2.  Material und Methoden

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Zellquelle:

In der vorliegenden Arbeit wurden humane respiratorische Epithelzellen (HRE-Zellen) untersucht. Diese stammten aus den Conchae nasales inferiores, die im Rahmen einer Konchotomie entnommen wurden. Die Patienten wurden ordnungsgemäß informiert und es wurde nur Gewebe verwendet, welches ansonsten verworfen worden wäre.
Ein Votum der Ethikkommission der Charité lag vor. Zur Standardisierung der Proben wurden die Daten Alter, Geschlecht, Raucher, Nichtraucher, Allergiker und Nicht­allergiker in anonymer Form erhoben. Die Proben stammten von insgesamt
80 Patienten im Alter von 16 bis 64 Jahren. Das durchschnittliche Alter der
22 Patientinnen betrug 39 ± 16 Jahre und das der 58 männlichen Patienten lag bei 41 ± 12 Jahre.

Kulturgefäße:

Kulturmedien und Zusätze:

serumfreies AECGM (Promo Cell) + 2% Supplement Mix + 1% Pen/Strep

• Adrenalin 0,5 μg/ml
• Bovine Pituitary Extract 0,4%
• Epidermal Growth Factor 0,5 ng/ml
• Hydrokortison 0,5 μg/ml
• Insulin 5 μg/ml
• Transferrin 10 μg/ml
• Triiodthyronin 6,7 ng/ml
• Retinsäure 0,1 ng/ml

RPMI 1640 (Biochrom AG) + 10% FBS + 1% Pen/Strep

• HEPES 25 mM
• N-Acetyl-L-Alanyl-L-Glutamin 0,532 g/l
• NaCl 5,5 g/l
• NaHCO₃ 2 g/l
• Phenolrot 5 mg/l

Im HNO-OP wurden Nasenmuscheln entnommen und in 50 ml Falcon-Röhrchen
mit RPMI-Medium transportiert. Die Isolierung der HRE-Zellen erfolgte mittels
enzymatischem Verdau mit Dispase ΙΙ 2,4 U/ml bei 4°C über Nacht (ca. 16h). Danach ließen sich die HRE-Zellen mit einem Skalpell leicht von dem Bindegewebe ablösen und in Hanks Salzlösung aufnehmen. Durch zweimaliges Zentrifugieren bei 600 g für 5 min und Resuspendieren konnten die Zellen vereinzelt und extrazelluläre Substanzen ausgewaschen werden.

Zur Kultivierung wurden die HRE-Zellen in AECG-Medium aufgenommen und bei
standardisierter Zelldichte von 12.000 Zellen/cm² ausgesät. Die Kultivierung der Zellen fand im Brutschrank bei 37°C, einer Luftfeuchtigkeit von 95% und einem CO₂-Gehalt von 5% statt. Zur optimalen Nährstoffversorgung der Zellen war ein Mediumwechsel mit AECGM alle zwei bis drei Tage notwendig.

Beschichten von Kulturoberflächen mit Kollagen A:

Pro 10 cm² Kulturoberfläche wurde 1 ml einer 1:1 Kollagen A in PBS Verdünnung in das Kulturgefäß gegeben und 30 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Lösung abgesaugt und das Kulturgefäß sofort verwendet oder ggf. mit PBS überschichtet und bei 4°C für maximal eine Woche gelagert.

Passagieren der Zellen:

Damit eine adhärente Zellkultur in ein neues Kulturgefäß überführt werden konnte, musste sie passagiert werden. Die Passage erfolgte bei Konfluenz, d. h. zu diesem Zeitpunkt wurde die Kulturoberfläche vollständig von Zellen bedeckt. Um die Zellen von der Oberfläche abzulösen, wurden sie zunächst mit PBS gewaschen und anschließend mit Trypsin-Lösung für 5 min bei 37°C inkubiert. Die Enzymreaktion ließ sich mit dem doppelten Volumen an serumhaltigem RPMI-Medium abstoppen. Im Anschluss wurde 5 min bei 600 g zentrifugiert und das entstandene Zellpellet in AECG-Medium ent­sprechend der Pelletgröße resuspendiert.

