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3.  Ergebnisse

3.1. Isolierung und Kultivierung

Die resezierten Nasenmuscheln sind durchschnittlich 2,7 cm lang mit einer Standard­abweichung von ± 0,7 cm. Bei der Aufarbeitung von n = 30 Nasenmuscheln ergibt sich im Mittelwert eine Zellzahl von 7,1 Mio. ± 4,4 Mio. Zellen pro Nasenmuschelpaar.

Durch die Alcianblau-Färbung (Abb. 15) an Kryoschnitten von nativem respiratorischem Gewebe wird das Sekret der Becherzellen blau gefärbt. Auf der Oberfläche des Epithels sind die Kinozilien der Zilienzellen zu sehen. Die Färbung mit Kernechtrot bewirkt eine Rotfärbung der Zellkerne. Da die Basalmembran frei von Zellkernen ist, lässt sie sich als Aussparung erkennen. Die Basalzellen befinden sich unmittelbar über der Basal­membran und lassen sich aufgrund der Lage identifizieren. Unterhalb der Basal­membran befindet sich eine Bindegewebsschicht, die als Lamina propria mucosae
bezeichnet wird.

Abb. 15 : Links ist die Alcianblau-Färbung der Nasenmuschel im nativen Zustand zu sehen (400 x). Das Sekret der Becherzellen wird blau gefärbt, die Basalmembran ist als Aussparung zu erkennen (A). Rechts wird die Nasenmuschel nach Dispase-Einwirkung und Präparation mit dem Skalpell ohne Epithel abgebildet. Die Basalmembran () bleibt vollständig erhalten (B).

Im Rahmen der Präparation wird das respiratorische Epithel vollständig von der Lamina propria abgelöst. Die Basalmembran bleibt dabei, trotz Dispase-Einwirkung und
Präparation mit dem Skalpell, als Barriere zum Bindegewebe weitgehend erhalten.


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Abb. 16 : Wachstumsverhalten der humanen respiratorischen Epithelzellen in der Kultur. Links sind Zellen der P0 und rechts der P1 abgebildet (100 x): Nach Aussaat adhärieren die Zellen innerhalb eines Tages (A, B), wachsen im Monolayer nach etwa sechs Tagen konfluent (C, D) und bilden nach ca. zehn Tagen einen Bilayer (E, F). Die Zellen der P0 adhärieren bevorzugt in Form von Inseln, in denen sich Zilienzellen befin­den (A). Nach Erreichen der Konfluenz weisen beide Zellkulturen eine charakteristische pflastersteinartige Morphologie auf (C, D).

Die humanen respiratorischen Epithelzellen (HRE-Zellen, Abb. 16) wachsen zunächst adhärent im Monolayer. Die HRE-Zellen aus der Primärkultur (P0) neigen dazu, „Inseln“


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zu bilden, d. h. sie adhärieren und proliferieren bevorzugt als größere Zellaggregate. In der Primärkultur befinden sich Zilienzellen bevorzugt in diesen „Inseln“, während ab der
ersten Passage (P1) kaum noch Zilienzellen erkennbar sind. In höheren Passagen
bleiben die HRE-Zellen stärker vereinzelt und verteilen sich gleichmäßig auf der Ober­fläche des Kulturgefäßes. In Kollagen-A-beschichteten T25-Kulturflaschen erreichen HRE-Zellen aus der P0 nach ca. sechs Tagen Konfluenz, HRE-Zellen aus der P1 nach etwa fünf Tagen. Zellkulturen, die konfluent gewachsen sind, weisen ein typisches pflastersteinartiges Relief auf, da die einzelnen HRE-Zellen eine polygonale Form
annehmen. Darüber hinaus wachsen die HRE-Zellen ohne erkennbare Kontaktinhibition in einer zweiten Schicht weiter: So entsteht aus dem Monolayer ein Bilayer. Nicht­adhärente Zellen wie Erythrozyten werden im Kulturverlauf durch Mediumwechsel
ausgewaschen.

3.1.1. Adhärenzverhalten

Direkt nach der Aussaat sind die HRE-Zellen der P1 noch abgerundet. Sie bilden
zunächst zytoplasmatische Ausläufer und nehmen mit fortschreitender Adhärenz eine längliche Form an. Mit dem Mikroskop lässt sich erkennen, dass die HRE-Zellen nach 12h auf Kollagen A schon eine längliche Form annehmen, während die HRE-Zellen auf Plastik noch abgerundet sind (Abb. 17).

