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4.  Diskussion

Die Ziele der vorliegenden Arbeit beinhalten die Isolierung von vitalen humanen
respiratorischen Epithelzellen (HRE-Zellen) und ihre Kultivierung, wobei typische
morphologische Eigenschaften beibehalten werden. Erstmalig soll eine Methode
etabliert werden, die eine magnetische Separation von Vorläuferzellen aus dem
humanen respiratorischen Epithel gewährleistet. Auf der Ebene von nativen Basalzellen und in Epithelzellmischkulturen gelingt der Nachweis von CD44v6-positiven Zellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen die These, dass Vorläuferzellen des humanen
respiratorischen Epithels das Potenzial zur Epithelisierung der Trachea besitzen.

4.1. Isolierung und Kultivierung

Die Isolierung der HRE-Zellen soll eine möglichst hohe Zellanzahl ergeben und dabei eine Kontamination durch andere Zellen wie z. B. Fibroblasten weitgehend vermeiden. Bei den primär isolierten HRE-Zellen handelt es sich stets um ein Gemisch aus Basal­zellen, Becherzellen und Zilienzellen [56]. Mittels schonender Präparation wird die
Basalmembran als natürliche Barriere zwischen Epithel und Bindegewebe erhalten, was eine Kontamination durch Fibroblasten nahezu verhindert.

Mikroskopisch lassen sich HRE-Zellen und Erythrozyten unterscheiden: Erythrozyten sind kernlos und haben mit 7,5 μm einen kleineren mittleren Durchmesser [5]. Eine ein­deutige Identifizierung im Hämozytometer gestaltet sich jedoch im Einzelfall schwierig. Deshalb ist die Zellzahlbestimmung der HRE-Zellen im Primärisolat mit einer Unschärfe behaftet, die zu einer Fehlerquote von mindestens 10% führt [54]. Die selektive Lyse der Erythrozyten mit 1%iger Essigsäure erleichtert die Zählung der verbleibenden HRE­Zellen. Dabei variiert die benötigte Einwirkzeit abhängig von der osmotischen Resistenz der Erythrozyten. Die Vitalität der primär isolierten HRE-Zellen liegt deutlich über 80% und genügt damit den Anforderungen für eine anschließende Kultivierung [57].

Die Kultivierung mit serumfreiem AECG-Medium begünstigt die Proliferation der HRE­Zellen [58]. Eine Vermehrung von Fibroblasten wird hingegen nicht unterstützt [27]. Dies bestärkt die Annahme, dass ein Großteil der kultivierten Zellen epithelialen
Ursprungs ist. Wie in der Literatur beschrieben, erreichen die HRE-Zellkulturen auf
Kollagen nach einem Wachstum von ca. sechs Tagen im Monolayer die Konfluenz [59].


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In der vorliegenden Arbeit nehmen die HRE-Zellen nach Erreichen der Konfluenz eine polygonale Form an und erzeugen dadurch ein pflastersteinartiges Muster, was mit
Angaben aus der Literatur konform ist [60, 61]. Dies zeigt, dass der Zell-zu-Zell-Kontakt einen entscheidenden Einfluss auf die Morphologie ausübt.

4.1.1. Adhärenzverhalten

Bei Betrachtung des Adhärenzverhaltens der HRE-Zellen ergeben sich zwei relevante Aspekte. Erstens stellt die Fähigkeit zur Adhärenz eine notwendige Voraussetzung zur Proliferation dar, weil eine Vermehrung von HRE-Zellen in Suspensionskulturen nicht stattfindet [62]. Zweitens ergibt sich durch die Tatsache, dass nicht alle Zellen aus dem Zellgemisch die Fähigkeit zur Adhärenz besitzen, zwangsläufig eine Selektion [47].

Basalzellen und Becherzellen gehören zu den Zellen, die adhärieren können [63].
Zilienzellen besitzen jedoch aufgrund ihrer Eigenbewegung eine eingeschränkte Fähig­keit zur Adhärenz [63]. Sie neigen dazu, freiflottierende Sphäroide zu bilden [64]. In Zellaggregaten können sie allerdings infolge des bedingten Zellkontaktes durchaus
adhärieren.

