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3.  Methodik

3.1. Art der Versuchstiere

Die Experimente wurden weiblichen Mäusen der Spezies A/J durchgeführt (Jackson Laboratory, 600 Main Street, Bar Harbor, Maine 04609 USA). Das Alter der Versuchstiere betrug 8 Wochen. Diese Mäuseart wurde 1921 durch Kreuzung von Cold Spring Harbor Mäusen und Bagg albino Mäusen entwickelt und seitdem weitestgehend in Krebs- und Immunologieforschung genutzt. Die Tiere wurden durch Inzucht vermehrt und haben ein albines Erscheinungsbild.

3.2. Haltung der Versuchstiere

Nach Lieferung der Tiere wurden diese in gesäuberten und desinfizierten Käfigen bei Standarddiät und Wasser ad libitum für eine Woche gehalten. In dieser Zeit konnten sie sich vom Transport erholen und an die neue Umgebung gewöhnen. Die Tiere wurden einem automatischen Tag/ Nacht Rhythmus ausgesetzt, die Käfige zweimal pro Woche gesäubert. Mit dem Beginn der Experimente wurden die Versuchstiere mehrmals täglich kontrolliert und Verhalten sowie Nahrungsaufnahme bewertet.

3.3. Versuchsaufbau

3.3.1. Einfluß des operativen Traumas auf die Entstehung pulmonaler Metastasen

60 Mäuse wurden in 3 Gruppen zu je 20 Tieren randomisiert. Die Tiere der Kontrollgruppe wurden keinem Eingriff unterzogen. Bei den Tieren der Laparoskopie-Gruppe wurde ein CO2 Pneumoperitoneum etabliert und dieses über einen Zeitraum von 15 min bei 2 mmHg aufrechterhalten. Danach wurde das Abdomen desuffliert und die Trokarinzision durch Klammernaht verschlossen. Bei den Tieren der Laparotomie-Gruppe wurde ein medianer Bauchschnitt von 3 cm Länge durchgeführt, die Bauchhöhle für 15 min geöffnet und danach durch Klammernaht verschlossen. Im direkten Anschluß an die Operationen wurde allen Tieren, einschließlich den Tieren der Kontroll-Gruppe, 105 TA3 Hauschka Tumorzellen in die Schwanzvene injiziert. Zwei Wochen später wurden die Tiere getötet und die Anzahl der pulmonalen Metastasen bestimmt.


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3.3.2.  Perioperative Immuntherapie zur Prävention pulmonaler Metastasen

100 Versuchstiere wurden in 5 Gruppen zu je 20 Tieren randomisiert. Die Tiere der Kontrollgruppe wurden keinem Eingriff unterzogen. Alle anderen Gruppen wurden laparotomiert.

Gruppe 1: [AC]

Kontrollgruppe

Gruppe 2: [OP]

Laparotomie

Gruppe 3: [MPL-A]

Laparotomie + Monophosphoryl Lipid A

Gruppe 4: [LTZ]

Laparotomie + lysierte Tumorzellen

Gruppe 5: [MPL-A + LTZ]

Laparotomie + Monophosphoryl Lipid A + lysierte Tumorzellen

Die Tiere der MPL-A Gruppe erhielten 6 intraperitoneale Injektionen, bestehend aus jeweils 16 μg Monophosphoryl Lipid A in 0,3 ml PBS. Das Adjuvans wurde einmal täglich, beginnend 3 Tage vor Operation bis einschließlich zweiter postoperativer Tag, verabreicht. Den Tieren der LTZ Gruppe wurden jeweils 5 x 105 lysierte Tumorzellen gelöst in 0,5 ml steriler Pufferlösung (PBS) an den präoperativen Tagen 15, 12, 9, 6 und 3, am Tag der Operation und am postoperativen Tag 3, intraperitoneal injiziert. Das gleiche Injektionsprotokoll wurde bei Gruppe 5 angewandt. Die Tiere der MPL-A + LTZ Gruppe erhielten 6 Injektionen, bestehend aus jeweils 16 μg Monophosphoryl Lipid A und 5 x 105 lysierten Tumorzellen. Im direkten Anschluß an die Operation wurden allen Tieren 1 x 105 TA3 Hauschka Tumorzellen in die Schwanzvene injiziert. Zwei Wochen später wurden die Tiere getötet und die Anzahl der pulmonalen Metastasen bestimmt.