Abb. 17 : Vergleich des Adhärenzverhaltens von humanen respiratorischen Epithel­zellen der P1 auf Kollagen A und Plastik als Kontrolle (100 x). Nach 12h haften auf
Kollagen A (A) mehr Zellen als auf Plastik (B). Die Zellen sind bei Aussaat noch
abgerundet und nehmen im Lauf der Adhärenz eine längliche Form an.


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Der Vergleich der beiden Gruppen Kollagen A und Plastik erfolgt für n = 5 Patienten (Abb. 18). Die Zelladhärenz nimmt in beiden Gruppen kontinuierlich zu und erreicht ihr Maximum nach 20h. Es zeigt sich, dass zu allen Zeitpunkten auf Kollagen A mehr HRE­Zellen haften als auf Plastik, wobei die restlichen nicht-adhärenten Zellen vor der Zell­zählung ausgewaschen werden. Nach 20h sind 43% der HRE-Zellen auf Kollagen A und 34% auf Plastik adhärent. Die Differenz zwischen den beiden Gruppen nähert sich somit an. Aber bei Betrachtung des gemittelten Effekts über alle Zeitpunkte ergibt die Varianzanalyse nach Brunner einen signifikanten Unterschied (p ≤ 0,0145) zwischen den beiden Gruppen.

Abb. 18 : Vergleich der Adhärenz auf Kollagen A und Plastik. Die Säulen geben den Mittelwert der Zellzahl in Prozent wieder. Die Fehlerbalken entsprechen der Standard­abweichung. Zu allen vier Zeitpunkten haften auf Kollagen A mehr Zellen als in der
Kontrollgruppe (Plastik).

3.1.2. Populationsverdoppelungszeit

Für die HRE-Zellen auf Kollagen-A-beschichteten 12-Well-Platten wird der folgende Kulturverlauf beobachtet. In den ersten beiden Tagen scheint die Zelldichte annähernd konstant zu bleiben. Ein deutlicher Anstieg in der Zelldichte lässt sich nach ca. zwei


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Tagen verzeichnen. Die Zellkulturen erreichen nach etwa fünf Tagen Konfluenz und wachsen anschließend im Bilayer weiter. Nach einer Woche verlangsamt sich das Wachstum der HRE-Zellen bis die Zellzahl stagniert. Für n = 3 Patienten werden die Zellzahlen im Wachstumsverlauf protokolliert und halblogarithmisch gegen die Zeit
aufgetragen (Abb. 19).

Abb. 19 : Grafische Darstellung der Wachstumskurven der humanen respiratorischen Epithelzellen. Die Populationsverdoppelungszeit wird aus der Mitte der exponentiellen Wachstumsphase einer Zellpopulation bestimmt. Die gestrichelten Linien zeigen
exemplarisch für Patient 1, dass eine Verdoppelung von 105 auf 2 x 105 Zellen eine Zeitspanne von ca. 19h in Anspruch nimmt.

Die Populationsverdoppelungszeit (tPD) lässt sich aus dem exponentiellen Wachstums­bereich einer Zellpopulation errechnen, wobei der größte Anstieg der Zellzahl nach rund drei Tagen zu verzeichnen ist. Für n = 3 Patienten ergibt sich nach der Formel für tPD ein Wert von 23 ± 3h. Alternativ wird die tPD im exponentiellen Wachstumsbereich
grafisch bestimmt (Abb. 19). Für Patient 1 wird beispielhaft die Verdoppelung von 100.000 auf 200.000 Zellen auf der Ordinaten abgetragen. Durch Projektion auf die


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Abszisse lässt sich die tPD ablesen, die für Patient 1 etwa 19h beträgt. Für n = 3
Patienten ergibt sich nach der grafischen Methode eine tPD von 21 ± 9h.

3.1.3. Expansionsstudie

Insgesamt werden n = 6 Patienten über mindestens vier Passagen subkultiviert, um das Vermehrungspotential der HRE-Zellen zu untersuchen. Die Zellzahl wird halb­logarithmisch gegen die Zeit aufgetragen (Abb. 20).

Abb. 20 : Vermehrung der humanen respiratorischen Epithelzellen über mehrere Passagen. Innerhalb eines Monats kann die anfängliche Zellzahl durchschnittlich auf das 383fache expandiert werden. Die Faktoren Alter und Rauchen scheinen dabei
keinen negativen Einfluss auszuüben.

