Witting, Anke: Erkennung apoptotischer Neurone durch Mikrogliazellen in vitro

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Kapitel 1. Einleitung

1.1 Apoptose und Nekrose

Zellen können durch Apoptose oder Nekrose sterben. Bei der Apoptose setzt ein intrazelluläres Programm den gezielten „Zell-Selbstmord“ in Gang, der in der Regel einzelne Zellen betrifft. „Die aus dem Griechischen stammende Bezeichnung Apoptose (apoptosis) beschreibt das Fallen der Blätter im Herbst und gibt damit einen bildlichen Vergleich für das altruistische Absterben einzelner Zellen zum Wohle des Gesamtorganismus“ ( Stephan et al., 2000 ). Im Gegensatz dazu versteht man unter Nekrose den durch äußere Einwirkungen „gewaltsam herbeigeführten Zell-Mord“ ( Stephan et al., 2000 ). Die Auslöser können physikalischer oder chemischer Natur sein, wie Verbrennung, Vergiftung oder mechanische Beschädigung. Diese führen in ausgedehnten Gewebsarealen zu einem Zelltod ( Gorman et al., 1996 ; Choi 1996 ).

1.1.1 Apoptose

Der apoptotische Zelltod ist durch definierte morphologische Veränderungen der Zellen charakterisiert ( Kerr et al., 1972 ). Die morphologischen Veränderungen des apoptotischen Zelltods sind vielfältig: Schrumpfung der Zellen, Bläschenbildung der Membran, Kondensation des Chromatins, Fragmentation des Zellkerns und Zerfall der Zelle in vesikuläre Strukturen, so genannte apoptotische Körper ( Duvall und Wyllie 1986 ; Kiechle und Zhang, 1998 ) (Abb.1).

Weiterhin ist der apoptotische Zelltod durch biochemische Veränderungen gekennzeichnet. Während der Apoptose kommt es beispielsweise zu einer Translokation von Phosphatidylserin auf die extrazelluläre Seite der Plasmamembran ( van den Eijnde et al., 1998 ; van Engeland et al., 1998 ). Phosphatidylserin ist ein Bestandteil der Plasmamembran und unter nicht pathologischen Bedingungen auf der zytoplasmatischen Seite der Doppelmembran lokalisiert. Ein weiteres biochemisches Merkmal des apoptotischen Zelltods ist die Aktivierung von Endonukleasen ( Bredesen 1995 ; Walker und Sirkorska, 1997 ). Diese Endonukleasen spalten den DNA-Doppelstrang an den Verbindungsstücken zwischen den Nukleosomen, was eine Fragmentation der DNA zur Folge hat ( Nicotera und Leist, 1997 ; Walker und Sirkorska, 1997 ).


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Der apoptotische Zelltod tritt vor allem unter physiologischen Bedingungen, wie in der Entwicklung eines Organismus, auf ( Oppenheim, 1997 ). Dieser entwicklungsbedingte apoptotische Zelltod, der eine wichtige Rolle in der Entwicklung des Nervensystems und des Immunsystems spielt, wird auch programmierter Zelltod genannt ( Burek und Oppenheim, 1996 ; Weller et al., 1997 ). Zusätzlich kann Apoptose auch unter pathologischen Bedingungen, wie Ischämie und AIDS, auftreten ( Gorman et al., 1996 ; Choi 1996 ).

1.1.2 Nekrose

Der nekrotische Zelltod ist durch andere morphologische Veränderungen der Zelle charakterisiert und kann dadurch gut von dem apoptotischen Zelltod unterschieden werden (Abb.1). Durch die Schädigung der Plasmamembran nekrotischer Zellen strömt Wasser in die Zelle ein ( Duvall und Wyllie 1986 ). Die Zelle schwillt an und lysiert letztendlich ( Duvall und Wyllie 1986 ). Durch die Freisetzung von zytoplasmatischen Bestandteilen verursacht ein nekrotischer Zelltod eine entzündliche Reaktion im Gewebe ( Savill 1997 ).

Abbildung 1: Morphologische Merkmale des apoptotischen und nekrotischen Zelltods.

(aus Boehringer Mannheim Apoptosis Guide; Trauth und Keesey, 1995)


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Obwohl Apoptose und Nekrose als zwei unterschiedliche Formen des Zelltods betrachtet werden, gibt es Hinweise, daß Apoptose und Nekrose nur zwei einer Reihe von möglichen morphologisch und biochemisch unterscheidbaren Formen des Zelltods sind ( Ankarcrona et al., 1995 ; Leist und Nicotera, 1997 ). Ein nekrotischer Zelltod kann beispielsweise einem apoptotischen Zelltod folgen (sekundäre Nekrose), wenn die apoptotischen Zellen nicht durch Phagozyten aufgenommen werden ( Leist et al., 1995 ; Leist und Nicotera, 1997 ). Der apoptotische und der nekrotische Zelltod können in vivo durch die Auswirkungen des Zelltods auf das umliegende Gewebe unterschieden werden. Im Gegensatz zu den Folgen einer Nekrose löst eine Apoptose, aufgrund einer raschen phagozytotischen Entfernung apoptotischer Zellen aus dem Gewebe, keine inflammatorische Antwort aus ( Savill et al., 1993 ; Leist und Nicotera, 1997 ).

1.2 Apoptose im Nervensystem

Während der Entwicklung des Nervensystems sterben Astrozyten und zwischen 40 und 85 Prozent aller gebildeten Neurone und Oligodendrozyten ( Barres und Raff, 1994 ; Krueger et al., 1995 ; Burek und Oppenheim, 1996 ; Oppenheim, 1997 ; Ludwin 1997 ). Da Neurone und Oligodendrozyten im Überschuß produziert werden, ist der programmierte Zelltod ein fundamentales und essentielles Merkmal der Entwicklung des Nervensystems ( Burek und Oppenheim, 1996 ). Durch den kontrollierten apoptotischen Zelltod kommt es zur Anpassung der Zahl von Neuronen und Oligodendrozyten an die Anzahl der zu innervierenden Neurone und Zellen des Zielgewebes und zu einer Entfernung fehlerhaft gebildeter neuronaler Verbindungen ( Waters 1996 ). Daher ermöglicht der programmierte Zelltod eine sinnvolle neuronale Netzwerkbildung.

