Präsident der Humboldt- Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Zusammenfassung

Das 26S Proteasom führt die letzen Schritte des essentiellen, Ubiquitin abhängigen Proteinabbaus durch, indem es ubiquitinierte und fehlgefaltete Proteine erkennt und eliminiert. Da es in S. cerevisiae während allen Stadien der Zellteilung vornehmlich im Zellkern lokalisiert ist, ist der Importweg dieses 2,5 MDa umfassenden proteolytischen Komplexes in den Zellkern von besonderem Interesse. Das 26S Proteasom unterteilt sich in das katalytisch aktive 20S Proteasom sowie den 19S Regulatorkomplex. Für 20S Proteasomen konnten Lehmann und Mitarbeitende (2002) zeigen, dass Vorläuferkomplexe über den Karyopherin α/β abhängigen Importweg in den Zellkern gelangen und dort zu 20S Proteasomen heranreifen. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass die nukleäre Lokalisation der 19S Regulatorkomplexe ebenfalls von Karyopherin α/β abhängt. Die Untersuchung der potentiellen klassischen Kernlokalisationssequenzen (cNLS) in den Untereinheiten des 19S Base Subkomplex ergab, dass Rpn2 und Rpt2 cNLS beherbergen, die Karyopherin α binden und in der Lage sind GFP Fusionsproteine in den Zellkern zu dirigieren, wenn diese in S. cerevisiae überexprimiert werden. Der C- terminale Bereich der ATPase Rpt1 ähnelt einer cNLS, zeigt aber nur geringe Bindung an Karyopherin α. Far Western Analysen bestätigen, dass ΔNLS rpn2 und ΔNLS rpt2 im Gegensatz zu Rpn2 und Rpt2 nicht mehr an Karyopherin α binden können und die Kernlokalisation der 19S Komplexe vom klassischen Importweg abhängig ist. Stämme, die eine cNLS Deletion in Rpn2 oder Rpt2 tragen, sind stark temperatursensitiv. Die Deletion der NLS in Rpn2 führt außerdem zu Canavanin Sensitivität und einer herabgesetzten 26S proteasomalen Aktivität. Des weiteren scheint die NLS in Rpn2 für die korrekte Lokalisation der 19S Komplexe kritischer zu sein als die in Rpt2, da 19S regulatorische Komplexe in ΔNLS rpn2 exprimierenden Stämmen im Gegensatz zu ΔNLS rpt2 exprimierenden Stämmen unter restriktiven Temperaturbedingungen im Cytoplasma lokalisiert sind. Die Deletion einer einzelnen cNLS im19S Base Komplex hat unter permissiven Bedingungen keinen Einfluss auf die Lokalisation der 19S Komplexe, so dass unter diesen Bedingungen vermutlich mehrere Karyopherin α/β Transporter kooperativ an die verschiedenen cNLS im 19S Komplex binden und diesen durch die Kernporen leiten. Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen zur molekularen Masse des transportierten Komplexes weisen darauf hin, dass 19S regulatorische Partikel als 19S Base und Lid Subkomplexe in den Zellkern importiert werden.

• 1  Einleitung

  • 1.1 Proteinabbau im Ubiquitin- Proteasom- System

  • 1.2 Aufbau des 20S Proteasoms sowie des 19S regulatorischen Komplexes

  • 1.3  Regulation des Ubiquitin- Proteasom Systems

  • 1.4  Biogenese des 26S Proteasoms in S. cerevisiae

  • 1.5  Intrazelluläre Lokalisation von Proteasomen

  • 1.6  Allgemeine Mechanismen des Kerntransports

  • 1.7  Zielsetzung der Arbeit

• 2  Materialien und Methoden

  • 2.1 Oligonukleotide, Vektoren, Stämme und Kultivierung von Mikroorganismen

    • 2.1.1 Oligonukleotide

    • 2.1.2 Vektoren

    • 2.1.3  Stämme und Kultivierung von Mikroorganismen

      • 2.1.3.1 Untersuchung auf Canavanin- und Temperatur Sensitivität

  • 2.2 Molekularbiologische Methoden

    • 2.2.1 DNA Amplifikation durch PCR (polymerase chain reaction)