In den ersten drei Passagen kann jeweils etwa eine Verfünffachung der Zellzahl erreicht werden. Ab der P4 wird durchschnittlich nur noch eine Verdreifachung der Zellzahl
erreicht. Die Vitalität liegt bis zur P4 über 80% und fällt in der P5 bis auf 60% ab,
sodass von einer weiteren Subkultivierung abgesehen wird. Durch Extrapolation kann


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errechnet werden, dass eine Zellexpansion auf durchschnittlich 230 Mio. Zellen möglich ist, was einer 383fachen Vermehrung entspricht. Eine langsamere Proliferation bei Rauchern oder älteren Patienten ist nicht zu beobachteten.

Abb. 21 : Morphologie der humanen respiratorischen Epithelzellen über mehrere Passagen (100 x): P0 (A), P1 (B), P2 (C), P3 (D), P4 (E), P5 (F). In der P0 (A) nehmen die Zellen nach Erreichen der Konfluenz eine polygonale Form an und es entsteht
ein kopfsteinpflasterartiges Muster. Der Zelldurchmesser nimmt mit jeder Passage zu, unförmige Zellen tragen in der P5 (F) zu einer heterogenen Morphologie bei.


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In der Expansionsstudie wird die Morphologie der HRE-Zellen über mehrere Passagen hinweg beobachtet (Abb. 21). Nach Erreichen der Konfluenz nehmen die HRE-Zellen eine polygonale Form an und bilden ein charakteristisches kopfsteinpflasterartiges
Muster. Die HRE-Zellen zeigen in der Primärkultur und in den unteren Passagen eine homogene Morphologie. Der Zelldurchmesser nimmt mit jeder Passage kontinuierlich zu. In der P0 beträgt der Zelldurchmesser im Durchschnitt noch 12 μm und in der P1
erreicht er bereits 20 μm. In höheren Passagen tragen unförmige Zellen zu einer
heterogenen Morphologie bei.

3.2. Zellmarkerspezifitäten

Alcianblau-Färbung von Becherzellen auf Chamber Slides:

Zur Charakterisierung der HRE-Zellen im Monolayer erfolgt ein semiquantitativer Nach­weis von Becherzellen mit der Alcianblau-Färbung über mehrere Passagen. In der P0 sind mehrfach Gruppierungen von Becherzellen anzutreffen. In der P1 finden sich noch vereinzelt Becherzellen. Bereits ab der P2 lassen sie sich nicht mehr nachweisen.

Immunperoxidase-Färbung an Kryoschnitten von nativem Gewebe:

Die Bindungsspezifitäten der monoklonalen Antikörper 34βE12, CD44S und CD44v6 werden an Kryoschnitten von nativem respiratorischem Gewebe getestet (Abb. 22). Die Antigen-positiven Zellen werden durch die Immunperoxidase-Färbung rot gefärbt. Bei Negativkontrollen mit Maus IgG1 ist keine Rotfärbung zu beobachten. Die Gegen­färbung mit Hämatoxylin führt zu einer Blaufärbung der Zellkerne.

Der Nachweis der Zytokeratine CK5/14 erfolgt mit dem monoklonalen AK 34βE12.
Die Färbung fällt für die Basalzellen positiv aus, da bei allen drei Patienten die Basal­zellen rot gefärbt sind. Allerdings werden auch die sekretorischen Zellen angefärbt, nämlich die Becherzellen im Epithel und die Drüsen im Bindegewebe. Mit dem
AK CD44S werden im Epithel ausschließlich Basalzellen markiert. Unterhalb der
Basalmembran werden im Bindegewebe Fibroblasten und Zellen aus der hämato­poetischen Entwicklungsreihe angefärbt. Die Färbung mit AK CD44v6 erfasst nur
Basalzellen. Die Zellen im Bindegewebe verhalten sich alle negativ zu AK CD44v6.


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Abb. 22 : Immunperoxidase-Färbung an Kryoschnitten von nativem respiratorischem Gewebe (400 x): Links wird die Färbung mit AK CD44S (A), AK CD44v6 (C) und rechts die dazugehörigen Negativkontrollen (B, D) dargestellt. Das Antigen CD44S (A) befindet sich auf den Basalzellen und auf Zellen im Bindegewebe, während CD44v6 (C) ausschließlich auf den Basalzellen exprimiert wird.

Immunperoxidase-Färbung von Zellkulturen im Air-Liquid-Interface:

Für den Nachweis von Vorläuferzellen in ALI-Kulturen findet eine immunhistochemische Auswertung mit AK 34βE12 und AK CD44v6 statt. Dabei werden die Zellen aus der P0 und der P1 bei Konfluenz, sowie in der P1 acht Tage nach Konfluenz betrachtet.

