Witting, Anke: Erkennung apoptotischer Neurone durch Mikrogliazellen in vitro

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Kapitel 4. Ergebnisse

4.1 Kleinhirnneurone als apoptotisches Modellsystem

Zur Untersuchung der Bindungsmechanismen zwischen apoptotischen Zellen des zentralen Nervensystems und Mikrogliazellen war es notwendig, ein neuronales Zellmodell zu etablieren, in dem ein apoptotischer Zelltod synchron in möglichst vielen Neuronen ausgelöst werden konnte. Neuronenkulturen aus dem Kleinhirn boten sich zu diesem Zweck an, da in diesen Kulturen die Auslösung eines apoptotischen Zelltods bereits von anderen Arbeitsgruppen untersucht wurde ( D'Mello et al., 1993 ; Leist et al., 1997 ; Chang und Wang, 1997 ). Ein apoptotischer Zelltod kann in diesen Kleinhirnneuronen beispielsweise durch einen Austausch des Kulturmediums mit hohen Kaliumkonzentrationen (25 mM) gegen Kulturmedium mit niedrigen Kaliumkonzentrationen (5 mM) oder durch die Zugabe von Stickstoffmonoxid (NO) Donatoren ausgelöst werden ( Bonfoco et al., 1995 ; Armstron et al., 1997 ; Leist et al., 1997 ; Chang und Wang, 1997 ).

Für diese Arbeit wurde ein apoptotischer Zelltod in den Kleinhirnneuronen mit dem NO-Donator S-Nitrosocystein (SNOC) ausgelöst. Hierzu wurde, wie im Methodenteil (3.2) beschrieben, SNOC in einer Konzentration von 100 µM den Neuronenkulturen beigefügt.

4.1.1 Nachweis des apoptotischen Zelltods in den Kleinhirnneuronen

Ob durch NO-Donatoren überwiegend ein apoptotischer oder nekrotischer Zelltod von Neuronen ausgelöst wird, hängt von den eingesetzten Konzentrationen der Donatoren und den Kulturbedingungen der Neurone ab ( Bonfoco et al., 1995 ; Nicotera et al., 1997a ). Unter Zellkulturbedingungen folgt dem apoptotischen Zelltod immer eine sekundäre Nekrose, da sich im allgemeinen keine Phagozyten in den Kulturen befinden ( Bonfoco et al., 1995 ). Daher war es notwendig, den Zeitverlauf des durch SNOC ausgelösten Zelltods in den Kleinhirnneuronenkulturen zu charakterisieren. Die Charakterisierung des Zelltods erfolgte anhand morphologischer und biochemischer Merkmale des apoptotischen und nekrotischen Zelltods.


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4.1.1.1 Nachweis der für Apoptose spezifischen morphologischen Veränderungen

Charakteristische morphologische Merkmale eines apoptotischen Zelltods sind Schrumpfung der Zelle, Bläschenbildung der Membran und Zerfall der Zelle in vesikuläre Strukturen (apoptotische Körper) und können im Phasenkontrastmikroskop beobachtet werden ( Duvall und Wyllie 1986 ). Aus diesem Grund wurden die Neuronenkulturen des Kleinhirns nach der Zugabe von 100 µM SNOC alle 30 Minuten mikroskopisch untersucht.

Abbildung 4: Für Apoptose spezifische morphologische Veränderungen der Kleinhirnneurone nach einer SNOC-Behandlung.

Kultivierte Kleinhirnneurone der Ratte wurden mit 100 µM S-Nitrosocystein (SNOC) behandelt und nach vier Stunden unter Phasenkontrastbeleuchtung fotografiert. Auf der linken Seite sind unbehandelte Kontrollneurone und auf der rechten Seite Neurone vier Stunden nach einer SNOC-Behandlung dargestellt.

Erste morphologische Zeichen einer Apoptose, wie Schrumpfung der Neurone und eine Zerstörung des Neuritennetzwerkes aufgrund einer Fragmentation der Neurone konnten frühestens zwei Stunden nach der SNOC-Behandlung festgestellt werden und waren vier Stunden nach der SNOC-Behandlung in der gesamten Kultur deutlich erkennbar (Abb.4).