Zellzählung:

Die Vitalität der Zellen ließ sich mit Tryphanblau in einer 1:1-Verdünnung bestimmen. Die toten Zellen färbten sich blau an, während lebende Zellen mit intakter Zellmembran ungefärbt blieben. Die Zellzählung erfolgte in der Neubauer Zählkammer. Zur Berech­nung der Zellzahl wurde folgende Formel angewandt [53]:

Zur Erythrolyse erwies es sich als geeignet, 1%ige Essigsäure zu verwenden, die zu gleichen Volumina mit der Zellsuspension gemischt wurde. Die Erythrolyse setze nach ca. 5 min ein. Der methodische Fehler der Zellzählung betrug mindestens 10% [54].

Zur Untersuchung des Adhärenzverhaltens der HRE-Zellen wurden Kulturgefäße aus Polystyrol in Gruppe 1 mit Kollagen A beschichtet und als Kontrolle in Gruppe 2 ohne Beschichtung miteinander verglichen. Als Kulturgefäße wurden 6-Well-Platten ver­wendet. Die Besiedelung erfolgte jeweils mit Zellen der ersten Passage (P1) eines
Patienten mit einer Dichte von 100.000 Zellen/Well. Von den 100.000 Zellen wurden zu vier Zeitpunkten nach 8h, 12h, 16h und 20h die nicht-adhärenten Zellen durch zweimal Waschen mit PBS ausgespült und die verbleibenden adhärenten Zellen in dreifacher Bestimmung ausgezählt.

Für die Ermittlung der Populationsverdoppelungszeit einer Zellkultur, musste der Wachstumsverlauf festgehalten werden. Zu diesem Zweck wurden zwei 12-Well-Platten mit Kollagen A beschichtet und mit HRE-Zellen aus der P1 eines Patienten mit der Dichte von 50.000 Zellen/Well besiedelt. Die Auszählung der Zellzahlen erfolgte zu den Zeitpunkten 12h, 24h, 2d bis 5d, sowie nach 7d und 10d in Dreifachbestimmung. Die Populationsverdoppelungszeit ließ sich aus der exponentiellen Wachstumsphase nach folgender Formel bestimmen [53]:

Um die Proliferationskapazität der HRE-Zellen zu untersuchen, wurde die Kultivierung über mehrere Passagen beobachtet. In jeweils zwei Kollagen-A-beschichtete T25­Kulturflaschen wurden pro Patient 300.000 Zellen aus dem Primärisolat ausgesät. Die Zellen wurden bis zum Erreichen der Konfluenz kultiviert und anschließend passagiert. Die passagierten Zellen wurden lediglich in zwei T25-Kulturflaschen mit jeweils 300.000 Zellen subkultiviert. Die gesamte Expansion (Abb. 8) erfolgte nach dem gleichen Schema über mindestens vier Passagen. Abbruchskriterien waren Stagnation des Zell­wachstums, eine Vitalität unter 60% oder eine starke Veränderung der Zellmorphologie.

	Abb. 8 : Schematische Darstellung der Expansionsstudie. Die humanen respira­torischen Epithelzellen wurden in standardisierter Dichte in Kollagen-A-beschichteten T25-Kulturflaschen ausgesät und jeweils bis zum Erreichen der Konfluenz über mindestens vier Passagen kultiviert, um ihre Proliferationskapazität zu ermitteln.

Zur Differenzierung der HRE-Zellen wurde die Methode des Air-Liquid-Interfaces (ALI, Abb. 9) angewandt. Hierzu wurden Cellagen Discs mit einer transparenten permeablen Membran aus Kollagen Typ Ι verwendet. Die Cellagen Discs wurden zentriert in das Well einer 6-Well-Platte eingesetzt und mit 2,5 ml AECG-Medium im Well und 1,0 ml AECGM auf der Membran für ca. 30 min bei 37°C im Brutschrank konditioniert. Danach wurden 70.000 HRE-Zellen auf der Oberseite der Membran ausgesät. Nach Erreichen der Konfluenz wurde das Medium von der Oberseite abgenommen. Die Versorgung der HRE-Zellen mit Nährstoffen war durch einen zweitägigen Mediumwechsel im Well und durch die Diffusion des Mediums durch die permeable Membran gewährleistet.

