Witting, Anke: Erkennung apoptotischer Neurone durch Mikrogliazellen in vitro

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Kapitel 3. Methoden

3.1 Zellkultur

3.1.1 Präparation der Körnerzellkulturen

Für die Herstellung der Körnerzellkulturen wurden sechs Tage alte Wistar Ratten (Charles River, Sulzfeld, Deutschland) verwendet und nach der von Drejer und Mitarbeitern beschriebenen Methode vorgegangen ( Drejer et al., 1985 ). Die Ratten wurden dekapitiert, die Schädeldecke geöffnet und das Kleinhirn entnommen. Das Kleinhirn wurde in eine Petrischale mit gekühltem „Hank´s balanced salt solution“ (HBSS, Seromed/Biochrom, Berlin) überführt und die Hirnhäute entfernt. Das Gewebe wurde mit einem Skalpell in kleine Stücke zerteilt und für sieben Minuten bei 37°C mit 1 % Trypsin (Boehringer, Mannheim) und 0,05 % DNAse (Worthington, Lakewood, NY) in HBSS behandelt. Anschließend wurde die Trypsinreaktion durch Zugabe von serumhaltigem „Basal Medium Eagle“ (BME) Medium (Zusammensetzung siehe 3.1.5) gestoppt. Es folgte eine einminütige Zentrifugation bei 3000 Umdrehungen pro Minute (Upm). Danach wurden die Zellen mit Hilfe einer feuerpolierten Pasteurpipette dissoziiert. Nach einer weiteren Zentrifugation bei 800 Upm für 10 Minuten wurde die Suspension zur Entfernung größerer Gewebsstücke gefiltert. Anschließend wurden die Zellen zur Bestimmung der Lebendzellzahl mit Trypanblau (Sigma, Deisenhofen) angefärbt und die nicht gefärbten, lebenden Zellen ausgezählt. Die Zellen wurden in einer Dichte von 3 x 105 Zellen auf Poly-L-Lysin (PLL, Sigma, Deisenhofen) beschichteten Deckgläsern in BME-Medium, welches 25 mM KCl enthielt, ausplattiert und bei 37°C und 5 % CO2 kultiviert. 24 Stunden nach dem Ausplattieren der Zellen wurde das BME-Medium gegen serumfreies Medium mit 25mM KCl (siehe 3.1.5) ausgetauscht. Das Medium enthielt zusätzlich 10 µM Cytosin Arabinofuranosid (Sigma, Deisenhofen), um die Proliferation von nichtneuronalen Zellen zu verhindern. Die Neuronenkulturen wurden nach sieben Tagen für die Experimente verwendet.


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3.1.2 Präparation der Mikrogliazellkulturen

Mikrogliazellen wurden aus dem Kortex von neugeborenen Wistar Ratten bzw. NMRI Mäusen präpariert ( Giulian und Baker, 1986 ; Nolte et al., 1996 ). Die Tiere wurden dekapitiert, das Gehirn entnommen und der Kortex herauspräpariert. Nach Entfernung der Hirnhäute und Blutgefäße wurden die Kortexhälften zweimal mit HBSS gewaschen, für 5-8 min mit 1 % Trypsin und 0,05 % DNAse in HBSS inkubiert, nochmals zweimal mit HBSS gewaschen und mit Hilfe einer feuerpolierten Pasteurpipette dissoziiert. Nach Zugabe von serumhaltigem BME-Medium folgte eine Zentrifugation bei 800 Upm für 10 Minuten bei 4°C. Die Zellen wurden in Poly-L-Lysin beschichteten 75 cm2 Kulturflaschen (Nunc, Wiesbaden) im BME-Medium mit 10 % fötalem Kälberserum (FKS) für Mikroglia der Ratte und im DMEM-Medium mit 10% FKS für Mikrogliazellen der Maus (Zusammensetzung siehe 3.1.5) ausplattiert. Nach einem Tag wurden die Kulturen dreimal mit Phosphatpuffer (PBS, Life Technologies/GibcoBRL, Eggenstein) gewaschen. Die Zellen wurden für 9-12 Tage in BME-Medium bzw. DMEM-Medium kultiviert, wobei das Medium jeden dritten Tag ausgetauscht wurde. Nach ungefähr neun Tagen bestand die Vorkultur aus einem konfluenten Astrozytenmonolayer, worauf sich Mikrogliazellen und - bei den Rattenkulturen - Oligodendrozyten befanden. Die Mikrogliazellen konnten durch leichtes Schütteln der Kulturflaschen von dem Astrozytenmonolayer abgelöst werden. Der Überstand wurde gesammelt, zentrifugiert und die resuspendierten Mikrogliazellen anschließend zu den Neuronen hinzugefügt oder in einer Dichte von 5 x 104 Zellen auf Poly-L-Lysin-beschichteten Deckgläsern (16 mm Durchmesser) bzw. in einer Dichte von 2 x 104 Zellen/Well in 96-Wellplatten (Greiner, Frickenhausen) in DMEM mit 2 % FKS (Zusammensetzung siehe 3.1.5) ausplattiert.