Einen wichtigen Faktor für die Adhärenz stellt die Oberflächenbeschaffenheit
des Kulturgefäßes dar. Im Vergleich zwischen unbeschichteten und Kollagen-A­beschichteten Polystyrol-Kulturgefäßen zeigt sich ein signifikanter Unterschied mit p ≤ 0,0145 zugunsten der Adhärenz auf Kollagen A. Laut Angaben des Herstellers
Biochrom AG besteht Kollagen A zu 95% aus Kollagen Typ Ι und zu 5% aus Kollagen Typ IV. Als integralen Bestandteil enthält die Basalmembran in vivo Kollagen Typ IV [5]. Deshalb kann mit Kollagen A in vitro die Matrix der Basalmembran simuliert werden, um so das Adhärieren der HRE-Zellen zu begünstigen.

Die Adhärenzstudie belegt, dass die Anzahl der adhärenten HRE-Zellen stetig zunimmt und auf Kollagen A nach 20h ein Maximum von 43% erreicht. Eine vollständige
Adhärenz aller Zellen aus dem Zellgemisch ist nicht zu erwarten, da überwiegend vitale Basal- und Becherzellen adhärieren [63]. In der Literatur wird eine Steigerung der
Adhärenz von respiratorischen Epithelzellen der Ratte durch Vorbehandlung der Kultur­oberfläche mit Kollagen beschrieben [27]. Für die HRE-Zellen wird ebenfalls gezeigt, dass die Adhärenz auf Kollagen A bereits nach 12h, jedoch auf Plastik erst nach 16h


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weitgehend abgeschlossen ist. In weiterer Konsequenz wird durch eine frühzeitige
Adhärenz die Progression der Proliferation begünstigt [65].

4.1.2. Proliferationsverhalten

Die Zellproliferation lässt sich prinzipiell in die drei Stadien Lag-, Log- und Plateau­Phase gliedern [53]. Die Proliferation der HRE-Zellen nimmt folgenden Verlauf: In der Lag-Phase erfolgt die Anpassung der HRE-Zellen an die Kulturbedingungen. Sie währt ungefähr einen Tag und es findet keine relevante Zellvermehrung statt. Danach setzt in der Log-Phase die Zellvermehrung ein, in der die Anzahl der HRE-Zellen ungefähr bis zum fünften Tag exponentiell zunimmt. Nach rund einer Woche schließt sich die
Plateau-Phase an, in der sich das Zellwachstum verlangsamt. Die Proliferation der HRE-Zellen nimmt etwa zeitgleich mit Erreichen der Konfluenz ab. Eine Kontakt­inhibition ist jedoch nicht erkennbar, da sich das Wachstum im Bilayer fortsetzt.

Für die Herstellung eines epithelisierten Trachealersatzes ist es von Bedeutung,
innerhalb kurzer Zeit eine große Anzahl von vitalen HRE-Zellen zu erzeugen. Zur
Charakterisierung der Proliferationskinetik eignet sich die Populationsverdoppelungszeit (tPD). Sie benennt die benötigte Zeit, um innerhalb exponentiellen Wachstums die Zell­zahl zu verdoppeln [53]. In der Literatur wird für die HRE-Zellen aus nasalen Polypen eine tPD = 36h beschrieben [66]. In der vorliegenden Arbeit wird für die tPD der HRE­Zellen aus den Conchae nasales inferiores ein Mittelwert von 23h errechnet. Bei der Beurteilung der tPD muss jedoch beachtet werden, dass sie von Faktoren wie Aussaat­dichte (hier 12.000 Zellen/cm2) und Beschichtung der Kulturoberfläche (hier Kollagen A) abhängig ist.

In der Expansionsstudie wird die Proliferationskapazität der HRE-Zellen über vier
Passagen verfolgt. Bei den sechs Patienten ergeben sich hinsichtlich der Proliferation keine offensichtlichen Unterschiede aufgrund der Faktoren Alter oder Rauchen. Ab
der P4 lässt sich bei allen HRE-Zellkulturen eine Verlangsamung der Proliferation
verzeichnen. Eine weitere Subkultivierung wäre zwar möglich, sollte aber aufgrund von morphologischer Degeneration, sinkender Vitalität und vermindertem Differenzierungs­potenzial nicht forciert werden.