Abb. 7: Injektionsprotokoll

3.4. Operationsprotokoll: Laparotomie

Die Tiere wurden narkotisiert, die Bauchhaut rasiert und mit einer Mischung aus PVP-Jod und 70 %igem Alkohol desinfiziert. Danach wurden Haut und Muskeln entlang der Linea alba, ausgehend vom Xiphoid bis in den oberen Teil der Regio pubica, [Seite 30↓]separat durchtrennt. Die Bauchhöhle wurde geöffnet und die Inzision nach 15 min durch eine Klammernaht verschlossen.

3.5. Operationsprotokoll: Laparoskopie

Die Versuchstiere wurden anästhesiert, die Regio Umbilicalis des Bauches depiliert und desinfiziert. Die Haut über dem Abdomen wurde median mit einem 3 mm langen Schnitt durchtrennt, der Musculus rectus abdominis mit einer Pinzette angehoben und eine Flexüle durch den Muskel in die Bauchhöhle gelegt. Durch die Flexüle wurde Kohlendioxid in die Bauchhöhle insuffliert und ein Pneumoperitoneum mit einem Druck von 2 mmHg etabliert. Nach 15 min wurde das Abdomen desuffliert und der Hautschnitt durch eine Klammernaht verschlossen.

3.6. Intravenöse Injektion der vitalen Tumorzellen

Im Anschluß an die Operation wurden den Versuchstieren jeweils 1 x 105 vitale Tumorzellen in 0,1 ml PBS in eine der seitlichen Schwanzvenen injiziert. Der Schwanz wurde mit 70 %igem Alkohol desinfiziert und in der linken Hand zwischen Daumen und Zeigefinger festgehalten. Mit der rechten Hand wurde die Vene punktiert (Injektionskanüle 30 G, 1,5 cm lang) und die Tumorzellsuspension injiziert.

3.7. Vorbereitung von Monophosphoryl Lipid A (MPL-A)

Aus jeweils 2000 μg MPL-A (Monophosphoryl Lipid A (MPL®) Art: MPL® von S. minnesota R595, Produkt Nr.: R-373, RiBi ImmunoChem, Inc., 553 Old Corvallis Road, Hamilton, MT 59840, USA) wurde eine Stammlösung hergestellt. Dazu wurde der Wirkstoff in einem Gemisch aus 1998 μl sterilem Wasser und 2 μl Triethylamin aufgelöst und die Stammlösung für 30 Sekunden in 70 °C warmem Wasser inkubiert und anschließend weitere 30 Sekunden in einem Ultrakurzwellenbad suspendiert. Das Erwärmen und Suspendieren der Stammlösung wurde fünfmal wiederholt. 1 ml der Stammlösung wurde mit 17 ml PBS verdünnt, in 60 Portionen zu jeweils 0,3 ml aufgeteilt und bei 4 °C aufbewahrt.

3.8. Anästhesie der Versuchstiere

Die Narkose wurde unter Anwendung von Injektionsnarkotika durchgeführt. Aus Ketamin (Volumen: 1 ml; Konzentration: 100 mg/ml), Xylazine (Volumen: 0,1 ml; Konzentration: 100 mg/ ml) und sterilem Wasser (10 ml) wurde eine Stammlösung hergestellt. Jedem Tier wurden 0,2 ml dieser Stammlösung intraperitoneal injiziert. Die Kurznarkose dauerte ca. 25 min.


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3.9.  Tötung der Versuchstiere

Zwei Wochen nach Injektion der vitalen Tumorzellen wurden alle Versuchstiere durch Gas getötet. In einem luftdichten Behälter wurden die Tiere 10 min lang einer Umgebung aus 99,9 % Kohlendioxid ausgesetzt. Die Tiere wurden nach ca. 30 Sekunden bewußtlos. Nach 10 min waren alle Versuchstiere verstorben und konnten für die Organentnahme vorbereitet werden.

