Aus der Klinik für Rheumatologie und Klinische Immunologie
der Medizinischen Fakultät der Charité - Universitätsmedizin Berlin

Dissertation

Isolierung, Kultivierung und
magnetische Separation
von Vorläuferzellen aus
humanem respiratorischem Epithel

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité -
Universitätsmedizin Berlin

von
Marek Wentges
aus Bonn

Dekan: Prof. Dr. med. Martin Paul

Gutachter:
1. PD Dr. Michael Sittinger, Charité – Universitätsmedizin Berlin, Medizinische Klinik mit Schwerpunkt Rheumatologie und Klinische Immunologie, Interdisziplinäres Labor für Tissue Engineering
2. Prof. Dr. Oliver Kaschke, St. Gertrauden-Krankenhaus Berlin, Abteilung für HNO-Heilkunde, Plastische Gesichts- und Hals-Chirurgie
3. Prof. Dr. Dr. Rainer Schmelzeisen, Universitätsklinikum Freiburg, Abteilung für Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie

Datum der Einreichung: 31.10.2003

Datum der Promotion: 13.12.2004

Kurzfassung:

EINLEITUNG: Eine Trachealrekonstruktion bedingt Komplikationen wie z. B. Infektionen und Stenosierungen durch Granulationsgewebe. Diese werden durch ein differenziertes respiratorisches Epithel, das eine mukoziliäre Clearance ermöglicht, deutlich reduziert. Die Basalzellen gelten als die Vorläuferzellen des humanen respiratorischen Epithels (HRE), d. h. sie können sich teilen und besitzen das Potenzial zur Differenzierung. Durch die magnetische Zellseparation (MACS) sollen Vorläuferzellen aus dem HRE an­gereichert und anschließend kultiviert werden.

METHODEN: Die Conchae nasales inferiores von 80 Patienten (mittleres Alter 40 ± 14 Jahre) dienen als Zellquelle für HRE-Zellen, die mittels enzymatischen Verdaus mit Dispase II (2,4 U/ml) aus dem Gewebeverband isoliert werden. Die Kultivierung der HRE-Zellen erfolgt auf Kollagen-A-beschichteten Kulturgefäßen in serumfreiem AECG­Medium. Die Bindungsspezifität von verschiedenen extrazellulären Zellmarkern wie GSA Ι B4, CD44S und CD44v6 wird immunhistochemisch überprüft. Dabei erweist sich nur CD44v6 als spezifisch für Basalzellen. Die Vorläuferzellen aus dem HRE­Zellgemisch werden durch monoklonale Antikörper gegen CD44v6 und Goat-Anti­Mouse-Microbeads magnetisch konjugiert. Anschließend werden sie mittels MACS
positiv selektiert.

ERGEBNISSE: Die Präparation der Nasenmuscheln ergibt Einzelzellsuspensionen aus vitalen HRE-Zellen (Vitalität > 80%, n = 30). Eine Beschichtung der Kulturgefäße mit Kollagen A steigert die Adhärenz der HRE-Zellen signifikant (p ≤ 0,0145, n = 5).
Die Proliferationskinetik der HRE-Zellkulturen lässt sich durch die Populations­verdoppelungszeit charakterisieren (t_PD = 23 ± 3h, n = 3). Während eines Monats wird die Proliferationskapazität der HRE-Zellen durch Zellvermehrung (383fach, n = 6)
ermittelt. Die magnetische Separation ergibt eine Zellfraktion (20 ± 2%, n = 5), die sich positiv zu CD44v6 verhält. Anschließend werden die separierten Zellen eine Woche auf Kollagen A kultiviert, wobei sie alle ein adäquates Proliferationsverhalten aufweisen.

SCHLUSSFOLGERUNG: Die Ergebnisse zeigen, dass CD44v6 ein spezifischer Marker für Basalzellen ist, der sich für die Anreicherung einer positiven Zellfraktion mittels MACS eignet. In weiteren Studien muss überprüft werden, inwiefern eine solche
magnetisch separierte Population aus Basalzellen die Besiedelung eines Tracheal­ersatzes mit einem differenzierten respiratorischen Epithel ermöglicht.

