werden bei 14000xg für 30 min zentrifugiert und der Überstand in ein mit 0,7ml Isopropanol gefülltem, neuem Eppendorfgefäß überführt. Die DNA wird für 5 min bei Raumtemperatur ausgefällt und anschließend für 10 s durch Zentrifugation bei 14000xg pelletiert. Das DNA Pellet wird in 300µl TE (10mM Tris- HCl pH 8,0, 1mM EDTA) mit 0,3µl RNAse A (Qiagen) versetzt resuspendiert, 10 min bei Raumtemperatur inkubiert und mit 30µl 3M Natriumacetat (pH4,8) und 0,2ml Isopropanol gemischt. Die DNA wird wiederum kurz abzentrifugiert und bei Raumtemperatur getrocknet. Abschließend wird die DNA in 100µl TE aufgenommen und bei –20°C gelagert.
Der zu transformierende E.coli Stamm wird über Nacht bei 37°C in 5ml LB-Medium angezogen. Eine Hauptkultur von 100ml LB wird mit 2ml der Vorkultur beimpft und für etwa 2h bei 37°C inkubiert. Das Wachstum der Zellen wird bei einer Wellenlänge von 600nm über die optische Dichte (OD) kontrolliert. Bei einer OD von 0,4 wird das Wachstum gestoppt indem die Kultur für 5 min auf Eis gekühlt wird und die Zellen werden anschließend bei 2000xg in sterilen Greiner Röhrchen 10 min abzentrifugiert. Das Pellet wird in 40ml eiskaltem, sterilfiltriertem TFB1 (100mM RbCl, 50mM MnCl2, 30mM KAc, 10mM CaCl2, 15% [v/v] Glycerol, ad pH 5,8 mit 0,2M Essigsäure) resuspendiert und 5 min auf Eis inkubiert. Nach erneutem Pelletieren der Zellen wird der Überstand sorgfältig entfernt und die E. coli in 4ml eiskaltem, sterilfiltriertem TFB2 (10mM MOPS, 10mM RbCl, 75mM CaCl2, 15% [v/v] Glycerol, ad pH 6,5 mit KOH) aufgenommen. Abschließend werden die Zellen in 105µl Aliquots in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -70°C gelagert.
50µl kompetenter E.coli Zellen werden mit der zu transformierenden DNA vermischt und 15 min auf Eis inkubiert. Anschließend werden die Zellen für 2 min einem Hitzeschock von 42°C ausgesetzt und zügig in 0,5ml LB Medium aufgenommen. Zur Regeneration werden die E. coli 1 h bei 37°C inkubiert, bevor sie pelletiert und auf Selektivmedium ausplattiert werden. Die Inkubation erfolgt bei 37°C über Nacht.
Der zu transformierende S. cerevisiae Stamm wird über Nacht in 50ml YPD angezogen und bei einer Zelldichte von ca. 5x 107 Zellen/ml steril abzentrifugiert (2000xg, 5 min). Das Zellpellet wird einmal mit 10ml eiskaltem, sterilem H2O sowie einmal in 10ml eiskaltem 1M Sorbitol gewaschen und mit 1ml eiskaltem 1M Sorbitol in ein 1,5ml Eppendorfgefäß überführt. Nach kurzem Abzentrifugieren (30 Sekunden, 17900xg)wird das Zellpellet in 1 Vol eiskaltem 1M Sorbitol resuspendiert. 40µl dieser Zellsuspension werden für eine Elektroporation mit 2-5µl der zu transformierenden DNA in EQUIBIO Elektroporationsküvetten (2mm Elektrodenabstand, PeqLab, Erlangen) vermischt und 5 min auf Eis inkubiert. Die Elektroporation erfolgt bei 1500 V, 25 µF und 200 Ohm im Gene Pulser® (Biorad, München). Sofort anschließend werden die Zellen in 1ml eiskaltem 1M Sorbitol aufgenommen, in ein Eppendorfgefäß überführt und kurz abzentrifugiert (30 Sekunden, 17900xg).Der Überstand wird bis auf ca. 100µl Sorbitol entfernt, das Zellpellet resuspendiert und auf Selektivmedium ausplattiert. Die Inkubation erfolgt für 3-5 Tage bei 28°C.
Die 5´Fluoroorotsäure (5´FOA; fluoro orotic acid)- shuffling Methode erlaubt, auf schnellem Weg ein essentielles, plasmidständiges Gen gegen eine mutierte Variante auszutauschen und konditional letale Mutationen festzustellen. Dazu wird die chromosomale Kopie des essentiellen Gens deletiert und die Überlebensfähigkeit des Stamms durch die Anwesenheit eines autonom replizierenden Plasmids sichergestellt, das sowohl eine intakte Kopie des essentiellen Gens als auch den URA3 Selektionsmarker trägt. Dieser sogenannte shuffle Stamm wird transformiert und ein zweites autonom replizierendes Plasmid, das die mutierte Genvariante und den LEU2 Selektionsmarker trägt, in die Zellen eingeführt. Mit Hilfe der negativen Selektion von 5´FOA wird das URA3 tragende Plasmid verdrängt, indem die LEU2 / URA3 prototrophen Stämme zweifach auf Selektionsmedium, das 1g/L 5´FOA enthält, überstempelt werden. Kolonien, die nach der 5´FOA Selektion Uracil bedürftig und Leucin prototroph sind, enthalten nur noch Plasmide, die die mutierte Genkopie tragen, und werden weiter untersucht. Das Prinzip der negativen Selektion basiert auf der Toxizität von 5´ Fluoroorotsäure für Uracil prototrophe Stämme. URA3 kodiert für die Orotidin- 5´Phosphat Decarboxylase, die in der Uracil Biosynthese benötigt wird, aber unter Anwesenheit von 5´FOA, dieses in das Zellgift 5- Fluorouracil umwandelt. Eine Schematische Darstellung der Generierung von PWt2G aus PWT2H16 mit Hilfe der Plasmid shuffling Methode zeigt Abb. 6A. Die Erzeugung der auf diese Weise in PWt2H16 eingeführten Plasmide beschreibt Abb. 6B.
Die Insertion einer linearisierten DNA Sequenz erlaubt, essentielle Gene an ihrem 3´ Ende um eine beliebige Markierung zu verlängern (tagging) ohne das Gen dabei zu duplizieren. Dazu wird ein DNA Fragment, das die C- terminalen 200- 400 Basenpaare des zu markierenden Gens ligiert an die gewünschte Markierung, mindestens einen Selektionsmarker sowie eine beliebige 200-400 Basenpaare umfassende DNA Sequenz abwärts des zu markierenden Gens trägt, in Wildtyp Zellen eingebracht. Mittels homologer Rekombination zwischen 5´ bzw. 3´Bereich des DNA Fragments und den homologen Sequenzen des chromosomalen Genlocus findet bei Selektion auf das eingebrachte Markerprotein die Insertion des DNA Fragments statt. Die zur Herstellung der in dieser Arbeit verwendeten, linearisierten DNA Fragmente notwendigen Klonierungsschritte sowie die verwendeten Gene, Markierungen und selektierbaren Marker sind in Abb.7 und 8 dargestellt. Da es nicht zu einer Integration der eingeführten DNA kommt, sondern der Bereich zwischen den homologen Rekombinationsstellen ersetzt wird, werden mit dieser Technik keine DNA Bereiche dupliziert. Wird anstelle des DNA Fragments ein linearisiertes, integratives Plasmid eingesetzt, gibt es nur einen Bereich an dem die homologe Rekombination stattfindet und das gesamte Plasmid integriert am chromosomalen Genlocus ins Genom.
Potentielle NLS aus Rpt2, Rpt1 und Rpn2 sowie die Kontroll- NLS des SV40 T-Antigens und deren mutierte Variante werden mit GFP und dem Strep- tag II (S) fusioniert (Abb. 9). Der N- terminale Bereich von Rpt2 wird mittels PCR amplifiziert und über die HindIII und KpnI Schnittstellen in pYESGFPS ligiert. Alle anderen Konstrukte werden als komplementäre Oligonukleotidstränge miteinander hybridisiert und an den Restriktionsschnittstellen für HindIII und KpnI in den linearisierten pYESGFPS Vektor ligiert. Alle Konstrukte werden durch Sequenzierung der DNA überprüft. Die Transkription findet unter Kontrolle des GAL1 Promotors (PGAL1) und der Terminationssequenz CYC1 (TTCYC1) vom episomalen Vektor pYES statt.
Abgesehen von der Hefeprotein Schnellaufarbeitung nach Yaffe und Schatz, 1984 werden Hefezellen je nach den Anforderungen der darauffolgenden Anwendungen in einem Puffersystem mit oder ohne ATP und MgCl2 aufgearbeitet. Der ATP enthaltende Puffer A nach Saeki et al. (2000) besteht aus 50mM Tris- HCl (pH 7,5), 0,5mM EDTA (pH 7,75), 100mM NaCl, 10% Glycerol, 0,5mM Dithiothreitol, 2mM ATP, 10mM MgCl2, 20 U DNAseI (Roche, 10U/µl), EDTA free Complete Protease Inhibitor cocktail (Roche) und 0,25mM Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF). Der PB Puffer ohne ATP enthält 20mM Tris- HCl (pH 7,5), 150mM NaCl, 0,25mM PMSF, 20 U DNAseI sowie 10% Glycerol.
Zur analytischen Proteinaufarbeitung werden bis zu 1x 109 Zellen einer Hefekultur abzentrifugiert (30 Sekunden, 17900xg), das Pellet in 1ml H2O resuspendiert und die Zellen unter Zugabe von 160µl 1,85M NaOH und 85µl 2-β Mercaptoethanol 10 min auf Eis aufgeschlossen. Zur Fällung der Proteine wird der Ansatz mit 160µl 50% Trichloressigsäure (TCA) versetzt und weitere 10 min auf Eis inkubiert. Nach dem Zentrifugieren für 3 min bei 17900xg wird das Pellet mit 800µl eiskaltem Aceton gewaschen (3 Sekunden, 17900xg) und in entsprechendem Volumen 1x Proteinprobenpuffer (Laemmli, 1970) resuspendiert. Der pH-Wert wird mit 0,5M Tris (ungepuffert) auf ca. pH 6,8 eingestellt, die Proben 4 min bei 95°C erhitzt und unlösliches Material vor der Auftrennung in SDS PAGE abzentrifugiert (3 Sekunden, 17900xg).
Für präparative Proteinaufarbeitungen kleinen Maßstabs werden 300µl Zellpellet (ca. 5 x 109 Zellen) in 500µl des gewünschten Aufschlusspuffers resuspendiert, mit 300µl silikonisierter Glasperlen (425-600 µm Durchmesser, Sigma) versetzt und sieben Mal je eine Minute bei maximaler Leistung gevortextund dazwischen jeweils eine Minute auf Eis inkubiert. Um die Effizienz des Aufschlusses zu steigern kann der Ansatz dabei mehrfach in flüssigem Stickstoff schockgefroren und wieder aufgetaut werden. Abschließend werden die Zellreste bei 17000xg für 10 Minuten bei 4°C zusammen mit den Glasperlen pelletiert und die löslichen Proteine im Überstand bis zur weiteren Verwendung auf Eis gehalten.
Für präparative Proteinaufarbeitungen größeren Maßstabs werden bis zu 1,5 x 1010 Zellen einer Hefekultur für 3 min bei 5000 rpm (Beckman Avanti J-25, GS3) geerntet, einmal in dem gewünschten Puffer gewaschen (3 min, 5000 rpm Beckman Avanti J-25) und das Pellet anschließend in 1 Vol Puffer resuspendiert. Bevor die Zellen in flüssigem Stickstoff schockgefroren werden, werden Mörser und Stößel in flüssigem Stickstoff vorgekühlt. Der Aufschluss erfolgt unter ständiger Stickstoffzugabe bis das Zellpellet pulverisiert ist. Nach dem Auftauen auf Eis oder bei Raumtemperatur wird der Zellextrakt für 20 min bei 14000 rpm (Beckman Avanti J-25, SS34) und 4°C zentrifugiert. Bis zur weiteren Verwendung wird der Überstand auf Eis aufbewahrt.
Die höchste Proteinextraktausbeute wird mit dem Aufschluss in der French® Pressure cell (AMINCO, 40000 psi Zelle) erreicht. Dazu werden bis zu 6 x 1010 Zellen wie zum Aufschluss unter flüssigem Stickstoff, pelletiert, gewaschen und in 1 Vol Puffer resuspendiert. Bei 1000psi werden die Zellen bis zu dreimal in der French Press Zelle aufgeschlossen. Die Lysate werden für 20 min bei 14000 rpm (Beckman Avanti J-25, SS34) und 4°C zentrifugiert und der Überstand bis zur weiteren Verwendung auf Eis gehalten.
