Die Amplifikation von DNA Fragmenten erfolgt entweder ausgehend von aufgereinigter Vektor DNA oder chromosomaler S. cerevisiae DNA als Vorlage. Alle Oligonukleotide werden bei Biotez, Berlin bestellt. In einem PCR Ansatz werden 1µl DNA, 10µl 10x PCR Puffer mit MgCl₂ (Roche, Mannheim), 0,8µl 25mM dNTPs und jeweils 1µl sense und antisense Oligonukleotid Primer (50 pmol/µl) in einem 0,5ml Eppendorfgefäß mit sterilem H₂O auf 100µl Endvolumen aufgefüllt. 0,4µl Taq-Polymerase (Roche, Mannheim) werden erst unmittelbar vor Start der PCR Reaktion zum Ansatz gegeben. Die PCR Bedingungen ergeben sich aus einer einminütigen Denaturierung der Primer bei 95°C, gefolgt von 30 Amplifikationszyklen bestehend aus Denaturierung bei 95°C für 45 Sekunden, Primeranlagerung bei 45-50°C für 1 min und DNA Polymerisation bei 72°C für eine der Größe des zu amplifizierenden DNA Fragment angepassten Zeitspanne von ca. 1kb = 1min. Abschließend findet die Endpolymerisation aller amplifizierten DNA Fragmente bei 95°C, 5 min statt.

Jeweils 2µl des amplifizierten Fragments werden nach Angaben des Herstellers mittels TOPO TA Cloning^® Kit (Invitrogen) in den Vektor pCR 2.1^®- TOPO^®ligiert und sequenziert.

Die Extraktion von DNA aus Agarosegelstücken sowie die Reinigung von DNA nach Restriktionen erfolgt mit dem Qiaquick^® Gel Extraction Kit (Qiagen) gemäß Herstellerangaben.

Die Selbstligation dephosphorylierter Vektor- DNA Enden wird mittels Alkalischer Phosphatase, durch die Entfernung der Phosphatgruppe vom 5’ Ende des dsDNA Strangs, unterbunden. In einem Ansatz werden 44µl gereinigte DNA (ca. 0.5µg) mit 5µl 10 x Alkalische Phosphatase Puffer und 1µl Alkalischer Phosphatase (Boehringer Mannheim) vermischt und 30 min bei 37°C inkubiert. Es folgt eine Hitzeinaktivierung des Enzyms für 15 min bei 65°C.

Für die Ligation dephosphorylierter Vektoren mit DNA-Fragmenten (insert) beträgt das Verhältnis der molaren Massen beider DNA Moleküle 3:1, während für die Ligation phosphorylierter Vektoren ein Verhältnis von 1:3 zum Insert besteht. Im Ligationsansatz wird ca. 50 ng Vektor- DNA mit der entsprechenden Menge Insert- DNA, 2µl T4-DNA-Ligase (1.2 U, New England Biolabs) sowie 2µl 10x T4-DNA-Ligase Puffer zu einem Endvolumen von 20µl vereinigt und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert.

In einem analytischen Restriktionsansatz mit einem Endvolumen von 20µl sind nicht mehr als 1µg QIAGEN Mini Präp DNA, 2µl 10 x Restriktionspuffer, 0,2µl BSA (10 mg/ml;New England Biolabs, Schwalbach) und 0,5µl Restriktionsendonuklease (bis zu 10 U/µl) enthalten. In einem präparativen Restriktionsansatz mit einem Endvolumen von 300µl sind bis zu 20µg DNA, 30µl 10x Restriktionspuffer, 3µl BSA und 3µl Restriktionsendonuklease enthalten. Die Wahl des Inkubationspuffers ist abhängig vom verwendeten Enzym. Die Restriktion erfolgt bei 37°C für maximal 2 Stunden. Die Restriktionsendonukleasen wurden von den Firmen New England Biolabs (Schwalbach) oder Boehringer Mannheim bezogen.

Zur DNA Schnellaufarbeitung werden die Kolonien ü/N bei 37°C in 3ml LB+ Ampicillin Medium auf dem Rundschüttler bei 120 rpm in sterilen Reagenzgläsern angezogen. Die Plasmidisolation erfolgt gemäß Vorschrift mit dem Qiaprep^® Spin Miniprep Kit der Firma QIAGEN. Plasmid- DNA aus 1,5ml Kultur wird in 50µl Elutionspuffer aufgenommen.