Während der Entwicklung des Nervensystems kann der programmierte Zelltod von Neuronen durch eine Reihe von Faktoren verhindert werden. Die Neurone benötigen beispielsweise zum Überleben trophische Faktoren, die lokal vom Zielgewebe produziert werden ( Dragunow et al., 1998 ). Zu diesen trophischen Faktoren gehören NGF („nerve growth factor“), NT-3 („neurotrophin 3“), BDNF („brain derived neurotrophic factor“) und NT-4/5 („neurotrophin 4/5“) ( Johnson et al., 1980 ; Henderson et al., 1993 ; Narayanan 1997 ). Diese Wachstumsfaktoren binden an Rezeptor Tyrosinkinasen und verhindern dadurch eine endogene Kaskade der Selbstzerstörung ( Segal et al., 1997 ; Dragunow et al., 1998 ).


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Die Ausschüttung von Wachstumsfaktoren durch das Zielgewebe ist ein wichtiger, aber nicht der einzige Mechanismus, durch den das Überleben der Neurone gesteuert werden kann. Afferente Signale von innervierenden Neuronen sind ebenfalls für das Überleben vieler Neurone wichtig ( Raff et al., 1993 ; Burek und Oppenheim, 1996 ; Pettmann und Henderson, 1998 ). Die Entfernung von afferenten Neuronen oder die Blockierung der afferenten Aktivität führt daher zu einem erhöhten programmierten neuronalen Zelltod ( Okado und Oppenheim, 1984 ; Kelley et al., 1997 ; Pettmann und Henderson, 1998 ). Die Depolarisierung durch diese innervierenden Neurone ist zum Überleben der Neurone wichtig. In Übereinstimmung mit diesem überlebensfördernden, depolarisierenden Effekt in vivo, sind einige Neurone, wie die Körnerzellen des Kleinhirns, in Zellkultur auf hohe depolarisierende Kaliumkonzentrationen im Medium angewiesen ( Chang und Wang, 1997 ). Die Depolarisation könnte zu einer erhöhten Empfindlichkeit der Neurone gegenüber trophischen Faktoren oder zu einer erhöhten endogenen Synthese dieser Faktoren durch die Neurone führen ( Ghosh et al., 1994 ; Meyer et al., 1995 ; Burek und Oppenheim, 1996 ; Weller et al., 1997 ; Pettmann und Henderson, 1998 ). Zusätzlich sind für das Überleben der Neurone auch Hormone, wie Steroidhormone und von Gliazellen produzierte Faktoren, wie GDNF („glial cell line-derived neurotrophic factor“), entscheidend ( Sloviter et al., 1993 ; Burek und Oppenheim, 1996 ). GDNF ermöglicht beispielsweise das Überleben von Motorneuronen ( Pettmann und Henderson, 1998 ; Boonman und Isacson, 1999 ).

Nicht nur die Neurone, sondern auch die Gliazellen sind während der Entwicklung des Nervensystems von einem apoptotischen Zelltod betroffen ( Barres und Raff, 1994 ; Krueger et al., 1995 ; Narayanan 1997 ). Das Überleben myelinisierender Gliazellen, wie das der Oligodendrozyten im zentralen Nervensystem (ZNS) und der Schwannzellen im peripheren Nervensystem (PNS), hängt von trophischen Faktoren ab ( Narayanan 1997 ). Hierbei handelt es sich um bislang unbekannte trophische Faktoren, die auf den Axonen der Neurone exprimiert werden ( Frost et al., 1999 ). Als Folge wird die Anzahl der myelinisierenden Gliazellen der Zahl der noch zu myelinisierenden Axone angepaßt ( Burek und Oppenheim, 1996 ; Frost et al., 1999 ).

Neuronale und gliale Apoptosen spielen weiterhin eine Rolle bei einer Reihe klinisch bedeutender neurologischer Erkrankungen, wie Schlaganfall, Trauma und neurodegenerativen Erkrankungen ( Li et al., 1995 ; Choi 1996 ; Agid et al., 1996 ; Gorman et al., 1996 ; Bancher et al., 1997 ; Bonetti et al., 1997 ; Dragunow et al., 1998 ; Nicotera und Lipton, 1999 ). So weisen Studien in humanem pathologischen Gewebe, transgenen Tiermodellen und in vitro Modellen darauf hin, daß die Neurone sowohl in der Alzheimererkrankung als auch in der Parkinsonerkrankung einen apoptotischen Zelltod sterben ( Agid et al., 1996 ; Waters 1996 ; Kusiak et al., 1996 ; Drache et al., 1997 ; Ludwin 1997 ; Stefanis et al., 1997 ). Unter pathologischen Situationen, wie Hypoxie und Hypoglykämie tritt ein apoptotischer neuronaler Zelltod aufgrund einer ständigen und/oder starken Aktivierung von Glutamatrezeptoren, wie dem N-Methyl-D-Aspartat Rezeptor (NMDA-Rezeptor), auf ( Choi 1988 ; Coyle und Puttfarcken, 1993 ; Leist und Nicotera, 1998 ). Diese Aktivierung der Glutamatrezeptoren wird auf eine erhöhte Ausschüttung von Glutamat und/oder fehlende Aufnahme des Glutamats aus dem synaptischen Spalt zurückgeführt ( Meldrum und Garthwaite, 1990 ; Leist und Nicotera, 1998 ). Der NMDA Rezeptor ist ein ligandenabhängiger Kationenkanal, der neben Natrium- und Kalium- auch für Kalziumionen durchlässig ist. Eine langanhaltende und/oder starke Aktivierung des NMDA-Rezeptors führt folglich zu einer Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration ( Bonfoco et al., 1996 ). Die erhöhte Kalziumkonzentration in der Zelle aktiviert Enzyme wie Proteasen, Phospholipasen und die Kalzium-Calmodulin abhängige Stickstoffmonoxidsynthetase (NOS) ( Choi 1988 ; Manev et al., 1989 ; Leist und Nicotera, 1998 ). Die Aktivierung dieser Enzyme kann einen apoptotischen oder nekrotischen Zelltod zur Folge haben ( Ankarcrona et al., 1995 ; Nicotera et al., 1997a ; Leist et al., 1997 ). Der nekrotische Zelltod von Neuronen, mit seiner unkontrollierten Ausschüttung von intrazellulären Substanzen wie Glutamat, führt wiederum zur Aktivierung von NMDA-Rezeptoren auf benachbarten Neuronen ( Nicotera und Leist, 1997 ).