Immunpräzipitationen von HA Fusionsproteinen werden in Puffer PB durchgeführt. 2ml Zellextrakt eines French Press Zellaufschlusses werden mit 200µl Protein A- Sepharose CL-4B (Pharmacia) für 3 Stunden bei 4°C inkubiert, um unspezifisch an die Sepharose bindende Proteine zu entfernen. Die Protein A Sepharose wird abzentrifugiert (2000xg, 2 min), dreimal mit Puffer PB gewaschen und in 1 x Proteinprobenpuffer aufgekocht. Das vorgeklärte Lysat wird mit 10µl mAb12CA5 (4µg Protein, Boehringer Mannheim) versetzt und über Nacht bei 4°C rollierend inkubiert. 100µl Protein A- Sepharose wird zum Zellextrakt gegeben und der Ansatz für 4 Stunden bei 4°C rolliert, um die HA Immunpräzipitate zu binden. Die Protein A- Sepharose wird durch Zentrifugation sedimentiert (2000xg, 2 min), dreimal mit 1,5ml Puffer PB gewaschen und in 1 vol einmal Probenpuffer aufgekocht. Die gebundenen Proteine werden durch SDS PAGE und Immunoblot identifiziert.
Für die Standard IgG Sepharose Affinitätschromatographie wird der Zellextrakt bei Raumtemperatur zweimal über 1/ 25 Zelllysatvolumen IgG Sepharose (6 Fast Flow/ Amersham Bioscience oder Cappel/ ICN, Eschwege) gegeben. Das Säulenmaterial wird mit 50 vol des verwendeten Aufschlusspuffers gewaschen und gebundene Proteine werden mit viermal 1ml 0,5M HOAc/NH4Oac (pH 3,4) eluiert.
Die sequentielle IgG Sepharose Affinitätschromatographie wird verwendet, um einzelne 26S Subkomplexe nativ aus PWn11HTP Lysaten zu gewinnen. Bis zur Elution der gebundenen Proteine wird das Protokoll der Standard Affinitätschromatographie verfolgt. Dabei wird als Aufschluss- und Waschpuffer immer Puffer A verwendet. Zur Elution werden zunächst alle assoziierten Proteine mit 4ml Puffer B (Puffer A ohne MgCl2 und ATP) abgelöst. Das 20S Proteasom eluiert vom 19S Regulatorkomplex mit 4ml Puffer B300 (Puffer B mit 300mM NaCl) und der 19S Base löst sich vom Lid Komplex mit 4ml Puffer B600 (Puffer B mit 600mM NaCl). Nach einem Waschschritt mit 10ml Puffer B wird der 19S Lid Komplex mit 10U TEV Protease (Invitrogen) pro 100µl Säulenmaterial für 3 Stunden bei Raumtemperatur eluiert.
Strep markierte Proteine werden über Strep-Tactin® Sepharose (Institut für Bioanalytik GmbH) eluiert. Zellaufschluss und Waschschritte finden bei diesem Aufschluss in Puffer W (0,1M Tris- HCl pH 8,0; 1mM EDTA pH 8,0) statt. Um biotinylierte Proteine, die unspezifisch an Strep tag II binden, aus dem Lysat zu entfernen, wird es für 30 Minuten bei 4°C mit ca. 40µg Avidin (Sigma) pro ml Lysat vorgeklärt. Vor Inkubation des Säulematerials mit ca. 40 vol Zellextrakt für 2 Stunden bei 4°C wird die StrepTactin Matrix mit 20 vol Puffer W gespült und der pH Wert des Zelllysats mit ungepuffertem 0,5M Tris auf pH 8,0 eingestellt. Die beladene Strep-Tactin® Sepharose wird in Poly- Prep® Chromatographie Säulen (Biorad) transferiert und zweimal mit 10 Bettvolumen Puffer W gewaschen. Die Elution der Strep markierten Proteine oder Komplexe erfolgt mit 6 x 0,5ml 5mM Desthiobiotin in Puffer W.
Die Fällung nativer Proteine erfolgt durch Zugabe von 1/10 Vol 72% (w/v) TCA sowie 1/10 Vol 0,15% (w/v) Natriumdesoxycholat bei 4°C für 20 min. Zum Einengen werden die Proteine 15 min bei 17900xg zentrifugiert. Das Pellet wird einmal mit 100% Aceton gewaschen und in 1x Proteinprobenpuffer resuspendiert.
Proteinkonzentrationen werden mit Hilfe des Protein Assay Konzentrats von Biorad (München) nach Bradford (1976) bestimmt. Die Verdünnung des Bradford Reagenz und der Probe erfolgen nach Herstellerangaben. Die Komplexierung von Protein mit Coomassie Blue G250 wird nach 15 min Inkubation bei Raumtemperatur anhand der Extinktion bei 595nm im Photometer (UltraspecIII, Pharmacia) gegen einen Nullwert gemessen. Zur Erstellung einer Eichkurve werden BSA Lösungen definierter Konzentrationen (1-10µg/ml) verwendet.
Die Auftrennung von Proteinen nach ihrem Molekulargewicht erfolgt durch SDS PAGE (Sodiumdodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis) nach Laemmli (1970). Standardmäßig werden 0,75mm dicke Gele mit einer Lauflänge von ca. 6 cm in dem Protean- Mini II sowie III System von Biorad verwendet. Für zwei 12% ige Trenngele werden 4ml 30% ige Acrylamidlösung (Vernetzungsverhältnis 37,5:1; Applichem), 2,5ml 1,5M Tris- HCl pH 8,8, 100µl 10% w/v SDS und 3,5ml H2O mit 50µl 10% Ammoniumpersulfatlösung (APS) und 5µl N,N,N´,N´- Tetramethylethylendiamid (TEMED) vermischt und zügig in die Gelkammern gegossen. Zur Herstellung zweier 4% iger Sammelgele werden 650µl 30% Acrylamid, 1,25ml 0,5M Tris- HCl pH 6,8, 50µl 10% w/v SDS, 3,05ml H2O, 25µl 10% APS sowie 5µl TEMED vermengt. Die elekrophoretische Auftrennung erfolgt in 1x Laufpuffer ( 25mM Tris; 192mM Glycin; 0,1% w/v SDS) für ca. 45 min bei 200 V. Als Proteingrößen- Marker dient entweder der RainbowTM Proteinmarker (Amersham) mit den Proteinen der Größen 200 kDa, 97,4 kDa, 69 kDa, 46 kDa, 30 kDa, 21,5 kDa und 14,3 kDa oder der low range Marker (NEB) mit Proteinen der Größen 175 kDa, 83 kDa, 62 kDa, 47,5 kDa, 32,5 kDa, 25 kDa, 16,5 kDa und 6,5 kDa.
Das Gel wird in die Färbelösung (0,2% [w/v] Coomassie- Brilliant- Blue R250, 30% [v/v] Methanol und 10% [v/v] Essigsäure in H2O; zuerst Farbstoff in Methanol über Nacht lösen) kurz in der Mikrowelle aufgekocht und für ca. eine Stunde bei Raumtemperatur abgekühlt oder über Nacht gefärbt. Zur Entfärbung wird das Gel entnommen und in mehrfach gewechselter Entfärbelösung (45% [v/v] Methanol, 10% [v/v] Essigsäure in H2O) solange entfärbt, bis der nicht proteingebundene Farbstoff entfernt ist. Um die Gele zu konservieren werden sie zwischen Geltrocknungsfolie (Promega), die von Geltrocknungspuffer (40% [v/v] Methanol, 7,5% [v/v] Essigsäure, 10% [v/v] Glycerol) durchnässt ist, in eine Geltrocknungsapparatur gespannt und für 3-4 Tage getrocknet.
Zunächst werden die Proteine mittels Nass- Blot- System (Biorad) oder Semi- dry- blotting Apparatur (PeqLab) nach einer SDS- PAGE auf Nitrocellulose (NC)- Membran (Optitran BA-S, Schleicher & Schuell) transferiert. Das Nass- Blot- System wird nach Angaben des Herstellers
Für die Immunfärbung wird der Western Blot für 30 min in 5% w/v Magermilchlösung bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert und anschließend über Nacht in dem gegen das zu detektierende Protein oder Peptid gerichtetem Primär- Antikörper in 5% w/v Magermilchlösung bei 4°C schüttelnd inkubiert. Der Blot wird bei Raumtemperatur dreimal für ca. 15 min in TST (50mM Tris- HCl pH 7,4, 150mM NaCl, 0,1% Tween 20) gewaschen und mit dem gegen den Primär- Antikörper gerichteten Sekundär- Antikörper in 5% w/v Magermilchlösung für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. In der Arbeit verwendete Primär- und Sekundär- Antikörper sind in Tab.6 zusammengefasst. Die sekundären Antikörper- Peroxidase- Konjugate werden in der Chemolumineszenz Detektion sichtbar gemacht. Dazu wird der Blot für eine Minute in ca. 20ml ECL Reagenz (100mM Tris pH 8,5; 1,25mM Aminophtalhydrazide (Luminol, Fluka), 0,2mM Coumarinsäure; 0,01% H2O2) bei Raumtemperatur inkubiert und danach luftblasenfrei in durchsichtige Folien gelegt. In einer Expositionskassette wird ein UV- Film (X-OMAT UV Film, Kodak) auf den Blot gelegt und der Film exponiert (maximal 5 Minuten). Die Entwicklung des Films erfolgt in der Entwicklermaschine CAWOMAT 2000 IR (CAWO GmbH).
10µl einer Dichtegradientenzentrifugationsfraktion oder eines verdünnten Zelllysats wird mit 100µl Substratpuffer (50mM Tris- HCl pH 7,5; 5mM MgCl2; 0,05mM Peptidsubstrat) werden in 96-Loch- Mikrotiterplatten (Greiner) vermischt und für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Bei Aufarbeitungen unter Anwesenheit von ATP enthält der Substratpuffer ebenfalls ATP in einer Konzentration von 2mM. Werden die Aktivitäten mehrerer Gradienten verglichen, findet die Messung in der gleichen Mikrotiterplatte statt. Als fluorogene Substrate werden Z- leu- leu- glu- β Naphthylamid (Bachem) und Z- leu- leu- glu- 7- amino- 4- methyl- Coumarin (Calbiochem) als Test auf PGPH (peptyl- glutamyl- peptide bond hydrolyzing)- Aktivität sowie Suc- leu- leu- val- tyr- 7- amino- 4- methyl- Coumarin (Bachem) als Test auf chymotrypsinähnliche Aktivität des Proteasoms verwendet. Die Fluoreszenz der abgespaltenen fluorogenen Gruppen wird im Fluorostar Fluorimeter (SLT) mit Easy Software bei einer Anregungswellenlänge von 390nm bzw. 355nm und einer Abstrahlungswellenlänge von 460nm bzw. 405nm für die Abgangsgruppen 7-amino-4-methyl Coumarin (AMC) bzw. β- Naphthylamid gemessen.