Sehr kurze dsDNA Fragmente von 30 bis hinzu 150 bp können erzeugt werden, indem komplementäre Oligonukleotidstränge miteinander hybridisiert werden. In dem Hybridisierungsansatz werden jeweils 50µl Oligonukleotid (75µg/ml in H₂O) mit 10µl 1M NaCl vermischt und für 10 min bei 95°C erhitzt. Nach dem Abkühlen bei RT oder auf Eis kann die dsDNA in der Ligation eingesetzt werden. Der Anteil der hybridisierten Primer in der Annealingreaktion wird überprüft, indem ein Aliquot des Hybridisierungsansatzes in einer 5% igen Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennt wird.

DNA- Sequenzierungen werden von der Firma Agowa, Berlin durchgeführt. Dazu werden 50µl Vektor- DNA aus der Plasmidisolierung mit 1/10 Volumen 3M Na- Acetat pH 4,8 und 2,5fachem Volumen Ethanol versetzt und entweder sofort verschickt oder zuvor vollständig gefällt. Das heißt der Ansatz wird 30 min auf Eis inkubiert und die DNA anschließend durch Zentrifugation bei 14000xg 15 min pelletiert und getrocknet.

Die Auftrennung von DNA Molekülen erfolgt mit Hilfe der Agarose- Gelelektrophorese. Die Beweglichkeit der DNA Moleküle in der Agarosematrix ist abhängig von der Porengröße des Gels und damit von der Agarosekonzentration. Alle Gelelektrophoresen werden mit 0,8-4% igen Agarosegelen durchgeführt.

Für ein 1%iges Minigel (50ml) werden 0,5 g Seakem LE Agarose (Biozym, Hess. Oldendorf) in 50ml 1x TBE Laufpuffer (90mM Tris- Base, 90mM Borsäure, 2mM EDTA, pH 8,0) durch Aufkochen gelöst und auf ca. 60°C abgekühlt. Der Agarose werden 0,25µg/ml Ethidiumbromid (Applichem) zugesetzt und anschließend wird der Ansatz in einen Gelträger gegossen. Nach dem Erstarren wird das Gel in die Elektrophoreseapparatur (Biorad, München) überführt und die DNA Proben nach Zugabe von 1x Probepuffer (0,25% Bromphenolblau, 0,25% Xylen Cyanol FF, 10% Glycerol in 1x TBE) aufgetragen. Die Elektrophorese findet bei 150-200 V in 1 x TBE Laufpuffer für 10 min statt. Die Emission (λ_560nm) des in die DNA interkalierten Fluoreszenzmittels unter der Anregung von UV Licht (λ_300nm, Appligene UV Tisch) wird photographiert (Dokumentationssystem Intas, Göttingen). Zur Größenbestimmung der DNA Fragmente werden 0,5µg/ Spur 1kb ladder DNA Marker (Invitrogen) verwendet.

Um DNA Fragmente der Größe von 40-150 bp zu trennen, wird anstelle eines Agarosegels ein Polyacrylamid-Gel (PAA- Gel) verwendet. 50ml eines 5%igen PAA- Gels werden durch Mischen von 8,3ml einer 30%igen Acrylamidlösung (Vernetzungsverhältnis 29:1) mit 5ml 10xTBE- Puffer und der entsprechenden Menge H₂O hergestellt. Die Polymerisierung wird mit 500µl einer 10%igen APS Lösung und 33µl TEMED gestartet. Die Elektrophorese findet in 1x TBE Puffer für 2h bei 75V statt. Zur Größenbestimmung wird der 1kb Marker von Invitrogen verwendet.

5ml einer Hefekultur aus der logarithmischen Wachstumsphase werden abzentrifugiert (2000xg, 3min) und das Pellet wird in 0,5ml 1M Sorbitol aufgenommen. Zu der Suspension wird eine Spatelspitze Zymolyase 20T (ICN, Eschwege) gegeben und der Ansatz für 60 min bei 37°C inkubiert. Die Protoplastierung wird mikroskopisch kontrolliert. Die Protoplasten werden bei 600xgfür 5 min pelletiert und zügig in 0,5ml 50mM Tris- HCl, 20mM EDTA (pH 7,4) und 0,05ml 100g/L SDS aufgenommen. Das Lysat wird schnell in ein Wasserbad überführt und bei 65°C unter gelegentlichem Schütteln für 30 min inkubiert. Anschließend werden 0,2ml einer 5M Kaliumacetatlösung zugegeben und der Ansatz für 60 min auf Eis gehalten. Die Proben werden bei 14000xg für 30 min zentrifugiert und der Überstand in ein mit 0,7ml Isopropanol gefülltem, neuem Eppendorfgefäß überführt. Die DNA wird für 5 min bei Raumtemperatur ausgefällt und anschließend für 10 s durch Zentrifugation bei 14000xg pelletiert. Das DNA Pellet wird in 300µl TE (10mM Tris- HCl pH 8,0, 1mM EDTA) mit 0,3µl RNAse A (Qiagen) versetzt resuspendiert, 10 min bei Raumtemperatur inkubiert und mit 30µl 3M Natriumacetat (pH4,8) und 0,2ml Isopropanol gemischt. Die DNA wird wiederum kurz abzentrifugiert und bei Raumtemperatur getrocknet. Abschließend wird die DNA in 100µl TE aufgenommen und bei –20°C gelagert.