    • 2.2.2 Gelelution und Reinigung von DNA Fragmenten

    • 2.2.3 Dephosphorylierung

    • 2.2.4 Ligation

    • 2.2.5 Restriktionsansätze

    • 2.2.6 Plasmidisolation aus E. coli

    • 2.2.7 Annealing von Oligonukleotiden

    • 2.2.8 DNA Fällung und Sequenzierung

    • 2.2.9 Agarose- Gelelektrophorese

    • 2.2.10 Polyacrylamid- Gelelektrophorese

    • 2.2.11 DNA Isolation aus S. cerevisiae (verändert nach Kaiser et. al, 1994)

    • 2.2.12 Herstellung kompetenter E. coli Zellen

    • 2.2.13 Transformation von E. coli

    • 2.2.14 Transformation von S. cerevisiae

    • 2.2.15  5´Fluoroorotsäure- shuffling (nach Boeke et al., 1987)

    • 2.2.16 Markierung von Genen mit Hilfe der Homologen Rekombination

    • 2.2.17 Erzeugung der NLS-GFPS Fusionsproteine

  • 2.3 Proteinbiochemische Methoden

    • 2.3.1 Aufschlussverfahren von Hefezellen

      • 2.3.1.1  Hefeprotein Schnellaufarbeitung nach Yaffe und Schatz, 1984

      • 2.3.1.2 Glasperlenaufschluss

      • 2.3.1.3 Aufschluss unter flüssigem Stickstoff

      • 2.3.1.4 French- Press Aufschluss

    • 2.3.2 Immunpräzipitation

      • 2.3.2.1 HA Tag

      • 2.3.2.2 Standard IgG Sepharose Affinitätschromatographie

      • 2.3.2.3  Sequenzielle IgG Sepharose Affinitätschromatographie

      • 2.3.2.4 Strep- tag II Affinitätschromatographie

    • 2.3.3 Proteinfällung und Proteinbestimmung

    • 2.3.4 SDS PAGE

    • 2.3.5 Coomassie Färbung

    • 2.3.6 Western Blot Analyse

    • 2.3.7 Proteaseassay mit fluorogenen Substraten

    • 2.3.8 Dichtegradientenzentrifugation

    • 2.3.9 Far Western Analyse

    • 2.3.10 Direkte Fluoreszenzmikroskopie

    • 2.3.11 Immunfluoreszenz

• 3  Ergebnisse

  • 3.1 Funktioneller Austausch endogener 19S proteasomaler Untereinheiten gegen GFPHA, ProA oder HA markierte Varianten

  • 3.2 Untersuchung klassischer Kerntransportmutanten

  • 3.3 Klassische Kernlokalisationssequenzen im 19S Base sowie Lid Komplex

  • 3.4 19S Base NLS- GFPS Fusionsprodukte lokalisieren im Zellkern und copräzipitieren Kar α/β in vivo

  • 3.5 Charakterisierung der ΔNLS Mutation in Rpt2

  • 3.6 Charakterisierung der ΔNLS Mutation in Rpn2

  • 3.7 Far Western Untersuchungen zur Bindung von 19S proteasomalen Untereinheiten an Kar α/β

• 4  Diskussion

  • 4.1 19S Untereinheiten lokalisieren im Zellkern und präzipitieren 19S Komplexe, Ubp6 und Ecm29

  • 4.2 Kernimport von 19S Partikeln ist abhängig von Karyopherin α/β

  • 4.3 Kernlokalisationssequenzen in Rpn2 und Rpt2 binden an Karyopherin α

  • 4.4 Mehrere NLS im 19S Komplex sind am effizienten Kernimport beteiligt

  • 4.5 Die Biogenese des 20S Proteasomens ist unabhängig von der 19S Lokalisation

  • 4.6 Ausblick

  • 4.7 Spekulationen über den biologischen Sinn der nukleären 19S Lokalisation

  • 4.8 Importmodell für 19S regulatorische Partikel

• Literaturverzeichnis
• Abkürzungsverzeichnis
• Danksagung
• Lebenslauf
• Erklärung

• Tab. 1: Substrate und deren Signalsequenzen der Importin- β ähnlichen Proteine. Die unterstrichene Sequenz in Spo12 ist ausreichend für die Translokation des Proteins in den Zellkern. Abkürzungen: HTLV-1: human T-cell leukemia virus type 1; Mouse importin-α IARS: autoinhibitorische pseudo- NLS von Importin α

• Tab. 2: Bezeichnungen und Sequenzen der verwendeten Oligonukleotide

• Tab. 3: Bezeichnung und Herkunft der verwendeten Plasmide; X in der Plasmidbezeichnung steht für die Proteine Rpn1, Rpn11 und Rpn2