3.10. Zellkultur

Die verwendeten TA3 Hauschka Tumorzellen (ECACC Nr.: 85061102, European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology & Research, Salisbury, Wiltshire SP4 0 JG, UK) wachsen gleichzeitig als adhärente Einzelschicht (Monolayer) und in Suspension. Morphologisch handelt es sich um Epithelzellen, die ursprünglich von einem 1949 spontan aufgetretenen Maus Mammakarzinom einer A/HeHa Maus abstammen. Die Tumorzellinie, benannt nach ihrem Entwickler T. S. Hauschka, wurde 1956 genetisch modifiziert, d.h. die Zellen erhielten ein zusätzliches Chromosom und wurden allotransplantabel für Mäuse anderer Spezies (Hauschka & Weiss, 1971).

3.10.1. Initiieren der Zellkultu

Die Tumorzellen wurden im gefrorenen Zustand geliefert und nach Erhalt in 36 °C warmem Medium (0,5l Eagle's minimum essential medium; 2 mM Glutamin; 1 % Nichtessentielle Aminosäuren; 10 % Fetales Rinderserum) aufgelöst. Innerhalb von ca. 1 Woche bildete sich ein dichter Zellrasen, so daß die Zellkultur subkulktiviert werden konnte.

3.10.2. Mediumwechsel und Subkultivierung der Tumorzellen

Die Notwendigkeit das Kulturmedium zu wechseln, wird durch drei Faktoren angezeigt:

Der pH-Wert des Mediums sollte nicht kleiner als 7,0 sein. Ein Abfall des pH-Wertes ist am Übergang der Farbe des Mediums von rot über orange in gelb zu erkennen.

Die Zellkonzentration sollte nicht zu hoch sein. Bei großer Zelldichte, d.h. der Zellrasen erstreckt sich über den gesamten Boden der Kulturflasche, tritt Wachstumshemmung und Degeneration der Zellen auf.

Die Zellmorphologie sollte unauffällig sein. Auffällige Degenerationsmerkmale wie vakuolisiertes Zytoplasma kann Hinweis auf toxisches Serum, mikrobiologische Kontamination oder Altern der Zelllinie sein.


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Die verwendete Tumorzellkultur wurde in wöchentlichem Abstand subkultiviert und jeweils am 4. Tag durch Zugabe von 10 ml frischem Medium ergänzt (Abb. 8). Bei der Zellpassagierung wurde das verbrauchte Medium mit den in Suspension befindlichen Zellen entfernt und in einem 50 ml Universalbehälter steril aufbewahrt. Die auf dem Kulturflaschenboden adhärenten Tumorzellen wurden für 1 min mit Trypsin (3 ml/ 25 cm2 ) inkubiert. Danach wurde die Kulturflasche geschüttelt bis alle Tumorzellen vom Boden abgelöst waren. Um die tryptische Aktivität zu stoppen wurde 5 ml frisches Medium zugesetzt, alle Flüssigkeit abpipetiert und zusammen mit dem zuvor gewonnenen Überstand bei 1000 U/min für 10 min zentrifugiert. Der neue Überstand wurde verworfen und durch 10 ml frisches Medium ersetzt. Diesem Gemisch wurde 1 ml entnommen und einer vorbereiteten Kulturflasche mit 20 ml frischem Medium zugegeben.

Abb. 8: Wachstumskurve der Zellkultur

3.10.3. Vorbereitung der Tumorzellen zur intravenösen Injektion

Nach einer Kulturdauer von 4 Tagen wurde das Medium entfernt, die Zellen durch Trypsinierung vom Boden der Kulturflasche gelöst, zentrifugiert und in steriler isotoner Salzlösung (PBS: phosphate buffered saline solution) vereinzelt. Nach 4 Tagen, vom Zeitpunkt der Subkultivierung ausgehend, sind ca. 80 % des verfügbaren Substrates besetzt, die Zellen erscheinen morphologisch einwandfrei, der Anteil abge[Seite 33↓]storbener Zellen ist kleiner als 5 % der Zellgesamtzahl. Mit Hilfe des Neubauer Hämozytometers wurde die Konzentration auf 106 Zellen/ ml eingestellt und jeweils 0,3 ml der Suspension in sterile Eppendorfgefäße gegeben. Für die Injektion stand für jedes Tier ein Eppendorfgefäß mit steriler Tumorzellsuspension zur Verfügung.