Der zu transformierende E.coli Stamm wird über Nacht bei 37°C in 5ml LB-Medium angezogen. Eine Hauptkultur von 100ml LB wird mit 2ml der Vorkultur beimpft und für etwa 2h bei 37°C inkubiert. Das Wachstum der Zellen wird bei einer Wellenlänge von 600nm über die optische Dichte (OD) kontrolliert. Bei einer OD von 0,4 wird das Wachstum gestoppt indem die Kultur für 5 min auf Eis gekühlt wird und die Zellen werden anschließend bei 2000xg in sterilen Greiner Röhrchen 10 min abzentrifugiert. Das Pellet wird in 40ml eiskaltem, sterilfiltriertem TFB1 (100mM RbCl, 50mM MnCl₂, 30mM KAc, 10mM CaCl₂, 15% [v/v] Glycerol, ad pH 5,8 mit 0,2M Essigsäure) resuspendiert und 5 min auf Eis inkubiert. Nach erneutem Pelletieren der Zellen wird der Überstand sorgfältig entfernt und die E. coli in 4ml eiskaltem, sterilfiltriertem TFB2 (10mM MOPS, 10mM RbCl, 75mM CaCl₂, 15% [v/v] Glycerol, ad pH 6,5 mit KOH) aufgenommen. Abschließend werden die Zellen in 105µl Aliquots in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -70°C gelagert.

50µl kompetenter E.coli Zellen werden mit der zu transformierenden DNA vermischt und 15 min auf Eis inkubiert. Anschließend werden die Zellen für 2 min einem Hitzeschock von 42°C ausgesetzt und zügig in 0,5ml LB Medium aufgenommen. Zur Regeneration werden die E. coli 1 h bei 37°C inkubiert, bevor sie pelletiert und auf Selektivmedium ausplattiert werden. Die Inkubation erfolgt bei 37°C über Nacht.

Der zu transformierende S. cerevisiae Stamm wird über Nacht in 50ml YPD angezogen und bei einer Zelldichte von ca. 5x 10⁷ Zellen/ml steril abzentrifugiert (2000xg, 5 min). Das Zellpellet wird einmal mit 10ml eiskaltem, sterilem H₂O sowie einmal in 10ml eiskaltem 1M Sorbitol gewaschen und mit 1ml eiskaltem 1M Sorbitol in ein 1,5ml Eppendorfgefäß überführt. Nach kurzem Abzentrifugieren (30 Sekunden, 17900xg)wird das Zellpellet in 1 Vol eiskaltem 1M Sorbitol resuspendiert. 40µl dieser Zellsuspension werden für eine Elektroporation mit 2-5µl der zu transformierenden DNA in EQUIBIO Elektroporationsküvetten (2mm Elektrodenabstand, PeqLab, Erlangen) vermischt und 5 min auf Eis inkubiert. Die Elektroporation erfolgt bei 1500 V, 25 µF und 200 Ohm im Gene Pulser^® (Biorad, München). Sofort anschließend werden die Zellen in 1ml eiskaltem 1M Sorbitol aufgenommen, in ein Eppendorfgefäß überführt und kurz abzentrifugiert (30 Sekunden, 17900xg).Der Überstand wird bis auf ca. 100µl Sorbitol entfernt, das Zellpellet resuspendiert und auf Selektivmedium ausplattiert. Die Inkubation erfolgt für 3-5 Tage bei 28°C.

Die Insertion einer linearisierten DNA Sequenz erlaubt, essentielle Gene an ihrem 3´ Ende um eine beliebige Markierung zu verlängern (tagging) ohne das Gen dabei zu duplizieren. Dazu wird ein DNA Fragment, das die C- terminalen 200- 400 Basenpaare des zu markierenden Gens ligiert an die gewünschte Markierung, mindestens einen Selektionsmarker sowie eine beliebige 200-400 Basenpaare umfassende DNA Sequenz abwärts des zu markierenden Gens trägt, in Wildtyp Zellen eingebracht. Mittels homologer Rekombination zwischen 5´ bzw. 3´Bereich des DNA Fragments und den homologen Sequenzen des chromosomalen Genlocus findet bei Selektion auf das eingebrachte Markerprotein die Insertion des DNA Fragments statt. Die zur Herstellung der in dieser Arbeit verwendeten, linearisierten DNA Fragmente notwendigen Klonierungsschritte sowie die verwendeten Gene, Markierungen und selektierbaren Marker sind in Abb.7 und 8 dargestellt. Da es nicht zu einer Integration der eingeführten DNA kommt, sondern der Bereich zwischen den homologen Rekombinationsstellen ersetzt wird, werden mit dieser Technik keine DNA Bereiche dupliziert. Wird anstelle des DNA Fragments ein linearisiertes, integratives Plasmid eingesetzt, gibt es nur einen Bereich an dem die homologe Rekombination stattfindet und das gesamte Plasmid integriert am chromosomalen Genlocus ins Genom.