• Tab. 4: Genotypen und Referenzen der verwendeten E. coli Stämme

• Tab. 5: Genotypen und Referenzen der verwendeten S. cerevisiae Stämme

• Tab. 6: Im Western Blot verwendete primäre und sekundäre Antikörper

• Tab. 7: In der direkten und indirekten Fluoreszenzmikroskopie verwendete Filterblöcke

• Tab. 8: Beschreibung der in dieser Arbeit verwendeten S. cerevisiae Mutationsstämme, die einen Defekt im Kernimportweg zeigen. Die gekennzeichneten (*) Autoren haben die temperatursensitiven Mutanten generiert. Wenn die publizierten Ergebnisse aus gleichen Arbeitsgruppen stammen, sind die Zitate mit (O ) markiert.

• Abb. 1: Proteinabbau im Ubiquitin Proteasomen System. Ubiquitin wird durch das Ubiquitin aktivierende Enzym E1 (UBA) aktiviert und auf das Ubiquitin konjugierende Enzym E2 (UBC) übertragen. Von der E2 kann Ubiquitin direkt auf das Substrat übertragen werden, dass an eine Ubiquitin Ligase E3 gebunden ist (Möglichkeit A). Dies geschieht, wenn die E3 Ligase zu der Familie der Ring Finger E3 Ligasen gehört. Enthält die E3 Ligase eine HECT Domäne, wird das aktivierte Ubiquitin zunächst auf die E3 Ligase übertragen, um anschließend mit dem Substrat verknüpft zu werden (Möglichkeit B). Weitere Ubiquitinreste werden an den ersten Ubiquitinrest konjugiert. Die Polyubiquitinkette wird spezifisch von proteasomalen Untereinheiten (Rpn10, Rpt5) sowie von mit dem Proteasomen assoziierten Proteinen (Rad23, Dsk2) erkannt. Das Substrat wird entfaltet und zu kurzen Peptiden degradiert. Wiederverwendbares Ubiquitin wird durch die Aktivität verschiedener deubiquitinierender Proteine freigesetzt. Die Anzahl der in S. cerevisiae bekannten E1, E2 und E3 Enzyme ist angegeben. Alternativ zur Ubiquitinerkennung durch o.g. Proteine kann das ubiquitinierte Substrat durch Cdc48/VCP(valosin containing protein), durch E3 Ligasen (z.B. APC Komplex) oder durch Bag1 (Bcl2 associated athanogene) gekoppeltes Hsp70 direkt an das Proteasomen weitergeleitet werden. Die Ornithin Decarboxylase (ODC) wird Ubiquitin unabhängig durch das Proteasomen erkannt und degradiert. Abbildung nach Ciechanover und Brundin, 2003 sowie Hartmann-Petersen et al., 2003.

• Abb. 2 : Struktur des 20S Proteasoms aus S. cerevisiae als sphärisches Modell (A) und als GRASP (graphical representation and analysis of structural properties) Modell (B)mit Kennzeichnung der Lage der katalytischen β Untereinheiten (Groll et al., 1997)

• Abb. 3 : (A) Struktur des 26S Proteasoms von Drosophila melanogaster Embryonen. Abgebildet ist die aus elektronenmikroskopischen Aufnahmen erhaltene Dichteverteilung. Um die wackelnde Bewegung des 19S regulatorischen Komplex auf dem 20S Proteasom zu verdeutlichen, sind Extremstadien gewählt (farbig und grau), aus denen die 5° Rotation an der Berührungsfläche zwischen 19S und 20S ersichtlich wird (Walz et al., 1998). Strukturen des 19S Komplexes sind weiß umrandet. (B)Schematische Darstellung des 19S regulatorischen Komplex mit interagierenden Proteinen. 19S Base Untereinheiten sind in grün, 19S Lid Untereinheiten in orange und interagierende Proteine in gelb dargestellt. Protein- Protein Interaktionen sind durch schwarze Verbindungslinien gekennzeichnet. Proteine, die mit dem 19S Komplex interagieren und deren Interaktionspartner unbekannt sind, sind ohne Verbindungslinie dargestellt. Zahlen kennzeichnen die Veröffentlichungen, in denen die Interaktionen beschrieben sind: (1) Wilkinson et al., 1997; (2) Elsasser et al., 2002; (3) Xie und Varshavsky 2000 sowie 2002; (4) Yen et al., 2003a; (5) Tone et al., 2000; (6) Leggett et al., 2002; (7) Dunand- Sauthier et al., 2002; (8) Papa et al., 1999; (9) Kleijnen et al., 2000; (10) Richmond et al., 1997; (11) Verma et al., 2000 (12) Tabb et al., 2000; (13) Hori et al., 1998; (14) Uetz et al., 2000; (15) Kaiser et al., 1999; (16) Fujimuro et al., 1998