3.1.3 Medien

Das Kulturmedium „Basal Medium Eagle“ (BME) wurde für die Vorkulturen der Ratte verwendet:

BME (Seromed/Biochrome, Berlin)

Penicillin

50 U/ml (Seromed/Biochrome, Berlin)

Streptomycin

50 µg/ml (Seromed/Biochrome, Berlin)

L-Glutamin

2 mM (Seromed/Biochrome, Berlin)

Fötales Kälberserum (FKS)

0,1 ml/ml (Life Technologies/GibcoBRL, Eggenstein)


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Das Kulturmedium „Dulbecco´s modifiziertes Eagle Medium“ (DMEM) mit 10% FKS wurde für die Vorkulturen der Maus verwendet

DMEM (Life Technologies/Gibco BRL, Eggenstein)

Penicillin

50 U/ml

Streptomycin

50 µg/ml

L-Glutamin

2 mM

Fötales Kälberserum (FKS)

0,10 ml/ml

Das Kulturmedium „Dulbecco´s modifiziertes Eagle Medium“ (DMEM) mit 2% FKS wurde für die Mikrogliakulturen verwendet:

DMEM (Life Technologies/Gibco BRL, Eggenstein)

Penicillin

50 U/ml

Streptomycin

50 µg/ml

L-Glutamin

2 mM

Fötales Kälberserum (FKS)

0,02 ml/ml

Das Kulturmedium „Basal Medium Eagle“ (BME) mit 25 mM KCl wurde für die Kleinhirnneuronenkulturen verwendet:

BME (Sigma, Deisenhofen)

Penicillin

50 U/ml

Streptomycin

50 µg/ml

L-Glutamin

2 mM

KCl

25 mM

Fötales Kälberserum (FKS)

0,1 ml/ml

Das Kulturmedium Serumfreies Medium mit 25 mM KCl wurde ebenfalls für die Kleinhirnneuronenkulturen verwendet:

DMEM-Pulver

10 g/l (Sigma, Deisenhofen)

NaHCO3

1 g/l

Transferrin

100 µg/ml (Sigma, Deisenhofen)

Gentamyzin

2 mg/ml (Seromed, Deisenhofen)

Insulin

10 µg/ml (Sigma, Deisenhofen)

Putreszin

16 µg/ml (Sigma, Deisenhofen)

Progesteron

62 ng/ml (Sigma, Deisenhofen)

3,3´,5-Triiodo-L-Thryonin

340 ng/ml (Sigma, Deisenhofen)

Natriumselenit

200 nM (Sigma, Deisenhofen)

L-Thyroxin

437 nM (Sigma, Deisenhofen)

BSA

10 µg/ml (Serva, Deisenhofen)

L-Glutamin

2 mM

Glukose

32 mM

KCl

25 mM


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3.2 Auslösung der Apoptose in Kleinhirnneuronen

Apoptose in kultivierten Neuronen wurde durch die Zugabe von 100 µM des Stickstoffmonoxid (NO) Donors S-Nitroso-L-Cystein (SNOC) ausgelöst ( Leist et al., 1997 ). Hierzu wurden 17,7 mg L-Cystein (Sigma, Deisenhofen) und 6,9 mg Natriumnitrit (Sigma, Deisenhofen) in einem Milliliter 100 mM Salzsäure gelöst ( Lei et al., 1992 ). SNOC wurde vor jedem Experiment frisch angesetzt. Nach Zugabe von SNOC zu den Kulturen wurde innerhalb weniger Minuten Stickstoffmonoxid (NO) freigesetzt ( Beauvais und Joly, 1999 ).