Abb. 7: Insertion linearisierter DNA Fragmente durch homologe Rekombination. Das SacI/XhoI linearisierte Genfragment (1) wird mittels homologer Rekombination in den chromosomalen Genlocus von Rpn11 insertiert. Weitere in dieser Arbeit verwendete Markierungen und Gene sind in grauer Schrift angezeigt. Die zur Herstellung des Fragments notwendigen Klonierungsschritte verlaufen über pBSFlu (6), pBSFluRpn11HA (5), pBSFluRpn11GFPHA (4), pBSHU (7), pBSHURpn11-3´ (3) und pBSHURpn11GFPHA (2).

Abb. 8: Struktur des RPN11-HA-TEV-ProA::URA3::HIS3 Fragment (1), das mit SacI/ XhoI linearisiert wird und mittels homologer Rekombination in den chromosomalen Genlocus von Rpn11 insertiert wird. Die zur Herstellung des Fragments notwendigen Klonierungsschritte verlaufen über pBSFluRpn11HA (4), pBSFluRpn11HATEVProA (2) und pBSHURpn11-3´ (3). Das NdeI/ XbaI Fragment (5), das für die TEV Schnittstelle und die zwei IgG bindenden Domänen codiert, wird mit Hilfe entsprechender Primer aus pZZ-HIS5 amplifiziert.

Potentielle NLS aus Rpt2, Rpt1 und Rpn2 sowie die Kontroll- NLS des SV40 T-Antigens und deren mutierte Variante werden mit GFP und dem Strep- tag II (S) fusioniert (Abb. 9). Der N- terminale Bereich von Rpt2 wird mittels PCR amplifiziert und über die HindIII und KpnI Schnittstellen in pYESGFPS ligiert. Alle anderen Konstrukte werden als komplementäre Oligonukleotidstränge miteinander hybridisiert und an den Restriktionsschnittstellen für HindIII und KpnI in den linearisierten pYESGFPS Vektor ligiert. Alle Konstrukte werden durch Sequenzierung der DNA überprüft. Die Transkription findet unter Kontrolle des GAL1 Promotors (PGAL1) und der Terminationssequenz CYC1 (TTCYC1) vom episomalen Vektor pYES statt.

Abb. 9: Potentielle cNLS der 19S Untereinheiten Rpt2 (1), Rpn2 (2) und Rpt1 (3) sowie die funktionelle SV40 NLS (4) und die mutierte SV40 NLS (5) werden wie abgebildet als GFP Fusionsprotein mit Strep- tag II Markierung (S) exprimiert.

Abgesehen von der Hefeprotein Schnellaufarbeitung nach Yaffe und Schatz, 1984 werden Hefezellen je nach den Anforderungen der darauffolgenden Anwendungen in einem Puffersystem mit oder ohne ATP und MgCl₂ aufgearbeitet. Der ATP enthaltende Puffer A nach Saeki et al. (2000) besteht aus 50mM Tris- HCl (pH 7,5), 0,5mM EDTA (pH 7,75), 100mM NaCl, 10% Glycerol, 0,5mM Dithiothreitol, 2mM ATP, 10mM MgCl₂, 20 U DNAseI (Roche, 10U/µl), EDTA free Complete Protease Inhibitor cocktail (Roche) und 0,25mM Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF). Der PB Puffer ohne ATP enthält 20mM Tris- HCl (pH 7,5), 150mM NaCl, 0,25mM PMSF, 20 U DNAseI sowie 10% Glycerol.

Die Fällung nativer Proteine erfolgt durch Zugabe von 1/10 Vol 72% (w/v) TCA sowie 1/10 Vol 0,15% (w/v) Natriumdesoxycholat bei 4°C für 20 min. Zum Einengen werden die Proteine 15 min bei 17900xg zentrifugiert. Das Pellet wird einmal mit 100% Aceton gewaschen und in 1x Proteinprobenpuffer resuspendiert.