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Eine Trachea mit beispielsweise einer Länge von 14 cm und einem Durchmesser von 2,7 cm besitzt eine Oberfläche von ca. 119 cm2 [4]. Zur vollständigen Epithelisierung der Trachea im Monolayer würden etwa 38 Mio. HRE-Zellen benötigt, wenn von einem durchschnittlichen Zelldurchmesser von 20 μm ausgegangen wird. Die Expansions­studie zeigt, dass innerhalb von vier Passagen eine Zellvermehrung um den Faktor 383 möglich ist. Aus einem Nasenmuschelpaar werden durchschnittlich 7,1 Mio. HRE-Zellen gewonnen. Bei Kultivierung aller HRE-Zellen kann eine theoretische Gesamtzellzahl von ca. 2,7 Milliarden erreicht werden. Damit würde die geforderte Zellzahl weit über­troffen und sogar für eine Epithelisierung der Trachea im Multilayer ausreichen. Die
Proliferationskapazität muss aber vor dem Hintergrund eines intakten Differenzierungs­potenzials, das nicht Gegenstand der Untersuchung ist, bewertet werden [67].
Letztendlich können nur differenzierte HRE-Zellen ein funktionelles respiratorisches
Epithel ausbilden, sodass eine epitheliale Barriere entsteht und die mukoziliäre
Clearance gewährleistet ist [39].

4.1.3. Differenzierung im Air-Liquid-Interface

Allgemein gilt für die Zellbiologie die Prämisse, dass Zellen zwei konträre
Funktionszustände annehmen können: Sie können entweder proliferieren oder sich
differenzieren, aber nicht beides gleichzeitig [68].

Zur vollständigen Funktionalität des respiratorischen Epithels gehört die mukoziliäre Clearance [39]. Ein wesentlicher Bestandteil von ihr ist der koordinierte Flimmerschlag der kinozilientragenden Zellen in Richtung des Pharynx [5]. Bei der konventionellen
Kultivierung der HRE-Zellen kommt es zu einer Dedifferenzierung [39]. Typische
Merkmale wie Zilienbesatz und Sekretion von Muzinen sind bereits nach einer Passage regredient.

Um das Milieu der Trachea in vitro nachzuempfinden, ist eine Kultivierung basierend auf dem Prinzip des Air-Liquid-Interfaces (ALI) geeignet [67]. Die Zellen befinden sich auf einer Kollagenmembran und erhalten eine Polarität, indem sie von der basalen Seite mit Medium unterspült und auf der apikalen Seite der gasförmigen Phase exponiert werden [69]. Dies birgt die Gefahr, dass mit Fortschreiten der Zellproliferation im Multilayer
die Diffusionsstrecke für das Nährmedium zu groß wird, sodass die oberen Zellen


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dehydrieren. Die Methode des ALI stabilisiert die Zilienexprimierung und soll die
Differenzierung von Vorläuferzellen zu zilienbildenden Zellen fördern [67].

Die immunhistochemische Charakterisierung der ALI-Kulturen gibt indirekt Aufschluss über das Differenzierungsverhalten der HRE-Zellen. Die eingesetzten Basalzellmarker AK CD44v6 und AK 34βE12 verhalten sich im Verteilungsmuster ihrer Anfärbung
analog und können gemeinsam diskutiert werden. Nach Erreichen der Konfluenz findet eine Exponierung der HRE-Zellen im ALI gegenüber der gasförmigen Phase statt, um eine Differenzierung zu induzieren. Die Monolayer-Kulturen der P0 und der P1 setzen sich größtenteils aus Antigen-positiven Zellen zusammen. Bei den positiv angefärbten HRE-Zellen handelt es sich folglich um Vorläuferzellen, wobei die Zulässigkeit einer Aufschlüsselung in Basalzellen und dedifferenzierte sekretorische Zellen unklar bleibt [26, 70].

Die Entwicklung der ALI-Kulturen setzt sich dergestalt fort, dass die Proliferation in
den Bilayer übergeht. Sukzessive wird die erste Schicht von Vorläuferzellen von
einer zweiten Zellschicht überzogen. Die Zellen des Bilayers erweisen sich als Antigen­negativ für AK 34βE12 sowie AK CD44v6. Das Färbeverhalten deutet darauf hin, dass es sich bei den Zellen im Bilayer nicht um Basalzellen, sondern möglicherweise um
differenzierte Zellen handelt. Zur Bestätigung müssten die differenzierten Zellen
immunhistochemisch identifiziert werden: Für die Detektion von Zilienzellen wird in der Literatur der AK 5B4/H3 beschrieben, der die Zilienzellen des Hasen auch unabhängig vom Zilienbesatz extrazellulär markieren kann [71]. Die humanen Becherzellen lassen sich durch AK HCS 18 detektieren, der spezifisch an intrazelluläre Muzine bindet [72].