Die in Dichtegradienten aufgetrennten Lysate stammen vorwiegend aus Zellaufschlüssen unter flüssigem Stickstoff. 10-40% ige Glycerolgradienten werden im Gradientenmischer aus 5,7ml 10% iger Glycerollösung (10% [v/v] Glycerol in PB oder Puffer A) und 5,9ml 40% iger Glycerollösung (40% [v/v] Glycerol in PB oder Puffer A) in TH-641 oder SW40 Zentrifugenröhrchen (Beckman) vom Grund des Zentrifugenröhrchens gegossen. Der Gradient wird mit maximal 800µl Zelllysat überschichtet und für 16 Stunden bei 40.000 rpm im SW40 Rotor (Beckman) oder im TH-641 Rotor (Sorvall) bei 4°C zentrifugiert. 600µl Fraktionen werden von der Öffnung des Röhrchens beginnend abpipettiert und auf Eis gehalten. Soll die relative proteasomale Aktivität gemessen werden, wird aus allen Fraktionen der Proteingehalt nach Bradford sowie die Proteaseaktivität gegen das
NLS enthaltende Proteine werden mit Hilfe der Far Western Analyse mit Karyopherin α- ProA als Bindungspartner detektiert. Dazu werden MFY Zellen aus der logarithmischen Wachstumsphase unter Verwendung von Puffer PB mit EDTA freiem Complete Protease Inhibitor Cocktail (Roche) in der French Pressure Cell aufgeschlossen. Die Zellreste werden entfernt (14000xg, 20 min) und das Lysat in flüssigem Stickstoff und anschließend bei –80°C bis zum Gebrauch tiefgefroren. Proteine oder Proteinkomplexe, die in der Far Western Analyse untersucht werden, werden im SDS PAGE Verfahren aufgetrennt und im Semi- dry- blot Verfahren unter Verwendung von Aminocapronsäurepuffer (10mM Aminocapronsäure, 10% Methanol) auf PVDF- Membran transferiert. Die PVDF- Membran wird vor dem Transfer in 100% Methanol aktiviert. Ohne vorherige Amidoschwarzfärbung wird der Blot direkt nach dem Transfer in Renaturierungspuffer (50mM HEPES pH 7,3; 100mM KOAc; 5mM MgOAc; 0,3% Tween; 0,5% BSA) bei 4°C über Nacht inkubiert. Die Membran wird für 30 Minuten in Blocking- Lösung (5% Magermilchpulver in PBST [80g/L NaCl; 2g/L KCl; 14,4g/L Na2HPO4; 2,4g/L KH2PO4; pH 7,4 mit HCl; 0,1% v/v Tween20]) bei Raumtemperatur geschwenkt. Werden NLS-GFPS Konstrukte untersucht erfolgt anschließend eine Inkubation in 10ml Blocking- Lösung die 20% CEY1b Lysat enthält, während bei der Untersuchung von Kernlokalisationssequenzen in 19S proteasomalen Untereinheiten 100% CEY1b Lysat verwendet wird. Als Kontrolle werden identisch behandelte Membranen in 10ml Blocking- Lösung mit 10µg Protein A inkubiert. Nach der Inkubation für 4 Stunden bei 4°C werden die Membranen dreimal 15 Minuten in PBST gewaschen, anschließend für eine Stunde in 5% Magermilchpulver mit Peroxidase gekoppeltem anti- Maus IgG Antikörper (1:10000) bei Raumtemperatur geschwenkt und danach wiederum dreimal 15 Minuten in PBST gewaschen. Mittels ECL Detektion werden NLS beinhaltende Proteine, die an Karyopherin α- ProA gebunden sind, nachgewiesen.
Für die in vivo Lokalisation fluoreszenter Proteine werden die Zellen aus Selektivmedium soweit nicht anders angegeben bis zur frühen logarithmischen Wachstumsphase in YPD bei 28°C oder 37°C angezogen, einmal mit sterilem Wasser gewaschen und bis zur Mikroskopie auf Eis gehalten.
In der Fluoreszenzmikrokopie wird das Leica DMR Mikroskop mit Quecksilberlampe HBO 50 W (Osram) und einem 100 x Ölimmersions- Objektiv (PL Fluotar) mit einer maximalen numerischen Appertur von 1,4 verwendet. Die für das jeweilige Fluorophor benutzten Filterblöcke sind in Tab. 7 zusammengefasst. Die Dokumentation erfolgt mit der Hamamatsu C5985 CCD Kamera in Verbindung mit der MetaVue Software (Visitron Systems, Puchheim) bei identischen Belichtungszeiten für alle Aufnahmen (2 sec, 2 fach gain). Zur Bestimmung der Pixelintensität von Rpn1-GFP und Rpn11-GFP in srp1-49 und SRP1 Zellen wird in Aufnahmen gleicher Belichtungszeit mit Hilfe des MetaVue Systems eine quadratische Fläche von etwa der Größe eines Fünftels des Zellkerns im Zytoplasma sowie im Zellkern gewählt und die durchschnittliche Pixelintensität dieser immer gleich großen Flächen berechnet. Mindestens 20 cytoplasmatische und nukleäre Werte von verschiedenen Aufnahmen werden gemittelt und das Verhältnis der Pixelintensitäten dieser Mittlungen für jeden Stamm berechnet, indem der Quotient aus der durchschnittlichen cytoplasmatischen und der durchschnittlichen nukleären Pixelintensität gebildet wird.
Für die indirekte Immunfluoreszenz werden ca. 100ml Zellen einer Zelldichte von ca. 1 x 107 Zellen/ml pelletiert und zweimal in PBS gewaschen. Durch Inkubation in 1ml Formaldehydlösung (3,7% Paraformaldehyd in PBS) für 3 Minuten bei Raumtemperatur werden die Zellen fixiert und anschließend zügig abzentrifugiert, um sie in zweimal 10ml PBS zu waschen. Das Pellet wird in 1
Um den 19 S Regulator in vivo in S. cerevisiae lokalisieren zu können, werden die endogenen Kopien von Rpn1 als repräsentative 19S Lid Untereinheit und Rpn11 als repräsentative 19S Base Untereinheit mittels homologer Rekombination gegen die GFP-HA (green flourescent protein- Haemagglutinin epitop) markierten Varianten ausgetauscht. HIS3 und URA3 werden dabei als Selektionsmarker eingesetzt. Durch Transformation von wt Stämmen werden die RPN1-GFP-HA::URA3::HIS3 und RPN11-GFP-HA::URA3::HIS3 Konstrukte an den gewünschten Stellen des RPN1 bzw. RPN11 Gens eingefügt und die Stämme PWn1GH und PWn11GH erzeugt (vgl. Abb. 7). Da Rpn1 und Rpn11 von essentiellen und einmalig im Genom vorhandenen Genen kodiert werden (Glickman et al., 1998b;Rinaldi et al., 1998), erfolgt der chromosomale Austausch dieser Untereinheiten durch Fusionsproteine nur dann, wenn die Fusionsproteine funktionell sind. Sowohl der Austausch von Rpn1 als auch von Rpn11 durch die GFP-HA oder Protein A markierten Varianten erbrachte lebensfähige Zellen. In der Western Blot Analyse aus Zellaufschlüssen dieser Stämme lassen sich GFP-HA markierte Proteine der molekularen Massen von 137 kDa (Rpn1-GFPHA) sowie 62 kDa (Rpn11-GFPHA) nachweisen (Abb. 10A). Beide Stämme (PWn1GH, PWn11GH) haben mit dem wt (WCGa) vergleichbare Wachstumsraten (Abb. 10B). Die in vivo Lokalisation von Rpn1-GFPHA und Rpn11-GFPHA in Zellen der logarithmischen Wachstumsphase ist sowohl im Temperaturoptimum (28°C), als auch unter Temperaturstress (37°C) vorwiegend nukleär (Abb. 10C). Die beobachtete cytoplasmatische Färbung erreicht nur ca. 1/5 der Intensität der nukleären Färbung.
Enenkel und Mitarbeitende (1998) beschreiben die proteasomale Lokalisation in S. cerevisiae Zellen als Kernmembran/ER assoziiert. Die Färbung von Zellkern und Endoplasmatischem Retikulum (ER) lässt sich aufgrund der geringen Größe von Saccharomyces cerevisiae Zellen in der direkten Fluoreszenzmikroskopie nur schwer auflösen, so dass nicht zu bestimmen ist, ob die markierten Untereinheiten im oder am Zellkern lokalisieren. Deshalb werden Stämme erzeugt, in denen endogenes Rpn1 oder Rpn11 jeweils gegen die CFP-HA (cyan fluorescent protein) markierte Variante ausgetauscht ist und zugleich GFP markiertes Nukleoporin Nup49, ER- ständiges Protein Pdr5* oder Plasmamembranprotein Pdr5 von autonom replizierenden Plasmiden mit Centromer Sequenz exprimiert wird (PWn1Cn49G, PWn1Cp5G, PWn11Cn49G und PWn11Cp5G). Nup49, Pdr5 und Pdr5* dienen dabei als Marker für die beschriebenen Zellstrukturen (Bucci und Wente, 1998; Egner et al., 1995). Durch direkte Fluoreszenzmikroskopie mit Filterblöcken für FITC/ GFP und CFP werden beide mit Fluorophoren markierten Proteine parallel in der gleichen Zelle lokalisiert (Abb. 11A). CFP-HA markierte 19S Untereinheiten colokalisieren in der logarithmischen Wachstumsphase weder eindeutig mit dem ER- ständigen oder Plasmamembran ständigen Protein Pdr5* bzw. Pdr5 noch mit Nukleoporin Nup49, sondern zeigen vorwiegend Kernlokalisation. Eine Colokalisation von Rpn1 und Nup49 wird jedoch beobachtet, wenn die Zellen vor der direkten Fluoreszenzmikroskopie für 45 min in Wasser inkubiert werden (Abb. 11B). Zwei weitere in dieser Arbeit betrachteten 19S Base
Die Markierung der 19S Untereinheiten mit Proteinen der Größe von GFP (28kDa)
Die Analyse im Glycerolgradienten lässt keine Aussage über die Zusammensetzung des mit den markierten Untereinheiten assoziierten Komplexes zu. Deshalb werden Rpn1 und Rpn11 C- terminal mit Protein A markiert und die Komplexe, in denen diese Untereinheiten inkorporiert sind, in einer Coimmunpräzipitation an IgG Sepharose isoliert. Der Austausch der endogenen Proteine gegen ihre Protein A markierten Varianten erfolgt mit Hilfe der homologen Rekombination von RPN1-ProA::URA3::HIS3 und RPN11-ProA::URA3::HIS3 in die Genloci von RPN1 und RPN11 (PWn1P, PWn11P). Die Protein A Markierung umfasst hierbei fünf IgG bindende Domänen (insgesamt 30 kDa). Rpn1-ProA und Rpn11-ProA assoziierte Komplexe werden mittels Standard IgG Sepharose Affinitätschromatographie aus PWn1P und PWn11P Lysaten aufgearbeitet und in der SDS PAGE aufgetrennt [Abb. 13 (1) und (2)]. Die Coomassie gefärbten Proteine aus PWn1P Lysaten werden in der Analyse durch Fingerprint Massenspektroskopie den 19S regulatorischen Untereinheiten, Ecm29 und Ubp6 zugeordnet. Mit Ausnahme der unterrepräsentierten Untereinheit Rpn10 ist die Stöchiometrie der einzelnen Proteine zueinander nahezu identisch. In Abhängigkeit des gewählten Aufschlusspuffers lässt sich in der IgG Sepharose Affinitätschromatographie der 19S Regulator oder das gesamte 26S Proteasom isolieren. In Puffer PB copräzipitieren mit der Protein A markierten
Der 19S regulatorische Komplex besteht aus mindestens 17 Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von insgesamt ca. 1 MDa. Allein die 19S Base Untereinheiten ergeben ein Gesamtmolekulargewicht von ca. 500 kDa. Für die, in die Kernmembran eingebetteten Kernporen wurde gezeigt, dass ab einer Partikelgröße von 9 nm bzw. einem Molekulargewicht von 40 kDa freie Diffusion in den Zellkern sehr ineffizient wird (Paine et al., 1975) und selbst kleinere Proteine, wie z. B. Histone, aktiv in den Zellkern gelangen
Zunächst soll jedoch die subjektive Abschätzung der Pixelintensitäten der GFP markierten Untereinheiten in srp1-49 Zellen durch eine Quantifizierung aus digitalen Aufnahmen im MetaVue- Programm ersetzt werden. Aus Aufnahmen identischer Belichtungszeiten wird, wie in Materialien und Methoden beschrieben, die cytoplasmatische zur nukleären Fluoreszenzintensität ins Verhältnis gesetzt. Ist der Import der markierten Untereinheit gestört (restriktive Temperatur), sollte eine Zunahme der cytoplasmatischen Färbung und eine Abnahme der Kernfärbung im Vergleich zu ungestörtem Import (permissive Temperatur) zu beobachten sein. Das Verhältnis von cytoplasmatischer zu nukleärer Pixelintensität sollte unter restriktiven Bedingungen zunehmen. Die Quantifizierung der Pixelintensitäten in srp1-49 Zellen sowie SRP1 wt Zellen ergibt, dass das Verhältnis der cytoplasmatischen zur nukleären Pixelintensität für Rpn1-GFPHA und Rpn11-GFPHA unter restriktiven Bedingungen in der Mutante deutlich (um 18% bzw. 14%) und im wt nur leicht (um 6% bzw. 5%) ansteigt (Abb. 14B). Die Pixelintensität im Zellkern der srp1-49 Zellen bleibt dabei nahezu konstant, während die der wt Zellen abnimmt. Die cytoplasmatische Pixelintensität dagegen steigt in srp1-49 Zellen deutlich an, während die der wt Zellen konstant bleibt.