Proteinkonzentrationen werden mit Hilfe des Protein Assay Konzentrats von Biorad (München) nach Bradford (1976) bestimmt. Die Verdünnung des Bradford Reagenz und der Probe erfolgen nach Herstellerangaben. Die Komplexierung von Protein mit Coomassie Blue G250 wird nach 15 min Inkubation bei Raumtemperatur anhand der Extinktion bei 595nm im Photometer (UltraspecIII, Pharmacia) gegen einen Nullwert gemessen. Zur Erstellung einer Eichkurve werden BSA Lösungen definierter Konzentrationen (1-10µg/ml) verwendet.

Die Auftrennung von Proteinen nach ihrem Molekulargewicht erfolgt durch SDS PAGE (Sodiumdodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis) nach Laemmli (1970). Standardmäßig werden 0,75mm dicke Gele mit einer Lauflänge von ca. 6 cm in dem Protean- Mini II sowie III System von Biorad verwendet. Für zwei 12% ige Trenngele werden 4ml 30% ige Acrylamidlösung (Vernetzungsverhältnis 37,5:1; Applichem), 2,5ml 1,5M Tris- HCl pH 8,8, 100µl 10% w/v SDS und 3,5ml H₂O mit 50µl 10% Ammoniumpersulfatlösung (APS) und 5µl N,N,N´,N´- Tetramethylethylendiamid (TEMED) vermischt und zügig in die Gelkammern gegossen. Zur Herstellung zweier 4% iger Sammelgele werden 650µl 30% Acrylamid, 1,25ml 0,5M Tris- HCl pH 6,8, 50µl 10% w/v SDS, 3,05ml H₂O, 25µl 10% APS sowie 5µl TEMED vermengt. Die elekrophoretische Auftrennung erfolgt in 1x Laufpuffer ( 25mM Tris; 192mM Glycin; 0,1% w/v SDS) für ca. 45 min bei 200 V. Als Proteingrößen- Marker dient entweder der Rainbow^TM Proteinmarker (Amersham) mit den Proteinen der Größen 200 kDa, 97,4 kDa, 69 kDa, 46 kDa, 30 kDa, 21,5 kDa und 14,3 kDa oder der low range Marker (NEB) mit Proteinen der Größen 175 kDa, 83 kDa, 62 kDa, 47,5 kDa, 32,5 kDa, 25 kDa, 16,5 kDa und 6,5 kDa.

Das Gel wird in die Färbelösung (0,2% [w/v] Coomassie- Brilliant- Blue R250, 30% [v/v] Methanol und 10% [v/v] Essigsäure in H₂O; zuerst Farbstoff in Methanol über Nacht lösen) kurz in der Mikrowelle aufgekocht und für ca. eine Stunde bei Raumtemperatur abgekühlt oder über Nacht gefärbt. Zur Entfärbung wird das Gel entnommen und in mehrfach gewechselter Entfärbelösung (45% [v/v] Methanol, 10% [v/v] Essigsäure in H₂O) solange entfärbt, bis der nicht proteingebundene Farbstoff entfernt ist. Um die Gele zu konservieren werden sie zwischen Geltrocknungsfolie (Promega), die von Geltrocknungspuffer (40% [v/v] Methanol, 7,5% [v/v] Essigsäure, 10% [v/v] Glycerol) durchnässt ist, in eine Geltrocknungsapparatur gespannt und für 3-4 Tage getrocknet.

Zunächst werden die Proteine mittels Nass- Blot- System (Biorad) oder Semi- dry- blotting Apparatur (PeqLab) nach einer SDS- PAGE auf Nitrocellulose (NC)- Membran (Optitran BA-S, Schleicher & Schuell) transferiert. Das Nass- Blot- System wird nach Angaben des Herstellers luftblasenfrei und mit jeweils drei Lagen 3MM Whatman Papier zwischen Blotschwämmen und dem Gel-/ NC-Membran Sandwich zusammengebaut. Der Proteintransfer aus dem Gel erfolgt in Transferpuffer (12,5mM Tris, 95mM Glycin, 0,1% SDS, 20% [v/v] Methanol) für eine Stunde bei 70 V und ca. 300 mA bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 25 V und ca. 75 mA bei 4°C. Im Semi- dry- blotting System werden drei Lagen 3 MM Whatman Papier gefolgt von NC Membran, Gel, und weiteren drei Lagen Whatman Papier blasenfrei auf die Graphit Anode geschichtet und nachdem die Kathode aufgelegt ist, wird mit einer Stromstärke von ca. 2 mA/ cm² Filterfläche für eine Stunde geblottet. Anschließend wird der Proteinmarker auf der Membran mit Kugelschreiber nachgezeichnet und der Blot zur Kontrolle der Effizienz des Proteintransfers in Amidoschwarzlösung (30% [v/v] Methanol, 10% Essigsäure, 0,1% Amidoschwarz) angefärbt und nicht gebundener Farbstoff mit H₂O abgespült.