4.2. Zellmarker für das humane respiratorische Epithel

Zellmarker sind unter zwei Aspekten von großer Bedeutung. Auf der einen Seite ist es nützlich, Marker zu finden, die die Identifizierung von Zelltypen aus dem humanen
respiratorischen Epithel erlauben. Der zweite Aspekt ist die Eignung des Zellmarkers für eine Separation. Die Tauglichkeit eines Markers für die Separation mittels MACS hängt von zwei Hauptkriterien ab: Der Marker muss für die Zielzelle eine hohe Spezifität
aufweisen und das Antigen sollte extrazellulär lokalisiert sein, um die Konjugation mit den Magnetpartikeln zu ermöglichen [50].


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4.2.1.  Alcianblau-Färbung

Mit der Alcianblau-Färbung erfolgt der histologische Nachweis von sauren Proteo­glykanen der Becherzellen [5]. Bei der Anfärbung von HRE-Zellen im Monolayer auf Chamber-Slides fällt auf, dass die Anzahl der muzin-produzierenden Becherzellen mit jeder Passage kontinuierlich abnimmt. Bereits nach zwei Passagen lassen sich keine blau gefärbten Zellen mehr nachweisen. Die Becherzellen gelten als teilungsfähig, sie dedifferenzieren jedoch während der Kultivierung [22]. Die Abnahme der Sekretion von Muzinen ist also nicht zwangsläufig mit der Abnahme von sekretorischen Zellen als Ganzes gleichzusetzen, sondern kann auch auf eine Dedifferenzierung von Becher­zellen zurückgeführt werden. Zur Identifikation der Becherzellen in Zellkulturen
wäre folglich ein sekretunabhängiger Marker ideal wie z. B. das Lektin HPA-gp120, das
sekretorische Zellen im respiratorischen Epithel des Hamsters unabhängig vom Muzin­gehalt bindet [73].

Tab. 2 : Zellmarker für das humane respiratorische Epithel. Für jede Färbemethode werden n = 3 Patienten aufgeführt.

n = 3

Zilienzellen

Becherzellen

Basalzellen

GSA

0

0

0

UEA in Formalin

+++

+++

0

UEA

0

++

+

PNA

0

+

++

34βE12

0

+++

+++

CD44S

0

0

+++

CD44v6

0

0

+++

+ , ++ , +++ : Anzahl der Patienten mit positivem Nachweis, 0: kein Nachweis


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4.2.2.  Lektine

Eine gängige Methode zur immunhistochemischen Charakterisierung des respira­torischen Epithels besteht in der Verwendung von Lektinen. Bei den Lektinen handelt es sich um Proteine, die meist aus Pflanzen stammen und mit bestimmten Kohlenhydraten reagieren [43].

UEA (Tab. 2) färbt bei zwei Patienten die Becherzellen an. In einem Fall kommt es
jedoch zum alleinigen Nachweis von Basalzellen. Nach vorheriger Fixierung in Formalin werden neben den Becherzellen auch die Kinozilien auf den hochprismatischen
Zilienzellen angefärbt. Es ist bekannt, dass Formalin zu einer Quervernetzung der
Proteine führt [5]. Außerdem färbt UEA die Glykokalyx auf der Epitheloberfläche an [27]. Eine spezifische Markierung der Kinozilien lässt sich dadurch aber nicht hinreichend
erklären. In der Literatur wird beschrieben, dass der Nachweis mit UEA nur für
Sekretoren, aber unabhängig von der jeweiligen Blutgruppe gelingt [74]. Allerdings kommt es bei Patienten mit der Blutgruppe 0 zu einer verstärkten Anfärbung der
Basalzellen [74].

PNA (Tab. 2) tendiert zu einer Färbung einzelner Basalzellen sowie der apikalen
Seite der Basalmembran. Bei einem Patienten kommt es jedoch ausschließlich zur Markierung von sekretorischen Zellen. Ein Grund für das Nichtanfärben der Basalzellen durch PNA kann die Maskierung der terminalen Galaktose durch Neuraminsäure sein [75]. Eine Färbung der Basalzellen mit PNA zeigt weder eine Abhängigkeit vom AB0­Blutgruppensystem noch vom Sekretor-Status [74].