In Untersuchungen zum Kerntransport von 20S Proteasomen zeigt der srp1-49 Stamm nach vierstündiger Inkubation unter restriktiven Temperaturbedingungen eine Anreicherung von Ump1 assoziierten, halben proteasomalen Core- Partikeln (hCP) im Cytoplasma (Lehmann et al., 2002). Die cytoplasmatische Anreicherung der markierten 19S Untereinheiten erfolgt unter den gleichen Bedingungen. Deshalb sollten PWn11srp1-49 Zellen nach Inkubation bei 37°C für 4 Stunden ebenfalls 20S proteasomale Vorläuferkomplexe anreichern. Um dies zu belegen und um zu erfahren, ob die
Das Laufverhalten der 20S Proteasomen im Glycerol- Dichtegradienten lässt sich anhand der in den einzelnen Fraktionen messbaren Proteaseaktivität gegenüber fluorogenen Substraten gut abschätzen. Demnach sedimentiert freies 20S Proteasom in den Fraktionen 12-16, während 26S Proteasomen in den schneller migrierenden Fraktionen 14-20 zu erwarten sind, wie aus Messung der Proteaseaktivität unter Anwesenheit von ATP in der Glycerol- Dichtegradienten Zentrifugation hervorgeht (vgl. Abb. 28). Die 26S Aktivität gegen fluorogenes Substrat unter Anwesenheit von ATP ist dabei ca. dreimal so hoch wie die der 20S Proteasomen. 19S proteasomale Aktivität lässt sich unter diesen Assaybedingungen nicht messen. Aufgrund dessen wird das Laufverhalten von 19S Proteasomen im 10-40% igen Glycerol- Dichtegradienten aufgeklärt, indem der aufgereinigte 19S Komplex einer Dichtegradientenzentrifugation unterzogen wird. Für die Aufreinigung von nativen 19S Komplexen nach Saeki und Mitarbeitenden (2000) werden zunächst 26S Proteasomen aus PCE6 Lysaten über Pre6-ProA unter Verwendung von Puffer A an IgG- Sepharose gebunden. Der native 19S Regulator wird mit PufferB600 (600mM NaCl) von den IgG gebundenen 20S Proteasomen abgelöst und über Glycerol- Dichtegradienten aufgetrennt. Im Coomassie gefärbten Gel sind die Untereinheiten des 19S Regulators in nahezu stöchiometrischer Verteilung jeweils in den Fraktionen 10-13 zu erkennen (Abb. 14D). Die höchste Proteinmenge findet sich in Fraktion 10. Der Vergleich des Laufverhaltens der 19S Untereinheiten in den Glycerolgradienten in Abbildung 14C und 14D zeigt, dass die 19S Untereinheiten im Srp1 wt Stamm PWn11SRP1 vorwiegend in 19S Partikel eingebaut sind (Sedimentation ab Fraktion 10), während die 19S Untereinheiten in der Mutante PWn11srp1-49 in Komplexe geringerer Dichte inkorporiert sind (Sedimentation ab Fraktion 8).
Da sich Rpn1 und Rpn11 in der Kerntransportmutante mit mutiertem Srp1/Kap60 unter
Unter der Annahme, dass die potentiellen cNLS des 19S regulatorischen Komplexes in vivo als Kernlokalisationssequenz für Karyopherin α/β abhängigen Import fungieren, sollten diese Sequenzen in der Lage sein ein Reporterprotein in lebenden Zellen in den
Die Expression der Fusionsproteine in diesen Stämmen wird aus der logarithmischen Wachstumsphase durch Inkubation für 4 Stunden in synthetischem Galaktose Selektionsmedium induziert. Abb. 16 A zeigt die in vivo Lokalisation der 19S NLS- GFPS Fusionsproteine in direkter Fluoreszenzmikroskopie. Die NLS ähnliche Sequenz aus Rpt2 wird dabei nahezu so effizient wie die SV40 NLS in den Zellkern transportiert, während die Kernfärbung in Zellen, die das Rpn2 NLS Fusionsprotein exprimieren etwas schwächer erscheint. Die Arginin- und Lysinreiche Sequenz im Rpt1 C- terminalen Bereich führt im Gegensatz zur mutierten SV40 NLS zu einer erkennbaren Lokalisation der Fusionsproteine im Zellkern, ist darin aber sehr viel ineffizienter als die anderen 19S Sequenzen.
Da die ausgewählten 19S Sequenzen GFPS in den Zellkern leiten, sollte es möglich sein, die verantwortlichen Kerntransporter aus Lysaten der oben genannten Stämme über Strep- tag II Affinitätschromatographie in Bindung an die jeweilige cNLS zu präzipitieren. Dazu werden ca. 2 x 1010 Zellen aus der logarithmischen Wachstumsphase 6 Stunden in Galaktose Selektionsmedium induziert, in der French Press Zelle aufgeschlossen und über Strep- tag II Affinitätschromatographie gereinigt. Gleiche Proteinmengen aller Eluate werden in der SDS PAGE aufgetrennt und in der Western Blot Analyse mit Antikörpern gegen Karyopherin α und β sowie GFP untersucht (Abb. 16 B). Die ECL Signale der GFP Fusionsproteine sind in allen Eluaten nahezu gleich intensiv, während sich die Signalstärken für die assoziierten Kerntransporter deutlich unterscheiden. So sind nur wenig Karα/ Karβ in den Eluaten der mutierten SV40 NLS- GFPS sowie der Rpt1 NLS- GFPS Konstrukte zu detektieren. Etwa gleiche Mengen Transporter sind dagegen mit den Fusionsproteinen aus SV40 NLS, Rpn2 NLS als auch Rpt2 NLS und GFP assoziiert.
Die Bindung zwischen Transporter und NLS ist nur vorrübergehend und der Komplex in der Affinitätschromatographie damit sehr instabil. Aus diesem Grund sollen diese Daten in einer Far Western Analyse abgesichert werden, deren Prinzip auf der in vitro Bindung des Transporters mit den auf einer Membran renaturierten Substraten beruht. In diesem Fall ist Protein A markiertes Karyopherin α der Bindungspartner der NLS Fusionsproteine und wird über Peroxidase gekoppelten Kaninchen- anti- Maus IgG Antikörper in der ECL Reaktion nachgewiesen. Karyopherin α- ProA wird dafür unter dem endogenen Promoter vom Centromer Plasmid pRS315 in einem Stamm exprimiert, in dem das chromosomale Karyopherin α Gen deletiert wurde (CEY1b, Enenkel et al., 1995) . Ca. 5 x 1010 Zellen werden unter Anwesenheit von EDTA freiem Protease Inhibitoren Cocktail (CompleteTM, Roche)in der French Press aufgeschlossen und Zellbruchstücke aus dem Lysat abzentrifugiert. Für die Far Western Analyse werden gleiche Proteinmengen Strep- tag II gereinigter Fusionsproteine in der SDS PAGE aufgetrennt, auf PVDF- Membran transferiert und über Nacht renaturiert. Die Membran wird für vier Stunden in Blockierungslösung mit 20% CEY1b Lysat inkubiert, um Protein A markiertes Karyopherin α aus dem Lysat an die cNLS Fusionsproteine zu binden. Als Kontrolle dafür, dass keine unspezifische Bindung zwischen der Protein A Domäne und den NLS Substraten auftritt, wird eine zweite, gleich behandelte Membran für vier Stunden in Blockierungslösung mit
Ob die in vitro gezeigte Bindung der Rpt2 NLS an Karyopherin α in vivo bedeutsam ist, lässt sich klären, indem der N- terminale, NLS tragende Bereich von Rpt2/ Yta5 in S. cerevisiae deletiert wird. In einem Stamm, dessen chromosomale RPT2 Kopie deletiert ist, wird mit Hilfe der Plasmid- shuffling (5´FOA) Methode das RPT2 Gen gegen das Δ
1-43 rpt2HA Allel ausgetauscht (vgl. Abb. 6; Materialien und Methoden). Zunächst wird der shuffle Stamm PWt2H16 generiert, indem Dp42 aus DY62 (Rubin et al., 1998) durch mehrfache Selektion auf Minimalmedium, das 60µg/ml Leucin und kein Uracil enthält, gegen pRpt2H-16 verdrängt wird. Die Zellen, die nach Selektion auf das URA3 tragende Plasmid nicht mehr auf Minimalmedium ohne Leucin Zusatz wachsen können, stellen den gewünschten shuffle Stamm dar. Die Verdrängung wird neben dem Einsatz einer Western Blot Analyse mit Antikörpern gegen humanes Rpt2 (PW8305; Affiniti) sowie den HA tag überprüft, indem die Plasmide aus S. cerevisiae isoliert und einer Restriktionsanalyse unterzogen werden. Unveröffentlichte Daten von B. Braun zeigen, dass der Antikörper gegen humanes Rpt2 (hRpt2) S. cerevisiae Rpt2 erkennt. Da kein Antikörper gegen S. cerevisiae Rpt2 verfügbar ist, soll nicht markiertes Rpt2 mit dem anti- hRpt2 Antikörper
Der anti- hRpt2 Antikörper erkennt das nicht markierte S. cerevisiaeRpt2 ungefähr in der Größe des erwarteten Molekulargewichts (48,8 kDa) in DY62, nicht aber Rpt2-HA in PWt2H16. Unmarkiertes Rpt2, wie es im Ausgangsstamm zu detektieren ist, wird in PWt2H16 durch den humanen Rpt2 Antikörper nicht nachgewiesen. Der Antikörper gegen das HA Epitop erkennt lediglich das im SDS PAGE langsamer migrierende Rpt2-HA Fusionsprotein (erwartetes MW: 51,5 kDa). In der Restriktionsanalyse der isolierten Plasmide wird pRpt2H-16 aus PWt2H16 und Dp42 in DY62 nachgewiesen. PWt2H16 dient nun als Ausgangsstamm für Mutationen und Markierungen des RPT2 Gens. Dazu werden Plasmide, die das RPT2 Gen, das Δ 1-43 rpt2HA Allel oder deren GFPHA markierte Varianten sowie das LEU2 Gen tragen, in PWt2H16 eingeführt (Abb. 6;Materialien und Methoden). Mit Hilfe der 5´FOA- shuffling Methode entstehen die Stämme PWt2H, PWt2G, PWΔNt2H und PWΔNt2G, in denen die chromosomale Rpt2 Deletion allein durch das LEU2 tragende Plasmid ersetzt ist. LEU2 tragende Plasmide, von denen die HA bzw. GFP-HA markierte wt oder mutierte Untereinheit exprimiert wird, können nur dann die chromosomale Deletion der Untereinheit komplementieren, wenn die exprimierten Untereinheiten funktionell sind.
Auch hier wird der Austausch des URA3 tragenden Plasmids gegen das LEU2 tragende Plasmid mittels Western Blot Analyse der Lysate gegen den HA Antikörper (Abb. 19) sowie Restriktionsanalyse der aus PWt2H, PWt2G, PWΔNt2H und PWΔNt2G isolierten Plasmide bestätigt. Das um 43 Aminosäuren (ca. 5 kDa) verkürzte Rpt2 wird in beiden Deletionsstämmen, soweit die aus der ECL Reaktion hervorgegangenen Filme eine Quantifizierung der detektierten Proteine zulassen, mit dem gleichen Expressionslevel wie die wt Variante gebildet.
Die generierten Stämme werden zunächst näher charakterisiert, indem sie auf Temperatur- und Canavanin- Sensitivität untersucht werden; denn sollte die NLS Deletion in Rpt2 einen Effekt auf die Lokalisation bzw. das Zusammenfinden der 19S Untereinheiten haben, müsste dies Auswirkungen auf die proteasomale Aktivität und damit auf die Überlebensrate der Zellen unter Stressbedingungen haben.
Der Test auf Canavanin- Sensitivität wird nur mit PWt2H und PWΔNt2H durchgeführt, der Test auf Temperatursensitivität auch mit PWt2G und PWΔNt2G (Abb. 20). Es zeigt sich, dass die Rpt2 NLS Deletionsstämme gegenüber den entsprechenden wt Stämmen eindeutig temperatursensitiv sind. Das Wachstum von PWt2H bei restriktiver Temperatur (37°C) unterscheidet sich nur geringfügig von dem bei permissiver Temperatur (28°C), während PWΔNt2H bei restriktiver Temperatur völlig im Wachstum gestoppt wird. Auch PWt2G Zellen, die wt Rpt2 mit einer C- terminalen GFP-HA Markierung exprimieren, sind temperatursensitiv. Nur eine von tausend Zellen überlebt die Temperaturumstellung von 28°C auf 37°. Ist zusätzlich zur GFP-HA Fusion die NLS von Rpt2 deletiert, sind auch diese Zellen (PWΔNt2G) nicht mehr fähig zu wachsen. Eine Sensitivität auf das Arginin Analog Canavanin kann weder bei PWt2H noch bei PWΔNt2H festgestellt werden.
