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5.  Zusammenfassung

Hintergrund:

Eine operative Rekonstruktion der Trachea ist erforderlich, wenn langstreckige
Stenosen oder substanzielle Defekte auftreten. Der klinische Einsatz von bioartifiziellen Trachealprothesen scheitert bisher an einer unzureichenden Besiedelung mit einem funktionellen respiratorischen Epithel. Dies kann zu Komplikationen wie Infektionen
oder einer Obstruktion des Prothesenlumens durch Granulationsgewebe führen. Das humane respiratorische Epithel setzt sich aus Zilienzellen, Becherzellen und Basal­zellen zusammen. Dabei gelten letztere als Vorläuferzellen, da sie das Potenzial zur Proliferation und Differenzierung besitzen. Das respiratorische Epithel sorgt mit seinem
gerichteten Zilienschlag für die mukoziliäre Clearance, die auch nach rekonstruktiven Eingriffen an der Trachea intakt sein sollte. Eine Möglichkeit der Epithelisierung
von Trachealprothesen besteht in der In-vitro-Herstellung von autologen Epithel­transplantaten. Dieses Vorgehen soll durch die Methoden des Tissue Engineerings
gewährleistet werden. Hierbei kann durch Kultivierung und Differenzierung autologer Zellen sowie durch Verwendung von biokompatiblen Trägermaterialien ein funktionelles Gewebetransplantat hergestellt werden. Die Ziele der vorliegenden Arbeit beinhalten die enzymatische Isolierung von vitalen humanen respiratorischen Epithelzellen
sowie deren Vermehrung unter Wahrung typischer morphologischer Eigenschaften.
Aufgrund der Fähigkeit der Vorläuferzellen zur Proliferation und Differenzierung ist ihre Anreicherung mittels magnetischer Zellseparation (MACS) durch spezifische Basalzell­marker von besonderem Interesse.

Methoden:

Aus den operativ entnommenen Conchae nasales inferiores von 80 Patienten (mittleres Alter 40 ± 14 Jahre) werden durch enzymatischen Verdau mit Dispase II (2,4 U/ml) die humanen respiratorischen Epithelzellen (HRE-Zellen) aus dem Gewebeverband isoliert. Die Kultivierung dieser Zellen erfolgt in serumfreiem AECG-Medium auf Kollagen A, das die Adhärenz der Zellen fördern soll, sowie in einem Zwei-Phasen-Kultursystem
(Air-Liquid-Interface), um eine Differenzierung zu induzieren. Die Vorläuferzellen
aus dem Epithelzellgemisch werden mit dem Lektin GSA Ι B4 sowie mit den


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monoklonalen Antikörpern CD44S und CD44v6 extrazellulär markiert und anschließend mit magnetischen Microbeads konjugiert. Hierdurch wird eine positive Selektion
der Vorläuferzellen mittels MACS ermöglicht. Eine zusätzliche Fluoreszenzmarkierung mit FITC erlaubt die Kontrolle der Zellseparation im Durchflusszytometer. Durch
Immunhistologie werden die Bindungsspezifitäten der monoklonalen Antikörper (CD44S, CD44v6, 34βE12) und der Lektine (GSA Ι B4, PNA, UEA) an Kryoschnitten von nativem respiratorischem Gewebe und an Zellkulturen überprüft. Der Nachweis von sauren Proteoglykanen im Sekret der Becherzellen erfolgt histologisch durch die
Alcianblau-Färbung.

Ergebnisse:

Die Präparation der Nasenmuscheln ergibt Einzelzellsuspensionen aus vitalen HRE­Zellen (Vitalität > 80%, n = 30). Eine Beschichtung der Kulturoberfläche mit Kollagen A steigert die Adhärenz der HRE-Zellen signifikant (p ≤ 0,0145, n = 5), die bereits nach 12h weitgehend (zu ca. 2/3) abgeschlossen ist. In Monolayerkulturen nehmen die HRE­Zellen nach Erreichen der Konfluenz eine typische kopfsteinpflasterartige Morphologie an. Sie wachsen aber sukzessive ohne erkennbare Kontaktinhibition im Bilayer
weiter. In Air-Liquid-Interface-Kulturen lassen sich die Zellen im Monolayer immun­histochemisch mit CD44v6 überwiegend (zu ca. 2/3) als Vorläuferzellen identifizieren, während die Zellen im Bilayer eine anfängliche Differenzierung zeigen. In Kultur
benötigen die HRE-Zellen in der Log-Phase etwa einen Tag zur Verdoppelung
(Populationsverdoppelungszeit = 23h, n = 3). Durch Subkultivierung über vier Passagen während eines Monats ist eine exponentielle Zellvermehrung (383fach, n = 6) möglich. Hierbei sind morphologische Merkmale wie Kinozilien und Synthese von Muzinen
bereits nach einer Passage regredient. Die magnetische Zellseparation ergibt für die beiden Zellmarker CD44S (n = 3) und CD44v6 (n = 5) eine positive Zellfraktion von je ca. 20%. In der Immunhistochemie erweist sich nur die epithelrestriktive Isoform CD44v6 als spezifisch für Basalzellen, während CD44S neben Basalzellen auch Fibroblasten und Erythrozyten bindet. Hingegen ist eine spezifische Bindung
von GSA Ι B4 weder im MACS noch in der Immunhistochemie erkennbar. Die
anschließende Analyse der Zellseparation im Durchflusszytometer liefert aufgrund einer geringen Fluoreszenzintensität von FITC kein eindeutiges Ergebnis bezüglich der


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Reinheit der separierten Zellfraktionen. Diese weisen alle in Kultur zunächst ein
vermindertes Adhärenzverhalten, aber nach einer Woche ein adäquates Proliferations­verhalten auf.

Schlussfolgerung:

Die Ansätze des Tissue Engineerings zur Epithelisierung einer bioartifiziellen Tracheal-prothese sind vielversprechend, denn die Ergebnisse zeigen eine erfolgreiche Isolierung von vitalen HRE-Zellen sowie ihre Vermehrung in Monolayerkulturen
unter Beibehaltung phänotypischer Eigenschaften. Die Vorläuferzellen des humanen respiratorischen Epithels werden durch den Zellmarker CD44v6 spezifisch gebunden, was ihre selektive Anreicherung durch die magnetische Separation ermöglicht.


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21.02.2005