Die apoptotischen Zellen im Nervensystem werden sowohl während der Entwicklung als auch unter pathologischen Bedingungen phagozytiert und dadurch aus dem Gewebe entfernt ( Waters 1996 ). Da Mikrogliazellen die professionellen Phagozyten im zentralen Nervensystem sind, übernehmen sie hauptsächlich die Funktion der Entfernung apoptotischer Zellen aus dem Gewebe und verhindern dadurch die Auslösung einer inflammatorischen Antwort.


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1.3 Mikroglia

Das zentrale Nervensystem (ZNS) gehört zu den immunologisch abgegrenzten Regionen im Körper ( Lassmann 1997 ). Immunzellen, Antikörper und andere immunologische Moleküle können die intakte Bluthirnschranke des Gehirns kaum überwinden ( Hickey et al., 1991 ; Lassmann 1997 ). Lediglich wenige Monozyten und aktivierte T-Lymphozyten können im ZNS nachgewiesen werden ( Lassmann 1997 ). Aktivierte T-Lymphozyten können die Bluthirnschranke überwinden, jedoch ist bisher unklar, wie Monozyten ins Gehirn einwandern ( Hickey et al., 1991 ; Wekerle 1995 ; Lassmann 1997 ). Unter physiologischen Bedingungen ist die Expression von immun relevanten Oberflächenmolekülen im ZNS, wie den Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klassen, kaum nachweisbar ( Hart und Fabry, 1995 ; Lassmann 1997 ). Aus diesem Grund können aktivierte T-Lymphozyten ihr spezifisches Antigen nicht erkennen und somit auch nicht wirksam werden ( Hart und Fabry, 1995 ; Lassmann 1997 ). Unter pathologischen Bedingungen, wie Ischämie, nimmt die Expression von immun relevanten Zelloberflächenmolekülen, wie den MHC-Klasse 1 und 2 Molekülen, vor allem auf Mikrogliazellen zu ( Kato et al., 1995 ; Kreutzberg 1996 ). Mikrogliazellen fungieren dann als antigenrepräsentierende Zellen, indem sie durch ein Antigen in Verbindung mit einem MHC Klasse 2 Molekül einen T-Lymphozyten aktivieren ( Matsumoto et al., 1992 ; Wekerle 1995 ; Zielasek und Hartung, 1996 ). Daher werden Mikrogliazellen als die Immuneffektorzellen des ZNS ansehen.

Die ontogenetische Herkunft der Mikrogliazellen ist noch umstritten ( Fedoroff 1995 ). Aufgrund von in vitro Studien, in denen sich Mikrogliazellen aus kultivierten Zellen des embryonalen Neuralrohrs entwickelten, wurde die Ansicht vertreten, daß Mikrogliazellen, wie alle anderen Gliazellen des zentralen Nervensystems neuroektodermalen Ursprung sind ( Hao et al., 1991 ; Richardson et al., 1993 ). Die meisten Evidenzien sprechen jedoch dafür, daß sich die Mikrogliazellen, im Gegensatz zu allen anderen Zelltypen des ZNS, ontogenetisch von den Monozyten herleiten lassen ( Hickey et al., 1992 ; Ling und Wong, 1993 ). Monozyten wandern während der frühen embryonalen Entwicklung an bevorzugten Stellen, den 'hot-spots', ins Gehirn ein ( Ling und Wong, 1993 ). In diesem Stadium besitzen die Monozyten/Mikroglia eine runde Morphologie mit wenigen Ausläufern. Während der weiteren Entwicklung des ZNS differenzieren die Mikrogliazellen zu Zellen mit kleinem Zellkörper und vielen langen, verzweigten Ausläufern aus ( Streit und Kincaid Colton, 1995 ). Die Mikroglia sind während der Entwicklung des ZNS an der Phagozytose


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apoptotischer Neurone und Gliazellen beteiligt und ermöglichen durch Sekretion von trophischen Faktoren, wie Plasminogen, NGF („nerv growth factor“) und NT-3 („neurotrophin-3“), das Überleben von Neuronen ( Ashwell, 1990 ; Perry und Gordon, 1991 ; Streit und Kincaid Colton, 1995 ; Zielasek und Hartung, 1996 ; Elkabes et al., 1996 ; Aschner et al., 1999 ). Im adulten Gehirn sind die Mikrogliazellen gleichmäßig über alle Gehirnregionen verteilt und weisen eine verzweigte Morphologie auf, die als ramifiziert bezeichnet wird ( Perry und Gordon, 1991 ; Kreutzberg 1996 ). Jede einzelne ramifizierte Mikrogliazelle deckt ein bestimmtes Areal mit ihren Ausläufern im Gewebe ab, ohne daß sich die Areale verschiedener Mikrogliazellen überschneiden ( Lawson et al., 1990 ; Streit und Kincaid Colton, 1995 ). Die ramifizierte Mikroglia weist eine geringe Expression von immunrelevanten Molekülen, wie z.B. MHC, auf und wird daher als immunologisch „ruhend“ bezeichnet ( Wu et al., 1994 ; Kreutzberg 1996 ). Durch die ramifizierte Morphologie haben die Mikrogliazellen engen Kontakt zu vielen Zellen in ihrer Umgebung ( Streit und Kincaid Colton, 1995 ). Aus diesem Grund können Veränderungen in der Umgebung der Mikrogliazelle wahrscheinlich schnell registriert werden und zu einer Reaktion der Mikroglia führen.