• Abb. 4: Transportvorgänge über die Kernmembran aus Görlich, 1998

• Abb. 5 : (A) Struktur von Importin β gebunden an die IBB Domäne von Importin α (Ström & Weis, 2001). Importin β (gelb) bildet mit den 19 HEAT Sequenzen eine schneckenartige Struktur um die IBB Domäne von Importin α (blau). Helices, die wichtig für die Interaktion mit den Nukleoporinen und RanGTP sind, sind in grün bzw. rot dargestellt. Der weiße Pfeil kennzeichnet den Bereich saurer Aminosäuren, der sowohl zu RanGTP als auch zur IBB Domäne Kontakt hat. (B) Struktur von Maus Importin α mit der autoinhibitorischen N- terminalen IBB Domäne in Magenta und den verschiedenen Armadillo Motiv Wiederholungen in unterschiedlichen Farben dargestellt (Kobe, 1999).

• Abb. 6: (A)Schematische Darstellung der Erzeugung von PWt2G aus PWT2H16 mit Hilfe der Plasmid shuffling Methode. Leucin tragende Plasmide, die auf diese Weise in PWt2H16 eingeführt werden, sind pRpt2H, pRpt2G, pΔNRpt2H sowie pΔNRpt2G (B)pRpt2H entsteht aus pRS315-H, indem das ca. 1,8 kbp RPT2 Gen einschließlich des 482 bp langen Promotorbereichs als XhoI- BamHI Fragment in pRS315-H ligiert wird. Mit Hilfe der angegebenen PCR Primer werden XhoI/ SacI und SacI/ XbaI Fragmente aus pRpt2H amplifiziert und in pRS315 ligiert. In pΔNRpt2H sind somit bp 1- 129 des RPT2 Gens deletiert. Das GFP Gen wird für die Erzeugung von pRpt2G sowie pΔNRpt2G als BamHI Fragment in pRpt2H bzw. pΔNRpt2H eingesetzt. pRpt2H-16 gleicht pRpt2H, trägt aber statt des LEU2 Gens das URA3 Gen und basiert damit auf dem pRS316 Vektor.

• Abb. 7: Insertion linearisierter DNA Fragmente durch homologe Rekombination. Das SacI/XhoI linearisierte Genfragment (1) wird mittels homologer Rekombination in den chromosomalen Genlocus von Rpn11 insertiert. Weitere in dieser Arbeit verwendete Markierungen und Gene sind in grauer Schrift angezeigt. Die zur Herstellung des Fragments notwendigen Klonierungsschritte verlaufen über pBSFlu (6), pBSFluRpn11HA (5), pBSFluRpn11GFPHA (4), pBSHU (7), pBSHURpn11-3´ (3) und pBSHURpn11GFPHA (2).

• Abb. 8: Struktur des RPN11-HA-TEV-ProA::URA3::HIS3 Fragment (1), das mit SacI/ XhoI linearisiert wird und mittels homologer Rekombination in den chromosomalen Genlocus von Rpn11 insertiert wird. Die zur Herstellung des Fragments notwendigen Klonierungsschritte verlaufen über pBSFluRpn11HA (4), pBSFluRpn11HATEVProA (2) und pBSHURpn11-3´ (3). Das NdeI/ XbaI Fragment (5), das für die TEV Schnittstelle und die zwei IgG bindenden Domänen codiert, wird mit Hilfe entsprechender Primer aus pZZ-HIS5 amplifiziert.

• Abb. 9: Potentielle cNLS der 19S Untereinheiten Rpt2 (1), Rpn2 (2) und Rpt1 (3) sowie die funktionelle SV40 NLS (4) und die mutierte SV40 NLS (5) werden wie abgebildet als GFP Fusionsprotein mit Strep- tag II Markierung (S) exprimiert.