	Abb. 9 : Differenzierung von Zellen im Air-Liquid-Interface (ICN). Die humanen respiratorischen Epithelzellen wurden auf einer Kollagenmembran in einem Zwei­Phasen-System (Gas- und Flüssigkeitsphase) kultiviert und erhielten dadurch eine polare Ausrichtung.

Die Kultivierung im ALI erfolgte mit HRE-Zellen aus der P0 bis zum Erreichen der Konfluenz und mit HRE-Zellen aus der P1 bis zur Konfluenz sowie bis acht Tage
nach Konfluenz. Zur anschließenden immunhistochemischen Auswertung der ALI­Kulturen musste die Kollagenmembran ausgeschnitten und in Aceton/Methanol 1:1 fixiert werden.

Für die magnetische Separation (MACS) von Vorläuferzellen aus dem humanen
respiratorischen Epithel erfolgte die Herstellung von Einzelzellsuspensionen mit 5 Mio. Zellen auf 100 μl MACS-Puffer entweder mittels Dispase-Verdau von nativem Gewebe oder durch Trypsinieren von Zellen in Primärkultur. Um die Epitope auf den Zellen zu erhalten, wurde ein modifizierter Enzymverdau angewandt. Anstatt 16h über Nacht bei 4°C zu verdauen, wurde ein 2h-Verdau mit Dispase ΙΙ 2,4 U/ml auf einer Roller­apparatur bei 37°C durchgeführt. Nach der Aufarbeitung der Nasenmuscheln folgte ein Percoll-Gradient zur Entfernung der Erythrozyten. So entstand ein Zellgemisch, das sich aus Basalzellen, Becherzellen und Zilienzellen zusammensetzte und unter dem Begriff Originalfraktion subsumiert wurde.

Dichtezentrifugation mit dem Percoll-Gradienten:

Der Percoll-Gradient (Abb. 10) diente der Depletierung von Erythrozyten und von Zell­debris. Das durch Dispase-Verdau gewonnene Zellpellet wurde in 10 ml RPMI-Medium aufgenommen. In zwei 50 ml Falcon-Röhrchen wurden 20 ml Percoll-Lösung der Dichte 1.073 g/ml vorgelegt und verwirblungsfrei mit je 5 ml Zellsuspension überschichtet. Es wurde mit 900 g für 15 min ohne Bremse zentrifugiert. Über dem Percoll bildete sich ein transparenter Ring aus HRE-Zellen, der vorsichtig mit einer Pipette abgenommen
wurde, ohne die Percoll-Phase zu durchstoßen. Es folgte ein Waschschritt mit dem doppelten Volumen an PBS und Zentrifugation bei 600 g für 5 min. Anschließend wurde das gewonnene Zellpellet in PBS resuspendiert und die Zellzahl bestimmt.

	Abb. 10 : Dichtezentrifugation mit einem Percoll-Gradienten. Die Percoll-Lösung wurde mit der Zellsuspension überschichtet. Durch die Zentrifugation bildete sich über der Percoll-Lösung eine ringförmige Phase aus vitalen humanen respiratorischen Epithelzellen. Die Erythrozyten und die Zelltrümmer sedimentierten aufgrund ihrer größeren Dichte auf dem Boden des Falcon-Röhrchens [47].

Protokoll zur magnetischen Markierung von Zellen in Suspension:

Die Färbung der Basalzellen erfolgte 30 min bei 4°C mit austitrierten Markerreagenzien, d. h. die eingesetzten Konzentrationen waren so hoch wie möglich, ohne dabei zu einer unspezifischen Bindung von anderen Zellen zu führen. Insgesamt kamen vier verschiedene Markerreagenzien für Basalzellen zur Anwendung:

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Die Zellen wurden anschließend mit 3 ml MACS-Puffer gewaschen, für 5 min bei 300 g zentrifugiert, und danach wurde der Überstand verworfen. Zum Resuspendieren des Zellpellets wurden 80 μl (bzw. 90 μl) MACS-Puffer verwendet und mit 20 μl (bzw. 10 μl) Microbeads auf ein Gesamt-Volumen von 100 μl aufgefüllt, gut durchmischt und 15 min bei 4°C inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt mit 5 ml MACS-Puffer folgte die magnetische Separation.