Unter pathologischen Bedingungen, wie bei bakteriellen und viralen Infektionen des Nervensystems, neurodegenerativen und demyelinisierenden Erkrankungen, Trauma und Ischämie wird die ruhende Mikroglia aktiviert (zur Übersicht: Zielasek und Hartung, 1996 ). Diese Aktivierung ist mit einer morphologischen Veränderung der Zelle verbunden ( Kreutzberg 1996 ). Es kommt zu einer Reduzierung der Ausläufer und zu einer Vergrößerung des Zellkörpers ( Kreutzberg 1996 ). Neben diesen morphologischen Veränderungen wird der Aktivierungsprozess von einer Proliferation und von einer Migration der Mikroglia zum Ort des pathologischen Ereignisses begleitet ( Kreutzberg 1996 ). In geschädigten Bereichen des Gehirns, wie bei den vom ß-Amyloid Peptid gebildeten Plaques in der Alzheimer Krankheit, kann daher eine erhöhte Ansammlung von aktivierten Mikrogliazellen festgestellt werden ( McGeer und McGeer, 1998 ). Kommt es durch den pathologischen Vorgang zum Absterben von Zellen, wird die Mikrogliazelle phagozytotisch aktiv ( Streit 1995 ; Kreutzberg 1996 ).

Während der Aktivierung der Mikrogliazellen kommt es zu einer neuen bzw. verstärkten Expression von Zelloberflächenmolekülen ( Graeber et al., 1988 ; Raivich et al., 1991 ; Zielasek und Hartung, 1996 ). Zu diesen Molekülen gehören die MHC Klassen, die Rezeptoren für den Komplementfaktor 3a (CR3), die Fc-Rezeptoren zur Erkennung von


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Antikörpern und die Rezeptoren für GM-CSF (Granulozyt-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor) und M-CSF (Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor) ( Graeber et al., 1988 ; Raivich et al., 1991 ; Zielasek und Hartung, 1996 ). GM-CSF und M-CSF werden von Astrozyten und Fibroblasten produziert und regen die Proliferation der Mikroglia an ( Benveniste 1995 ).

Eine Aktivierung der Rezeptoren durch Adenosin-5´-triphosphat (ATP) oder durch Komplementfaktoren (C3a, C5a) ist mit einem intrazellulären Kalziumsignal und einer Aktivierung von Kaliumkanälen in der Mikrogliazelle verbunden ( Walz et al., 1993 ; Ilschner et al., 1995 ; Ilschner et al., 1996 ; Moller et al., 1997 ). Kaliumkanäle mit auswärtsgleichrichtenden Eigenschaften treten im Gegensatz zu unstimulierten kultivierten Mikrogliazellen in aktivierten, kultivierten Mikrogliazellen auf ( Eder 1998 ). Daher wird die Expression von Kaliumkanälen mit auswärtsgleichrichtenden Eigenschaften als ein Aktivierungsmarker für Mikrogliazellen angesehen.

Die aktivierte Mikroglia sekretiert zudem Zytokine, wie „tumor-necrosis factor alpha“ (TNFalpha), „transforming growth factor beta“ (TGFbeta1) und Interleukine (z.B. IL-1 und IL-6) ( Lee et al., 1993 ; Zielasek und Hartung, 1996 ; Prinz et al., 1999 ). Diese Zytokine spielen eine wichtige Rolle in der Induzierung bzw. Modulation des inflammatorischen Prozesses. Auch Chemokine, die chemoattraktiv auf inflammatorische Zellen wirken und zum verstärkten Einwandern von Leukozyten führen, werden von der aktivierten Mikroglia produziert ( Prinz et al., 1999 ; Bacon und Harrison, 2000 ). Ferner kommt es zur Sekretion von adhäsiven Glykoproteinen wie Thrombospondin, welches eine Bedeutung für die Erkennung von apoptotischen Zellen besitzen könnte ( Kreutzberg 1996 ; Moller et al., 1996 ) (siehe 1.4.1.3).

Eine Aktivierung der Mikrogliazelle führt neben der Induktion einer immunologischen Antwort, einer Phagozytose und einer Unterstützung des Regenerationsvorgangs ab einem bestimmten Grad der Aktivierung auch zur Schädigung des umliegenden Gewebes ( Streit und Kincaid Colton, 1995 ). Aktivierte Mikrogliazellen sekretieren zytotoxische Substanzen wie freie Sauerstoffradikale, Stickstoffmonoxid (NO), Proteasen, Glutamat und zytotoxische Zytokine, wie TNF-alpha ( Banati et al., 1993 ; Streit und Kincaid Colton, 1995 ; Kreutzberg 1996 ; Aschner et al., 1999 ). Diese zytotoxischen Substanzen schädigen neben fremden Pathogenen oder letal verletzten Neuronen auch intakte Zellen ( Streit und Kincaid Colton, 1995 ). Oligodendrozyten sind besonders empfindlich gegenüber diesen


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zytotoxischen Substanzen, aber auch Neurone werden durch diese Substanzen angegriffen, wodurch es zu einer Auslösung des Zelltods in diesen Zellen kommt ( Selmaj et al., 1991 ; Downen et al., 1999 ).

1.4 Erkennung apoptotischer Zellen durch Phagozyten

Im lebenden Organismus kommt es innerhalb kurzer Zeit (1-2 Stunden) zu einer Erkennung und Phagozytose apoptotischer Zellen durch Phagozyten ( Savill 1997 ). Aufgrund der effizienten Phagozytose können nur wenige apoptotische Zellen im Gewebe nachgewiesen werden. Trotzdem kann der Zellverlust durch die entwicklungsbedingte oder pathologische Apoptose im Gewebe dramatisch sein. Aus diesem Grund wurde die Bedeutung der Apoptose für den Organismus erst spät erkannt. An der Aufnahme apoptotischer Zellen sind nicht nur professionelle Phagozyten, wie Makrophagen und Mikrogliazellen sondern auch „semiprofessionelle“ Phagozyten, wie Epithelzellen und Hepatozyten beteiligt ( Dini et al., 1992 ; Savill 1997 ).