4.1.1.2 Nachweis einer DNA-Fragmentation

Ein biochemisches Merkmal der Apoptose ist die enzymatische Fragmentation der DNA ( Bredesen 1995 ; Nicotera und Leist, 1997 ) Nicotera und Leist, 1997 . Isolierte DNA aus apoptotischen Zellen, die elektrophoretisch aufgetrennt und mit Ethidiumbromid angefärbt wurde, bildet daher ein charakteristisches Leitermuster im Gel aus ( Gong et al., 1994 ;


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Darzynkiewicz und Traganos, 1998 ). Eine weitere Methode zum Nachweis apoptotischer Fragmentation der DNA ist die in situ Markierungen der Strangenden der DNA ( Gorczyca et al., 1992 ; Darzynkiewicz und Traganos, 1998 ).

Dazu wurde in den Kleinhirnneuronen die sogenannte ApopTag-Färbung (Oncor; Gaithersburg, USA) durchgeführt, wobei die DNA-Enden fluorometrisch markiert wurden (siehe Methodenteil 3.3.3). Da es auch während des nekrotischen Zelltods in geringem Maße zu DNA Strangbrüchen kommt, wurden die Zellen zusätzlich mit PI gefärbt (siehe Methodenteil 3.3.3).

Abbildung 5: ApopTag-positive Kleinhirnneurone nach einer Behandlung mit 100 µM SNOC.

Körnerzellen in unbehandelten (Kontroll-) Kulturen (linke Abbildungen) und 18 Stunden nach der SNOC-Behandlung (rechte Abbildungen) wurden durch ApopTag-Färbung markiert. Die Phasenkontrast-Aufnahmen sind in den oberen Bildern dargestellt. Die ApopTag-Färbungen sind in den unteren Bildern dargestellt.


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18 Stunden nach einer SNOC-Behandlung wies ein Großteil der Neurone, im Gegensatz zu unbehandelten Kontrollneuronen, eine intensive ApopTag-Färbung im Zellkern auf (Abb.5). Einige dieser ApopTag-positiven Neurone zeigten ebenfalls eine PI-Färbung (nicht dargestellt). Es liegt nahe, daß es sich bei diesen Neuronen um sekundär nekrotische Zellen handelt (siehe 4.1.1.3).

4.1.1.3 Nachweis einer Chromatinkondensation

Morphologische Merkmale des apoptotischen Zelltods, wie die Kondensation des Chromatins und die zum Teil auch stattfindende Fragmentation des Zellkerns können mit Hilfe von DNA-Farbstoffen, wie 4,6-Diamidino-2-Phenylindoldihydrochlorid (DAPI) nachgewiesen werden (Übersicht: Darzynkiewicz und Traganos, 1998 ). In den Zellkernen mit kondensiertem Chromatin kommt es zu einer Zunahme der Fluoreszenzintensität.

Zum Nachweis einer Chromatinkondensation und einer Fragmentation des Zellkerns wurden unbehandelte Kleinhirnneurone und Kleinhirnneurone nach unterschiedlichen Zeiten nach einer SNOC-Behandlung mit dem DNA-Farbstoff DAPI angefärbt (siehe Methodenteil 3.3.2). Zum Nachweis nekrotischer Zellen wurden die Zellen mit dem membranimpermeablen DNA-Farbstoff Propidiumjodid (PI) angefärbt. Die Anzahl der Neurone mit kondensiertem Chromatin oder PI-markierten Zellkernen in den Kleinhirnneuronenkulturen wurde wie im Methodenteil (3.3.2) beschrieben ermittelt.


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Abbildung 6: Apoptotischer und nekrotischer Zelltod in den Körnerzellen des Kleinhirns nach einer Behandlung mit 100 µM S-Nitroso-L-Cystein.

A: DAPI-Färbung in Kontrollkulturen (linke Abbildung) und sechs Stunden nach einer Behandlung mit 100 µM SNOC (rechte Abbildung). Apoptotische Neurone werden durch ihre kondensierten Zellkerne und das kondensierte Chromatin charakterisiert (Pfeile).