Bei der Gegenüberstellung des monoklonalen AK 34βE12 und AK CD44v6 fällt auf, dass AK 34βE12 das Zytoplasma der Zellen durch Rotfärbung hervorhebt, während
AK CD44v6 die Zellgrenzen betont. Ansonsten zeigen sich beide Antikörper im Färbe­verhalten analog, sodass die folgenden Beobachtungen für beide gelten. In Monolayer­Kulturen der P0 und der P1 kommt es bei einem Großteil der Zellen (ca. 2/3) zum
Antigennachweis und somit zur Rotfärbung. Nach Erreichen der Konfluenz setzt sich


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das Zellwachstum in bestimmten Bereichen im Bilayer fort. Die Zellen im Bilayer lassen sich durch keinen der beiden monoklonalen AK anfärben und erscheinen durch die
Gegenfärbung mit Hämatoxylin blau.

Immunfluoreszenz-Färbung an Kryoschnitten von nativem Gewebe:

Die Zellkerne werden mit Bisbenzimide (Abb. 23) blau gefärbt und sind innerhalb des humanen respiratorischen Epithels palisadenförmig aufgereiht. Die Basalmembran ist als Aussparung zu erkennen. Im Bindegewebe liegen die Zellkerne in diffuser
Anordnung.

Abb. 23 : Immunfluoreszenzfärbung an Kryoschnitten von nativem respiratorischem Gewebe in Formalin (400 x). Die Färbung mit Bisbenzimide (A) gibt einen Überblick auf die Anordnung der Zellkerne im respiratorischen Epithel und im Bindegewebe darunter. In Formalin färbt UEA (B), neben dem Sekret der Becherzellen, auch die Kinozilien der Zilienzellen auf der Epitheloberfläche an.

UEA-Rhodamine:

Die Präparate, die mit UEA gefärbt werden, erhalten durch Rhodamine eine rote Fluoreszenz. Bei zwei Patienten werden die Becherzellen rot gefärbt, bei einem dritten Patienten ausschließlich die Basalzellen. Nach Fixierung der Präparate in Formalin (Abb. 23) werden neben den Becherzellen zusätzlich die Kinozilien auf den hochprismatischen Zilienzellen rot gefärbt.


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PNA-Fluoreszein:

Präparate, die mit PNA gefärbt werden, leuchten aufgrund des Farbstoffes Fluoreszein grün. Die Färbung mit PNA führt im humanen respiratorischen Epithel zu einer basalen Akzentuierung. Dabei wird die apikale Seite der Basalmembran angefärbt. Bei zwei Patienten werden die Basalzellen in einer unregelmäßigen Frequenz markiert. Hingegen werden bei einem drittem Patienten keine Basalzellen und dafür einige sekretorische Zellen angefärbt.

GSA-Ι-B4-FITC:

Die Farbgebung bei GSA (Abb. 24) erfolgt mit FITC, einem Fluoreszenzfarbstoff aus dem grünen Spektralbereich. Die Färbung mit GSA-FITC fällt jedoch, abgesehen von unspezifischen Randeffekten, bei allen drei Patienten negativ aus.

Abb. 24 : Immunfluoreszenz-Färbung an Kryoschnitten von nativem respiratorischem Gewebe in Aceton/Methanol (400 x). Im Vergleich: das Lektin GSA-FITC (A) und der monoklonale Antikörper CD44v6-FITC (B). Die Färbung mit dem Lektin GSA-FITC (A) bleibt negativ und führt lediglich zu unspezifischen Randeffekten. Durch den mono­klonalen Antikörper CD44v6-FITC (B) werden die Basalzellen spezifisch markiert und stellen sich als kontinuierliche Fluoreszenzbande dar.


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CD44v6-FITC:

Bei der Färbung mit dem monoklonalen AK CD44v6-FITC (Abb. 24) werden bei allen drei Patienten die Basalzellen angefärbt, aber keine weiteren Zellen im respiratorischen Epithel oder im Bindegewebe. Die Basalzellen erscheinen im gefärbten Präparat als durchgehende Fluoreszenzbande.

3.3. Magnetische Separation von Vorläuferzellen

Dichtezentrifugation mit dem Percoll-Gradienten:

Mit dem Percoll-Gradienten gelingt es, die Erythrozyten, deren Anzahl im Vergleich zu den HRE-Zellen etwa ein Fünffaches beträgt, fast vollständig aus dem Zellgemisch zu depletieren. Durch die Dichtezentrifugation kommt es jedoch insgesamt zu einem
Verlust von etwa 1/4 aller HRE-Zellen. Die Vitalität steigt von ca. 80% auf 95% an und zeugt von einer zusätzlichen Depletierung der toten Zellen.