Für die Immunfärbung wird der Western Blot für 30 min in 5% w/v Magermilchlösung bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert und anschließend über Nacht in dem gegen das zu detektierende Protein oder Peptid gerichtetem Primär- Antikörper in 5% w/v Magermilchlösung bei 4°C schüttelnd inkubiert. Der Blot wird bei Raumtemperatur dreimal für ca. 15 min in TST (50mM Tris- HCl pH 7,4, 150mM NaCl, 0,1% Tween 20) gewaschen und mit dem gegen den Primär- Antikörper gerichteten Sekundär- Antikörper in 5% w/v Magermilchlösung für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. In der Arbeit verwendete Primär- und Sekundär- Antikörper sind in Tab.6 zusammengefasst. Die sekundären Antikörper- Peroxidase- Konjugate werden in der Chemolumineszenz Detektion sichtbar gemacht. Dazu wird der Blot für eine Minute in ca. 20ml ECL Reagenz (100mM Tris pH 8,5; 1,25mM Aminophtalhydrazide (Luminol, Fluka), 0,2mM Coumarinsäure; 0,01% H₂O₂) bei Raumtemperatur inkubiert und danach luftblasenfrei in durchsichtige Folien gelegt. In einer Expositionskassette wird ein UV- Film (X-OMAT UV Film, Kodak) auf den Blot gelegt und der Film exponiert (maximal 5 Minuten). Die Entwicklung des Films erfolgt in der Entwicklermaschine CAWOMAT 2000 IR (CAWO GmbH).

Primäre Antikörper

Spezies

Eingesetzte Verdünnung

Referenz

anti- HA.11 16B12

Maus

1:1000

Babco

anti- Pre2/ β5

Kaninchen

1:1000

Heinemeyer et al., 1997

anti- Cim3/ Rpt6

Kaninchen

1:5000

Ghislain et al., 1993

anti- GFP

Kaninchen

1:500

Clontech

anti- Karyopherin α

Kaninchen

1:3000

Enenkel et al., 1995

anti- Karyopherin β

Kaninchen

1:3000

G. Blobel

anti- Ubiquitin

Kaninchen

1:3000

DAKO

anti- Rpt2 (human)

Kaninchen

1:500

PW8305, Affiniti

Sekundäre Antikörper

Spezies

Eingesetzte Verdünnung

Referenz

anti- Kaninchen IgG- POD

Ziege

1:10000

DIANOVA

anti- Maus IgG- POD

Kaninchen

1:10000

DIANOVA

Tab. 6: Im Western Blot verwendete primäre und sekundäre Antikörper

10µl einer Dichtegradientenzentrifugationsfraktion oder eines verdünnten Zelllysats wird mit 100µl Substratpuffer (50mM Tris- HCl pH 7,5; 5mM MgCl₂; 0,05mM Peptidsubstrat) werden in 96-Loch- Mikrotiterplatten (Greiner) vermischt und für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Bei Aufarbeitungen unter Anwesenheit von ATP enthält der Substratpuffer ebenfalls ATP in einer Konzentration von 2mM. Werden die Aktivitäten mehrerer Gradienten verglichen, findet die Messung in der gleichen Mikrotiterplatte statt. Als fluorogene Substrate werden Z- leu- leu- glu- β Naphthylamid (Bachem) und Z- leu- leu- glu- 7- amino- 4- methyl- Coumarin (Calbiochem) als Test auf PGPH (peptyl- glutamyl- peptide bond hydrolyzing)- Aktivität sowie Suc- leu- leu- val- tyr- 7- amino- 4- methyl- Coumarin (Bachem) als Test auf chymotrypsinähnliche Aktivität des Proteasoms verwendet. Die Fluoreszenz der abgespaltenen fluorogenen Gruppen wird im Fluorostar Fluorimeter (SLT) mit Easy Software bei einer Anregungswellenlänge von 390nm bzw. 355nm und einer Abstrahlungswellenlänge von 460nm bzw. 405nm für die Abgangsgruppen 7-amino-4-methyl Coumarin (AMC) bzw. β- Naphthylamid gemessen.