Die Phagozytose von apoptotischen Zellen verhindert eine inflammatorische und immunologische Antwort, was durch histologische Studien über den entwicklungsbedingten Zelltod gezeigt werden konnte ( Savill 1997 ). Obwohl eine große Zahl apoptotischer Zellen während der Entwicklung durch Phagozyten aufgenommen wird, konnte ein inflammatorischer Prozess im Gewebe bisher nicht nachgewiesen werden. Das Ausbleiben einer inflammatorischen und immunologischen Antwort beruht einerseits darauf, daß phagozytierende Zellen durch die Aufnahme apoptotischer Zellen nicht aktiviert werden, sondern vielmehr deaktivierende Faktoren ausschütten ( Green und Beere, 2000 ). Andererseits wird durch die rasche Entfernung eine sekundäre Nekrose der apoptotischen Zellen vermieden ( Savill 1997 ).

Die Lyse apoptotischer Zellen (sekundäre Nekrose), und die damit einhergehende Freisetzung von zytoplasmatischen Bestandteilen hat eine inflammatorische Antwort zur Folge ( Savill 1997 ). Eine unvollständige Phagozytose apoptotischer Zellen aufgrund eines induzierten massiven apoptotischen Zelltods von Hepatozyten in Mäusen ist daher wahrscheinlich ursächlich für den Tod der Tiere verantwortlich ( Ogasawara et al., 1993 ; Savill 1997 ; Ren und Savill, 1998 ). Protein- oder DNA-Fragmente aus sekundär nekrotischen Zellen, die aufgrund von Proteolyse intrazellulärer Proteine und Spaltung des Chromatins während der Apoptose entstehen, könnten außerdem zu einer


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immunologischen Antwort führen ( Ren und Savill, 1998 ). DNA-Fragmente (Oligonukleosome) aus apoptotischen Zellen können beispielsweise eine Immunglobulinsynthese in Lymphozyten induzieren, was eine immunologische Antwort zur Folge hat ( Bell und Morrison, 1991 ; Savill 1997 ). Im Blut vieler Autoimmunerkrankter konnten des weiteren Oligonukleosomen, die von apoptotischen Zellen stammen könnten, nachgewiesen werden ( Savill 1997 ).

Durch die Phagozytose von apoptotischen Zellen wird weiterhin die Produktion von antiinflammatorischen Zytokinen, wie „transforming growth factor-beta“ (TGF-beta) aktiviert und die Produktion von inflammatorischen Molekülen, wie TNF-alpha inhibiert ( Fadok et al., 1998 b; Green und Beere, 2000 ). Diese antiinflammatorische Antwort der Phagozyten beruht auf einem spezifischen Bindungsmechanismus, durch den diese Phagozyten apoptotische Zellen erkennen und aufnehmen ( Fadok et al., 1998 ). Wenn der spezifische Bindungsmechanismus durch eine Opsonierung der apoptotischen Zellen mit Antikörpern verhindert wird, so daß die apoptotischen Zellen mit Hilfe eines Fc- oder Komplement Rezeptors durch die Makrophagen aufgenommen werden, kommt es zur Auslösung einer inflammatorischen Antwort ( Fadok et al., 1998 b). Weiterhin kommt es bei der Phagozytose von apoptotischen Zellen durch dendritische Zellen, im Gegensatz zur Phagozytose von nekrotischen Zellen, nicht zu einer Expression von co-stimulierenden Molekülen. Dadurch wird eine T-Zell Aktivierung vermieden ( Green und Beere, 2000 ). Das Fehlen von co-stimulierenden Molekülen führt vielmehr zu einer Toleranz der spezifischen T-Zellen gegenüber den durch das MHC-I präsentierten Peptiden der apoptotischen Zelle ( Green und Beere, 2000 ).

Eine effiziente Beseitigung apoptotischer Zellen verhindert daher die Inflammation des Gewebes und die Auslösung einer (auto)Immunantwort auf potentielle (selbst)Antigene von apoptotischen Zellen.


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1.4.1 Erkennungsmechanismen

Während für das periphere Immunsystem ein breites Verständnis über die Mechanismen vorliegt, die zur Aufnahme von apoptotischen Zellen führen, ist das Wissen darüber für das ZNS noch gering ( Savill et al., 1993 ). In diesem Kapitel werden überwiegend Erkennungsmechanismen zwischen apoptotischen Zellen und Makrophagen bzw. Monozyten aus dem peripheren Immunsystem beschrieben (Abb. 2).

Eine Grundvoraussetzung für die Erkennung apoptotischer Zellen durch Phagozyten ist eine veränderte Oberflächenstruktur der apoptotischen Zellen im Gegensatz zu normalen Zellen ( Savill et al., 1993 ). Da eine Neusynthese von Proteinen kein generelles Merkmal der Apoptose ist, ist eine Markierung apoptotischer Zellen durch ein neu synthetisiertes spezifisches Zelloberflächenprotein unwahrscheinlich ( Savill et al., 1993 ). Nach dem heutigen Verständnis beruht die Erkennung von apoptotischen Zellen auf eine Veränderung bereits existierender Plasmamembranbestandteile ( Savill et al., 1993 ) (Abb.2).

Abbildung 2: Verschiedene Erkennungsmechanismen, die zur Phagozytose von apoptotischen Zellen durch Phagozyten führen können.


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1.4.1.1 Erkennung spezifischer Zuckerstrukturen

Während des apoptotischen Prozesses kommt es zu Veränderungen der Zuckerstrukturen auf der Zelloberfläche apoptotischer Zellen ( Dini et al., 1992 ). Durch den Verlust terminaler Sialinsäurereste von Zuckerstrukturen der Glykoproteine auf der Oberfläche apoptotischer Zellen werden Reste wie N-Acetylglukosamin, N-Acetylgalaktosamin und Galaktose exponiert ( Duvall et al., 1985 ; siehe Abb.2). Lektine, die selektiv N-Acetylgalaktosamin erkennen, konnten daher apoptotische Leberzellen der Ratte markieren ( Dini et al., 1992 ). Die exponierten Zuckerreste auf apoptotischen Zellen können durch Lektine der Phagozyten erkannt werden ( Duvall et al., 1985 ; Savill et al., 1993 ; Falasca et al., 1996 ; siehe Abb.2). Die Erkennung apoptotischer Thymozyten durch Peritonealmakrophagen kann daher durch Mono- und Disaccharide inhibiert werden, die an die Lektine der Phagozyten binden ( Duvall et al., 1985 ).