Um den Effekt der NLS Deletion in Rpt2 auf die Verteilung der 19S Untereinheit in der Zelle zu betrachten, werden PWt2G und PWΔNt2G aus derlogarithmischen Wachstumsphase für drei Stunden bei 37° sowie 28°C angezogen und die Lokalisation
Welchen Effekt die Deletion der Rpt2 NLS auf die Lokalisation anderer 19S Untereinheiten zeigt, wird untersucht, indem die endogenen Kopien von Rpn1 sowie Rpn11 durch GFPS markierten Varianten in PWΔNt2H ersetzt werden und die in vivo Lokalisation dieser Untereinheiten in den resultierenden Stämmen PWΔNt2H11GS und PWΔNt2H1GS geprüft wird. Zellen aus der logarithmischen Wachstumsphase werden dazu für 3 Stunden bei 28°C sowie 37°C inkubiert und die GFP Fluoreszenz mittels direkter Fluoreszenzmikroskopie bestimmt (Abb. 21C). Die Lokalisation der 19S Base Untereinheit Rpn1- GFPS ist sowohl bei 28°C als auch bei 37°C nukleär und unterscheidet sich damit nicht von der der ATPase. Auch die 19S Lid Untereinheit Rpn11-GFPS ist unter den beobachteten Bedingungen nukleär lokalisiert, wird aber im Vergleich zu Rpn1-GFPS in PWΔNt2H, als auch im Vergleich zu PWn11GH nur schwach exprimiert.
Die Deletion der NLS in Rpt2 könnte dazu führen, dass das gebildete Rpt2 nicht vollständig in den 19S regulatorischen Komplex eingebaut wird, oder dass der Komplex an sich bzw. in Verbindung mit dem 20S Proteasom an Stabilität verliert. Der vollständige, funktionelle Einbau der verkürzten Rpt2 Untereinheit in den 19S Komplex wird mit Hilfe des Glycerol- Dichtegradienten gezeigt. PWt2H und PWΔNt2H werden in der logarithmischen Wachstumsphase für eine Stunde bei restriktiver Temperatur inkubiert, die Lysate mit Zusatz von ATP sowie MgCl2 in der 10-40% igen Glycerol-
Die Stabilität des Komplexes wird überprüft, indem wt bzw. mutierte 26S Proteasomen, die über Rpn11ProA an eine IgG Sepharose Matrix gebunden sind, einer 600mM Natrium- Chlorid (NaCl) Lösung ausgesetzt und anschließend im 10-40% igen Glycerol- Dichtegradienten aufgetrennt werden. Die für diesen Versuch benötigten Stämme werden
Mit Hilfe der abspaltbaren Protein A Markierung lassen sich 26S Proteasomen in der sequenziellen IgG Sepharose Affinitätschromatographie in die nativen Subkomplexe 20S, 19S Base und 19S Lid zerlegen (Abb. 23). Das Prinzip dieser sequenziellen Affinitätschromatographie ist, die Bindung der einzelnen Subkomplexe zueinander anhand steigender NaCl Konzentrationen zu lösen und lediglich die an die IgG Sepharose verankerten 19S Lid Komplexe zurückzubehalten, um sie durch eine TEV Protease Spaltung nativ zu eluieren. Die 20S- 19S Base Bindung wird dabei bei 300mM NaCl getrennt und die 19S Base- 19S Lid Bindung bei 600mM NaCl. Eine weitere Erhöhung der Salzkonzentration auf 1M NaCl führt zu keiner stärkeren Auftrennung des IgG gebundenen Komplexes.
In einer geringfügig abgewandelten Aufarbeitung wird die Stabilität der proteasomalen Komplexe aus PWt2Hn11HTP sowie PWΔNt2Hn11HTP überprüft. 26S Proteasomen aus Zelllysaten werden über Rpn11-HA-TEV-ProA an IgG Sepharose gebunden, 19S Base sowie 20S Komplex mit 600mM NaCl eluiert und in der 10-40% igen Glycerol- Dichtegradientenzentrifugation aufgetrennt. Die Verteilung der Subkomplexe beider Stämme kann bereits anhand der Amidoschwarz gefärbten PVDF Membran verglichen
Eine weitere potentielle NLS im 19S Base Komplex ist die in vitro mit Karyopherin α interagierende lysinreiche Sequenz im KEKE Motiv von Rpn2. Auch hier wird die in vivo Relevanz der in vitro erzielten Ergebnisse durch die Deletion der NLS in Rpn2 überprüft. Dazu werden WCGa wt Zellen mit den Rpn2-HA::URA3::HIS3 bzw. Rpn2ΔC-HA::URA3::HIS3 Konstruktentransformiert und mittels homologer Rekombination im Rpn2 Genlocus die Stämme PWn2H und PWΔCn2H geschaffen. In PWn2H ist endogenes Rpn2 durch die HA markierte Variante ersetzt, während in PWΔCn2H ein C- terminal um 155 Aminosäuren (entspricht 465 Basenpaare bzw. ca. 17 kDa) verkürztes RPN2 mit HA Markierung abgelesen wird. Der Austausch wird auf Proteinebene mittels Western Blot Analyse mit Antikörpern gegen das HA Epitop und auf DNA Ebene mittels PCR sowie Sequenzierung überprüft. Die Western Blot Analyse ergibt für Rpn2-HA sowie für ΔNLS rpn2-HA zwar Signale auf Höhe des erwarteten Molekulargewichts (106 kDa bzw. 89 kDa), die Intensität bei gleicher Proteinmenge des Gesamtlysats ist jedoch für Rpn2-HA ca. fünfmal so stark wie für ΔNLS rpn2-HA (Abb. 25A). Die PCR Analyse der
Eine nähere Charakterisierung der Mutanten in Bezug auf Temperatur- und Canavanin- Sensitivität ergibt, dass PWΔCn2H Zellen in beiden Tests starke Sensitivität zeigen, während PWn2H keinerlei Wachstumseinschränkungen aufweist (Abb. 26A). Nur eine von tausend PWΔCn2H Zellen überlebt Wachstumsbedingungen mit 0,6µg/ml Canavanin als Argininersatz, während unter restriktiven Temperaturbedingungen sogar nur eine von zehntausend Zellen zu wachsen vermag. Die Canavanin Sensitivität beruht auf einem Defekt im Abbau fehlgefalteter Proteine durch das Proteasom und deutet auf einen erhöhten Anteil ubiquitinierter Proteine in diesen Zellen hin (Heinemeyer et al., 1991). Um zu belegen, dass die Deletion des C- terminalen Bereichs in Rpn2 tatsächlich zu einem Anstau ubiquitinierter Proteine führt, aber keinen Einfluss auf die Prozessierung der 20S β Untereinheiten β5 und β7 hat, werden Stämme auf Grundlage von WCGa, PWn2H und PWΔCn2H erzeugt, bei denen jeweils eine der beiden β Untereinheiten HA markiert ist. Dazu werden YIplac128
Pre2HA bzw. YIplac128Pre4HA genomisch in die o.g. Stämme integriert und die Stämme PWβ5H, PWn2Hβ5H und PWΔCn2Hβ5H bzw. PWβ7H, PWn2Hβ7H und PWΔCn2Hβ7H erzeugt. Alle Stämme werden aus der logarithmischen Wachstumsphase für eine Stunde bei 37°C inkubiert und gleiche Proteinmengen der Gesamtlysate in der SDS PAGE aufgetrennt. Im Immunoblot gegen Ubiquitin Antikörper zeigt sich in PWΔCn2H Lysaten im Vergleich mit den wt Lysaten eine deutliche Anreicherung des Ubiquitin Signals für Proteinmassen von 48 bis 200 kDa (Abb. 26B). Der Immunoblot gegen das HA Epitop zeigt nahezu äquivalente Mengen der unprozessierten β5 sowie β7 Untereinheit in allen Lysaten. Des weitern wird aus den Western Analysen gegen die Untereinheiten Rpt6 und Rpn2-HA bzw. ΔNLS rpn2-HA mit den entsprechenden Antikörpern ersichtlich, dass,
Da keine Transformanten erzeugt werden konnten, die funktionelles Rpn2-GFPHA oder ΔNLS rpn2-GFPHA exprimieren, wird die Lokalisation von Rpn2-HA und ΔNLS rpn2-HA in der indirekten Immunfluoreszenz betrachtet. PWΔCn2H und PWn2H Zellen werden aus der logarithmischen Wachstumsphase für eine Stunde bei restriktiver Temperatur gehalten, fixiert und die Lokalisation der HA markierten Proteine mit Antikörpern gegen das HA- Epitop visualisiert (Abb. 27). Parallel wird die DNA in diesen Zellen mit DAPI angefärbt, um die Lage des Zellkerns anzuzeigen. Die Lokalisation von Rpn2-HA ist sowohl unter permissiven als auch unter restriktiven Temperaturbedingungen nukleär, während ΔNLS rpn2-HA lediglich bei 28°C im Zellkern lokalisiert ist. Wenn die Zellen eine Stunde bei 37°C inkubiert werden, ist das ΔNLS rpn2-HA Signal deutlich verringert und in punktartiger Struktur über die Zelle verteilt. Als Kontrolle dafür, dass die Zellstrukturen unter den Fixierungsbedingungen nicht zerstört wurden, werden Zellen beider Stämme nach der Fixierung mit Antikörpern gegen Kernporenproteine immungefärbt. Die ring- und punktartigen „Nuclear Pore Complex“ (NPC) Signale an der Kernmembran sind in allen
Die cytoplasmatische Lokalisation von ΔNLS rpn2-HA in PWΔCn2H nach Inkubation des Stamms bei 37°C, könnte darauf hindeuten, dass Rpn2 unter diesen Bedingungen nicht korrekt in den 19S Komplex eingebaut wird. Unter der Annahme, dass Rpn2 kein essentielles Protein in S. cerevisiae ist (Yokota et al., 1996), scheint diese Hypothese sehr wahrscheinlich. Da widersprüchliche Veröffentlichungen über die Letalität der Rpn2 Deletion publiziert sind, wird die Disruption des RPN2 Gens in dem von Yokota und Mitarbeitenden generierten Stamm überprüft, indem dieser Stamm mit dem Rpn2-HA::URA3::HIS3 bzw. Rpn2ΔC-HA::URA3::HIS3 Konstrukt transformiert wird. Es entstehen die Stämme PWΔn2ΔCn2H und PWΔn2n2H. Lysate dieser Stämme zeigen in der Western Blot Analyse mit Antikörpern gegen das HA Epitop Signale bei Molekulargewichtsgrößen von 60 kDa bzw. 80 kDa für ΔRpn2 ΔNLS rpn2-HA bzw. ΔRpn2 Rpn2-HA (Abb. 25C). Die Disruption von RPN2,
die durch Integration des LEU2 Gens in die HindIII Schnittstelle von Rpn2 (Bp 437 von 2838) durchgeführt wurde, führt demnach nicht wie von Yokota und Mitarbeitenden (1996) beschrieben zu einem vollständigen Verlust des Rpn2 Proteins. Die funktionelle Markierung des von diesem Gen- Locus entstehenden ca. 80 kDa Proteins, weist darauf hin, dass 4/5 des Rpn2 Gens abgelesen wird (vgl. Abb.25 C). Könnte das auf die HindIII Schnittstelle folgende ATG als Startcodon genutzt werden, würde ein 81kDA Protein gebildet werden. Der vollständige Verlust der
Der korrekte Einbau der mutierten Rpn2 Untereinheit in 19S Komplexe unter restriktiven Temperaturbedingungen wird untersucht, indem PWΔCn2Hβ5H und PWn2Hβ5H Zellen für eine Stunde bei 37°C inkubiert werden und die Lysate der Stämme mit und ohne ATP Zusatz einer 10-40% igen Glycerol- Dichtegradienten Zentrifugation unterzogen werden. In allen Fraktionen der Gradienten wird der Proteingehalt und die proteasomale PGPH Aktivität gemessen, bevor die Verteilung von Rpn2, Rpt6/ Cim3 und β5/ Pre2 im Immunoblot mit entsprechenden Antikörpern überprüft wird (Abb. 28).