Die in Dichtegradienten aufgetrennten Lysate stammen vorwiegend aus Zellaufschlüssen unter flüssigem Stickstoff. 10-40% ige Glycerolgradienten werden im Gradientenmischer aus 5,7ml 10% iger Glycerollösung (10% [v/v] Glycerol in PB oder Puffer A) und 5,9ml 40% iger Glycerollösung (40% [v/v] Glycerol in PB oder Puffer A) in TH-641 oder SW40 Zentrifugenröhrchen (Beckman) vom Grund des Zentrifugenröhrchens gegossen. Der Gradient wird mit maximal 800µl Zelllysat überschichtet und für 16 Stunden bei 40.000 rpm im SW40 Rotor (Beckman) oder im TH-641 Rotor (Sorvall) bei 4°C zentrifugiert. 600µl Fraktionen werden von der Öffnung des Röhrchens beginnend abpipettiert und auf Eis gehalten. Soll die relative proteasomale Aktivität gemessen werden, wird aus allen Fraktionen der Proteingehalt nach Bradford sowie die Proteaseaktivität gegen das entsprechende fluorogene Substrat bestimmt. Aus dem Rest der Fraktion werden die Proteine über TCA ausgefällt und mittels SDS PAGE und Westernblot Analyse untersucht.

NLS enthaltende Proteine werden mit Hilfe der Far Western Analyse mit Karyopherin α- ProA als Bindungspartner detektiert. Dazu werden MFY Zellen aus der logarithmischen Wachstumsphase unter Verwendung von Puffer PB mit EDTA freiem Complete Protease Inhibitor Cocktail (Roche) in der French Pressure Cell aufgeschlossen. Die Zellreste werden entfernt (14000xg, 20 min) und das Lysat in flüssigem Stickstoff und anschließend bei –80°C bis zum Gebrauch tiefgefroren. Proteine oder Proteinkomplexe, die in der Far Western Analyse untersucht werden, werden im SDS PAGE Verfahren aufgetrennt und im Semi- dry- blot Verfahren unter Verwendung von Aminocapronsäurepuffer (10mM Aminocapronsäure, 10% Methanol) auf PVDF- Membran transferiert. Die PVDF- Membran wird vor dem Transfer in 100% Methanol aktiviert. Ohne vorherige Amidoschwarzfärbung wird der Blot direkt nach dem Transfer in Renaturierungspuffer (50mM HEPES pH 7,3; 100mM KOAc; 5mM MgOAc; 0,3% Tween; 0,5% BSA) bei 4°C über Nacht inkubiert. Die Membran wird für 30 Minuten in Blocking- Lösung (5% Magermilchpulver in PBST [80g/L NaCl; 2g/L KCl; 14,4g/L Na₂HPO₄; 2,4g/L KH₂PO₄; pH 7,4 mit HCl; 0,1% v/v Tween20]) bei Raumtemperatur geschwenkt. Werden NLS-GFPS Konstrukte untersucht erfolgt anschließend eine Inkubation in 10ml Blocking- Lösung die 20% CEY1b Lysat enthält, während bei der Untersuchung von Kernlokalisationssequenzen in 19S proteasomalen Untereinheiten 100% CEY1b Lysat verwendet wird. Als Kontrolle werden identisch behandelte Membranen in 10ml Blocking- Lösung mit 10µg Protein A inkubiert. Nach der Inkubation für 4 Stunden bei 4°C werden die Membranen dreimal 15 Minuten in PBST gewaschen, anschließend für eine Stunde in 5% Magermilchpulver mit Peroxidase gekoppeltem anti- Maus IgG Antikörper (1:10000) bei Raumtemperatur geschwenkt und danach wiederum dreimal 15 Minuten in PBST gewaschen. Mittels ECL Detektion werden NLS beinhaltende Proteine, die an Karyopherin α- ProA gebunden sind, nachgewiesen.

Für die in vivo Lokalisation fluoreszenter Proteine werden die Zellen aus Selektivmedium soweit nicht anders angegeben bis zur frühen logarithmischen Wachstumsphase in YPD bei 28°C oder 37°C angezogen, einmal mit sterilem Wasser gewaschen und bis zur Mikroskopie auf Eis gehalten.

In der Fluoreszenzmikrokopie wird das Leica DMR Mikroskop mit Quecksilberlampe HBO 50 W (Osram) und einem 100 x Ölimmersions- Objektiv (PL Fluotar) mit einer maximalen numerischen Appertur von 1,4 verwendet. Die für das jeweilige Fluorophor benutzten Filterblöcke sind in Tab. 7 zusammengefasst. Die Dokumentation erfolgt mit der Hamamatsu C5985 CCD Kamera in Verbindung mit der MetaVue Software (Visitron Systems, Puchheim) bei identischen Belichtungszeiten für alle Aufnahmen (2 sec, 2 fach gain). Zur Bestimmung der Pixelintensität von Rpn1-GFP und Rpn11-GFP in srp1-49 und SRP1 Zellen wird in Aufnahmen gleicher Belichtungszeit mit Hilfe des MetaVue Systems eine quadratische Fläche von etwa der Größe eines Fünftels des Zellkerns im Zytoplasma sowie im Zellkern gewählt und die durchschnittliche Pixelintensität dieser immer gleich großen Flächen berechnet. Mindestens 20 cytoplasmatische und nukleäre Werte von verschiedenen Aufnahmen werden gemittelt und das Verhältnis der Pixelintensitäten dieser Mittlungen für jeden Stamm berechnet, indem der Quotient aus der durchschnittlichen cytoplasmatischen und der durchschnittlichen nukleären Pixelintensität gebildet wird.