	Abb. 11 : Darstellung des Versuchsaufbaus zur magnetischen Separation (Miltenyi Biotec). Die Apparatur für die magnetische Separation bestand aus einer Halterung, einem Magneten und einer Trennsäule, sowie Röhrchen zum Auffangen der sortierten Zellen (A). Vergrößerte Darstellung der Separationseinheit bestehend aus Hoch­leistungsmagneten und Trennsäule Typ MS+ für die positive Selektion (B).

Für eine kritische Beurteilung der magnetischen Separation war es notwendig, die
Bindungsspezifitäten eingehend zu untersuchen. Die Spezifität der primären Marker­reagenzien wurde anhand von immunhistochemischen Färbungen und von Immun­fluoreszenzfärbungen an nativen und an kultivierten HRE-Zellen überprüft. Um eine
unspezifische Bindung der Microbeads z. B. an tote Zellen auszuschließen, wurden im MACS unmarkierte Zellen nur mit Microbeads inkubiert über die Trennsäule gegeben.

	Abb. 12 : Schematischer Ablauf der magnetischen Separation von Basalzellen aus dem Zellgemisch der humanen respiratorischen Epithelzellen. Die Originalfraktion beinhaltete noch alle drei Zelltypen: Zilienzellen, Becherzellen und Basalzellen. Die Basalzellen wurden mit Konjugaten aus spezifischen monoklonalen Antikörpern (bzw. Lektinen) und Microbeads markiert. Dies ermöglichte im Magnetfeld ihre Bindung an die Säulenmatrix, während die unmarkierten Zilien- und Becherzellen ungehindert die Trennsäule passierten und die negative Fraktion bildeten. Nach Entnahme der Trenn­säule aus dem Magnetfeld konnten dann die Basalzellen als positive Fraktion eluiert werden.

Magnetische Separation mit Trennsäulen für die positive Selektion:

Zur positiven Selektion der Basalzellen wurde eine Trennsäule vom Typ MS+ gewählt und mit Hilfe einer Halterung (MACS Multistand) senkrecht in den Magneten ein­gespannt (Abb. 11). Zur Entfernung von noch vorhandenen Zellaggregaten wurde die Zellsuspension mit einem Vorfilter aus Nylongaze mit 30 μm Porengröße filtriert. Die Trennsäule wurde mit 500 μl MACS-Puffer vorgespült und die gefärbte Zellsuspension in 1 ml MACS-Puffer über die Säule gegeben. Im Anschluss wurde mit 4 x 500μl MACS-Puffer nachgespült und der Durchlauf, der aus unmarkierten Zellen bestand, als negative Fraktion gesammelt. Danach wurde die Trennsäule aus dem Magnetfeld ge­nommen, auf einem Falcon-Röhrchen platziert, mit 1 ml MACS-Puffer aufgefüllt und die markierten Zielzellen wurden mit einem Stempel als positive Fraktion eluiert (Abb. 12).

Auswertung und Kultivierung der magnetisch separierten Zellpopulationen:

Für die Auswertung der magnetischen Separation waren die Originalfraktion im
ungefärbten und gefärbten Zustand, die negative Fraktion und die positive Fraktion von Interesse. Da die Microbeads mit 50 nm im Lichtmikroskop nicht sichtbar waren, wurden die magnetisch und fluoreszenzmarkierten Zellen im Anschluss mit dem Durchfluss­zytometer analysiert. Alternativ erwies sich die semiquantitative Auswertung am
Fluoreszenzmikroskop aufgrund der geringen Intensität des Farbstoffes FITC als wenig praktikabel und wurde nicht weiter verfolgt. Die Zellzahlbestimmung der einzelnen
Fraktionen erfolgte mit dem Neubauer Hämozytometer. Aufgrund der geringen Größe der Apparatur konnte die gesamte magnetische Separation an der Laminar-Flow­Sicherheitswerkbank unter sterilen Bedingungen stattfinden. Dies eröffnete an­schließend die Möglichkeit, die Zellen aus den einzelnen Fraktionen unter Verwendung von Kollagen-A-beschichteten T25-Kulturflaschen zu kultivieren.