3.3 Nachweis und Charakterisierung des apoptotischen Zelltods

Der Prozeß der neuronalen Apoptose wurde durch vier verschiedene Methoden charakterisiert, die im folgenden Abschnitt beschrieben werden.

3.3.1 Untersuchung morphologischer Veränderungen mit Hilfe des Phasenkontrastmikroskops

Charakteristische morphologische Veränderungen apoptotischer Zellen, wie die Kondensation der Zellen und die Bildung apoptotischer Körper, können mit Hilfe eines Phasenkontrastmikroskops festgestellt werden ( Duvall und Wyllie 1986 ). Die Neuronenkulturen wurden nach der Behandlung mit 100 µM SNOC mit dem Phasenkontrastmikroskop (Zeiss Telaval 31, Oberkochen) auf diese morphologischen Veränderungen hin überprüft und zur Dokumentation fotografiert.

3.3.2 Untersuchung der Membranintegrität und der Zellkernmorphologie mit Hilfe von DNA-Farbstoffen

Mit dem Fluoreszenzfarbstoff 4,6-Diamidino-2-Phenylindoldihydrochlorid (DAPI) (Boehringer, Mannheim), der sich in die DNA interkaliert, kann die Zellkernmorphologie untersucht und die Kondensation der Zellkerne identifiziert werden (zur Übersicht siehe Darzynkiewicz und Traganos, 1998 ). Der Fluoreszenzfarbstoff Propidiumjodid (PI) (Sigma, Deisenhofen), der sich ebenfalls in die DNA interkaliert, markiert ausschließlich nekrotische Zellen, da der Farbstoff nicht membrangängig ist. Die durchlässige


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Plasmamembran stellt ein Merkmal nekrotischer Zellen dar ( Duvall und Wyllie 1986 ).

Die Kleinhirnneurone wurden fünf Minuten mit DAPI (Endkonzentration 1 µg/ml) und PI (Endkonzentration 5 µg/ml) in serumfreiem Medium mit 25 mM KCl inkubiert. Anschließend wurden die Neurone auf den Deckgläsern dreimal mit PBS gewaschen. Die Deckgläser wurden für zehn Minuten mit 2 % Paraformaldehyd (Merck, Darmstadt) fixiert, mit PBS gewaschen und auf einem Objektträger in einem Eindeckelmedium bestehend aus 76,9 g/l Mowiol (Hoechst, Frankfurt am Main), 2,5 % Diazabicyclo-[2.2.2]-Octan (DABCO, Sigma, Deisenhofen) und 31 % Glyzerin in PBS eingebettet. Die Auswertung und Dokumentation erfolgte unter dem Fluoreszenzmikroskop (Zeiss Axiophot, Oberkochen), das mit Filtern zur Detektion von FITC, DAPI und PI ausgerüstet war. Die Anregungswellenlängen betrugen 480 nm für FITC, 360 nm für DAPI und 540 nm für PI die Emissionsmaxima liegen bei 535 nm für FITC, 460 nm für DAPI und bei 630 nm für PI. In zufällig gewählten Gesichtsfeldern wurde die Anzahl der Neurone mit kondensiertem Chromatin und die Anzahl der Neurone, die PI gefärbt waren, bestimmt. Hierbei wurden mindestens 200 Zellen pro Deckglas ausgezählt. Die Experimente wurden in Doppel- bzw. Dreifachansätzen durchgeführt und die Ergebnisse als Mittelwert ± Standardfehler (SEM) dargestellt.

3.3.3 Untersuchung der DNA-Fragmentation mit Hilfe des in situ Apoptose Detektions Tests

Eine Fragmentierung der DNA, wie sie bei apoptotischen Zellen vorkommt, kann mit Hilfe eines in situ Apoptose Detektions Tests von ONCOR (Gaithersburg, MD, USA) nachgewiesen werden. Hierbei werden Digoxigeninnukleotide mit Hilfe einer terminalen Deoxynukleotidyltransferase (TdT) an die 3´ OH-Enden der DNA-Fragmente angefügt. In einem zweiten Schritt bindet ein fluoreszenzmarkierter anti-Digoxigenin Antikörper an das Digoxigenin der angefügten Nukleotide.