3.10.4. Kryokonservierung der Tumorzellen

Die Tumorzellen wurden bis zur späten exponentiellen Wachstumsphase (105 Zellen / cm2) vermehrt. Das Medium mit den in Suspension befindlichen Zellen wurde entfernt und in einem sterilen 50 ml Universalbehälter aufbewahrt. Die in der Kulturflasche verbliebenen adhärenten Zellen wurden mit Trypsin (3 ml / 25 cm2) von der Oberfläche gelöst. Um die zytotoxische Wirkung des Trypsins zu stoppen wurde der Suspension 5 ml frisches Kulturmedium zugefügt. Der gesamte Inhalt der Kulturflasche wurde zusammen mit dem anfänglich entfernten alten Medium bei 1000 U/min für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, die Zellen im vorbereiteten Gefriermedium resuspendiert und auf 5 x 106 Zellen / ml eingestellt. Das für die Kryokonservierung verwendete Kulturmedium (0,5l Eagle's minimum essential medium; 2 mM Glutamin; 1 % Nichtessentielle Aminosäuren; 10 % Fetales Rinderserum) enthielt das Gefrierschutzmittel DMSO in einer Endkonzentration von 10 %. Jeweils 1,5 ml der Zellsuspension wurden in Kryokontainer gefüllt und innerhalb von 2 Stunden kontinuierlich auf - 90°C gefroren. Danach wurden die Kryokontainer in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.

3.10.5. Bestimmung der Zellzahl

Die Zellkonzentration wurde mit Hilfe eines Hämozytometers nach Neubauer bestimmt. Aus der vorbereiteten Zellsuspension wurde mit einer Mikropipette 10 μl Flüssigkeit entnommen und am Rand der Zählkammer aufgetragen. Durch die Kapillarkraft saugt sich die Zellsuspension unter das Deckglas. Die Zellen wurden unter dem Mikroskops gezählt und ihre Konzentration in der Zellsuspension berechnet. Durch Verdünnung oder erneutes Zentrifugieren wurde die gewünschte Zellkonzentration eingestellt.

3.10.6. Vitalitätstest der Tumorzellen

Zur Überprüfung der Zellvitalität wurde der Trypanblau-Farbausschlußtest angewannt. Das Prinzip des Testes ist die Impermeabilität vitaler Zellen für den Farbstoff Trypanblau. Das Zytoplasma einer vitalen Zelle erscheint bei Anwendung dieses Testes hell und transparent. Ist die Zellmembran beschädigt, was bei einer abgestorbenen Zelle immer der Fall ist, färbt sich nach Inkubation mit dem Farbstoff das Zytoplasma blau. 20 μl frische Zellsuspension wurden 1:1 mit Trypanblau versetzt und 1 Minute inkubiert. Zur Auswertung wurden 10 μl des Gemisches auf ein Hämozytometer nach Neubauer aufgetragen und der Prozentsatz der ungefärbten Zellen be[Seite 34↓]rechnet. Kriterium für die Verwendung der Tumorzellen war ein Anteil vitaler Zellen von mehr als 95 %.

3.10.7. Herstellung des Tumorzelllysats

Eine Zellsuspension mit einer Konzentration von 106 Tumorzellen/ ml wurde hergestellt und in einem 50 ml Universalbehälter aufbewahrt. Als Medium für die Zellsuspension wurde eine sterile, isotone Pufferlösung (PBS) verwendet. Der Universalbehälter mit der Tumorzellsuspension wurde in flüssigem Stickstoff schockgefroren und nach 5 min in warmem Wasser aufgetaut. Diese Prozedur wurde sechsmal wiederholt. Durch die beim Einfrieren und Auftauen entstehenden Scherkräfte wurden die Zellmembranen zerstört. Die Lyse aller Zellen wurde mit Hilfe des Trypanblau-Farbausschlußtests bestätigt. Das Tumorzelllysat wurde portionsweise bei - 80 °C aufbewahrt. Eine Stunde vor Beginn der Injektionen wurde das gefrorene Tumorzelllysat aufgetaut, suspendiert und in Portionen zu 0,5 ml steril verwahrt.