Fluorophor

Wellenlänge (λmax)

Wellenlänge Filterblock

Filterblock

EGFP

488nm Exitation

507nm Emission

495nm Exitation
425nm Emission

FITC/ L4

ECFP

433nm Exitation

475nm Emission

440nm/ 20nm Exitation

480nm/ 30nm Emission

CFP

EYFP

513nm Exitation

527nm Emission

500nm/ 25nm Exitation
545nm/ 35nm Emission

YFP

Cy3™

552nm Exitation

568nm Emission

535nm/ 25nm Exitation
610nm/ 38nm Emission

Cy3™/ TRITC N2.1

DAPI

365nm Exitation

418nm Emission

340nm/ 80nm Exitation

425nm Emission

UV

Tab. 7: In der direkten und indirekten Fluoreszenzmikroskopie verwendete Filterblöcke

Für die indirekte Immunfluoreszenz werden ca. 100ml Zellen einer Zelldichte von ca. 1 x 10⁷ Zellen/ml pelletiert und zweimal in PBS gewaschen. Durch Inkubation in 1ml Formaldehydlösung (3,7% Paraformaldehyd in PBS) für 3 Minuten bei Raumtemperatur werden die Zellen fixiert und anschließend zügig abzentrifugiert, um sie in zweimal 10ml PBS zu waschen. Das Pellet wird in 1 Vol Protoplastierungspuffer (218,6g/L Sorbitol, 17,4g/L KH₂PO₄, 7,0g/L Citrat) aufgenommen und mit 1/10 vol Glusulase sowie 1/100 Vol 1% Zymolyaselösung (Zymolyase 20T [ICN] in Protoplastierungspuffer) versetzt. Der Ansatz wird 90 Minuten bei 37°C inkubiert und dabei mehrfach invertiert. Die Protoplasten werden dreimal in 1,1M Sorbitol gewaschen (5 min, 2000xg) und das Pellet anschließend in 200 Vol Protoplastierungspuffer resuspendiert. Je ein Tropfen Protoplastenlösung wird in jede Vertiefung eines 15 well multitest Objektträgers gegeben, der zuvor mit 0,1% Poly- L- Lysin Lösung (MW 400 kDa, Sigma) beschichtet wurde. Nach 3-5 Minuten wird der Überstand vorsichtig entfernt und der Objektträger für 5 min in eiskaltes, sauberes Methanol getaucht bevor er für 30 Sekunden in sauberem Aceton inkubiert wird. Zum Trocknen wird der Objektträger kurz an der Luft geschwenkt. Zum Blockieren unspezifischer Bindungsstellen wird in jede Vertiefung für 10 Minuten ein Tropfen einer 1% igen BSA (bovine serum albumin)- Lösung in PBS gegeben. Nach Entfernung der Lösung wird sofort die Primärantikörperlösung wie folgt aufgetragen und über Nacht bei 4°C in einer feuchten Kammer auf dem Objektträger inkubiert: für den Nachweis HA markierter Proteine wird mAb12CA5 (Boehringer Mannheim) in einer Verdünnung von 1:100 und für den Nachweis verschiedener Nukleoporine wird der mAB414 Antikörper in einer Verdünnung von 1:500 in 1% BSA/ PBS eingesetzt. Der Primärantikörper wird entfernt und alle Vertiefungen dreimal mit 1% BSA/ PBS gewaschen, wobei jeder Waschgang 2 min einwirken gelassen wird. Als Sekundärantikörper wird Cy3™ gekoppelter Esel anti Maus IgG Antikörper (1:100 Verdünnung in 1% BSA/ PBS, Dianova) für mAb12CA5 und FITC gekoppelter Ziege anti Kaninchen IgG für mAB414 Antikörper (1:50 Verdünnung in1% BSA/ PBS, R. Schekman, Berkeley) verwendet und für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Es folgen sechs Waschgänge in1% BSA/ PBS, wobei nach dem dritten Waschgang für 20 min DAPI (4,6- Diamino- 2- phenylindol) Färbelösung (1%) aufgetragen wird. Abschließend werden die Zellen in Moviol eingebettet und mit einem Deckglas abgedeckt. Die Mikroskopie erfolgt mit den in Tabelle beschriebenen Filterblöcken.