Für diese Nachweismethode wurden die auf Deckgläsern wachsenden Kleinhirnneurone fünf Minuten mit PI (Endkonzentration 5 µg/ml) im serumfreien Medium mit 25 mM KCl inkubiert. Anschließend wurden die Neurone auf den Deckgläsern dreimal mit PBS gewaschen, für 30 Minuten mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, mit PBS gewaschen und mit 0,1 % TritonX-100 für fünf Minuten permeabilisiert. Nach einem weiteren Waschschritt mit PBS wurden die Zellen fünf Minuten mit Equilibrations Puffer (Oncor) inkubiert und


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anschließend mit TdT-Lösung (Oncor) für eine Stunde in einer feuchten Kammer bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen für zehn Minuten in eine Wanne mit Stop-Wasch-Puffer (Oncor) gegeben, dreimal mit PBS gewaschen und für 30 Minuten mit einem Fluoreszenz gekoppelten anti-Dioxigenin-Antikörper (Oncor) bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimaligem Waschen der Zellen mit PBS wurden die Deckgläser mit Eindeckelmedium auf einen Objektträger eingebettet. Die Auswertung und Dokumentation erfolgte unter dem Fluoreszenzmikroskop (Zeiss Axiophot, Oberkochen), das mit Filtern zur Detektion von FITC, DAPI und PI ausgerüstet war (Wellenlänge siehe 3.3.2).

3.3.4 Untersuchung der Phosphatidylserin Präsentation auf der Außenseite der Plasmamembran mit Hilfe von Annexin-V

Der apoptotische Zelltod in den Neuronen konnte mit Hilfe von FITC-konjugierten Annexin-V (Boehringer Mannheim) detektiert werden. Annexin-V bindet an Phosphatidylserin, das auf der Außenseite der Plasmamembran apoptotischer Zellen exprimiert wird ( van Engeland et al., 1998 ).

Zunächst wurden apoptotische Neurone zur Identifikation von nekrotischen Zellen für fünf Minuten mit PI (5 µg/ml) im Kultivierungsmedium inkubiert. Anschließend wurden die Zellen dreimal mit Annexin-Bindungspuffer (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2) gewaschen und für zwei Minuten mit Annexin-V-FITC (0,2 µg/ml) im Annexin-Bindungspuffer gefärbt. Nach erneutem Waschen mit Annexin-Bindungspuffer wurden die Deckgläser mit einem konfokalem Mikroskop (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, USA), ausgerüstet mit einem 488 nm Argonionen Laser, mit Hilfe eines Wasserimmersionsobjektivs (40x) untersucht. Die Speicherung und Anzeige der Fluoreszenzbilder erfolgte mit dem Programm Imagespace (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, USA). Die Präsentation erfolgte mit der PC-Standardsoftware.

3.4 Videomikroskopie

Mit Hilfe der Videomikroskopie können Zellbewegungen über einen längeren Zeitraum beobachtet werden ( Nolte et al., 1996 ). In dieser Arbeit wurden die Bewegungen der Mikroglia nach Zugabe zu apoptotischen Kleinhirnneuronen auf Deckgläsern aufgenommen. SNOC-behandelte Neurone auf Deckgläsern wurden in eine auf 37°C


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Temperatur kontrollierte Inkubationskammer, in der sich serumfreies Medium mit 25 mM KCl befand, überführt. Die Kammer wurde auf den Objekttisch eines inversen Mikroskops (Zeiss IM 100, Oberkochen), das mit einer Videokamera (C2400-07 Hamamatsu, Herrsching) verbunden war, montiert. Die Inkubationskammer wurde kontinuierlich mit Karbogen begast, um den pH-Wert des Mediums konstant auf pH 7,4 zu halten. Zu den Neuronen in der Inkubationskammer wurden 5 x 104 Mikrogliazellen gegeben. Die Mikrogliazellen setzten sich nach ungefähr 15 Minuten auf den Deckgläsern mit den apoptotischen Neuronen ab. Mit einem Videorecorder (Panasonic AG 6730) wurden im Zeitraffer-Modus Videobilder aufgenommen. Zur Dokumentation wurden einzelne Aufnahmen digitalisiert (Movieblaster, CPS, Hamburg, Deutschland).