Die Exposition der veränderten Zuckerstrukturen ist wahrscheinlich eine Folge von späten Ereignissen des apoptotischen Prozesses, da es in den späten Phasen der Apoptose zu einer Fusion der Plasmamembran mit Elementen des Endoplasmatischen Retikulums und/oder des Golgi-Apparats kommt ( Savill 1997 ). Diese Organellen enthalten Proteine, die sich noch im Prozess der Glykolisierung befinden und daher Zucker wie N-Acetylglukosamin exponieren ( Duvall et al., 1985 ). Die Erkennung apoptotischer Zellen durch Lektine scheint bei semiprofessionellen Phagozyten, wie Fibroblasten, Epithelzellen und Hepatozyten von Bedeutung zu sein ( Dini et al., 1992 ). Bei diesen Zellen konnte die Aufnahme apoptotischer Zellen durch Monosaccharide inhibiert werden ( Dini et al., 1992 ; Savill 1997 ). Hepatozyten können veränderte Zuckerstrukturen durch einen Asialoglykoproteinrezeptor erkennen ( Dini et al., 1992 ). Andere Lektine der Phagozyten, die veränderte Zuckerstrukturen apoptotischer Zellen erkennen, sind bisher nicht bekannt ( Savill 1997 ). Da eine Erkennung apoptotischer Zellen schon in frühen Phasen des apoptotischen Prozesses erfolgt sollten professionelle Phagozyten weitere Rezeptoren für die Erkennung apoptotischer Zellen exprimieren ( Savill 1997 ).


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1.4.1.2 Erkennung von Phosphatidylserin

Unter physiologischen Bedingungen zeichnet sich die Plasmamembran von Zellen durch eine Phospholipidasymmetrie aus. Auf der Außenseite der Plasmamembran befinden sich überwiegend Lipidmoleküle, die Cholin in der Kopfgruppe enthalten, wie Phosphatidylcholin (PC) und Sphingomyelin. Aminophospholipide, wie Phosphatidylserin (PS) und Phosphatidylethanolamin (PE) befinden sich dagegen überwiegend auf der Innenseite der Plasmamembran. Diese Plasmamembranasymmetrie wird durch eine ATP-abhängige Aminophospholipid Translokase aufrecht erhalten, die PS und PE auf die zytosolische Seite der Plasmamembran transportiert ( Zwaal und Schroit, 1997 ). Während des apoptotischen Prozesses einer Zelle kommt es zur Präsentation von PS auf der Außenseite der Plasmamembran ( van den Eijnde et al., 1998 ; van Engeland et al., 1998 ; siehe Abb.2). Ursache dafür sind die Inhibierung der Aminophospholipid Translokase und die Aktivierung einer kalziumabhängigen Lipid-Scramblase, die Phospholipide zwischen den zwei Membranseiten transportiert (flip-flop) ( Zwaal und Schroit, 1997 ; Fadok et al., 1998 ). Dies führt innerhalb von Minuten zu einem Verlust der Phospholipidasymmetrie und damit zu einer Präsentation des anionischen PS auf die Außenseite der Plasmamembran ( Zwaal und Schroit, 1997 ; Fadok et al., 1998 ). Untersuchungen mit PS bindendem Annexin-V zeigten, daß die Präsentation von PS ein sehr früher Marker der Apoptose ist ( Martin et al., 1995 ; Vincent und Maiese, 1999 ). Die Präsentation von PS tritt bereits vor den charakteristischen morphologischen Veränderungen der Apoptose und vor der nukleären Kondensation auf ( Martin et al., 1995 ; van Engeland et al., 1998 ).

Fadok und Mitarbeiter brachten den Verlust der Phospholipidasymmetrie der Plasmamembran und die damit einhergehende Präsentation von PS mit der Erkennung von apoptotischen Zellen durch Phagozyten in Zusammenhang ( Fadok et al., 1992 ; Savill et al., 1993 ; Platt et al., 1996 ). Liposome, die PS enthielten, oder wasserlösliche PS Analoga inhibierten kompetetiv die Erkennung apoptotischer Lymphozyten durch Makrophagen ( Fadok et al., 1992 ). Da einige Phagozyten PS exprimierende Zellen binden, ohne sie zu phagozytieren, scheint die Phagozytose noch von weiteren Faktoren abzuhängen ( Schwartz et al., 1985 ; Savill 1997 ).

Mögliche Rezeptoren für PS könnten Scavenger-Rezeptoren auf den Phagozyten sein ( Fadok et al., 1998 ; Platt et al., 1996 ). Der Ausdruck „Scavenger Rezeptor“ wurde eingeführt, um Bindungsstellen für chemisch modifizierte Formen (acetylierte oder


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oxidierte Form) von Lipoproteinen mit niedriger Dichte („low density lipoprotein“ (LDL)) auf der Oberfläche von Makrophagen zu beschreiben ( Hart et al., 1996 ). Die Scavenger Rezeptoren werden in sechs Gruppen unterteilt und stellen eine Familie von strukturell unterschiedlichen Rezeptoren mit einer breiten Ligandenspezifität dar ( Platt et al., 1998 ). Die Klassen B und D Scavenger Rezeptoren binden PS-Liposome ( Fadok et al., 1998 ). Zu den Klasse B Scavenger Rezeptoren gehört CD36, welches auch Thrombospondin bindet ( Rigotti et al., 1995 ; Aderem und Underhill, 1999 ; siehe Abb.2). Obwohl CD36 an PS bindet, konnte nicht gezeigt werden, daß diese Bindung zu einer Aufnahme von apoptotischen Zellen führt ( Fadok et al., 1998 ). Dagegen wird die PS-Bindung durch den Klasse D Scavenger Rezeptor CD68 (Mensch) oder Macrosialin (Maus) für eine Erkennung und Phagozytose von apoptotischen Zellen durch Peritonealmakrophagen benötigt. Dies konnte durch Experimente mit einem Antikörper gegen CD68 und Liposomen, die PS enthielten, gezeigt werden ( Sambrano und Steinberg, 1995 ; Fadok et al., 1998 ). Für die Scavenger Rezeptoren der Klasse A (SR-As) konnte bisher keine Bindung an PS beobachtet werden ( Fadok et al., 1998 ). Die SR-As sind jedoch an der Phagozytose von apoptotischen Zellen beteiligt, wie in vitro Studien an der Phagozytose apoptotischer Thymozyten durch Makrophagen zeigten ( Hart et al., 1996 ; siehe Abb.2). Diese Phagozytose konnte durch monoklonale Antikörper gegen SR-As inhibiert werden ( Hart et al., 1996 ). In vitro wurde die Phagozytose von apoptotischen Thymozyten durch Makrophagen aus einer SR-A Null Maus, die keine SR-As exprimierten, um 50% reduziert ( Platt et al., 1996 ; Terpstra et al., 1997 ). In vivo nahm die relative Anzahl von apoptotischen Thymozyten in den SR-A Null Tieren jedoch nicht zu, was darauf hindeutet, daß andere Rezeptoren ebenfalls eine Rolle für die Entfernung von apoptotischen Zellen im Thymus spielen ( Fadok et al., 1998 ).