3.11. Identifikation der Metastasen

Die toten Versuchstiere wurden in Rückenlage auf dem Untergrund befestigt. Eine Thorakolaparotomie wurde durchgeführt. Das Diaphragma wurde von medial nach lateral durchtrennt und die Lunge mobilisiert. Die Trachea wurde frei präpariert und durchtrennt. Es wurden 2 ml Kontrastmedium (85 ml destilliertes Wasser, 15 ml India ink) mit sanftem Druck in die Trachea injiziert. Die Alveolen füllten sich mit dem Farbstoff und die Lunge blähte sich auf. Alle Lungenlappen färbten sich tief schwarz. Lunge und Herz wurden en-bloc reseziert und für 5 min in Leitungswasser aufbewahrt. Überschüssiges Kontrastmedium konnte entweichen, die Lungenoberfläche wurde von Farbstoffpartikeln gereinigt. Danach wurde das Herz-Lungen Paket für 24 Stunden in Fekete's Lösung (100 ml Ethanol (70%), 10 ml Formaldehyd, 5 ml Essigsäure) aufbewahrt. Die Metastasen auf der Lungenoberfläche wurden durch das Gemisch weiß gebleicht. Anschließend wurden die Organe einzeln in 5 % Formalin-Lösung aufbewahrt [59].

3.12. Quantitative Bestimmung der Lungenmetastasen

Zunächst wurde das Herz von der Lunge abpräpariert. Danach wurden die 5 Lungenlappen freipräpariert und einzeln dargestellt. Die Lungenlappen wurden auf eine Glasplatte gebracht und durch eine zweite Glasplatte abgedeckt. Die beiden Glasplatten wurden durch Plastikspangen zusammengepreßt. Die Anzahl der Metastasen wurde auf beiden Seiten ausgezählt, wobei der Untersucher nicht über die Gruppenzugehörigkeit des Lungengewebes informiert war.


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3.13.  Paraffinschnitte und Hämatoxylin/ Eosin-Färbung

Zur Herstellung der 5 µm dicken Gewebsschnitte wurde das verwendete Lungengewebe in Paraffinblöcke eingebettet. Dazu wurde das, in Formalin fixierte Gewebe, mit PBS (Phosphat gepufferte NaCl-Lösung) gewaschen und in einer aufsteigenden Ethanolreihe für jeweils 15 Minuten dehydriert. Anschließend wurde das Ethanol durch 30-minütige Inkubation mit dem Intermedium Xylol entfernt und dann das Xylol durch heißes Paraffinwachs ersetzt. Die von Paraffin durchtränkten Gewebestücke wurden in ein Gießschälchen gelegt, mit heißem Paraffin überschichtet und zu einem Paraffinblock verarbeitet. Die ausgehärteten Paraffinblöcke wurden bei 4°C mit dem Mikrotom geschnitten. Nach dem Schneiden der Präparate und Anheften der Gewebsschnitte an die Objektträger wurden die Schnitte in Xylol entparaffiniert und in einer absteigenden Alkoholreihe wieder in ein wässriges Milieu überführt. Die anschließende Hämatoxylin/ Eosin Färbung wurde nach dem Standartprotokoll von Bancroft und Stevens (1990) durchgeführt [60].

3.14. Statistische Analyse

Die Anzahl der Versuchstiere pro Gruppe, bei denen pulmonale Metastasen festgestellt wurden, entspricht der Inzidenz Ob sich die einzelnen Gruppen diesbezüglich signifikant unterscheiden wurde mit Hilfe des Chi-Quadrat-Tests errechnet. Bei p < 0,05 wurden Paarvergleiche unter Verwendung des Exakten Tests nach Fisher durchgeführt.

Die Rohdaten wurden deskriptiv in Form von Boxplots dargestellt. Die Box stellt den Interquartilbereich mit 50% der Werte dar. Die von der Box ausgehenden Linien entsprechen den Perzenzilen 10 und 90.

Zur Prüfung der Datenverteilung wurde der Kolmogorov-Smirnov-Test angewandt. Die Datengruppen waren größtenteils nicht normal verteilt, weshalb für die weiteren Berechnungen nicht-parametrische Tests verwendet wurden. Die Mehrfachvergleiche wurden unter Verwendung des Kruskal-Wallis Tests durchgeführt. Bestand statistische Signifikanz (p< 0,05), wurden Paarvergleiche mit dem Mann-Whitney-U-Test durchgeführt. Das Signifikanzniveau dieser Paarvergleiche wurde nach Bonferroni korrigiert und somit dem Mehrfachvergleich angepaßt. Dazu wurde das ursprüngliche Signifikanzniveau von p = 0,05 durch die Anzahl der durchgeführten Paarvergleiche dividiert.


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12.11.2004