• Abb. 10 (A) Zellextrakte von PWn1GH (1) und PWn11GH (2) wurden in der SDS PAGE aufgetrennt und in der Western Blot Analyse mit anti- HA Antikörper untersucht. (B) Stämme, die Rpn1-GFPHA (linke Abb.) oder Rpn11-GFPHA (rechte Abb.) exprimieren, wachsen bei 28°C und 37°C mit vergleichbarer Wachstumsrate wie der Wildtyp Stamm WCGa. (C) In vivo Lokalisation von GFPHA markiertem Rpn1 (obere Abb.) sowie Rpn11 (untere Abb.) in PWn1GH und PWn11GH. Die fluoreszierenden Untereinheiten werden in direkter Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht, indem der FITC Filterblock (rechts) oder simultan FITC Filterblock und Normarski Filter (links) verwendet werden.

• Abb. 11:(A) Parallele Fluoreszenzmikroskopie der in vivo Lokalisation von Rpn1-CFPHA oder Rpn11-CFPHA und Markerproteinen bestimmter Zellkompartimente. In Zellen, deren endogenes Rpn1 bzw. Rpn11 gegen die CFPHA markierte Variante ausgetauscht ist, werden die GFP markierten Varianten von Nup49, Pdr5* bzw. Pdr5 als Nukleoporin-, Endoplasmatisches Retikulum- bzw. Zellmembranmarker von Centromer tragenden Plasmiden exprimiert. Fluoreszierende 19S Untereinheiten werden mit dem CFP Filterblock (links), GFP markierte Proteine mit dem FITC Filterblock (rechts) aufgenommen und mit der Software Adobe Photoshop 6.0 ineinander kopiert (Mitte). (B) Zellen, die CFPHA markiertes Rpn1 sowie GFPHA markiertes Nup49 exprimieren, werden aus der logarithmischen Wachstumsphase für 45 min in Wasser inkubiert und die i n vivo Lokalisation der Fluorophore wie unter 11 (A) mittels direkter Fluoreszenzmikroskopie untersucht.

• Abb. 12: PWn1GH und PWn11GH Lysate werden im Glyceroldichtegradienten sedimentiert und die angegebenen Fraktionen in der SDS PAGE aufgetrennt. In der folgenden Western Blot Analyse werden die HA markierten Untereinheiten, Rpt6 sowie α1 mit den entsprechenden Antikörpern detektiert.

• Abb. 13: Rpn1-ProA und Rpn11-ProA präzipitieren 19S und 20S proteasomale Untereinheiten. 19S Komplexe aus PWn1P (2) und PWn11P (1) Lysaten werden in der Standard IgG Affinitätschromatographie aufgereinigt und im SDS PAGE aufgetrennt. In der Coomassie Färbung sichtbare Proteine aus (2) werden in der Massen Fingerprint Analyse bestimmt. IgG Affinitätschromatographie unter Anwesenheit von Puffer A präzipitiert aus PWn11P Lysaten 26S proteasomale Untereinheiten (3). Molekulargewichtsmarker in kDa sind angegeben.

• Abb. 14:(A) Rpn1 und Rpn11 sind in srp1-49 und SRP1 Zellen gegen die GFPHA markierten Varianten ausgetauscht. Die in vivo Lokalisation der fluoreszierenden Untereinheiten wird nach 3 Stunden Wachstum bei 28°C bzw. 37°C mittels direkter Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht. (B) Die nukleäre und cytoplasmatische GFP Pixelintensität der digitalen Aufnahmen von wenigstens 20 Zellen der in A abgebildeten Stämme wird quantifiziert, um die durchschnittliche Pixelintensität zu erhalten. Die mittlere Standardabweichung ist für alle Werte angegeben. Das Verhältnis von durchschnittlicher cytoplasmatischer zu nukleärer Pixelintensität für alle Stämme bei permissiver und restriktiver Temperatur ist in Prozent dargestellt. (C) Wild Typ und srp1-49 Zellen, die Rpn11-GFPHA anstelle des endogenen Proteins exprimieren, werden für 4 Stunden bei 37°C inkubiert und die Lysate dieser Zellen im Puffersystem ohne ATP Zusatz in der Glycerolgradientenzentrifugation aufgetrennt. Aus allen Fraktionen wird der Proteingehalt sowie die Protease- Aktivität gegen Suc- Leu- Leu- Val- Tyr- 7- Amino- 4- Methyl- Coumarin bestimmt und die relative proteasomale Aktivität pro mg Protein als prozentualer Wert des Maximalwerts errechnet. In der Western Blot Analyse werden die HA markierten Proteine, Rpt6 und β5 aller Fraktionen mittels entsprechender Antikörper nachgewiesen. Das Signal der prozessierten β5 Untereinheiten deckt sich mit der proteasomalen Aktivität und zeigt damit die 20S enthaltenden Fraktionen an. Nicht prozessierte β5 Untereinheiten zeigen die Fraktionen des 13-16S Vorläuferkomplex des 20S Proteasoms an. (D) 26S Proteasomen werden aus PCE6 Lysaten in Puffer A an IgG Sepharose gebunden, 19S Komplexe mit 600mM NaCl nativ eluiert und in 10- 40% igen Glycerolgradienten sedimentiert. Proteine aller Fraktionen werden im SDS PAGE aufgetrennt und mit Coomassie Färbelösung visualisiert.