GSA wird in der Literatur als ein spezifischer Marker für Basalzellen beschrieben [27, 76]. In der vorliegenden Arbeit fällt die Färbung mit GSA (Tab. 2) jedoch bei
allen drei Patienten negativ aus. Eine mögliche Ursache dafür ist, dass nur Sekretoren mit der Blutgruppe B und AB das Antigen für GSA besitzen [74]. Außerdem beruht der Nachweis der Spezifität von GSA für Basalzellen vor allem auf der Testung bei Ratten, weshalb eine Übertragbarkeit der Spezifität auf den Menschen umstritten ist [44].

Insgesamt scheint das Färbeverhalten der Lektine von interindividuellen Unterschieden und Blutgruppenzugehörigkeit dominiert zu werden. Deshalb genügen die Lektine
nicht dem Anspruch, einzelne Zelltypen aus dem humanen respiratorischen Epithel spezifisch nachzuweisen oder zu separieren.


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4.2.3.  Monoklonale Antikörper

Antikörper gegen die Zytokeratine CK5/14 gelten als Standard für den Nachweis
von Basalzellen [77]. Als intermediäre Filamente sind die Zytokeratine ein Teil des
Zytoskeletts der Zellen [78].

Der Nachweis der Basalzellen mit dem intrazellulären AK 34βE12 (Tab. 2) gelingt bei allen Patienten. Zusätzlich werden aber auch die Becherzellen und die seromukösen Drüsenpakete im Bindegewebe angefärbt. Die Färbung der sekretorischen Zellen
erscheint zuerst unerwartet, da AK 34βE12 als ein spezifischer Basalzellmarker
beschrieben wird [28]. Neben CK5/14 liegen jedoch auch die Zytokeratine CK1/10 im Spektrum von AK 34βE12, was zu einer Färbung der sekretorischen Zellen führt [79].

Das oberflächliche Epitop CD44 ist als Adhäsionsmolekül bekannt und bindet spezifisch an Hyaluronsäure [80]. Es kann zwischen einer Standardform CD44S und zehn
variablen Isoformen CD44v1 bis CD44v10 unterschieden werden [45]. Die ubiquitäre Standardform CD44S kann laut Angaben des Herstellers Dako auf folgenden Zellen nachgewiesen werden: Leukozyten und Erythrozyten aus der hämatopoetischen
Entwicklungsreihe, Fibroblasten im Bindegewebe und Basalzellen im Epithel. Die
variablen Isoformen von CD44 gelten als epithelrestriktiv; besonders hervorzuheben sind CD44v6 und CD44v9 als spezifische Marker für Basalzellen [46]. Bisher wird der Nachweis von Basalzellen mit monoklonalen Antikörpern gegen CD44v6 im humanen bronchialen Epithel beschrieben [81]. In der vorliegenden Arbeit werden Basalzellen aus dem oberen Respirationstrakt mit monoklonalen AK gegen CD44v6 (Tab. 2) nach­gewiesen. Der Nachweis des Antigens CD44v6 auf Basalzellen gelingt an nativen
Kryoschnitten der Conchae nasales inferiores bei drei verschiedenen Patienten, und zwar sowohl durch Immunperoxidase-Färbung, als auch durch Immunfluoreszenz­Färbung. In den ALI-Kulturen von primären und subkultivierten HRE-Zellen werden die Vorläuferzellen, die sich in der unteren Zellschicht unmittelbar auf der Kollagenmatrix befinden, mit AK CD44v6 angefärbt, während die Zellen in der oberen Zellschicht unge­färbt bleiben. Vorangegangene Studien von anderen Arbeitsgruppen zeigen sogar eine erhöhte Exprimierung von CD44v6 auf regenerativen Zellen z. B. nach Epithelzellverlust bei Asthma bronchiale [82]. Eine verstärkte Exprimierung von CD44v6 wird auch in vitro nach mechanischer Schädigung von Epithelzellkulturen beobachtet [83].


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Bei der Färbung der ALI-Kulturen mit AK CD44v6 und AK 34βE12 lässt sich
demonstrieren, dass die entsprechenden Antigene an unterschiedlichen Zellorten
lokalisiert sind. Die markante Akzentuierung der Zytoplasmamembran bestätigt, dass es sich bei CD44v6 um ein extrazelluläres Antigen handelt [45]. Hingegen wird mit
AK 34βE12 verstärkt das intrazelluläre Zytoplasma angefärbt, die Zytoplasmamembran jedoch ausgespart [79].