MACS mit dem Lektin GSA-FITC:

Das Lektin GSA-FITC (Tab. 1) wird bei fünf Patienten eingesetzt, um die Basalzellen mit magnetischen Partikeln zu konjugieren und anschließend als eigene Population
zu separieren. Es zeigt sich jedoch, dass die meisten Zellen aus dem humanen respira­torischen Epithel negativ für dieses Epitop sind und die positive Fraktion nicht mehr als 5% erreicht. Die GSA-positiven Zellen werden mit Farbstoff Fluoreszein markiert
und leuchten deshalb grün. Allerdings entwickeln die positiven Zellen in dieser
Versuchsreihe weder im Fluoreszenzmikroskop noch im FACS ein hinreichend
starkes Fluoreszenz-Signal, das eine Quantifizierung der positiven Zellen einwandfrei ermöglichen würde. Selbst die Titration des Lektins GSA-FITC mit Konzentration bis zu 40 μg/ml und Kontrollen ohne Anti-FITC-Microbeads führen nicht zu einer eindeutig
positiven Färbung.


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MACS mit dem monoklonalen Antikörper CD44S:

Die Separation von Zellen, die positiv für das Epitop CD44S (Tab. 1) sind, ergibt eine Fraktion von 11%. Hingegen führen Kontrollen ohne primären Antikörper nur zu einer Fraktion von ca. 2%. Zur besseren Vergleichbarkeit von verschiedenen MACS-Läufen wird die positive Fraktion auf alle zurückgewonnenen Zellen (positive und negative Fraktion) bezogen und dann als Ausbeute von positiven Zellen angegeben, die in
diesem Fall 20% beträgt. Die monoklonalen Antikörper gegen das Epitop CD44S
markieren, neben den Basalzellen, auch die Erythrozyten. Diese bewirken, wenn sie nicht depletiert werden, eine Rotfärbung des Primärisolats, das mittels MACS in eine klarsichtige negative Fraktion ohne Erythrozyten und eine rötliche positive Fraktion mit Erythrozyten separiert wird.

Tab. 1 : Magnetische Separation zur Anreicherung von Vorläuferzellen

 

GSA-FITC (n = 5)

CD44S (n = 3)

CD44v6 (n = 5)

Ungefärbte Originalfraktion

100%

100%

100%

Gefärbte Originalfraktion

keine Angaben

74%

63%

Negative Fraktion (NF)

48%

45%

41%

Positive Fraktion (PF)

5%

11%

10%

Rückgewinnung = PF + NF

53%

56%

51%

Ausbeute = PF/(PF + NF)

9%

20%

20%

Der methodische Fehler für die positive Fraktion beträgt mindestens 2%. Dieser Fehler wird ermittelt, indem ungefärbte Zellen, nur mit Microbeads inkubiert, über die Trenn­säule gegeben werden. Die Rückgewinnung liegt bei über 50%, d. h. im Rahmen der magnetischen Separation werden von der ursprünglichen Zellsuspension (ungefärbte Originalfraktion) mehr als 50% der Zellen zusammen in der negativen und positiven Fraktion wiedergewonnen. Die restlichen Zellen gehen während der Waschschritte bei der magnetischen Markierung und durch die Filtration der Zellsuspension vor der Trennsäule verloren.


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MACS mit dem monoklonalen Antikörper CD44v6:

Für n = 5 Patienten wird eine magnetische Separation mit dem monoklonalen
AK CD44v6 (Tab. 1) vorgenommen. Nach Depletierung der Erythrozyten entsteht ein Gemisch aus HRE-Zellen (ungefärbte Originalfraktion), aus dem standardisiert 5 Mio. Zellen (100%) zur weiteren Verarbeitung entnommen werden. Es folgt die Markierung mit AK CD44v6 und die Kopplung mit den magnetischen Partikeln. Durch die hierfür notwendigen Waschschritte kommt es zu einem Zellverlust von ca. 1/3. Die markierte Zellsuspension wird nun als gefärbte Originalfraktion (63%) auf die Trennsäule im
Magnetfeld gegeben. Der Durchlauf bildet die negative Fraktion (41%). Außerhalb des Magnetfeldes wird anschließend die positive Fraktion (10%) durch Eluieren gewonnen und ergibt, bezogen auf alle zurückgewonnenen Zellen (51%), eine 20%ige Ausbeute von CD44v6 positiven Zellen.