Analyse der Zellseparation mit dem Durchflusszytometer:

Die Analyse der magnetischen Separation und Identifizierung der Zellen erfolgte
mit dem Durchflusszytometer (FACS, Abb. 13). Dazu wurden im Anschluss an die magnetische Separation Zellsuspensionen mit 250.000 Zellen pro 1ml MACS-Puffer (PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA) hergestellt, in 1,5 ml Reaktionsgefäße (Eppendorf)

abgefüllt und stetig bei 4°C gekühlt. Die ungefärbte, sowie die gefärbte Originalfraktion und die negative ebenso wie die positive Fraktion wurden mit je 10.000 Zellen durch­flusszytometrisch untersucht. Die ungefärbte Originalfraktion diente dabei als Kontrolle, um die Eigenfluoreszenz der Zellen von der Fluoreszenz der FITC-positiven Zellen
abzugrenzen. Zur Signalgebung im Durchflusszytometer wurden die Zellen mit 5 μg/ml CD44v6-FITC markiert. Alternativ wurde mit 5 μg/ml CD44v6 als Primärantikörper
inkubiert und mit Rabbit-Anti-Mouse-IgG-FITC (Dako) 1:20 nachgefärbt, was allerdings zu unspezifischer Bindung des Sekundärantikörpers führte und deshalb ungeeignet war. Kurz vor der Messung wurden die Proben 5 min mit 5 μg/ml Propidiumiodid (PI)
inkubiert. Das basische PI interkalierte in die saure DNA von toten Zellen und erlaubte so die Vitalitätsbestimmung der Zellen.

	Abb. 13 : Durchflusszytometer vom Typ LSR (Becton Dickinson), ausgestattet mit einem primären 488 nm Argon-Ionen-Laser. Gemessen wurden die Fluoreszenz­farbstoffe FITC in Kanal FL1 und PI in Kanal FL3.

Die Messungen erfolgten an einem Durchflusszytometer vom Typ LSR mit drei ver­schiedenen Lasern (325 nm Helium-Cadmium, 488 nm Argon-Ionen, 633 nm Helium­Neon) und sechs Fluoreszenzkanälen FL1 bis FL6. Das Durchflusszytometer wurde vor Beginn der Messung mit 10%iger FACS-Clean-Lösung und mit destilliertem H₂O durch­gespült, zwischen den einzelnen Messungen nur mit destilliertem H₂O durchgespült, um

Verunreinigungen vorzubeugen. Im Kanal FL1 wurde das emittierte Fluoreszenzlicht des Farbstoffes FITC gemessen und im Kanal FL3 das von PI. Mit Hilfe der Software Cellquest (Becton-Dickinson) wurde jede Zelle entsprechend ihrem Wert für den ersten Parameter FITC (X-Achse) und den zweiten Parameter PI (Y-Achse) als Punkt in einem zweidimensionalen Dot-Plot-Diagramm abgebildet und ausgewertet.

Die Färbungen wurden pro Färbemethode bei n = 3 verschiedenen Patienten durch­geführt.

Histologie mit der Alcianblau-Färbung:

Für die histologische Untersuchung wurden am Kryostat 6 μm dicke Querschnitte der Nasenmuscheln angefertigt und bei –20°C gelagert. Die Fixierung erfolgte 5 min in
Aceton/Methanol im Verhältnis 1:1. Zur Färbung wurde 1%ige Alcianblau-Lösung für 30min eingesetzt, deren pH-Wert auf 2,5 mit 3%iger Essigsäure eingestellt wurde. Die Gegenfärbung erfolgte mit Kernechtrot für eine Inkubationszeit von 5 min. Es schloss sich eine Dehydrierung für jeweils 5 min mit 96%igem und mit 100%igem Alkohol an. Mit Xylol wurde der Alkohol ausgewaschen, die Konservierung in Kanadabalsam vor­genommen. Die sauren Mukopolysaccharide der sekretorischen Zellen wurden blau
angefärbt, während die Zellkerne rot erschienen.