Neben den Scavenger Rezeptoren könnte das CD14 Molekül, das für die Vermittlung von LPS-Signalen bekannt ist, PS auf apoptotischen Zellen binden ( Devitt et al., 1998 ). Die Bedeutung des CD14 für die Phagozytose von apoptotischen Zellen wurde durch Experimente mit einem monoklonalen Antikörper gegen CD14 gezeigt, der spezifisch die Phagozytose von apoptotischen Lymphozyten durch Makrophagen verhinderte ( Devitt et al., 1998 ; siehe Abb.2). Die apoptotischen Zellen binden an oder in der Nähe der LPS-Bindungstelle ( Devitt et al., 1998 ). Trotzdem wird durch die Bindung apoptotischen Zellen an CD14, im Gegensatz zur Bindung von LPS, keine inflammatorische Antwort ausgelöst ( Devitt et al., 1998 ).


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Weiterhin könnten das Serumprotein beta2-Glykoprotein-I, welches an anionische Phospholipide bindet, und das lösliche GAS-6 Protein, das an Tyrosinkinaserezeptoren bindet und die kalziumabhängige Bindung von U937 Zellen an PS-beschichteten ELISA Platten vermittelt, an der Phagozytose apoptotischer Zellen durch Phagozyten beteiligt sein ( Nakano et al., 1997 ; Balasubramanian et al., 1997 ; Fadok et al., 1998 ). In der Gegenwart von beta2-Glycoprotein konnten Antiphospholipid-Antikörper aus Patienten mit dem Antiphospholipid Antikörper Syndrom (aPL) apoptotische Zellen opsonieren ( Price et al., 1996 ).

Erst kürzlich wurde ein Antikörper (217) generiert, der im gleichen Ausmaß wie PS-Liposome die Aufnahme apoptotischer Zellen durch Makrophagen inhibiert ( Fadok et al., 2000 ). Dieser Antikörper bindet an ein bisher unbekanntes Oberflächenprotein auf der Oberfläche von Makrophagen und Epithelzellen ( Fadok et al., 2000 ).

1.4.1.3 Thrombospondin-vermittelte Erkennung

Apoptotische Zellen besitzen anionische Thrombospondin-1 Bindungsstellen auf der Zelloberfläche ( Savill et al., 1993 ; siehe Abb.2). Diese Bindungsstellen ermöglichen apoptotischen Neutrophilen in vitro die Bindung von Latexkugeln, die mit dem Protein Thrombospondin-1 (TSP1) beschichtet sind ( Savill et al., 1992 ). TSP1 ist ein trimeres, multifunktionales, adhäsives Glykoprotein, welches von Makrophagen und Mikroglia sekretiert und von diesen auch erkannt werden kann ( Savill et al., 1990 ; Kreutzberg 1996 ; Savill 1997 ). Die Erkennung von apoptotischen Zellen kann daher mit Hilfe von TSP1, das die apoptotische Zelle mit dem Phagozyten verbindet, erfolgen ( Savill 1997 ). Die Erkennung apoptotischer Neutrophiler durch Makrophagen kann spezifisch durch kationische Aminozucker, die die anionischen TSP1 Bindungsstellen auf den apoptotischen Zellen maskieren, inhibiert werden ( Savill et al., 1993 ).

TSP1 besitzt die spezifische Aminosäuresequenz Argenin-Glycin-Asparagin (RGD), die durch Integrine von Makrophagen gebunden werden kann ( Savill et al., 1990 ). Für die TSP1 vermittelte Erkennung apoptotischer Zellen durch Makrophagen ist ein TSP Rezeptor von Bedeutung, der sich aus dem CD36 und dem Vitronektin Rezeptor (Integrin alphavbeta3) zusammensetzt ( Savill et al., 1990 ; Savill et al., 1992 ; Ren et al., 1995 ; siehe Abb.2). Die Erkennung von apoptotischen Eosinophilen und Lymphozyten durch Makrophagen