Der extrazelluläre Bindungsort und die Spezifität für Basalzellen offerieren, dass der monklonale AK CD44v6 ein spezifischer Marker zur Identifizierung und zur Separation von Basalzellen aus dem humanen respiratorischen Epithel ist.

4.3. Magnetische Separation von Vorläuferzellen

Durch magnetische Separation (MACS) soll aus dem humanen respiratorischen Epithel eine Population von Vorläuferzellen angereichert werden. Als Vorläuferzelle verfügt die Basalzelle über das Potenzial zur Proliferation und zur Differenzierung [84]. Deshalb besitzen die Basalzellen die Fähigkeit zur Restitutio ad integrum, also zur vollständigen Wiederherstellung, des respiratorischen Epithels [85]. Durch die Anreicherung einer
reinen Basalzellpopulation eröffnen sich molekularbiologische Analysemöglichkeiten für chronische Atemwegsentzündungen, die Tumorgenese und die Gentherapie [25].

MACS und FACS mit GSA-FITC:

In vorangegangenen Studien wird demonstriert, dass Basalzellen aus dem respira­torischen Epithel der Ratte erfolgreich mittels FACS angereichert werden können [27]. Dies gelingt ebenfalls mittels MACS [51]. Die genannten Studien basieren auf der
Verwendung des Lektins GSA-FITC als spezifischen Marker für die Basalzellen der
Ratte. In einer weiteren Studie wird versucht, eine Population aus humanen Basalzellen durch Verwendung von GSA-FITC im FACS anzureichern [52]. Problematisch erscheint aber, dass sich die Spezifität von GSA für Basalzellen der Ratte nicht uneingeschränkt auf humane Basalzellen übertragen lässt, da diese nicht gebunden werden [44]. Eine
andere Aussage lautet, dass ein positiver Nachweis von humanen Basalzellen mit dem Lektin GSA nur bei Sekretoren der Blutgruppen B und AB möglich ist [74]. In der
vorliegenden Arbeit führt die magnetische Zellseparation mit GSA-FITC lediglich zur


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einer positiven Fraktion von ca. 5% und unterscheidet sich damit nur unwesentlich von dem methodischen Fehler, der 2% beträgt. Die Überprüfung der Bindungsspezifität von GSA-FITC an nativen Kryoschnitten führt bei allen drei Patienten zu einem negativen Resultat. Die Tauglichkeit von GSA-FITC zur Separation von humanen Basalzellen steht somit zur Disposition.

MACS mit AK CD44S:

Die magnetische Separation mit AK CD44S ergibt eine positive Fraktion von durch­schnittlich 11% und hebt sich klar vom methodischen Fehler mit 2% ab. Bezogen
auf die Anzahl der zurückgewonnen Zellen ergibt sich sogar eine Ausbeute von 20% positiven Zellen. Die Ausbeute ist ein relatives Maß und berücksichtigt die variierenden Zellverluste, die während der magnetischen Markierung und Separation entstehen. Trotz der guten Separationsergebnisse muss es als nachteilig angesehen werden, dass der AK CD44S nicht monospezifisch für Basalzellen ist, sondern auch die Erythrozyten und Fibroblasten bindet [86]. Die Erythrozyten können problemlos durch die Dichte­zentrifugation mit dem Percoll-Gradienten entfernt werden und beeinflussen somit
die Kultivierung nicht. Hingegen stellen die Fibroblasten trotz sorgfältiger Präparation eine potenzielle Quelle der Kontamination dar, weil sie in der Kultur proliferieren und
morphologisch den Basalzellen ähnlich sind [27]. Deshalb sollten bei der Anreicherung von Basalzellen mittels MACS nur epithelrestriktive Antikörper, wie z.B. AK gegen die variablen Isoformen von CD44, verwendet werden.