Abstract:

OBJECTIVE: Common problems affecting patients with tracheal replacement are infec­tions and stenosis caused by granulation tissue. These complications can be minimized by establishing a differentiated respiratory epithelium, which facilitates mucocilliary clearance. The basal cells are regarded as the progenitor cells of the human respiratory epithelium (HRE). They are known to divide and possess the ability to differentiate. These cells can be enriched by means of magnetic cell sorting (MACS) for the purpose of cultivation.

METHODS: The inferior nasal turbinates of 80 patients (mean age 40 ± 14 years) are used as cell source. The HRE-cells are isolated by a standard preparation using an
enzymatic digestion with Dispase ΙΙ (2,4 U/ml). The HRE-cells are plated on culture dishes coated with Collagen A in serum-free AECG-Medium. Several extracellular cell markers including GSA Ι B4, CD44S and CD44v6 are tested by immunohistochemistry. Only CD44v6 shows specific staining of basal cells. The progenitor cells of mixed single cell suspensions of HRE-cells are marked with monoclonal antibodies against CD44v6 and are conjugated with Goat-Anti-Mouse-Microbeads. Enrichment of progenitor cells is achieved by MACS using a positive selection protocol.

RESULTS: The preparation of the nasal turbinates yields viable single cell suspensions of HRE-cells (viability > 80%, n = 30). Adhesion of HRE-cells is enhanced significantly (p ≤ 0,0145, n = 5) by coating the culture dishes with Collagen A. The kinetics of
proliferation of HRE-cell-cultures can be characterized by the population doubling time (t_PD = 23 ± 3h, n = 3). In the course of one month the capacity of proliferation is
approximated by cell expansion (383fold, n = 6). Magnetic cell sorting results in a cell fraction (20 ± 2%, n = 5) positive for CD44v6. The separated cells are cultured on
Collagen A for one week, where they all show adequate proliferation.

CONCLUSIONS: The results indicate that CD44v6 is a specific marker for basal cells and enables the enrichment of a positive cell fraction via application of MACS. Further studies will be required to investigate the potential of such a magnetically separated population of basal cells to generate a differentiated respiratory epithelium on a tracheal prosthesis.

Eigene Schlagwörter: Gewebezüchtung, Luftröhre, Vorläuferzelle, Basalzelle, CD44, MACS

Keywords: tissue engineering, trachea, progenitor cell, basal cell, CD44, MACS

„Wissenschaft wird immer eine Suche sein, niemals wirklich eine Entdeckung.
Es ist eine Reise, niemals wirklich eine Ankunft.“

Karl R. Popper (1902 — 1994)

Inhaltsverzeichnis

• 1.  Einleitung
  • 1.1. Aufbau und Rekonstruktion der Trachea
  • 1.2. Respiratorisches Epithel
  • 1.3. Conchae nasales
  • 1.4. Tissue Engineering
  • 1.5. Zellmarker zur Gewebecharakterisierung
  • 1.6. Verfahren der Zellseparation
    • 1.6.1. Parallele Zelltrennverfahren
    • 1.6.2.  Serielle Zelltrennverfahren
  • 1.7. Zielsetzung der Arbeit
• 2.  Material und Methoden
  • 2.1. Material
    • 2.1.1. Chemikalien
    • 2.1.2. Geräte
    • 2.1.3. Zellkultur
    • 2.1.4. Histologie
    • 2.1.5.  Immunhistochemie und Immunfluoreszenz
  • 2.2. Methoden
    • 2.2.1. Isolierung und Kultivierung
    • 2.2.2. Adhärenzverhalten
    • 2.2.3. Populationsverdoppelungszeit
    • 2.2.4.  Expansionsstudie
    • 2.2.5. Differenzierung im Air-Liquid-Interface
    • 2.2.6. Magnetische Separation von Vorläuferzellen
    • 2.2.7. Histologie, Immunhistochemie und Immunfluoreszenz
    • 2.2.8. Statistik
• 3.  Ergebnisse
  • 3.1. Isolierung und Kultivierung
    • 3.1.1. Adhärenzverhalten
    • 3.1.2. Populationsverdoppelungszeit
    • 3.1.3. Expansionsstudie
  • 3.2. Zellmarkerspezifitäten
  • 3.3. Magnetische Separation von Vorläuferzellen
• 4.  Diskussion
  • 4.1. Isolierung und Kultivierung
    • 4.1.1. Adhärenzverhalten
    • 4.1.2. Proliferationsverhalten
    • 4.1.3. Differenzierung im Air-Liquid-Interface
  • 4.2. Zellmarker für das humane respiratorische Epithel
    • 4.2.1.  Alcianblau-Färbung
    • 4.2.2.  Lektine
    • 4.2.3.  Monoklonale Antikörper
  • 4.3. Magnetische Separation von Vorläuferzellen
  • 4.4. Ausblick
• 5.  Zusammenfassung
• Abkürzungsverzeichnis
• Literaturverzeichnis
• Eidesstattliche Erklärung
• Danksagung