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kann daher durch Antikörper gegen TSP1, gegen das CD36 oder gegen den Vitronektin Rezeptor und durch RGD Peptide, die an den Vitronektin Rezeptor binden, spezifisch inhibiert werden ( Savill et al., 1992 ). Semiprofessionelle glomuläre Zellen der Niere, die CD36 nicht exprimieren, besitzen ebenfalls einen TSP1 vermittelten Mechanismus zur Erkennung von apoptotischen Zellen ( Hughes et al., 1997 ). Dieser TSP1 vermittelte Mechanismus in dem der Vitronektin Rezeptor involviert ist, ist in Bezug auf die Zahl der phagozytierten Zellen dreimal weniger effizient als der Vitronektin/TSP1/CD36-Mechanismus von Makrophagen ( Savill 1997 ; Hughes et al., 1997 ). Daher wird vermutet, daß das CD36 eine verstärkende Rolle bei der Vitronektin/TSP-vermittelten Erkennung einnimmt ( Savill 1997 ). Dieser verstärkende Effekt bei der Aufnahme von apoptotischen Zellen durch CD36 könnte auf der Fähigkeit des CD36-Moleküls beruhen, oxidierte Oberflächenreste auf apoptotischen Zellen zu erkennen und zu binden ( Endemann et al., 1993 ; Savill 1997 ). Jedoch ist eine PS Erkennung auf der Oberfläche von apoptotischen Zellen mittels CD36 nicht für den verstärkenden Effekt bei der Aufnahme von apoptotischen Zellen durch Makrophagen verantwortlich, da PS Inhibitoren den verstärkenden Effekt von CD36 auf die Phagozytose nicht inhibieren konnten ( Fadok et al., 1992 ; Ren et al., 1995 ; Savill 1997 ). Eine Vitronektin Erkennung von apoptotischen Zellen spielt auch bei dendritischen Zellen, die ebenfalls kein CD36 exprimieren, eine Rolle ( Rubartelli et al., 1997 ). Diese Phagozytose von apoptotischen Zellen durch dendritische Zellen ist im Gegensatz zu der Phagozytose durch Makrophagen mit einem intrazellulären Kalziumsignal verbunden ( Rubartelli et al., 1997 ). Dieses Kalziumsignal wird sowohl durch Kalzium aus den intrazellulären Speichern als auch durch extrazelluläres Kalzium generiert und ist für die Aufnahme apoptotischer Zellen durch dendritische Zellen notwendig, da Kalziumchelatoren diese Aufnahme inhibieren konnten ( Rubartelli et al., 1997 ).

Unklar ist, durch welchen Mechanismus TSP1, welches auch an nicht apoptotische Zellen binden kann, apoptotische Zellen für eine Phagozytose markiert ( Savill 1997 ). Möglicherweise wird TSP1 durch die bislang nicht näher identifizierten TSP1 Bindungsstellen auf apoptotischen Zellen in einer prophagozytischen Konformation präsentiert ( Savill 1997 ).


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1.4.1.4 Weitere Erkennungsmechanismen

Antikörper gegen ICAM-3 auf der Oberfläche von apoptotischen B-Zellen inhibierten die Erkennung dieser Zellen durch Phagozyten ( Flora und Gregory, 1994 ; Savill 1997 ). ICAM-3 könnte daher ein weiterer Marker für die Erkennung apoptotischer Zellen durch Phagozyten darstellen (siehe Abb.2).

Es gibt Hinweise, daß das Makrophagen ABC-1 („ATP binding cassette-1“) Molekül in Mäusen an der Aufnahme von apoptotischen Zellen durch Peritonealmakrophagen beteiligt ist ( Luciani und Chimini, 1996 ; Devitt et al., 1998 ; siehe Abb.2). Dieses Molekül ist ein Mitglied der ABC Superfamilie von Membrantransportern. Antikörper gegen die zytoplasmatische ATP-Bindungsdomäne des transmembranen ABC-1 Moleküls inhibierten die Aufnahme von apoptotischen Thymozyten durch Makrophagen ( Luciani und Chimini, 1996 ; Savill 1997 ). Die ABC Transporter besitzen eine Proteinsequenzhomologie zu dem Ced-7 Protein des Nematoden Caenorhabditis elegans ( Moynault et al., 1998 ). In diesem Nematoden wurden sieben Gene identifiziert, die bei der Entfernung von apoptotischen Zellen durch Phagozytose beteiligt sind ( Liu und Hengartner, 1999 ). So führen Mutationen im ced-7 Gen beispielsweise zu einer verringerten Phagozytose von apoptotischen Zellen durch Nachbarzellen ( Ellis et al., 1991 ). Das Ced-7 Protein spielt sowohl in der phagozytierenden wie auch in der apoptotischen Zelle ein Rolle ( Wu und Horvitz, 1998 ). Wahrscheinlich ist das Protein daher wichtig für die Interaktion zwischen diesen Zellen ( Wu und Horvitz, 1998 ). Das ABC-1 Molekül könnte eine ähnliche Funktion bei der Phagozytose von apoptotischen Zellen durch Makrophagen einnehmen. Es wird diskutiert, daß das ABC-1 Molekül an der Aufrechterhaltung des Lipidgleichgewichts entlang der Plasmamembrandoppelschicht beteiligt ist ( Marguet et al., 1999 ).


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Obwohl mehrere Rezeptoren für die Erkennung apoptotischer Zellen auf den Makrophagen vorliegen, sind in den spezifischen Zellsystemen immer bestimmte Rezeptorsysteme vorrangig für die Erkennung von apoptotischen Zellen verantwortlich ( Aderem und Underhill, 1999 ). Welcher Mechanismus zur Erkennung von apoptotischen Zellen führt, hängt vermutlich von der Makrophagenpopulation ab ( Fadok et al., 1992 ). Beispielsweise läßt sich die Phagozytose apoptotischer Zellen durch Peritonealmakrophagen durch PS inhibieren, während sich die Phagozytose dieser Zellen durch Knochenmarksmakrophagen mit RGDS inhibieren läßt ( Fadok et al., 1992 ). Der bevorzugte Phagozytosemechanismus hängt ebenfalls von der zu phagozytierenden apoptotischen Zelle ab ( Aderem und Underhill, 1999 ). Die Aufnahme apoptotischer Lymphozyten durch Peritonealmakrophagen kann durch PS blockiert werden, während die Aufnahme von apoptotischen Neutrophilen durch dieses Phospholipid nicht gehemmt wird ( Hart et al., 1996 ; Aderem und Underhill, 1999 ). Außerdem kann das bevorzugte Rezeptorsystem zur Aufnahme von apoptotischen Zellen auch vom Aktivierungszustand der Makrophagenzelle abhängig sein ( Ren und Savill, 1995 ). Die Aufnahme apoptotischer Lymphozyten durch aktivierte Makrophagen erfolgt beispielsweise durch Lektin-ähnliche Rezeptoren, während diese Phagozytose durch unaktivierte Makrophagen mit Hilfe eines TSP vermittelten Mechanismus erfolgt ( Pradhan et al., 1997 ).


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Fri Jan 26 13:08:51 2001