B: Unbehandelte (Kontroll-) und SNOC-behandelte Neuronenkulturen wurden mit DAPI und PI gefärbt. Der Prozentsatz apoptotischer und nekrotischer Neurone wurde durch Auszählung von fünf zufällig ausgewählten Feldern auf den Deckgläsern ermittelt. Eine spontane Apoptose konnte in den Kontrollkulturen festgestellt werden; eine sekundäre Nekrose konnte 18 Stunden nach der SNOC-Behandlung beobachtet werden. Die Ergebnisse sind in Mittelwerten ± SEM dargestellt, die von 23 Experimenten für die sechs Stunden Werte und 11 Experimenten für die 18 Stunden Werte erhalten wurden. * p < 0,05


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Sechs Stunden nach einer Behandlung der Kleinhirnneurone mit 100 µM SNOC besaßen die Mehrzahl der Neurone (86.2 % ± 3.0 %) kondensiertes Chromatin im Zellkern und waren apoptotisch (Abb. 6). Ein nekrotischer Zelltod war sechs Stunden nach einer SNOC-Behandlung - verglichen mit unbehandelten Kontrollkulturen - kaum erkennbar
(0.3 ± 0.1 %) (Abb.6). Eine Behandlung der Kleinhirnneurone mit 100 µM SNOC löste also keinen nekrotischen Zelltod aus. 18 Stunden nach der SNOC-Behandlung konnte eine signifikante Zunahme des nekrotischen Zelltods (23.6 ± 2.2 %) festgestellt werden, während der Prozentsatz apoptotischer Neurone abnahm (69.2 ± 3.8 %). Diese PI-markierten Zellen wiesen häufig einen kondensierten Zellkern auf. Dies läßt darauf schließen, daß eine sekundäre Nekrose stattgefunden hatte. In der Kontrollkultur, die nicht mit SNOC behandelt wurde, wiesen ebenfalls einige Zellen kondensierte Zellkerne auf (18.3 ± 2.2 %, von 6.6 bis 45.7 %; n = 23). Es handelte sich hierbei um spontan apoptotische Zellen (Abb.6).

4.1.1.4 Nachweis von Phosphatidylserin auf der Außenseite der Plasmamembran

Während des apoptotischen Zelltods kommt es zu einer Präsentation von Phosphatidylserin (PS) auf der Außenseite der Plasmamembran ( van den Eijnde et al., 1998 ; van Engeland et al., 1998 ). Mit Hilfe des fluoreszenzmarkierten Proteins Annexin-V, welches an negativ geladene Phospholipide wie PS bindet, können PS präsentierende apoptotische Zellen markiert werden ( Koopman et al., 1994 ; Darzynkiewicz und Traganos, 1998 ). Die Präsentation von PS auf der Außenseite der Plasmamembran wird als ein früher Marker des apoptotischen Zelltods angesehen, da die Präsentation von PS in vielen apoptotischen Zellen bereits vor der nukleären Kondensation auftritt ( van Engeland et al., 1998 ).

Zum Nachweis der PS Präsentation wurden die SNOC behandelten Kleinhirnneurone mit FITC-konjugierten Annexin-V gefärbt (siehe Methodenteil 3.3.4). Zum Nachweis nekrotischer Zellen wurde diese Färbung mit einer PI-Färbung kombiniert. Im direkten Anschluß an die Färbung wurden die Zellen mit Hilfe eines konfokalen Mikroskops untersucht. Auf Ebene der Zellkörper wurden die mit Annexin angefärbten Membranen als Ringe sichtbar (Abb.7).


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Abbildung 7: Phosphatidylserin wird im Verlauf der SNOC induzierten Apoptose früh auf der Oberfläche der Neurone präsentiert.

Unbehandelte (Ktr) Körnerzellen und nach verschiedenen Zeitpunkten (2, 4 und 6 Stunden) mit SNOC behandelte Körnerzellen. Die Phasenkontrastaufnahmen sind auf der linken Seite dargestellt. Die Präsentation von Phosphatidylserin auf der äußeren Seite der Plasmamembran wurde mit Hilfe des FITC-konjugierten Annexin-V markiert und ist in den mittleren Abbildungen zu sehen. Die PI gefärbten Kerne der nekrotischen Zellen sind in der rechten Abbildung dargestellt. Die Abbildungsserie zeigt einen repräsentativen Versuch aus drei unabhängigen Versuchen.