Immunhistochemie mit Immunperoxidase-Färbung:

Die Immunperoxidase-Färbung (Abb. 14) mit dem EnVision™-System verwendete
unkonjugierte Primärantikörper gegen das Antigen und Konjugate mit einem Dextran­Rückgrat, an welches Anti-Maus-Sekundärantikörper und das Enzym Meerrettich­Peroxidase (HRP) gekoppelt waren, was eine Färbung in zwei Schritten ermöglichte.

	Abb. 14 : Immunperoxidase-Färbung mit dem EnVision™-System (Dako) in zwei Schritten. Schritt 1 bestand aus der Inkubation mit einem für das nachzuweisende Antigen spezifischen Primärantikörper aus der Maus. In Schritt 2 erfolgte die Inkubation mit einem Anti-Maus-Sekundärantikörper, der zusammen mit dem Enzym Meerrettich­Peroxidase (HRP) an ein Dextranpolymer gebunden war. Die spezifische Umsetzung des Substrats AEC durch das Enzym HRP führte zu einer Rotfärbung.

Zunächst wurden die Präparate 5 min in Aceton/Methanol 1:1 fixiert. Zur Trocknung wurden sie 20 min im Wärmeschrank bei 37°C aufbewahrt. Die weiteren Schritte
erfolgten in einer Feuchtkammer. Zur Hemmung der endogenen Peroxidase wurden die Präparate 5 min mit Peroxidase-Inhibitor-Lösung inkubiert. Danach wurde 5 min mit PBS gewaschen. Es folgten die Proteinblockierung mit Kasein für 20 min bei 37°C, um eine unspezifische Hintergrundfärbung zu reduzieren, und 5 min Waschen mit PBS. Jetzt konnte der primäre Antikörper aufgetragen werden, dann wurde 30 min bei 37°C inkubiert. Anschließend folgten zwei Waschritte für 5 min mit PBS. Danach wurde für 30 min bei 37°C das Enzym HRP aufgetragen. Nach zwei Waschschritten mit PBS
wurde das gebrauchsfertige Substrat AEC auf die Präparate getropft und 10 min
inkubiert. Das Enzym HRP katalysierte die Oxidation des Substrats AEC zu einem
roten Farbstoff. Nach Spülung mit destilliertem H₂O erfolgte die Gegenfärbung mit
Hämatoxylin 1:5 und die Bläuung der Zellkerne für 15 min in H₂O aus der Leitung.
Die Präparate wurden in Aquatex eingedeckt und die Färbung wurde mikroskopisch ausgewertet.

Immunfluoreszenz-Färbung mit Lektinen und Antikörpern:

Die Präparate wurden 5 min in Aceton/Methanol 1:1 fixiert und bei 37°C für 20 min
getrocknet. Nach 20 min Proteinblockierung mit Kasein bei 37°C und 5 min Waschen mit PBS konnten die fluoreszenzmarkierten Antikörper oder Lektine 30 min bei 37°C aufgetragen werden. Schließlich wurden die Präparate zweimal für 5 min mit PBS
gewaschen, optional mit dem blauen Fluoreszenzfarbstoff Bisbenzimide die Zellkerne gegengefärbt, noch einmal mit PBS gewaschen und in Fluoreszenzmedium eingedeckt.

Die Darstellung der Daten erfolgte als Mittelwert ± der Standardabweichung. Als
Signifikanzniveau wurde α = 0,05 gewählt.

Varianzanalyse nach Brunner:

Zur Bestimmung von signifikanten Unterschieden zwischen Messergebnissen wurde bei der Adhärenzstudie für n = 5 Patienten eine nichtparametrische Varianzanalyse für
longitudinale Daten nach Brunner durchgeführt [55]. Die Auswertung wurde mit dem Statistikprogramm SAS 8.2 vorgenommen.