3.5 Mikrochemotaxis Test

Die Motilität der Mikroglia in der Anwesenheit von Kulturüberständen von apoptotischen Neuronen wurde in einer 48-Well Mikrochemotaxiskammer (Neuroprobe Inc., Bethesda, MD, USA) untersucht (Abb.3). Die unteren Wells der Kammer wurden mit Zellkulturüberständen von Kontrollneuronen, von apoptotischen Neuronen (sechs Stunden nach einer SNOC-Behandlung) oder von nekrotischen Neuronen gefüllt. Zellkulturüberstände von nekrotischen Neuronen wurden erhalten, indem die Neurone durch mehrmaliges pipettieren durch eine sehr eng geschmolzene Pasteurpipette mechanisch lysiert wurden. Das obere und untere Kompartiment der Mikrochemotaxiskammer wurde durch einen PLL-beschichteten Polykarbonat Filter mit einer Porengröße von 5 µm (Poretics, Livermore, Ca, USA) getrennt. Mikrogliazellen (2-3 x 104 in 50 µl serumfreiem Medium) wurden in das obere Kompartiment der Chemotaxiskammer gefüllt. Die Experimente wurden jeweils in Dreifachansätzen durchgeführt. Nach einer Inkubationszeit von vier Stunden bei 37°C wurden die Filter drei Minuten mit Diff-Quick (Baxter Diagnostics, Düdingen, Schweiz) Fixierungslösung fixiert. Anschließend wurde für zwei Minuten mit Diff-Quick Färbelösung 1 eine eosinophile (rote) Färbung und anschließend für fünf Minuten mit Diff-Quick Färbelösung 2 eine basophile (blaue) Färbung durchgeführt. Die Filter wurden in Wasser gewaschen und über Nacht getrocknet. Mit Hilfe eines feuchten Wattestäbchens wurden Zellen, die nicht durch den Filter gewandert waren, von der oberen Seite des Filters entfernt. Die Rate der gewanderten Mikrogliazellen wurde durch Auszählung der Zellen auf der unteren Filterseite in drei zufälligen Gesichtsfeldern (= 9 Felder pro Versuchsgruppe) bestimmt.


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Hierzu wurde ein 40-faches Hellfeld Objektiv verwendet. Die Anzahl der gewanderten Mikrogliazellen in der Gegenwart von apoptotischen bzw. nekrotischen Überständen wurden gegen die Anzahl der gewanderten Mikrogliazellen in Gegenwart von Kontrollüberständen normalisiert und als Prozent der Kontrolle dargestellt.

Abbildung 3: Schematische Darstellung des Chemotaxisansatzes

3.6 Phagozytoseassay

Zur Untersuchung der Bindungsmechanismen zwischen Mikrogliazellen und apoptotischen Neuronen war es notwendig, einen geeigneten Phagozytoseassay zu entwickeln. Hierfür wurden zwei Stunden nach der SNOC-Behandlung der Neurone Mikrogliazellen in einer Dichte von 5 x 104 Zellen/cm2 auf die apoptotischen Neurone gegeben. Diese Kokultur wurde für weitere sechs Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend erfolgte zur Identifikation nekrotischer Zellen für fünf Minuten eine Inkubation mit PI (5 µg/ml). Die Kulturen wurden dreimal mit PBS gewaschen und für 10 Minuten mit 2 % Paraformaldehyd fixiert. Nach einem weiteren Waschschritt mit PBS wurden die Deckgläser für 30 Minuten mit 10 µg/ml FITC-konjugiertem Lektin von Griffonia simplicifolia (Isolektin B4-FITC; Boehringer Mannheim), welches die Mikrogliazellen färbt ( Streit, W. J., 1990 ), und DAPI, zur Identifikation der apoptotischen Zellen, (1 µg/ml) inkubiert. Die Zellen wurden anschließend dreimal mit PBS gewaschen und auf einen Objektträger in Mowiol-Eindeckelmedium eingebettet. Die Auswertung erfolgte am Fluoreszenzmikroskop. In zufällig gewählten Gesichtsfeldern wurde die Anzahl der Mikroglia, die kondensierte Zellkerne apoptotischer Neurone enthielten, bestimmt. Hierbei wurden mindestens 100 Zellen pro Deckglas ausgezählt. Die Experimente wurden in Doppel- bzw. Dreifachansätzen durchgeführt. Die Ergebnisse wurden auf die Kontrolle (Kontrolle = Mikroglia Phagozytose in unbehandelten Neuronenkulturen) normalisiert und als Mittelwert ± Standardfehler (SEM) dargestellt.