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In den mit Annexin-V gefärbten unbehandelten Kontrollkulturen konnten wenige Annexin-V-positive Zelle beobachtet werden (Abb.7). Zwei Stunden nach der Behandlung mit 100 µM SNOC wurde eine Zunahme von Annexin-V-positiven Neuronen beobachtet (Abb.7). Eine Behandlung der Kleinhirnneurone mit 100 µM SNOC löst also schnell den apoptotischen Zelltod in den Neuronen aus. Vier Stunden nach der SNOC-Behandlung nahm die Anzahl Annexin-positiver Zellen weiter zu und sechs Stunden nach der SNOC-Behandlung war der größte Teil der Neurone Annexin-V-positiv (Abb.7). Somit zeigt die Annexin-Markierung, daß innerhalb des Untersuchungszeitraumes von sechs Stunden die Mehrheit der Neurone apoptotische wurden, wenn auch nicht in allen Neuronen synchron PS auf der Außenseite präsentiert wurde. Die Anzahl nekrotischer Zellen nahm im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollkulturen nicht zu (Abb.7). Innerhalb der ersten sechs Stunden nach der SNOC-Behandlung konnte also keine sekundäre Nekrose festgestellt werden.

4.2 Apoptotische Neurone produzieren keine löslichen Signale, die eine chemotaktische Reaktion in Mikrogliazellen hervorrufen.

Apoptotische Zellen im peripheren Immunsystem produzieren keine löslichen Signale, die auf professionelle Phagozyten chemotaktisch wirken ( Savill et al., 1993 ). Die Erkennung apoptotischer Zellen im peripheren Immunsystem erfolgt ausschließlich über Zell-Zell-Kontakte ( Savill et al., 1993 ). Um zu überprüfen, ob im zentralen Nervensystem gleiche Gesetzmäßigkeiten wie im peripheren Immunsystem herrschen, wurden in dieser Arbeit die Überstände von apoptotischen Neuronen auf das Potential hin untersucht, eine Migration der Mikrogliazellen in einem Mikrochemotaxistest auszulösen (siehe Methodenteil 3.5). Zusätzlich wurden die Bewegungen der Mikrogliazellen in apoptotischen Neuronenkulturen auf zielgerichtete Bewegungen zu apoptotischen Neuronen hin mit Hilfe von Zeitraffervideomikroskopie untersucht. Zielgerichtete Bewegungen der Mikrogliazelle weisen auf chemoattraktive Substanzen hin.

Für die Mikrochemotaxisexperimente wurden Überstände von unbehandelten Kontrollneuronen, SNOC behandelten Kleinhirnneuronen und lösliche Überstände von mechanisch zerstörten, nekrotischen Neuronen verwendet. Diese Überstände, die von sieben unterschiedlichen Präparationen stammten, wurden im Mikrochemotaxis Test eingesetzt (siehe Methodenteil 3.5) (Abb.8).


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Abbildung 8: Kulturüberstände von apoptotischen Neurone besitzen keine chemotaktische Wirkung auf Mikroglia.

Überstände von unbehandelten Neuronen, SNOC-behandelten und mechanisch zerstörten Neuronen wurden in einem Mikrochemotaxistest auf ihr Potential getestet, eine mikrogliale Migration auszulösen. Überstände von apoptotischen Neurone besaßen keine chemotaktische Wirkung, während Überstände von nekrotischen Zellen in drei von sieben Experimenten eine deutliche chemotaktische Reaktion hervorriefen. Die Experimente wurden mit dreifach Ansätzen durchgeführt. Die dargestellten Werte stellen Mittelwerte von 7 Experimenten, ausgedrückt als Migration und deren Standardfehler (± SEM) im Vergleich zur Migration in Kontrollkulturen dar und wurden auf die Migration der Kontrollneurone norminiert.

Obwohl die einzelnen Präparationen sich in ihrem migrationsfördernden Potential auf Mikrogliazellen unterschieden, gab es keine signifikante Induktion der Mikroglia Chemotaxis durch Überstände von apoptotischen Neuronen im Vergleich zu den Überständen der jeweiligen unbehandelten Kontrollneuronen (Abb.8). Im Gegensatz dazu stimulierten die löslichen Überstände von neuronalen Zellextrakten in drei von sieben Präparationen die Mikroglia Migration (Abb.8). Diese Ergebnisse zeigen, daß apoptotische Neurone keine löslichen Substanzen produzieren, die chemoattraktiv auf Mikrogliazellen wirken.