MACS mit AK CD44v6:

In der vorliegenden Arbeit wird erstmals der Marker AK CD44v6 verwendet, um Basal­zellen des humanen respiratorischen Epithels mittels MACS zu separieren. Tatsächlich lässt sich eine Ausbeute von 20% positiven Zellen erreichen, bei einer maximalen
Frequenz von 31% Basalzellen [28]. Die Rate der Zellrückgewinnung beträgt über
50%. Der Verlust der restlichen Zellen ist auf die wiederholten Waschschritte bei der magnetischen Markierung und die Verwendung eines Vorfilters vor der Trennsäule
zurückzuführen. Die HRE-Zellen reagieren empfindlich auf mechanische Scherkräfte, die während der magnetischen Separation auftreten. So sinkt die Vitalität in der


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positiven Fraktion um maximal 20% im Vergleich zu unseparierten HRE-Zellen. Die
separierten HRE-Zellen weisen trotzdem eine ausreichende Vitalität auf und können über eine Woche erfolgreich kultiviert werden. In der Literatur wird innerhalb des
respiratorischen Epithels den Basalzellen die höchste Proliferationskapazität
zugeschrieben [51]. Wider Erwarten ergeben sich für die potenziellen Basalzellen aus der positiven Fraktion keine Vorteile bezüglich der Proliferation. Stattdessen weisen alle separierten HRE-Zellen eine initial verminderte Adhärenz und geringere Proliferation im Vergleich zu den unseparierten HRE-Zellen auf. Eine verminderte Vitalität beeinflusst sowohl die Adhärenz als auch die Proliferation. Die Besetzung von oberflächlichen
Adhäsionsmolekülen durch Antikörper-Microbeads-Komplexe kann zu einer verzögerten Adhärenz führen. Nach Angaben der Firma Miltenyi Biotec sind diese Komplexe auf den Zielzellen insofern biodegradierbar, da sie innerhalb einer Woche dissoziieren oder durch intrazelluläre Endozytose eliminiert werden. Insgesamt besteht aber kein Hinweis auf eine permanente Schädigung der separierten HRE-Zellen, da sie spätestens nach einer Passage wieder adäquates Proliferationsverhalten zeigen.

MACS von Vorläuferzellen aus Primärkultur:

Im Rahmen der magnetischen Separation von Vorläuferzellen aus primär kultivierten HRE-Zellen ist zu erwarten, dass sich überwiegend die Vorläuferzellen des humanen respiratorischen Epithels in der Kultur vermehren, sodass ihr Anteil proportional
zunimmt. Dies würde den Beobachtungen aus der immunhistochemischen Auswertung der ALI-Kulturen entsprechen. Eine Steigerung der Ausbeute im MACS kann aber nur für AK CD44S mit einer Zunahme um 15% verzeichnet werden. Für AK CD44v6 kommt es hingegen zu einer Reduzierung der Ausbeute um 10%, obwohl die immun­histochemische Auswertung der ALI-Kulturen eine verstärkte Präsenz von CD44v6 zeigt. Die verminderte Ausbeute kann z. B. auf eine mangelnde Stabilität des Antigens CD44v6 zurückzuführen sein.

Stabilität des Antigens CD44v6:

Die Exprimierung des Antigens CD44v6 kann im nativen respiratorischen Gewebe und nach ca. drei Tagen in ALI-Kultur sicher nachgewiesen werden. Dagegen ist fraglich, ob


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das Antigen CD44v6 trotz enzymatischer Inkubation mit Dispase bzw. mit Trypsin voll­ständig erhalten bleibt oder erst durch De-Novo-Synthese wieder exprimiert wird.
Die Inkubation mit Trypsin bewirkt nämlich, dass sich KP8D4, ein anderes Antigen auf humanen Basalzellen, anschließend nicht mehr durch monoklonale AK nachweisen lässt [87]. Alternativ zum Trypsin kann Accutase zur enzymatischen Dissoziation von adhärenten Monolayerkulturen eingesetzt werden [88]. Eine Modifizierung der
enzymatischen Isolierung der HRE-Zellen aus dem Gewebeverband könnte in der
Verwendung der proteolytischen Enzyme Pronase und Kollagenase anstelle von
Dispase bestehen [53].

Weiterhin wird in der Literatur das Phänomen der rezeptormediierten Endozytose
beschrieben [89, 90]. Dabei ist die Bindung des Antikörpers an das oberflächliche
Epitop der Auslöser für seine intrazelluläre Endozytose. Die faktische Anzahl an
extrazellulären Epitopen wird dadurch vermindert. Dieser Umsatz kann z. B. bei Chondrozyten innerhalb von vier Stunden zu einer Verminderung des Oberflächen­antigens CD44 um ca. 20% führen [91]. Die Stabilität des Antigens CD44v6 auf frisch isolierten Zellen kann vorzugsweise im Durchflusszytometer durch fluoreszenz­konjugierte AK eindeutig überprüft werden.