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3.7 Effekt löslicher Inhibitoren

Um potentielle Erkennungsmechanismen kompetetiv zu blockieren, wurden 15 Minuten vor Zugabe der Mikrogliazellen im Phagozytoseassay potentielle Inhibitoren in das Neuronenmedium gegeben. Als potentielle Inhibitoren wurden Glukose (Merck, Darmstadt), Mannose (Sigma, Deisenhofen), Fukose (Sigma, Deisenhofen), Galaktose (Sigma, Deisenhofen), N-Acetylglukosamin (Sigma, Deisenhofen), N-Acetylgalaktosamin (Sigma, Deisenhofen), Glukosamin (Sigma, Deisenhofen), Mannosamin (Sigma, Deisenhofen), das Tetrapeptid Argenin-Glycin-Asparagin-Serin (RGDS, Sigma, Deisenhofen), das Kontrollpeptid Argenin-Glycin-Glutamin-Serin (RGES, Sigma, Deisenhofen) oder die wasserlösliche Kopfgruppe des Phosphatidylserins, O-Phospho-L-Serin (Sigma, Deisenhofen), verwendet. Die Monosaccharide lagen alle in D(+)-steroisomerer Form vor. Die Stammlösungen der Inhibitoren wurden in Wasser angesetzt und der pH auf 7.4 eingestellt.

3.8 Neutralrottest

Um einen unspezifischen, toxischen Effekt der gelösten Inhibitoren (siehe 3.7) auf Mikrogliazellen zu untersuchen wurden Neutralrottests ( Borenfreund und Puerner, 1986 ) durchgeführt. Die Mikrogliazellen wurden in einer 96 Well Platte (2 x 104 Zellen/Well) kultiviert und für drei Stunden in der Anwesenheit von Monosacchariden, Peptiden und Phospho-L-Serin inkubiert. Neutralrot (Merck, Darmstadt) wurde in einer Endkonzentration von 50 µg/ml in das Kulturmedium gegeben und die Kulturen wurden für weitere drei Stunden inkubiert. Der Farbstoff, der von den lebenden Zellen aufgenommen wird ( Babich und Borenfreund, 1990 ), konnte durch 10 minütiges Schütteln in essigsaurem Alkohol (10 % Alkohol und 1 % Essigsäure) extrahiert und spektrophotometrisch bei 540 nm mit einem ELISA Reader (Wallac-ADL-GmbH, Freiburg) bestimmt werden. Insgesamt wurden fünf Experimente durchgeführt und für jede eingesetzte Substanz sechs Parallelwerte bestimmt. Die Kontrolldaten wurden von Zellen, die unter gleichen Bedingungen ohne Inhibitoren kultiviert wurden, ermittelt. Mikrogliazellen, die zuvor mit 2% Paraformaldehyd für 15 min inkubiert wurden, dienten als Negativkontrolle.


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3.9 Bindung von Lipidvesikeln an Gliazellen

Um eine mögliche Phosphatidylserin Erkennung bei der Phagozytose von apoptotischen Zellen durch Mikroglia näher zu untersuchen, wurden Lipidvesikel, die mit Phosphatidylserin angereichert waren, als apoptotisches Zellmodell verwendet. Diese Lipidvesikel (Large unilamellar vesicles“ (LUVs)) wurden von der Arbeitsgruppe von Prof. Herrmann aus der Humboldt Universität zur Verfügung gestellt. Vier Sorten von LUVs gelöst in HEPES gepufferter Salzlösung (150 mM NaCl, 5 mM HEPES, pH 7.4) wurden eingesetzt:

  1. Phosphatidylcholin (PC)-LUVs, die aus Phosphatidylcholin (Sigma, Deisenhofen) und 1 % Rhodamin markiertem Phosphatidylethanolamin (Sigma, Deisenhofen) bestanden, dienten als Modell für nicht apoptotische Zellen.
  2. Phosphatidylserin (PS)-LUVs, die aus Phosphatidylcholin, 10 %, 1 % oder 0,1 % Phosphatidylserin (Sigma, Deisenhofen) und 1 % Rhodamin markiertem Phosphatidylethanolamin bestanden, dienten als Modell für apoptotische Zellen.