• Abb. 15: Potentielle Kernlokalisationssequenzen der 19S Untereinheiten sind grau unterlegt. Sequenzen, die mit den Konsensussequenzen übereinstimmen, sind unterstrichen. Die Position der Aminosäuresequenz in den jeweiligen Proteinen ist angegeben.

• Abb. 16: (A) Die in Abb. 9 dargestellten Fusionsproteine aus potentiellen 19S Kernlokalisationssequenzen bzw. Kontrollsequenzen und GFP werden für 4 Stunden durch Galaktose Induktion der Stämme PWRpt2NLSG (1), PWRpt1NLSG (2), PWRpn2NLSG (3), PWNLSG (4) bzw. PWmNLSG (5) überexprimiert und die in vivo Lokalisation der fluoreszierenden Fusionsproteine durch direkte Fluoreszenzmikroskopie mit dem FITC Filterblock sichtbar gemacht. (B) Gleiche Mengen der NLS- GFPS Fusionsproteine, die mit Hilfe der StrepTactin Affinitätschromatographie aus den unter (A) beschriebenen Kultivierungsbedingungen und Stämmen isoliert sind, werden in der SDS PAGE aufgetrennt und einschließlich assoziierter Proteine mit Coomassie Lösung angefärbt (obere Abb.). In der parallel durchgeführten Western Blot Analyse werden Karyopherin α und Karyopherin β sowie die GFP Fusionsproteine mit entsprechenden Antikörpern nachgewiesen (untere Abb.). Das mit einem * markierte Signal ist unspezifisch.

• Abb. 17: Gleiche Proteinmengen der NLS- Fusionsproteine werden, wie zu Abb. 14B beschrieben, aufgearbeitet und mittels Far Western Analyse untersucht (+: SV40NLS; -: mutierte SV40NLS). Der Amidoblack gefärbte Blot (links) wird mit Lysaten von Zellen inkubiert, die anstatt des endogenen Karyopherin α Karyopherin α- ProA exprimieren. Die auf dem im Far Western erzeugten Film (rechts) ersichtlichen Signale, stammen von Karyopherin α- ProA, das an Kernlokalisationssequenzen gebunden ist und von anti- IgG Antikörpern erkannt wird. Bei der mit einem * markierten Proteinbande handelt es sich um ein Degradationsprodukt des Rpt2NLS-GFP Fusionsproteins.

• Abb. 18: Zellextrakte von DY62 und PWt2H16 werden im SDS PAGE aufgetrennt und in der Western Blot Analyse mit Antikörpern gegen humanes Rpt2 (links) sowie gegen die HA Markierung (rechts) untersucht. Größenmarker in kDa sind angegeben.

• Abb. 19: Identische Proteinmengen der Zellextrakte aus PWt2H (1), PW Δ Nt2H (2), PWt2G (3) und PW Δ Nt2G (4) werden im SDS PAGE aufgetrennt und in der Western Blot Analyse mit Antikörpern gegen das HA Epitop untersucht. Molekulargewichtsgrößen in kDa sind angegeben.

• Abb. 20: Stämme, die Rpt2-HA (PWt2H), ΔNLS rpt2-HA (PWΔNt2H), Rpt2-GFPHA (PWt2G) oder ΔNLS rpt2-GFPHA (PWΔNt2G) anstatt des endogenen Rpt2 exprimieren werden auf Temperatursensitivität und Canavanin Sensitivität (nur PWt2H und PWΔNt2H) untersucht. Die für die Canavanin- Sensitivitätsbestimmungen verwendeten CM Agar- Platten ohne Arginin enthalten 0,6µl/ml Canavanin, die Referenzplatten ohne Canavanin 20 mg/ml Arginin. Die Platten werden für 3 Tage bei 28°C bzw. bei 37°C inkubiert.