Für die Videozeitraffer Beobachtungen (siehe Methodenteil 3.4) wurden Mikrogliazellen zwei Stunden nach der SNOC-Behandlung auf die Neuronenkulturen gegeben.


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Abbildung 9: Video Zeitraffer Aufnahmen von Mikrogliazellen, die zu apoptotischen Neuronen gegeben wurden.

Zwei Stunden nach der SNOC-Behandlung der Neurone wurden Mikrogliazellen (schwarze Pfeilspitze) zu der Kultur gegeben. Die Beobachtungszeit ist jeweils oben links vermerkt. Nachdem sich die Mikroglia am Substrat angeheftet hatten, bewegten sich ihre Lamellipodien und nahmen Kontakt mit verschiedenen apoptotischen Neuronen in der Nachbarschaft auf (Mikroglia mit Sternchen). Nach 90 Minuten (12.31) band die Mikroglia ein Neuron mit einem kondensierten Zellkern (Pfeil) und phagozytierte dieses Neuron.


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Zunächst mußten sich die Mikrogliazellen auf dem Substrat anheften (Abb.9). Die Mikrogliazellen adherierten dabei auf zellfreien Regionen des Deckglases. Anschließend kam es zur Ausbildung von Lamellipodien, mit denen die Mikrogliazellen Kontakt zu den Neuriten und den Zellkörpern der benachbarten Neurone aufnahmen. Eine Wanderung der Mikroglia fand nicht statt, was darauf hindeutet, daß apoptotische Neurone keine chemoattraktiven Signale produzieren. Die Lamellipodien der Mikroglia interagierten erst mit vielen nicht apoptotischen Neuronen bevor es zur Phagozytose eines apoptotischen Neurons kam. Dies deutet darauf hin, daß wie im peripheren Immunsystem ein direkter Zell-Zell-Kontakt für die Erkennung apoptotischer Neurone durch Mikroglia notwendig ist. Der eigentliche Prozess der Aufnahme von Neuronen durch die Mikrogliazelle dauerte in diesem Modell normalerweise 15-20 Minuten, wie auch schon für das peripheren Immunsystem beschrieben ( Falasca et al., 1996 ; van den Eijnde et al., 1998 ).

4.3 Mikrogliazellen binden/phagozytieren apoptotische Zellen

Um die Bindungsmechanismen zwischen apoptotischen Neuronen und Mikrogliazellen zu untersuchen, war es notwendig ein Interaktionsmodell zu entwickeln. Der Zeitraum der Interaktion zwischen apoptotischen Neuronen mit Mikrogliazellen wurde so gewählt, daß eine sekundäre Nekrose der Neurone ausgeschlossen werden konnte.

Wenn auch in allen bisher beschriebenen Arbeiten im peripheren Immunsystem so durchgeführt, war es für die Fragestellung dieser Arbeit nicht sinnvoll, apoptotische Zellen zu adhärenten Mikrogliazellen zu geben, da das Ablösen der Neurone einen hohen Prozentsatz nekrotischer Zellen induzierte. Vor allem in den Kontrollkulturen konnte durch die mechanische Zerstörung der Neuriten ein nekrotischer Zelltod festgestellt werden (nicht dargestellt). Für das Interaktionsmodell wurden daher die Neurone, die sich auf Deckgläsern befanden, mit 100 µM SNOC behandelt und nach zwei Stunden Inkubationszeit wurden Mikrogliazellen in einem Verhältnis von einer Mikrogliazelle zu zehn Neuronen zugegeben. Der Prozentsatz der phagozytierenden Mikroglia wurde nach einer Koinkubationszeit von sechs Stunden ermittelt (für einige Experimente wurde der Prozentsatz bereits nach drei Stunden ermittelt). Hierzu wurden, wie im Methodenteil (3.6) beschrieben, die Mikrogliazellen, die apoptotische Neurone phagozytiert hatten, ausgezählt (Abb.10).


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Abbildung 10: Die Bindung/Phagozytose von Neuronen durch Mikrogliazellen nimmt in Kokultur mit SNOC-behandelten Neuronen zu.