In den ATP enthaltenden Lysaten von PWΔCn2Hβ5H und PWn2Hβ5H sedimentiert reifes β5/ Pre2 deckungsgleich in den Fraktionen 12 bis 20, in denen auch die Proteaseaktivität gegen fluorogenes Substrat festgestellt wird. In fünf unabhängigen Aufarbeitungen war der Anteil und die Verteilung von nicht prozessiertem Pro- β5/ Pre2 in den Gradienten nicht reproduzierbar und es konnte kein Einfluss der Mutation in ΔNLS rpn2-HA auf die Prozessierung von β5/ Pre2 beobachtet werden. Die Signale für Pro- β5/ Pre2 werden deshalb nicht gezeigt. Rpt6 Signale finden sich in den ATP enthaltenden Lysaten für PWn2H in den Fraktionen 13- 20 während die ATPase in PWΔCn2H Lysaten bereits in Fraktion 11 und 12 nachgewiesen wird. Die Migration von Rpn2-HA sowie ΔNLS rpn2-HA im Glycerolgradienten lässt sich aufgrund der stark unterschiedlichen Erkennung
Die Stabilität der proteasomalen Komplexe wird auch hier überprüft, indem die 600mM NaCl Elutionen der sequentiellen Affinitätschromatographie aus PWn2Hn11P sowie PWΔCn2Hn11P Lysaten im 10- 40% igen Glycerolgradienten aufgetrennt werden. Um zunächst die erforderliche Protein A Markierung an Rpn11 in PWn2H sowie PWΔCn2H einzuführen, werden die Stämme mit Rpn11-ProA::LEU2 Konstrukten transformiert und damit PWn2Hn11P und PWΔCn2Hn11P erzeugt. Ein Teil der 600mM NaCl Elution aus beiden Stämmen wird in der SDS PAGE aufgetrennt und das restliche Eluat im Glycerolgradienten analysiert. Die in der SDS PAGE separierten Proteine werden in Coomassie Lösung angefärbt und copräzipitiertes ΔNLS rpn2-HA massenspektrometrisch nachgewiesen. Aus allen Fraktionen des Glycerolgradienten werden die Proteine gefällt und in der Western Blot Analyse untersucht. Anhand der Amidoblack gefärbten
Die Funktionalität der lysinreichen Sequenzen aus Rpt2 und Rpn2 als Kernlokalisationssignal wurde anhand von in vivo Lokalisation und Far Western Analyse unter 3.4 gezeigt. Die Sequenzen wurden für diese Untersuchungen aus ihrer Proteinumgebung isoliert. Das heißt sie unterliegen im Fusionskonstrukt mit GFPS keiner festen tertiären Struktur, sondern nehmen neben der räumlichen Struktur von GFP eine ungeordnete Form ein, die für die Transportrezeptoren leicht zugänglich ist. Ob die NLS in den nativ gefalteten Rpt2 und Rpn2 Proteinen ebenfalls für Karyopherin α/β zugänglich
Ziel der Arbeit ist die Aufklärung der Transportmechanismen zur nukleären Lokalisation des 19S regulatorischen Partikels des 26S Proteasoms in Saccharomyces cerevisiae. Hinweise darauf, dass 19S Komplexe während der logarithmischen Wachstumsphase in S. cerevisiae im/am Zellkern lokalisiert sind, stammen aus der Arbeit von Enenkel und Mitarbeitenden (1998) mit der GFP markierten ATPase Cim5/ Rpt1. Die Lokalisation der 19S Lid Untereinheit Rpn11 sowie der 19S Base Untereinheit Rpn1 anhand einer funktionellen, C- terminalen Markierung mit GFP in dieser Arbeit bestätigen die früheren Ergebnisse. Rpn1-GFPHA und Rppn11-GFPHA sind in Zellen der logarithmischen Wachstumsphase hauptsächlich nukleär lokalisiert (vgl. Abb. 10). Es lässt sich durch die parallele Betrachtung der fluoreszenzmarkierten 19S Untereinheiten und den Zellkompartimentmarkern Nup49, Pdr5 und Pdr5* eine präzise Bestimmung der Fluoreszenzmarkierung im Zellkern treffen (vgl. Abb. 11), während eine Lokalisation am cytoplasmatischen ER weitestgehend ausgeschlossen werden kann (vgl. Pdr5*GFP und Rpn1/11-GFPHA Lokalisation). Gestützt werden diese Ergebnisse durch Daten von Wilkinson und Mitarbeitenden (1998), die zeigen, dass Immunogold markiertes Pad1/ Rpn11 in elektronenmikroskopischer Analyse an der inneren Kernmembran lokalisiert ist. Auch eine globale Analyse der Lokalisation von S. cerevisiae Proteinen zeigt, dass alle 19S Untereinheiten überwiegend im Zellkern vorliegen (Huh et al., 2003). Zusätzlich lässt die Akkumulation der fluoreszenzmarkierten, proteasomalen Untereinheiten an den Kernporen/ der Kernmembran unter Hungerbedingungen, die einen niedrigen Energiestatus der Zelle zur Folge haben, die Schlussfolgerung zu, dass ein Anteil der Proteasomen ständig energieabhängigen Transportprozessen unterworfen ist (vgl. Abb 11B). Die Co- Sedimentation der GFP markierten 19S Untereinheiten mit der ATPase Rpt6 sowie der 20S Untereinheit α1 in 10- 40% igen Glycerolgradienten als auch die stöchiometrische Copräzipitation aller 19S proteasomalen Untereinheiten mittels der Protein A markierten Untereinheiten Rpn1 und Rpn11 an IgG Sepharose zeigt den vollständigen Einbau der C- terminal veränderten Proteine in 19S Komplexe (Abb. 12 und 13). Da der Austausch von Rpn1 und Rpn11 gegen die GFP-HA und ProA markierten Varianten der Proteine lebensfähige Zellen erbrachte, müssen die veränderten Proteine unter den erfassten Bedingungen funktionell sein. Die Wachstumsraten der Stämme unterscheiden sich bei 28°C und 37°C nicht von denen des entsprechenden Ausgangsstamms, so dass die Markierung der essentiellen Proteine in diesen Zellen auch unter temperaturbedingtem Stress keine phänotypische Ausprägung findet (vgl. Abb. 10). Allerdings ist zu bemerken, dass die Co- Sedimentation der markierten Untereinheiten lediglich zu einer 19S Base sowie zu einer 20S Untereinheit gezeigt wurde. Es ist nicht nachgewiesen, dass alle Untereinheiten des 19S Komplexes mit den markierten Untereinheiten in diesen Stämmen im 10-40% igen Glycerolgradienten cosedimentieren.
Die nicht essentiellen Proteine Ecm29 und Ubp6 werden nahezu stöchiometrisch in affinitätschromatografischen Aufarbeitungen des 19S Komplexes sowie des 26S Proteasoms detektiert. Das mit naszierenden 20S Proteasomen assoziierte Blm3 konnte in Aufarbeitungen von 19S Komplexen nicht nachgewiesen werden. Für die Assoziation des nicht essentiellen, deubiquitinierenden Enzyms Ubp6 mit 19S Partikeln gibt es bereits Belege, die eine Bindung des Proteins an den 19S Base zeigen (Leggett et al., 2002; Guterman und Glickman, 2004). Copräzipitationen von Ecm29 mit dem 26S Proteasomen wurden ebenfalls schon beschrieben (Leggett et al., 2002; Ho et al., 2002; Gavin et al., 2002). Untersuchungen der Arbeitsgruppe von D. Finley zufolge ist Ecm29 jedoch mit dem 20S Proteasom assoziiert und verbindet dieses mit dem 19S Komplex zum aktiven 26S Proteasom (Leggett et al., 2002). Diese Ergebnisse lassen sich nur mit der in dieser Arbeit gefundenen Assoziation von Ecm29 mit 19S Komplexen in Einklang bringen, wenn Ecm29 sowohl an den 20S als auch an den 19S Komplex binden kann und die Bindung an den ein oder anderen 26S Subkomplex von den in der Aufarbeitung verwendeten Salz- sowie ATP Konzentrationen abhängig ist.
Eine BLASTP 2.2.8 Proteindatenbank Recherche mit der Aminosäuresequenz von Ecm29 ergibt, dass sequenzhomologe Proteine auch in Homo sapiens, Arabidopsis thaliana und Drosophila melanogaster existieren. Das Homo sapiens Homolog von Ecm29, KIAA0368, besitzt 29% Sequenzidentität zu der Aminosäure Sequenz von Ecm29 und hat mit 1441 Aminosäuren ein Molekulargewicht von ca. 160 kDa. Über die Funktion dieses Proteins ist nichts bekannt. Die Homologie zwischen Ecm29 und Proteinen höherer Species könnte auf eine evolutionär konservierte Funktion des Proteins innerhalb des Ubiquitin-
Nachdem verifiziert wurde, dass 19S regulatorische Untereinheiten vorwiegend im Zellkern lokalisieren, wurde anhand von Mutationsstämmen überprüft, welche Transportfunktionen für den Kernimport von 19S Partikeln verantwortlich sind. Die verwendeten Mutationsstämme tragen einen beschriebenen Defekt in Genen, deren Proteinprodukte essentielle Funktionen im Kernimportweg ausüben und ermöglichen in Kombination mit den GFP markierten 19S Untereinheiten das Auslesen der verantwortlichen Transportfunktionen. Unter Betrachtung der beiden essentiellen Kernimportrezeptoren Pse1/ Kap121 und Kap95 zeigt sich die nukleäre Lokalisation der 19S Partikel lediglich abhängig vom Srp1/ Kap60- Kap95 vermittelten Import. In der von Seedorf und Silver (1997) generierten pse1-1 Mutante sind Rpn1-GFP und Rpn11-GFP unter restriktiven Bedingungen nicht cytoplasmatisch lokalisiert. Da in dieser Mutante bisher nur für Transkriptionsfaktoren, wie Pdr1 und Spo12, eine cytoplasmatische Delokalisation gefunden wurde und in weiteren Untersuchungen direkte Interaktionen zwischen den Transkriptionsfaktoren Pho4 bzw. Ste12 und Pse1 gezeigt werden konnten, könnten Transkriptionsfaktoren die bevorzugten Importsubstrate von Pse1/ Kap121 darstellen (Chaves und Blobel, 2001; Delahodde et al., 2001; Kaffman et al., 1998; Leslie et al., 2002). Der nukleäre Import von 20S Proteasomen (Lehmann et al., 2002) sowie 19S regulatorischen Komplexen ist dagegen Karyopherin α/β abhängig. Sowohl die 20S proteasomalen Precursorkomplexen als auch die GFP markierten 19S Untereinheiten Rpn1 und Rpn11 delokalisieren nur in srp1-49 Zellen unter restriktiven Bedingungen ins Cytoplasma. Die von Loeb und Mitarbeitenden (1995) in der NLS Bindung und im Protein Import in den Zellkern als defekt beschriebene Mutante srp1-31 zeigt dagegen unter restriktiven Bedingungen keine abweichende Lokalisation der 19S Untereinheiten. Bezüglich der phänotypischen Merkmale dieser beiden Mutanten gibt es in der Literatur widersprüchliche Aussagen (siehe Tab. 8). Der in dieser Arbeit verwendete Stamm trägt, wie ursprünglich von Yano und Mitarbeitenden (1994) beschrieben, eine Glu145à Lys Mutation und zeigt nach 8 stündiger Inkubation unter restriktiven Temperaturbedingungen verlangsamtes Wachstum sowie einen Zellteilungsdefekt beim Übergang von G2 zu M Phase während der Mitose. Weiterhin delokalisieren in diesem Stamm SV40NLS-GFP Fusionsproteine und 20S proteasomale Precursor Komplexe in vivo unter restriktiven Bedingungen aus dem Zellkern ins Cytoplasma, was auf schwere Defekte im cNLS abhängigen Import von Proteinen in den Zellkern hindeutet (Lehmann et al., 2002). Die gleichen Bedingungen, die zur Anreicherung von proteasomalen Precursor Komplexen im Cytoplasma der srp1-49 Mutante führen, bewirken im Vergleich zu permissiven Bedingungen eine quantifizierbare Verstärkung der cytoplasmatischen Pixelintensität von Rpn1-GFPHA und Rpn11-GFPHA in dieser Mutante (vgl. Abb. 14), so dass 19S regulatorische Partikel vermutlich vorwiegend über den cNLS und Karyopherin α/β
Die Unterbindung des 19S Kerntransports in srp1-49 Zellen scheint nicht vollständig zu sein. Aus Abb. 14B geht hervor, dass die nukleäre Pixelintensität in srp1-49 Stämmen nach der Inkubation für 4 Stunden bei 37°C im Mittel nahezu den gleichen Wert erreicht, wie in den bei Raumtemperatur gewachsenen Kontrollzellen. Der selbe Wert nimmt während der Inkubation der wt Stämme bei 37°C in der Tendenz ab. Auch wenn die Fluoreszenzaufnahmen der einzelnen Stämme nicht vollständig miteinander vergleichbar sind, weil der Expressionslevel der fluoreszenzmarkierten Untereinheiten in den verschiedenen Stämmen bei den untersuchten Temperaturen unterschiedlich sein kann, ist hier eine Tendenz auszumachen: Die Intensität der nukleären Fluoreszenz nimmt unter restriktiven Bedingungen nicht ab. In Anbetracht dessen, dass sich die S. cerevisiae Zellen während der Inkubationszeit bei 37°C ein- bis zweimal teilen ohne dass sich die Kernmembran wie bei höheren Eukaryonten auflöst, sollten sich die im Kern vorhandenen, fluoreszierenden Untereinheiten erheblich verdünnen, wenn der Kernimport vollständig blockiert wäre. Da dies nicht der Fall ist, kann davon ausgegangen werden, dass die srp1-49 Mutation lediglich zu einem verschlechterten Kernimport der aktiv transportierten Substrate führt. Entweder können - wie oben erwähnt – andere Karyopherine die srp1-49 Mutation kompensieren oder die srp1-49 Mutation bewirkt eine verminderte Karyopherin α Bindungseffizienz. In beiden Fällen wäre der Kernimport in srp1-49 Zellen ineffizienter als in entsprechenden Zellen mit voll funktionsfähigem
Werden Lysate der srp1-49 und wt Stämme, deren endogenes Rpn11 gegen das GFPHA markierte Protein ausgetauscht ist, nach Wachstum unter restriktiven Bedingungen im Glycerolgradienten aufgetrennt, sedimentieren Anteile der 19S Untereinheiten Rpt6 und Rpn11 aus srp1-49 vor allem im Vergleich zum Laufverhalten des 20S Proteasoms in Fraktionen geringerer Dichte (7-9) als im wt Stamm (vgl. Abb. 14C). Native 19S Komplexe sedimentieren gewöhnlich in den Fraktionen 10- 12 (vgl. Abb. 14D). Daraus kann geschlussfolgert werden, dass das im Cytoplasma des srp1-49 Stamms unter restriktiven Bedingungen angereicherte GFP markierte Rpn11 nicht in freier Form vorliegt, sondern in Komplexe eingebaut ist, die geringfügig langsamer in 10- 40 % igen Glycerolgradienten sedimentieren als 19S Komplexe. Das Sedimentationsverhalten dieser Komplexe entspricht in etwa denen der 19S Base und Lid Subkomplexe.