FACS-Analyse der magnetischen Separation:

Die Effizienz der Zellseparation ist aus der FACS-Analyse ersichtlich. Die ungefärbte Originalfraktion wird als Negativkontrolle benötigt, um die Eigenfluoreszenz der Zellen zu berücksichtigen [92]. In der gefärbten Originalfraktion sollten zwei Populationen von unterschiedlicher Intensität bezüglich des Parameters FITC zu finden sein. Optimale Ergebnisse werden durch Titration des Primärantikörpers erreicht [47]. Für eine hohe Rückgewinnung sollen möglichst wenige Zielzellen (hier Basalzellen) in der negativen Fraktion verbleiben. Weiterhin soll eine hohe Reinheit an Zielzellen erreicht werden,
sodass in der positiven Fraktion außer den Basalzellen keine weiteren Zellen enthalten sind. Generell besteht ein Zielkonflikt zwischen Rückgewinnung und Reinheit bei der Zellseparation, da die Erhöhung der Reinheit zu einer geringeren Rückgewinnung führt und umgekehrt [47].


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Die Versuche mit FITC zur Signalgebung im FACS verlaufen suboptimal, da es
zwischen der positiven und negativen Fraktion nur zu einer marginalen Rechts­verschiebung kommt. Deshalb muss auf eine Angabe der Reinheit der separierten
Fraktionen verzichtet werden. Mögliche Störfaktoren sind unersichtlich, können aber
unter Umständen auf eine Beschädigung des Epitops durch den Dispase-Verdau bzw. die Trypsin-Einwirkung oder auf den Färbevorgang selbst zurückzuführen sein. Eine verminderte Intensität der Fluoreszenz aufgrund der Konjugation mit Microbeads wird durch Kontrollen ohne Microbeads ausgeschlossen.

4.4. Ausblick

Zellmarker für Basalzellen spielen sowohl für die Diagnostik als auch für die Zell­separation eine wichtige Rolle. Die magnetische Separation von Basalzellen aus dem humanen respiratorischen Epithel erfordert spezifische Marker, die an extrazelluläre
Epitope binden. So gilt die epithelrestriktive Isoform CD44v9 neben CD44v6 als ein
weiterer potenzieller extrazellulärer Marker für Basalzellen [82]. Das Integrin α6β4 kommt als Bestandteil der Hemidesmosomen ausschließlich auf Basalzellen vor, die deshalb durch monoklonale AK spezifisch gebunden werden können [19].

Die mukoziliäre Differenzierung der HRE-Zellen im Air-Liquid-Interface kann durch
additionale Faktoren wie z. B. Vitamin A gefördert werden [93]. Außerdem induziert der Serumersatz Ultroser G die Ziliogenese [94]. Weiterhin ist eine Co-Kultivierung von HRE-Zellen mit Chondrozyten oder Fibroblasten im ALI denkbar, um das Milieu der Trachea mit den entsprechenden Wachstumsfaktoren in vitro zu simulieren [95].

Das noch junge Forschungsgebiet „Tissue Engineering“ eröffnet neue Perspektiven in der Herstellung von autologen Gewebetransplantaten für die Kopf-Hals-Chirurgie und könnte das Problem der begrenzten Verfügbarkeit von autologen Ersatzmaterialien
lösen [3]. Studien zur Herstellung eines Trachealersatzes aus autologem Knorpel
sind vielversprechend. Eine klinische Anwendung scheitert aber bisher an einer
insuffizienten Epithelisierung und der damit verbundenen Restenosierung [9]. In der
vorliegenden Arbeit wird erstmals die Möglichkeit aufgezeigt, Vorläuferzellen durch magnetische Separation aus dem humanen respiratorischen Epithel anzureichern. Hierdurch stehen nun vitale Vorläuferzellen zur Verfügung, die eine ausreichende


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Proliferationskapazität und das Potenzial zur Differenzierung besitzen, um einen
bioartifiziellen Trachealersatz mit einem funktionellen respiratorischen Epithel
auszustatten. Im Tiermodell und durch weiterführende Differenzierungsversuche im Zwei-Phasen-Kultursystem muss noch gezeigt werden, inwiefern auf dieser Basis
ein in vitro hergestelltes Knorpel-Epithel-Transplantat den klinischen Anforderungen
entspricht.


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21.02.2005