• Abb. 21: (A) In vivo Lokalisation von ΔNLS rpt2- GFPHA bzw. Rpt2- GFPHA in PWΔNt2GH bzw. PWt2GH Zellen nach Inkubation für drei Stunden bei 28°C bzw. 37°C. (B) Zellteilungsdefekt der PWΔNt2GH Zellen. Das Fluoreszenzsignal stammt von ΔNLS rpt2- GFPHA nach Inkubation der Zellen für eine Stunde bei 37°C. (C) In vivo Lokalisation von Rpn1- GFPS (oben) bzw. Rpn11- GFPS (unten) in PWΔNt2H Zellen nach Inkubation für drei Stunden bei 28°C bzw. 37°C. Die Zellen sind jeweils mit dem FITC Filterblock (links) und FITC sowie Normarski Filterblock simultan (rechts) aufgenommen.

• Abb. 22:PWt2H und PWΔNt2H Zellen werden für eine Stunde bei 37°C inkubiert und die Lysate im Puffersystem mit Zusatz von ATP und MgCl in der 10- 40% igen Glycerolgradientenzentrifugation aufgetrennt. Aus allen Fraktionen wird der Proteingehalt sowie die Protease- Aktivität gegen Suc- Leu- Leu- Val- Tyr- 7- Amino- 4- Methyl- Coumarin bestimmt und die relative proteasomale Aktivität pro mg Protein als prozentualer Wert des Maximalwerts errechnet. In der Western Blot Analyse aller Fraktionen werden die HA markierten Proteine, Rpt6 und β5 mittels entsprechender Antikörper nachgewiesen. Das Signal der prozessierten β5 Untereinheiten deckt sich mit der proteasomalen Aktivität und zeigt damit die 20S enthaltenden Fraktionen an.

• Abb. 23: Elution proteasomaler Subkomplexe aus PWn11HTP Lysaten in der sequenziellen Affinitätschromatographie durch Bindung von Rpn11-HA-TEV-ProA an IgG Sepharose. Die 300mM NaCl Fraktion enthält 20 S Proteasom und geringe Mengen an 19S Base Komplex sowie assoziierten Proteinen. Mit 600mM NaCl werden 19S Base Komplexe eluiert und in der TEV Protease Abspaltung werden die noch an die Matrix gebundenen 19S Lid Komponenten freigesetzt. Der Größenmarker in kDa ist angegeben.

• Abb. 24: 600mM NaCl Elution, die 19S Base und 20 S Komplexe aus PWt2Hn11HTP (rechts) sowie PWΔNt2Hn11HTP (links) enthalten, werden im 10- 40% igen Glycerolgradienten aufgetrennt, alle Fraktionen gefällt und in der Western Blot Analyse untersucht. Amidoblack gefärbte Membranen (oben) und ECL Signale (unten) aus der Immunreaktion mit Antikörpern gegen das HA Epitop, Rpt6/ Cim3 und α4 sind abgebildet. Die markierten Signale (*) stammen von Rpn11-ProA, das mit den 600mM NaCl Elutionen von der IgG Matrix abgelöst wird und im Glycerolgradienten in den Fraktionen 7-14 sedimentiert.

• Abb. 25: (A) Zellextrakte aus PWΔCn2H (1) und PWn2H (2) werden im SDS PAGE aufgetrennt und in der Western Blot Analyse mit Antikörpern das HA Epitop untersucht. Größenmarker in kDa sind angegeben. (B) Ergebnisse der PCR Analyse aus PWΔCn2H (1-3) und PWn2H (4-6). Die für den jeweiligen Ansatz verwendeten Primer sind schematisch dargestellt. DNA Größenmarker in kbp ist angegeben. (C) Zellextrakte aus PWΔCn2H (1), PWn2H (2), PWΔn2ΔCn2H (3) und PWΔn2n2H (4) werden wie unter (A) beschrieben untersucht.