Tabellen

• Tab. 1 : Magnetische Separation zur Anreicherung von Vorläuferzellen
• Tab. 2 : Zellmarker für das humane respiratorische Epithel. Für jede Färbemethode werden n = 3 Patienten aufgeführt.

Bilder

• Abb. 1 : Darstellung der Trachea in dorsolateraler Ansicht. Die Trachea besteht aus 16 bis 20 Knorpelspangen und einer elastisch-muskulösen Membran auf der Rückseite. Das Innere der Röhre wird von der Schleimhaut der Atemwege ausgekleidet [4].
• Abb. 2 : Darstellung des mehrreihigen hochprismatischen Flimmerepithels mit seinen drei Zelltypen, den Zilienzellen, Becherzellen und Basalzellen sowie der Basalmembran auf der Unterseite [18].
• Abb. 3 : Links: Sagittalschnitt durch die Nasenhöhle mit Darstellung der drei Nasen­muscheln (A, Quelle: Yavivo, Lifeline). Rechts: Abbildung des unteren Nasenmuschel­paares nach operativer Entnahme (B).
• Abb. 4 : Schematische Veranschaulichung des Prinzips von Tissue Engineering zur autologen Transplantatherstellung am Beispiel der Trachealrekonstruktion. Geringe Mengen körpereigenes Gewebe werden in einer Biopsie entnommen. Nach Ver­mehrung außerhalb des Körpers können differenzierte Zellen dazu verwendet werden, geschädigte Organe und ihre Funktionen wiederherzustellen [4].
• Abb. 5 : Struktureller Aufbau des membranständigen Antigens CD44 in seiner  Standardform. Durch Einfügen von zusätzlichen Peptidsequenzen entstehen variable Isoformen, wie z. B. CD44v6 und CD44v9. Die variablen Isoformen sind in ihrem Vor­kommen und in ihrer Spezifität stärker eingeschränkt (Quelle: Glycoforum, Seikagaku).
• Abb. 6 : Schematische Darstellung der magnetischen Zellseparation. Innerhalb des Zellgemischs werden die Zielzellen magnetisch markiert. Die Zellsuspension wird nun über eine spezielle Trennsäule gegeben, die sich in einem starken Magnetfeld befindet. Die unmarkierten Zellen passieren die Säule ungehindert, während die markierten Ziel­zellen zunächst festgehalten und erst später außerhalb des Magnetfeldes ausgespült werden [47].
• Abb. 7 : Schematische Darstellung der Fluoreszenz-aktivierten-Zell-Sortierung. Inner­halb eines Zellgemischs werden die Zielzellen mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert. Die Zellsuspension wird dann mit Druckluft angepresst und über einen Schlauch zu  einer Düse transportiert. Hier wird nun ein dünner Flüssigkeitsstrahl erzeugt und die Zellen passieren hintereinander einen Laserstrahl. Dabei entsteht Streulicht und die Zielzellen emittieren zusätzlich Fluoreszenzlicht. Danach werden die Zellen einzeln in Tropfen verpackt und wahlweise mit einer positiven oder negativen Ladung versehen. Aufgrund der elektrischen Ladung werden die Zielzellen abgelenkt und getrennt von den unmarkierten Zellen gesammelt [47].
• Abb. 8 : Schematische Darstellung der Expansionsstudie. Die humanen respira­torischen Epithelzellen wurden in standardisierter Dichte in Kollagen-A-beschichteten T25-Kulturflaschen ausgesät und jeweils bis zum Erreichen der Konfluenz über  mindestens vier Passagen kultiviert, um ihre Proliferationskapazität zu ermitteln.
• Abb. 9 : Differenzierung von Zellen im Air-Liquid-Interface (ICN). Die humanen  respiratorischen Epithelzellen wurden auf einer Kollagenmembran in einem Zwei­Phasen-System (Gas- und Flüssigkeitsphase) kultiviert und erhielten dadurch eine  polare Ausrichtung.