Der Durchmesser der Lipidvesikel betrug etwa 0.1 mm. Die Lipid Konzentration in den Proben betrug 1 mM.

Mit Hilfe der LUVs erfolgte die Untersuchung der PS-Bindung an Mikrogliazellen und anderen Gliazellen. Die untersuchten Kriterien waren:

  1. Zeitabhängige Bindung der LUVs an Mikroglia
  2. Abhängigkeit der Bindung durch Mikroglia von der PS-Konzentration in den LUVs
  3. Abhängigkeit der Bindung vom Aktivierungszustand der Mikrogliazelle:
    a) Mikroglia unter normalen Kulturbedingungen
    b) mit 100 ng/ml Lipopolysaccharid (LPS) aktivierte Mikrogliazellen
    c) mit astrozytenkonditioniertem Medium kultivierte Mikrogliazellen
  4. Bindung der LUVs an Oligodendrozyten und Astrozyten


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Für die Versuche wurden die Zellen, die sich auf Deckgläsern befanden, mit 10 µl der jeweiligen LUV-Lösung in 200 µl Kulturmedium unterschiedlich lange inkubiert. Anschließend wurden die Zellen auf den Deckgläsern dreimal mit PBS gewaschen, 15 Minuten mit 2 % Paraformaldehyd fixiert und auf Objektträger mit Eindeckelmedium eingebettet. Die Auswertung und Dokumentation erfolgte mit Hilfe des Fluoreszenzmikroskops (Zeiss Axiophot, Oberkochen), das mit Filtern zur Detektion von FITC, DAPI und PI ausgerüstet war (Wellenlängen siehe 3.3.2).

3.10 Freisetzung von Zytokinen und Chemokinen durch Mikroglia

Um eine mögliche Aktivierung der Mikrogliazellen durch die Lipidvesikel zu untersuchen, wurde die Freisetzung von Zytokinen und Chemokinen durch Mikrogliazellen nach einer Inkubation mit den LUVs bestimmt.

Mikrogliazellen kultiviert in 96-Wellplatten in BME Medium mit 2 % FKS wurden für 15 Stunden mit 2 µl LUV-Lösung pro Well behandelt. Zusätzlich wurden einige Mikrogliazellen mit 100 ng/ml LPS (Escherichia coli K-235, Sigma, Deisenhofen) behandelt. Die LPS Behandlung diente als Positivkontrolle. Nach der Inkubation wurde der Gehalt von den Zytokinen TNF-alpha, IL-6 und IL-12 und den Chemokinen KC und MIP1-alpha in den Überständen mit Hilfe spezifischer ELISAs (FactorTestTM und IntertestTM, Genenzym Virotech, Rüsselsheim für IL-12; QuantikineTM M, R&D Systems, Wiesbaden für TNFalpha, IL-6, KC und MIP1alpha) untersucht. Hierzu wurden 96-Wellplatten zunächst mit einem Antikörper beschichtet. Die Platten wurden zum Absättigen unspezifischer Bindungen mit Blockierungspuffer, der Proteine enthielt, vorinkubiert. Anschließend wurden die Zellüberstände aus den durchgeführten Versuchen in diese 96-Wellplatten überführt und für die jeweiligen ELISAs entsprechend der Angaben der Hersteller inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen der Platten wurden diese mit einem biotylinierten Antikörper inkubiert. Nach weiteren Waschschritten wurden die Platten mit Streptavidin-HPR („Horseradish Peroxidase conjugated Streptavidin“) inkubiert. Anschließend wurden die Platten mehrmals gewaschen und mit Tetramethylbenzidin (TMP) inkubiert. Die Farbreaktion wurde gestoppt und die Absorption bei 450 nm in einem Photometer für 96-Wellplatten (STL, Spectra, LabInstruments Deutschland GmbH, Crailsheim) gemessen. Die Proteinmengen in den Zelllysaten wurden mit Hilfe des MicroBCA Proteintests (Pierce, Rockford, IL, USA) ermittelt. Die Ausschüttung der Zytokine und Chemokine