• Abb. 26: (A) Stämme, die Rpn2-HA (PWn2H) und ΔNLS rpn2-HA (PWΔCn2H) anstatt des endogenen Rpn2 exprimieren, werden auf Temperatursensitivität und Canavanin Sensitivität untersucht. Die für die Canavanin- Sensitivitätsbestimmungen verwendeten CM Agar- Agar Platten ohne Arginin enthalten 0,6µl/ml Canavanin, die Referenzplatten ohne Canavanin 20 mg/ml Arginin. (B) PWβ5H (1), PWn2Hβ5H (2) und PWΔCn2Hβ5H (3) bzw. PWβ7H (4), PWn2Hβ7H (5) und PWΔCn2Hβ7H (6) werden aus der logarithmischen Wachstumsphase für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Lysate der Zellen werden in der SDS PAGE aufgetrennt und in der Western Blot Analyse gegen die HA markierten Untereinheiten Rpn2, ΔNLS rpn2, β5 sowie β7 und gegen Rpt6 mit den entsprechenden Antikörpern untersucht (oben). Ubiquitinierte Proteine werden parallel in der Western Blot Analyse mit einem gegen Ubiquitin gerichteten Antikörper detektiert (unten).

• Abb. 27: HA markiertes Rpn2 und ΔNLS rpn2 aus PWn2H bzw. PWΔCn2H Stämmen, die bei 28°C oder 37°C für eine Stunde gewachsen sind, werden mittels indirekter Immunfluoreszenz unter Verwendung des mAB12CA5 Antikörpers lokalisiert. Kontrollzellen werden mit dem Antikörper mAb414 gegen Kernporenproteine behandelt. Nukleäre und mitochondriale DNA aller Ansätze wird mit DAPI angefärbt.

• Abb. 28:PWn2Hβ5H und PWΔCn2Hβ5H Zellen aus der exponentiellen Wachstumsphase werden für eine Stunde bei 37°C inkubiert und die Lysate mit und ohne ATP Zusatz werden einer 10-40 %igen Glycerolgradientenzentrifugation unterzogen. Alle Fraktionen werden mit dem Substrat Z-leu- leu- glu- βNaphthylamid auf proteasomale PGPH Aktivität untersucht. Die ATP enthaltenden Fraktionen werden gefällt, in der SDS PAGE aufgetrennt und im Immunoblot mit den Antikörpern gegen das HA Epitop und Rpt6 analysiert.

• Abb. 29: 600mM NaCl Elution, die 19S Base und 20 S Komplexe aus PWn2Hn11P (rechts) sowie PWΔCn2Hn11P (links) enthalten, werden im 10- 40% igen Glycerolgradienten aufgetrennt, alle Fraktionen gefällt und in der Western Blot Analyse untersucht. Amidoblack gefärbte Membranen (oben) und ECL Signale (unten) aus der Immunreaktion mit Antikörpern gegen das HA Epitop, Rpt6/ Cim3 und α4 sind abgebildet.

• Abb. 30: (A) Nativ eluierte 19S Base Subkomplexe, die Rpn2-HA (wt) oder ΔNLS rpn2-HA (Δ) enthalten, werden in der SDS PAGE aufgetrennt, auf PVDF Membran übertragen und der Far Western Analyse unterzogen. Signale, die im Far Western (FW) zu erkennen sind, stammen aus der Immunreaktion des Protein A markierten Karyopherin α mit NLS tragenden Proteinen. Die * markierten Signale werden von Rpn11ProA Fusionsproteinen hervorgerufen, die in den 600mM NaCl Elutionen von der Matrix abgelöst werden und mit den Peroxidase gekoppelten Kaninchen anti Maus IgG, die in der Far Western Analyse das Karyopherin α- ProA erkennt, interagieren. Nach der Far Western Analyse werden die Membranen mit pH 3,0 gewaschen, in Amidoblack (AB) gefärbt und in der Western Analyse mit Antikörpern gegen das HA Epitop und Rpt6 untersucht. (B)Nativ eluierte 19S Base Subkomplexe aus PWt2H (wt) und PWΔNt2H (Δ) werden den unter (A) beschrieben Analysen unterzogen (C) Der 19S Lid Komplex wird aus PWn11HTP isoliert und wie unter (A) beschrieben untersucht (D)GFP markierte SV40 NLS, mutierte SV40 NLS sowie das GFP Reporterprotein allein werden als Kontrollen bei allen Far Western Analysen auf dem selben Blot mitgeführt.

• Abb. 31: Modell für den Karyopherin α/β abhängigen Import von 19S Komplexen. 19S Base Untereinheiten sind grün, 19S Lid Untereinheiten sind orange angefärbt. Die NLS tragenden Untereinheiten in 19S Base und Lid Komplex sind blau hervorgehoben. Das Größenverhältnis von proteasomalen Subkomplexen zum Kernporenkomplex ist für eine bessere Übersichtlichkeit verzerrt dargestellt.