• Abb. 10 : Dichtezentrifugation mit einem Percoll-Gradienten. Die Percoll-Lösung  wurde mit der Zellsuspension überschichtet. Durch die Zentrifugation bildete sich über der Percoll-Lösung eine ringförmige Phase aus vitalen humanen respiratorischen  Epithelzellen. Die Erythrozyten und die Zelltrümmer sedimentierten aufgrund ihrer  größeren Dichte auf dem Boden des Falcon-Röhrchens [47].
• Abb. 11 : Darstellung des Versuchsaufbaus zur magnetischen Separation (Miltenyi Biotec). Die Apparatur für die magnetische Separation bestand aus einer Halterung,  einem Magneten und einer Trennsäule, sowie Röhrchen zum Auffangen der sortierten Zellen (A). Vergrößerte Darstellung der Separationseinheit bestehend aus Hoch­leistungsmagneten und Trennsäule Typ MS+ für die positive Selektion (B).
• Abb. 12 : Schematischer Ablauf der magnetischen Separation von Basalzellen aus dem Zellgemisch der humanen respiratorischen Epithelzellen. Die Originalfraktion  beinhaltete noch alle drei Zelltypen: Zilienzellen, Becherzellen und Basalzellen. Die  Basalzellen wurden mit Konjugaten aus spezifischen monoklonalen Antikörpern (bzw. Lektinen) und Microbeads markiert. Dies ermöglichte im Magnetfeld ihre Bindung an die Säulenmatrix, während die unmarkierten Zilien- und Becherzellen ungehindert die Trennsäule passierten und die negative Fraktion bildeten. Nach Entnahme der Trenn­säule aus dem Magnetfeld konnten dann die Basalzellen als positive Fraktion eluiert werden.
• Abb. 13 : Durchflusszytometer vom Typ LSR (Becton Dickinson), ausgestattet mit  einem primären 488 nm Argon-Ionen-Laser. Gemessen wurden die Fluoreszenz­farbstoffe FITC in Kanal FL1 und PI in Kanal FL3.
• Abb. 14 : Immunperoxidase-Färbung mit dem EnVision™-System (Dako) in zwei Schritten. Schritt 1 bestand aus der Inkubation mit einem für das nachzuweisende  Antigen spezifischen Primärantikörper aus der Maus. In Schritt 2 erfolgte die Inkubation mit einem Anti-Maus-Sekundärantikörper, der zusammen mit dem Enzym Meerrettich­Peroxidase (HRP) an ein Dextranpolymer gebunden war. Die spezifische Umsetzung des Substrats AEC durch das Enzym HRP führte zu einer Rotfärbung.
• Abb. 15 : Links ist die Alcianblau-Färbung der Nasenmuschel im nativen Zustand zu sehen (400 x). Das Sekret der Becherzellen wird blau gefärbt, die Basalmembran ist als Aussparung zu erkennen (A). Rechts wird die Nasenmuschel nach Dispase-Einwirkung und Präparation mit dem Skalpell ohne Epithel abgebildet. Die Basalmembran (↓) bleibt vollständig erhalten (B).
• Abb. 16 : Wachstumsverhalten der humanen respiratorischen Epithelzellen in der Kultur. Links sind Zellen der P0 und rechts der P1 abgebildet (100 x): Nach Aussaat adhärieren die Zellen innerhalb eines Tages (A, B), wachsen im Monolayer nach etwa sechs Tagen konfluent (C, D) und bilden nach ca. zehn Tagen einen Bilayer (E, F). Die Zellen der P0 adhärieren bevorzugt in Form von Inseln, in denen sich Zilienzellen befin­den (A). Nach Erreichen der Konfluenz weisen beide Zellkulturen eine charakteristische pflastersteinartige Morphologie auf (C, D).
• Abb. 17 : Vergleich des Adhärenzverhaltens von humanen respiratorischen Epithel­zellen der P1 auf Kollagen A und Plastik als Kontrolle (100 x). Nach 12h haften auf  Kollagen A (A) mehr Zellen als auf Plastik (B). Die Zellen sind bei Aussaat noch  abgerundet und nehmen im Lauf der Adhärenz eine längliche Form an.
