Aus der Klinik für Rheumatologie und Klinische Immunologie
der Medizinischen Fakultät der Charité - Universitätsmedizin Berlin

Dissertation

Isolierung, Kultivierung und
magnetische Separation
von Vorläuferzellen aus
humanem respiratorischem Epithel


Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)


vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité -
Universitätsmedizin Berlin


von
Marek Wentges
aus Bonn

Dekan: Prof. Dr. med. Martin Paul

Gutachter:
1. PD Dr. Michael Sittinger, Charité – Universitätsmedizin Berlin, Medizinische Klinik mit Schwerpunkt Rheumatologie und Klinische Immunologie, Interdisziplinäres Labor für Tissue Engineering
2. Prof. Dr. Oliver Kaschke, St. Gertrauden-Krankenhaus Berlin, Abteilung für HNO-Heilkunde, Plastische Gesichts- und Hals-Chirurgie
3. Prof. Dr. Dr. Rainer Schmelzeisen, Universitätsklinikum Freiburg, Abteilung für Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie

Datum der Einreichung: 31.10.2003

Datum der Promotion: 13.12.2004

Kurzfassung:

EINLEITUNG: Eine Trachealrekonstruktion bedingt Komplikationen wie z. B. Infektionen und Stenosierungen durch Granulationsgewebe. Diese werden durch ein differenziertes respiratorisches Epithel, das eine mukoziliäre Clearance ermöglicht, deutlich reduziert. Die Basalzellen gelten als die Vorläuferzellen des humanen respiratorischen Epithels (HRE), d. h. sie können sich teilen und besitzen das Potenzial zur Differenzierung. Durch die magnetische Zellseparation (MACS) sollen Vorläuferzellen aus dem HRE an­gereichert und anschließend kultiviert werden.

METHODEN: Die Conchae nasales inferiores von 80 Patienten (mittleres Alter 40 ± 14 Jahre) dienen als Zellquelle für HRE-Zellen, die mittels enzymatischen Verdaus mit Dispase II (2,4 U/ml) aus dem Gewebeverband isoliert werden. Die Kultivierung der HRE-Zellen erfolgt auf Kollagen-A-beschichteten Kulturgefäßen in serumfreiem AECG­Medium. Die Bindungsspezifität von verschiedenen extrazellulären Zellmarkern wie GSA Ι B4, CD44S und CD44v6 wird immunhistochemisch überprüft. Dabei erweist sich nur CD44v6 als spezifisch für Basalzellen. Die Vorläuferzellen aus dem HRE­Zellgemisch werden durch monoklonale Antikörper gegen CD44v6 und Goat-Anti­Mouse-Microbeads magnetisch konjugiert. Anschließend werden sie mittels MACS
positiv selektiert.

ERGEBNISSE: Die Präparation der Nasenmuscheln ergibt Einzelzellsuspensionen aus vitalen HRE-Zellen (Vitalität > 80%, n = 30). Eine Beschichtung der Kulturgefäße mit Kollagen A steigert die Adhärenz der HRE-Zellen signifikant (p ≤ 0,0145, n = 5).
Die Proliferationskinetik der HRE-Zellkulturen lässt sich durch die Populations­verdoppelungszeit charakterisieren (tPD = 23 ± 3h, n = 3). Während eines Monats wird die Proliferationskapazität der HRE-Zellen durch Zellvermehrung (383fach, n = 6)
ermittelt. Die magnetische Separation ergibt eine Zellfraktion (20 ± 2%, n = 5), die sich positiv zu CD44v6 verhält. Anschließend werden die separierten Zellen eine Woche auf Kollagen A kultiviert, wobei sie alle ein adäquates Proliferationsverhalten aufweisen.

SCHLUSSFOLGERUNG: Die Ergebnisse zeigen, dass CD44v6 ein spezifischer Marker für Basalzellen ist, der sich für die Anreicherung einer positiven Zellfraktion mittels MACS eignet. In weiteren Studien muss überprüft werden, inwiefern eine solche
magnetisch separierte Population aus Basalzellen die Besiedelung eines Tracheal­ersatzes mit einem differenzierten respiratorischen Epithel ermöglicht.

Abstract:

OBJECTIVE: Common problems affecting patients with tracheal replacement are infec­tions and stenosis caused by granulation tissue. These complications can be minimized by establishing a differentiated respiratory epithelium, which facilitates mucocilliary clearance. The basal cells are regarded as the progenitor cells of the human respiratory epithelium (HRE). They are known to divide and possess the ability to differentiate. These cells can be enriched by means of magnetic cell sorting (MACS) for the purpose of cultivation.

METHODS: The inferior nasal turbinates of 80 patients (mean age 40 ± 14 years) are used as cell source. The HRE-cells are isolated by a standard preparation using an
enzymatic digestion with Dispase ΙΙ (2,4 U/ml). The HRE-cells are plated on culture dishes coated with Collagen A in serum-free AECG-Medium. Several extracellular cell markers including GSA Ι B4, CD44S and CD44v6 are tested by immunohistochemistry. Only CD44v6 shows specific staining of basal cells. The progenitor cells of mixed single cell suspensions of HRE-cells are marked with monoclonal antibodies against CD44v6 and are conjugated with Goat-Anti-Mouse-Microbeads. Enrichment of progenitor cells is achieved by MACS using a positive selection protocol.

RESULTS: The preparation of the nasal turbinates yields viable single cell suspensions of HRE-cells (viability > 80%, n = 30). Adhesion of HRE-cells is enhanced significantly (p ≤ 0,0145, n = 5) by coating the culture dishes with Collagen A. The kinetics of
proliferation of HRE-cell-cultures can be characterized by the population doubling time (tPD = 23 ± 3h, n = 3). In the course of one month the capacity of proliferation is
approximated by cell expansion (383fold, n = 6). Magnetic cell sorting results in a cell fraction (20 ± 2%, n = 5) positive for CD44v6. The separated cells are cultured on
Collagen A for one week, where they all show adequate proliferation.

CONCLUSIONS: The results indicate that CD44v6 is a specific marker for basal cells and enables the enrichment of a positive cell fraction via application of MACS. Further studies will be required to investigate the potential of such a magnetically separated population of basal cells to generate a differentiated respiratory epithelium on a tracheal prosthesis.

Eigene Schlagwörter: Gewebezüchtung, Luftröhre, Vorläuferzelle, Basalzelle, CD44, MACS

Keywords: tissue engineering, trachea, progenitor cell, basal cell, CD44, MACS

„Wissenschaft wird immer eine Suche sein, niemals wirklich eine Entdeckung.
Es ist eine Reise, niemals wirklich eine Ankunft.“

Karl R. Popper (1902
1994)

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21.02.2005