Abb. 25 : Kultivierung der verschiedenen Populationen nach MACS (100 x). Die
Zellen aus der positiven Fraktion (A) und aus der negativen Fraktion (B) zeigen
adäquates Proliferationsverhalten. Nach vier Tagen in der Kultur unterscheidet sich die Morphologie der beiden Populationen nur unwesentlich.

Nach der magnetischen Separation werden die Zellen aus den vier Fraktionen in
Kollagen-A-beschichteten T25-Kulturflaschen eine Woche erfolgreich kultiviert und
einmal passagiert (Abb. 25). Im Vergleich zur ungefärbten Originalfraktion zeigen die
Zellen aus den anderen drei Fraktionen (gefärbte Originalfraktion, negative und positive


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Fraktion) initial eine verminderte Adhärenz und eine geringere Proliferation. Nach einer Passage gleichen sich die Unterschiede im Adhärenz- und Proliferationsverhalten bei allen Fraktionen an.

MACS von Vorläuferzellen aus Primärkultur:

Die primären HRE-Zellen werden bis zum Erreichen der Konfluenz kultiviert, durch Trypsinierung wieder gelöst und anschließend magnetisch separiert. Zur Nutzung eines Percoll-Gradienten besteht keine Notwendigkeit, da die Erythrozyten bereits durch
Mediumwechsel ausgewaschen sind. Die Vitalität der HRE-Zellen liegt bei ca. 90%.
Der durchschnittliche Zelldurchmesser der P1 beträgt 20 μm und stellt kein Hindernis für das Passieren der Zellen durch Vorfilter und Trennsäule dar. Die magnetische
Zellseparation wird für die primären Marker GSA-FITC, AK CD44S und AK CD44v6
vorgenommen. Als Resultat werden für GSA-FITC und AK CD44v6 weniger als 10% Ausbeute erzielt. Die Separation mit AK CD44S führt zu einer wesentlich höheren
Ausbeute von 35%.

Analyse der magnetischen Separation mit dem Durchflusszytometer:

Im Anschluss an die magnetische Separation werden die folgenden vier Fraktionen
im FACS analysiert: ungefärbte Originalfraktion, gefärbte Originalfraktion, negative Fraktion und positive Fraktion (Abb. 26).

Die Vitalität entspricht dem Anteil der PI-negativen Zellen (PI < 102) und beträgt für die ungefärbte Originalfraktion noch 79%, für die gefärbte Originalfraktion 64%, für die
negative Fraktion 68% und für die positive Fraktion nur 58%. Die restlichen Zellen sind PI-positiv (PI > 102) und werden als tote Zelle betrachtet. Im Hinblick auf CD44v6-FITC ergeben sich zwischen der ungefärbten Originalfraktion als Kontrolle und den
übrigen drei Fraktionen (gefärbte Originalfraktion, negative und positive Fraktion) keine eindeutigen Unterschiede. Die ungefärbte Originalfraktion liefert den Referenzwert
für CD44v6-FITC-negative Zellen (FITC < 102), da nur die Eigenfluoreszenz der Zellen gemessen wird. Die übrigen drei Fraktionen enthalten keine eindeutig CD44v6-FITC­positiven Zellen (FITC > 102). Lediglich in der positiven Fraktion kommt es bezüglich des Parameters FITC, verglichen mit der negativen Fraktion, zu einer graduellen


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Rechtsverschiebung. Selbst nach Austitrieren des Primärantikörpers AK CD44v6-FITC mit Konzentrationen von 0,5 bis 5 μg/ml und in Kontrollen ohne Anti-FITC-Microbeads lässt sich keine eindeutig positive Färbung nachweisen.

Abb. 26 : FACS-Analyse der magnetischen Separation mit dem monoklonalen
Antikörper CD44v6-FITC und Anti-FITC-Microbeads: ungefärbte Originalfraktion (A), gefärbte Originalfraktion (B), negative Fraktion (C), positive Fraktion (D). Zwischen der negativen Fraktion (C) und der positiven Fraktion (D) lässt sich nur eine graduelle Rechtsverschiebung beobachten. Die Vitalität entspricht dem Anteil der PI-negativen Zellen und liegt bei der ungefärbten Originalfraktion (A) noch bei 79% und fällt in der positiven Fraktion (D) auf 58% ab.


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21.02.2005