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wurde als pg pro µg Zellprotein bestimmt und auf die Zytokin- bzw. Chemokin-Ausschüttung durch eine LPS Behandlung der Mikrogliazellen normalisiert und als Mittelwert ± Standardfehler (SEM) dargestellt.

3.11 Messung von Änderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration mit Fluoreszenzfarbstoffen

Zur Identifikation möglicher Änderungen der intrazellulärer Kalziumkonzentration durch Bindung von Lipidvesikeln an Mikrogliazellen wurden Messungen des intrazellulären Kalziumgehalts an Mikrogliazellen durchgeführt.

Der hier verwendete Kalziumindikator Fura-2-Acetoxymethyl-Ester (Fura-2-AM, Molecular Probes, Eugene, USA) ändert durch die Bindung von Kalzium seine Fluoreszenzeigenschaft und zeigt eine Verschiebung seines Emmisionsspektrums ( Grynkiewicz et al., 1985 ). Dieser ratiometrische Farbstoff ermöglicht durch die Verhältnisbildung der Fluoreszenz bei zwei verschiedenen Anregungswellenlängen eine Angabe der intrazellulären Kalziumkonzentration ( Grynkiewicz et al., 1985 ).

Die Beladung der kultivierten Mikrogliazellen erfolgte durch 30 minütige Inkubation der Deckgläschen mit 5 µM Fura-2-AM (Stammlösung: 5 mM in DMSO) gelöst in HEPES-Lösung (150 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 2,0 mM CaCl2, 1,0 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 10 mM Glukose, pH 7,4). Für die Kalziummessungen wurden die Fura-2 gefüllten Mikrogliazellen in eine Plexiglasmeßkammer transferiert. Diese Kammer war auf dem Mikroskopkreuztisch (inverses Mikroskop, Zeiss IM100, Oberkochen) montiert und wurde kontinuierlich mit HEPES-Lösung durchspült. Die Lipidvesikel wurden in einer Konzentration von 100 µM mit einer Glaspipette, die mit Hilfe eines Mikromanipulators (Eppendorf, Hamburg) in die Nähe der Zellen plaziert wurde, appliziert. Die Glaspipetten wurden aus Borosilikatglas mit einem horizontalen Elektodenziehgerät (Modell P-2000 und P87, Sutter Instruments, Navato, USA) gezogen. Fura-2 wurde mit Hilfe einer UV-Lampe und Filtern mit 340 nm und 380 nm angeregt. Die Fluoreszenz bei 520 nm wurde alle 3 Sekunden mit 512 x 480 Bildpunkten durch eine lichtverstärkte CCD-Kamera (C2400, Hamamatsu, Herrsching) aufgenommen. Die Fluoreszenz wurde mit einer Bildanalysesoftware (Vprobe, ETM Systems, Mountain View, USA) und PC-Standardsoftware gemessen und ausgewertet. Die Darstellung der Kalziumsignale erfolgt durch Angabe des Verhältnisses der Fluoreszenz von 340 nm zu 380 nm.


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3.12 Quantifikation/ Statistik

Mit Hilfe von PC-Standardsoftware wurden die Mittelwerte und Standardfehler (± SEM) der Meßwerte aus den einzelnen Versuchen ermittelt. Für die weitere Auswertung wurden die Daten in Prozent auf die jeweiligen Kontrolldaten bezogen. Die Meßwerte aus den Kontrollversuchen entsprachen hierbei 100 %. Die aufgenommenen Daten wurden auf diese Weise normiert, um sie untereinander vergleichbar zu machen.

Zur Signifikanzanalyse wurde mit der Sigma Stat Software (Jandel Scientific, Chicago, IL,USA) ein Mann-Whitney Rank Sum Test für gepaarte Stichproben durchgeführt. Die Signifikanzgrenze lag bei p = 0,05.


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