Die von Srp1/ Karyopherin α erkannten Signalsequenzen, sind im Vergleich zu denen anderer Transportrezeptoren relativ gut charakterisiert. Trotzdem ist eine Vorhersage über die Funktionalität NLS ähnlicher Sequenzen in Proteinen schwer, da vornehmlich die Interaktionen zwischen NLS und NLS- Bindungstasche anhand von kurzen ungefalteten Peptiden mit Srp1/ Karyopherin α untersucht sind (Fontes et al., 2000). Die Struktur von Karyopherin α gebunden an ein Cargo Protein ist bisher nicht aufgeklärt und deshalb sind Protein- Protein Interaktionen, die nicht die NLS- Bindungstasche betreffen, unbekannt. Die Sequenzanalyse der 19S Untereinheiten ergibt, dass 8 der 17 Untereinheiten lysin-/ argininreiche Sequenzen tragen, die mit den Konsensussequenzen der klassischen NLS
Die Untersuchung, der aus dem Proteinzusammenhang isolierten NLS ähnlichen Sequenzen von Rpn2, Rpt2 und Rpt1 zeigt, dass die mit der NLS Konsensussequenz übereinstimmende Rpn2 sowie Rpt2 Sequenz in der Lage ist, das GFP Reporterprotein in den Zellkern zu leiten, während die lysinreiche Region im Rpt1 C- Terminus zu keiner deutlichen Kernfärbung führt. Die Immunpräzipitation der Kernimportrezeptoren Karyopherin α/βund die in vitro Bindung der Rezeptoren an die Rpn2 und Rpt2 Sequenz in der Far Western Analyse bestätigt die Funktion dieser Sequenzen als NLS. Die Rpt1 Sequenz zeigt unter diesen Versuchsbedingungen dagegen nur eine sehr schwache (Lokalisation von GFP; Präzipitation von Karyopherin α/β) bzw. keine (Far Western) Qualität als NLS.
Um die Relevanz der identifizierten NLS in vivo zu untersuchen, werden sie aus den
Rpt2 ist in der ATP Bindungsdomäne die mutationssensibelste ATPase und der C- terminale Bereich des Proteins wird für die ATP abhängige Öffnung des Translokationskanals im 20S Proteasom verantwortlich gemacht (Rubin et al., 1998; Köhler et al., 2001). Dementsprechend sind die in dieser Arbeit verwendeten C- terminalen HA bzw. GFPHA Markierungen kritisch zu betrachten. Wie in den Untersuchungen zur Temperatursensibilität erkennbar ist, führt schon das Anhängen des zweifachen HA Epitops (22 Aminosäuren) an Rpt2 zu leichter Temperatursensitivität des
Zellen, die eine Deletion der NLS in RPN2 tragen, sind drastisch temperatur- sowie canavaninsensitiv und reichern im Vergleich zu isogenen wt Stämmen ubiquitinierte Proteine an. Da Mutationen in den Untereinheiten des 19S Komplexes häufig zu Defekten in der proteasomalen Degradation führen (zusammengefasst in Voges et al., 1999; Hilt und Wolf, 2000), lässt sich nicht zwangsläufig schlussfolgern, dass die phänotypischen Merkmale der Mutante auf einen Verlust der NLS Funktion in Rpn2 zurückzuführen sind. Die untersuchte Rpn2 NLS ist in eine KEKE Region (Lysin-/ Glutamat reiche Sequenzen) eingebettet. Realini und Mitarbeitende (1994) postulieren, dass KEKE Motive in verschiedenen Multiproteinkomplexen (Proteasomen, Chaperonen) Protein-Protein
Es könnten mehrere, durch die Deletion der Rpn2 NLS hervorgerufene Funktionsverluste zu den beobachteten Merkmalsausprägungen führen. Dass Rpn2 für das Überleben der Zellen essentiell ist und Mutationen in diesem Protein die proteasomale Degradation beeinträchtigen, wurde bereits von DeMarini und Mitarbeitenden (1995) gezeigt. Für den Nachweis der Assoziation von Rpn2 mit dem 26S Proteasom haben DeMarini und Kollegen (1995) eine N- terminale Markierung an Rpn2 verwendet und fanden, dass bei dem Großteil des in den Zellen entstandenen Rpn2 diese HA Markierung proteolytisch abgespalten wurde. Auch die in dieser Arbeit verwendete C- terminale Markierung von ΔNLS rpn2 mit dem HA Epitop lässt sich in Zelllysaten nur in geringem Maß nachweisen (vgl. Abb. 25A und 26B). Vielmehr geht aus der Aufreinigung proteasomaler Komplexe in Coimmunpräzipitationen hervor, dass der größte Anteil des in die Proteasomen eingebauten ΔNLS rpn2-HA die HA Markierung nicht mehr trägt, sondern ein einheitliches Molekulargewicht von ca. 75 kDa besitzt (vgl. Abb. 29). Offenbar wird jedoch nur ΔNLS rpn2-HA partiell degradiert, denn in Stämmen, die Rpn2-HA exprimieren, konnte keine verkürzte Form des Proteins nachgewiesen werden. Die Struktur des Rpn2 Proteins scheint für die reibungslose Funktion des 19S Partikels äußerst wichtig zu sein und die durch die Deletion der KEKE Region bzw. durch eine N- terminale HA Markierung hervorgerufenen strukturellen Veränderungen in dem essentiellen Protein können durch partielle Degradation teilweise kompensiert werden. Die in dieser Arbeit verwendete C- terminale HA Markierung an Rpn2 dagegen ist strukturell und funktionell nicht hinderlich.
Aus Abbildung 28 geht hervor, dass ΔNLS rpn2-HA trotz der Deletion in proteolytisch aktive 26S Proteasomen eingebaut wird. Diese 26S Proteasomen zeigen jedoch im Vergleich zu wt Proteasomen eine um 40% verringerte Aktivität gegenüber fluorogenen Substraten. Da die 20S proteasomale Aktivität in wt Zellen und ΔNLS rpn2-HA exprimierenden Zellen nahezu identisch ist, scheint die 19S Regulator Aktivität in den ΔNLS rpn2-HA exprimierenden Zellen beeinträchtigt zu sein. Genauer gesagt muss die Effizienz der Proteintranslokation (gating) in das katalytisch aktive 20S Proteasom gestört sein, da bei einer Hydrolyse von fluorogenen Peptiden keine Ubiquitin abhängige Erkennung, Entfaltung oder Deubiquitinierung des Substrats vonnöten ist. Eine geringere Effizienz der Translokation von Substraten ins 20S Proteasom könnte auf eine strukturelle Destabilisation des 19S Base Komplexes durch die Deletion der KEKE Region in Rpn2 hindeuten. Dies zeigt sich tatsächlich bei Behandlungen des isolierten 26S Proteasoms
Die leichte Veränderung im Sedimentationsverhalten der ATPase Rpt6 in Glyceroldichtegradienten mit Lysaten von ΔNLS rpn2-HA exprimierenden Zellen im Vergleich zu Lysaten aus Rpn2- HA exprimierenden Zellen (Abb. 28) ist konsistent mit dem in den Glycerolgradienten mit srp1-49/ Srp1 Lysaten beobachteten Effekt. Offenbar kommt es durch das Fehlen der NLS in Rpn2 unter restriktiven Bedingungen zu einem Anstau von Rpt6 enthaltenden Komplexen, die geringfügig langsamer sedimentieren als Rpt6 enthaltende Komplexe im vergleichbaren Experiment mit wt Lysaten. Unter Berücksichtigung der Lokalisation der ΔNLS rpn2 Untereinheit in der indirekten Immunfluoreszenz im Cytoplasma, die unter den gleichen Bedingungen durchgeführt wurde wie der Glyceroldichtegradient, scheint die Rpn2 NLS zumindest unter restriktiven Bedingungen für die korrekte Lokalisation des 19S Base notwendig zu sein (vgl. Abb. 27). Die Deletion der Rpn2 NLS kann unter diesen Bedingungen nicht mehr durch die Anwesenheit anderer Kernlokalisationssequenzen kompensiert werden. Leider kann aufgrund der Instabilität der HA Markierung an ΔNLS rpn2-HA keine Aussage über ein verändertes Sedimentationsverhalten dieser Untereinheit getroffen werden, da die Signalstärke im Western Blot nicht mit der von Rpn2- HA vergleichbar ist. Die exakte Größe und Zusammensetzung des im Cytoplasma angereicherten Komplex lässt sich anhand der Ergebnisse dieser Arbeit nicht ableiten. Aufgrund der Verteilung der 19S Untereinheiten im Glycerolgradienten lässt sich jedoch aussagen, dass der cytoplasmatische Komplex nicht langsamer sedimentiert als 19S Base und Lid Komplexe.
Die Far Western Analyse der 19S Base Komplexe aus Stämmen deren NLS in Rpn2 oder Rpt2 deletiert sind, zeigt eindeutig, dass wenigstens in diesem Subkomplex mehrere Karyopherin α bindende Domänen vorhanden sind. In den 19S Lid Untereinheiten konnten mit dieser Methode allerdings keine Kernlokalisationssequenzen nachgewiesen
Eine Abhängigkeit der 20S Proteasomen Biogenese vom Kernimport der 19S regulatorischen Partikel konnte in dieser Arbeit nicht festgestellt werden. Wie Abb. 26B zeigt, ist weder die Prozessierung von Pro β5 noch von Pro β7 unter Bedingungen, bei denen 19S Komplexe im Cytoplasma angereichert werden, beeinträchtigt. Diese Beobachtung ist in Übereinstimmung mit der Annahme, dass halbe Kernpartikel im Zellkern mit Blm3 assoziieren und unter Anwesenheit dieses Proteins koordiniert maturieren (Fehlker et al., 2003). Der 19S Regulatorkomplex bindet erst an reifes 20S Proteasom, so dass die Biogenese des 20S Proteasoms aber nicht die Assoziation der im Kern lokalisierten 26S Proteasomen unabhängig von der Lokalisation der 19S Komplexe ist.