• Abb. 18 : Vergleich der Adhärenz auf Kollagen A und Plastik. Die Säulen geben den Mittelwert der Zellzahl in Prozent wieder. Die Fehlerbalken entsprechen der Standard­abweichung. Zu allen vier Zeitpunkten haften auf Kollagen A mehr Zellen als in der  Kontrollgruppe (Plastik).
• Abb. 19 : Grafische Darstellung der Wachstumskurven der humanen respiratorischen Epithelzellen. Die Populationsverdoppelungszeit wird aus der Mitte der exponentiellen Wachstumsphase einer Zellpopulation bestimmt. Die gestrichelten Linien zeigen  exemplarisch für Patient 1, dass eine Verdoppelung von 10⁵ auf 2 x 10⁵ Zellen eine Zeitspanne von ca. 19h in Anspruch nimmt.
• Abb. 20 : Vermehrung der humanen respiratorischen Epithelzellen über mehrere Passagen. Innerhalb eines Monats kann die anfängliche Zellzahl durchschnittlich auf das 383fache expandiert werden. Die Faktoren Alter und Rauchen scheinen dabei  keinen negativen Einfluss auszuüben.
• Abb. 21 : Morphologie der humanen respiratorischen Epithelzellen über mehrere Passagen (100 x): P0 (A), P1 (B), P2 (C), P3 (D), P4 (E), P5 (F). In der P0 (A) nehmen die Zellen nach Erreichen der Konfluenz eine polygonale Form an und es entsteht  ein kopfsteinpflasterartiges Muster. Der Zelldurchmesser nimmt mit jeder Passage zu, unförmige Zellen tragen in der P5 (F) zu einer heterogenen Morphologie bei.
• Abb. 22 : Immunperoxidase-Färbung an Kryoschnitten von nativem respiratorischem Gewebe (400 x): Links wird die Färbung mit AK CD44S (A), AK CD44v6 (C) und rechts die dazugehörigen Negativkontrollen (B, D) dargestellt. Das Antigen CD44S (A) befindet sich auf den Basalzellen und auf Zellen im Bindegewebe, während CD44v6 (C) ausschließlich auf den Basalzellen exprimiert wird.
• Abb. 23 : Immunfluoreszenzfärbung an Kryoschnitten von nativem respiratorischem Gewebe in Formalin (400 x). Die Färbung mit Bisbenzimide (A) gibt einen Überblick auf die Anordnung der Zellkerne im respiratorischen Epithel und im Bindegewebe darunter. In Formalin färbt UEA (B), neben dem Sekret der Becherzellen, auch die Kinozilien der Zilienzellen auf der Epitheloberfläche an.
• Abb. 24 : Immunfluoreszenz-Färbung an Kryoschnitten von nativem respiratorischem Gewebe in Aceton/Methanol (400 x). Im Vergleich: das Lektin GSA-FITC (A) und der monoklonale Antikörper CD44v6-FITC (B). Die Färbung mit dem Lektin GSA-FITC (A) bleibt negativ und führt lediglich zu unspezifischen Randeffekten. Durch den mono­klonalen Antikörper CD44v6-FITC (B) werden die Basalzellen spezifisch markiert und stellen sich als kontinuierliche Fluoreszenzbande dar.
• Abb. 25 : Kultivierung der verschiedenen Populationen nach MACS (100 x). Die  Zellen aus der positiven Fraktion (A) und aus der negativen Fraktion (B) zeigen  adäquates Proliferationsverhalten. Nach vier Tagen in der Kultur unterscheidet sich die Morphologie der beiden Populationen nur unwesentlich.
• Abb. 26 : FACS-Analyse der magnetischen Separation mit dem monoklonalen  Antikörper CD44v6-FITC und Anti-FITC-Microbeads: ungefärbte Originalfraktion (A), gefärbte Originalfraktion (B), negative Fraktion (C), positive Fraktion (D). Zwischen der negativen Fraktion (C) und der positiven Fraktion (D) lässt sich nur eine graduelle Rechtsverschiebung beobachten. Die Vitalität entspricht dem Anteil der PI-negativen Zellen und liegt bei der ungefärbten Originalfraktion (A) noch bei 79% und fällt in der positiven Fraktion (D) auf 58% ab.