Die mit srp1-49 durchgeführten Untersuchungen deuten darauf hin, dass 19S Lid und Base unabhängig in den Kern transportiert werden. Im wesentlichen basieren diese Vermutungen jedoch auf dem im Glyceroldichtegradienten gezeigten Sedimentationsverhalten einzelner 19S Untereinheiten. Auch wenn die Abgrenzung zwischen aufgereinigtem 19S Base und 19S Regulatorkomplex im Glycerolgradienten gut ausgemacht werden kann, muss beachtet werden, dass in Glycerolgradienten aus Zelllysaten alle in der Zelle vorhandenen, bekannten oder nicht bekannten Subpopulationen des 19S Komplexes aufgetrennt werden und sich auch überlagern können. Eine wirklich befriedigende Antwort auf die Frage der Zusammensetzung des Transportkomplexes kann im Prinzip nur erreicht werden, wenn eine Coimmunpräzipitation dieser 19S Subpopulation mit Karyopherin α/β gezeigt werden kann und dieser Komplex in ausreichenden Mengen vorhanden ist, um alle interagierenden Proteine zu charakterisieren. Da die Verbindung zwischen Kerntransportern und Substrat
Um zu klären, ob der 19S Regulator als gesamter Komplex oder nur in Subkomplexen an Karyopherin α/β binden kann, müssten in vitro Bindungsstudien durchgeführt werden. Leider konnte während der Dauer dieser Arbeit kein funktionsfähiger Ansatz gefunden werden, der eine vertrauenswürdige Bindung der Transportrezeptoren Karyopherin α/βzum 19S Regulator bzw. zu dessen Subkomplexen in vitro rekonstituieren ließe. Alle Kontrollen, die zu den in der Literatur beschriebenen Kernimportuntersuchungen etabliert worden sind, stellten die Aussage der Rekonstitutionsversuche in Frage.
Die sehr interessante Frage, ob nur 19S regulatorische Komplexe in den Zellkern transportiert werden, die neu entstehen, oder ob 19S Komplexe generell zwischen Cytoplasma und Zellkern hin und her transportiert werden können, konnte bisher nicht geklärt werden. In Analogie zur Kernimport verknüpften Biogenese von 20S Proteasomen, scheint es naheliegend, dass lediglich neu entstehende 19S Komplexe in den Zellkern transportiert werden müssen. Ein Nachweis für diese These ist jedoch schwierig, da im 19S Komplex keine zu prozessierenden Untereinheiten existieren, die verschiedene Biogenesestadien kennzeichnen würden und da somit eine Trennung der neu synthetisierten Komplexe von bestehenden 19S Komplexen nahezu unmöglich ist. Insbesondere die Kopplung der Biogenese mit dem Kerntransport ist schwer nachweisbar, da möglicherweise nur strukturelle Umlagerungen im 19S Komplex zu einer Unterscheidung zwischen reifen und maturierenden 19S Regulatoren führen und zur Erkennung oder Maskierung der NLS beitragen. Für zukünftige Arbeiten wäre es deshalb sehr hilfreich eine verbesserte biochemische Trennung der einzelnen 19S Subkomplexe innerhalb der Gesamtpopulation zu erreichen sowie exakte strukturelle Daten über diesen Komplex zu erhalten. Die bei 20S Proteasomen und deren Vorläuferkomplexen erfolgreich angewendete Methode der nativen Elution der Komplexe mit Hilfe einer Strep- Tag II Markierung und deren Auftrennung in der Nativ- Gelelektrophorese ließ sich bei 19S Regulatoren nicht anwenden, da weder Rpn1-GFP-S noch Rpn11-GFP-S Untereinheiten des 19S Komplexes copräzipitieren (nicht gezeigt). Diese Markierung
Über den biologischen Sinn der nukleären Lokalisation von 19S Komplexen sowie 20S Proteasomen kann nur spekuliert werden. Die naheliegenste Erklärung ist, dass im Zellkern funktionelle 26S Proteasomen benötigt werden, um die Vielzahl der dort vorhandenen proteasomalen Substrate, wie Transkriptionsfaktoren, Tumor Suppressor Proteine oder Cycline, abzubauen. Insbesondere Prozesse, die die Chromosomen Erhaltung (chromosome maintenance), die DNA Reparatur (DNA repair), die Transkriptionsaktivierung und den Zellzyklus steuern, werden vom Ubiquitin- Proteasomen System reguliert (zusammengefasst in McBride et al., 2003). Da bereits mehrfach eine Assoziation von ribosomalen Protein und Ribosomen interagierenden Proteinen mit Proteasomen beschrieben wurde (Verma et al., 2000; Nop1: Tone und Toh-e (2002); Sum1: Dunand- Sauthier et al., 2002) und durch Studien mit Mutationsstämmen eine genetische Verbindung zwischen Ribosomen und Proteasomen postuliert wurde (Gerlinger et al., 1997), sind 26S Proteasomen im Zellkern möglicherweise für den Abbau einiger der ca. 60 trans aktiven Proteine in der Ribosomenbiogenese verantwortlich. Vornehmlich im Zellkern bietet sich ein breites Spektrum an kurzlebigen Proteinen, die sehr effizient vom Ubiquitin- Proteasomen System vernichtet werden müssen, um das Überleben der Zelle zu garantieren. Einige Komponenten des für die Markierung der Substrate benötigten Ubiquitin Systems, wie zum Beispiel das Ubiquitin aktivierende Enzym UBA1 oder das F-box Protein Cdc4, sind ähnlich in der Zelle verteilt wie 26S proteasomale Untereinheiten und damit auch im Zellkern lokalisiert (Huh et al., 2003). Für das S. cerevisiae Zellzyklusprotein Far1 sowie die Xenopus Proteine p27 und MyoD konnte tatsächlich die Degradation im Zellkern bewiesen werden. Die Untersuchung des proteasomalen Abbaus von p53, β- Catenin und p27Kip1 in Mammalia Zellen hat allerdings erbracht, dass diese Proteine abhängig vom nukleären Export degradiert werden und demnach nicht im Zellkern abgebaut werden (zusammengefasst in Glickman und Ciechanover, 2002). Sowohl die Kernexport abhängige als auch die nukleäreDegradation von Proteinen scheint damit die Stabilität von proteasomalen Substraten zu regulieren.
Eine vom 20S Proteasomen unabhängige Funktion des 19S Partikels im Zellkern kann nicht ausgeschlossen werden. Auch wenn die meisten biochemischen Nachweise auf eine weitgehende Assoziation von 19S und 20S Komplex schließen lassen, existiert bisher kein einfach handhabbarer Nachweis für die 19S Aktivität. Vom 20S Proteasomen unabhängige 19S Aktivität kann in vivo nicht gemessen werden. So ist denkbar, dass 19S Regulatoren in vivo Chaperon ähnliche Aktivität zeigen und - wie in vitro Daten belegen - denaturierte Proteine reaktivieren können (Braun et al., 1999). Auch eine Kontrollfunktion für die Ubiquitinierung von Proteinen könnte insbesondere den bisher funktionell kaum charakterisierten19S Lid Untereinheiten beigemessen werden. Die frappierende strukturelle Homologie dieses Subkomplexes zu COP9 Signalosomen könnte auf eine Ähnlichkeit in den regulatorischen Funktionen der Komplexe hindeuten (Kapelari et al., 2000).
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, dass 19S regulatorische Komplexe des 26S Proteasoms in S. cerevisiae durch Karyopherin α/β abhängigen Import in den Zellkern gelangen. Es sind drei 19S Base Untereinheiten identifiziert worden, die Karyopherin α bindende Kernlokalisationssequenzen tragen (Rpn2, Rpt2, Rpt6). Unterschiede in der Relevanz der einzelnen Kernlokalisationssequenzen für den Import von 19S Komplexen in den Zellkern konnten
Herrn Professor Dr. Peter- M. Kloetzel möchte ich für die Möglichkeit, diese Arbeit am Institut für Biochemie der HU Berlin/ Charite anzufertigen, danken.
Mein besonderer Dank gilt Frau Dr. Cordula Enenkel für die wissenschaftliche Betreuung.
Ein herzliches Dankeschön an alle Mitarbeitenden der Arbeitsgruppe Kloetzel sowie an alle Mitarbeitenden des Instituts für Biochemie der HU Berlin/ Charite für die freundliche Aufnahme und Kooperation.
Andrea Lehmann danke ich für die exzellente technische und persönliche Beratung in vielen kniffligen Laborangelegenheiten sowie für den Spaß......
Vielen Dank auch an Dr. Roland Beckmann und seine Mitarbeiter, die bei angenehmen und anregenden Frühstücksdiskussionsrunden meinen Horizont erweitert haben.
Ich danke auch ganz besonders den Menschen, die mir außerhalb des Instituts die nötige seelisch- moralische Unterstützung gegeben haben, um diese Arbeit zu Ende zu bringen. In erster Linie geht dieser Dank an Martina Meyer und Nicole Knobloch sowie an meine Familie und FreundInnen.
Dr. Ing. Thomas Polakowski gilt mein Dank für hilfreiche Diskussionen und das leidige Korrekturlesen der Arbeit.
P e r s ö n l i c h e A n g a b e n
Geburtstag: 09. Mai 1972
Geburtsort: Gehrden (Hannover)
A u s b i l d u n g
Institut für Biochemie, Charité, HU Berlin
Dissertation im Rahmen des Forschungsprojektes „Adressierung von 26S Proteasomen“: Nukleärer Import von 19S regulatorischen Komplexen in der Hefe S. Cerevisiae
BetreuerIn: Dr. Cordula Enenkel, Prof. P.-M. Kloetzel
TU Berlin
Abschluß zur Diplom- Ingenieurin im August 1998, Note: gut. Diplomarbeit im Februar 1998 an der TU Berlin mit dem Thema: "Die Spalthefe Schizosaccharomyces pombe als Expressionssystem für Membranproteine am Beispiel des humanen Transferrinrezeptors". Abschlussnote: sehr gut.
BetreuerIn: PD Dr. Christine Lang, Prof. U. Stahl
Gehrden
Abiturnote: 1,8
B e r u f s e r f a h r u n g
TU Berlin
Wissenschaftliche Mitarbeiterin: „Mikrobiologie und Enzymatik der mikrobiellen Eliminierung von Dichlordiisopropylether“; Sonderforschungsbereich 193
TU Berlin
Tätigkeit als studentische Hilfskraft auf dem Gebiet der mikrobiellen, reduktiven Dechlorierung von Trichlorbenzolen in Abwasser; Ergebnisse gehen ein in:
Adrian, L., U. Szewzyk, J. Wecke and H. Gorisch (2000). "Bacterial dehalorespiration with chlorinated benzenes." Nature 408(6812): 580-3.
Wageningen Agricultural University, Niederlande
Studienarbeit im Mai 1995 mit dem Thema: "Ectopic Recombination in Aspergillus nidulans". Abschlussnote: 1,7
Mikrobiologische Entwicklung Charlottenburg
Berlin
Industriepraktikum im Rahmen des Studiums
Wendler, P., Lehmann, A. Janek, K., Baumgart, S. und Enenkel, C. (2004). The bipartite nuclear localisation sequence of Rpn2 is required for nuclear import of proteasomal base complexes via karyopherin αβ and proteasome functions. J Biol Chem (in press).
Fehlker, M., Wendler, P., Lehmann, A. und Enenkel, C. (2003). Blm3 is part of nascent proteasomes and is involved in a late stage of nuclear proteasome assembly. EMBO Rep4(10): 959-63.
Hauck, R., Adrian, L., Wendler, P., Amidjojo, M., Hegemann, W. und Gorisch, H. (2001). Transformation of 2,2'-dichlorodiisopropyl ether in mixed and pure culture. Appl Microbiol Biotechnol56(3-4): 491-5.
Auszeichnung der Diplomarbeit mit dem Biotechnica Preis 1999
Hiermit erkläre ich, die Dissertation selbständig und ohne unerlaubte Hilfe angefertigt zu haben.