A,B: Doppelte Fluoreszenzfärbung von Mikroglia, die apoptotische Neurone phagozytieren. In (A) sind vier Mikrogliazellen gezeigt, die mit ILB4-FITC markiert wurden. Die DAPI Färbung (B) zeigt, daß zwei der Mikrogliazellen ein apoptotisches Neuron, erkennbar am kondensierten Zellkern, gebunden bzw. phagozytiert haben (Pfeile).

C: Der Prozentsatz phagozytierender Mikroglia nimmt nach einer sechstündigen Koinkubationszeit in den SNOC behandelten Neuronen-Kulturen auf 134 ± 7.7 % zu. Die Werte sind auf die Kontrolle normiert und als Mittelwerte ± SEM dargestellt (n = 29). * p < 0,05


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Abhängig von den an jeweils unterschiedlichen Tagen präparierten Neuronenkulturen trat eine relativ hohe Phagozytoserate in den unbehandelten Kontrollkulturen auf (Mittelwert 21.3 ± 1.9 %, von 7.4-46.2 %; n = 29). Wie unter 4.1.2 beschrieben, können apoptotische Zellen in den unbehandelten Neuronenkulturen festgestellt werden. Da nur Neurone mit kondensiertem Chromatin im Zellkern durch die Mikrogliazellen in den Kontrollkulturen aufgenommen wurden, beruhte die hohe Phagozytoserate in den Kontrollkulturen (Mittelwert 21.3 ± 1.9 %, von 7.4-46.2 %; n = 29) auf einer Aufnahme apoptotischer Neurone. In der SNOC-behandelten Kultur nahm der Prozentsatz der Mikroglia, die apoptotische Neurone phagozytiert hatten (Mittelwert 27.2 ± 2.2 %; n = 29) im Vergleich zu den Kontrollkulturen zu. In den einzelnen Experimenten wurde eine Phagozytoserate von 50.8 % (von 8.5-50.8 %) nie überschritten. Aufgrund der hohen Variabilität zwischen den einzelnen Experimenten wurde die Mikroglia Phagozytose in den apoptotischen Kulturen in jedem Experiment auf die Phagozytose in den jeweiligen, nicht mit SNOC behandelten Kontrollkulturen normalisiert. In den apoptotischen Kulturen konnte so eine signifikante Zunahme der Phagozytose auf 134 ± 7.7 % im Vergleich zu der Phagozytose in den Kontrollkulturen festgestellt werden (Abb.10).

Führte man den Kokulturansatz umgekehrt durch, gab also apoptotische Neurone zu kultivierten Mikrogliazellen, nahm der Prozentsatz phagozytierender Mikroglia deutlich zu (66 ± 8.9 %) (nicht dargestellt). Dieser experimentelle Ansatz war jedoch, aus den erwähnten Gründen, für die Fragestellung dieser Arbeit nicht sinnvoll.

4.4 Identifikation der Bindungsmechanismen zwischen apoptotischen Neuronen und Mikrogliazellen

Im peripheren Immunsystem spielen drei Erkennungsmechanismen zwischen apoptotischen Zellen und Makrophagen eine bedeutende Rolle:

1. Die Erkennung von veränderten Zuckerstrukturen auf der Oberfläche von apoptotischen Zellen durch Lektine der Phagozyten (siehe 1.4.1.1).

2. Eine Thrombospondin-vermittelte Erkennung von apoptotischen Zellen (siehe 1.4.1.3).

3. Die Erkennung von Phosphatidylserin auf der Oberfläche apoptotischer Zellen (siehe 1.4.1.2).


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In dieser Arbeit wurde untersucht, ob diese Erkennungsmechanismen ebenfalls eine Rolle bei der Erkennung apoptotischer Neurone durch Mikroglia spielen.

4.4.1 Spezifische Kohlenhydrate inhibieren die Bindung/Aufnahme von apoptotischen Neurone durch Mikroglia

Monosaccharide, die mit den Lektin-Bindungsstellen interagieren, inhibieren die Aufnahme von apoptotischen Leukozyten durch Makrophagen und semiprofessionellen Phagozyten aus dem peripheren Immunsystem ( Savill et al., 1990 ; Hughes et al., 1997 ). Um festzustellen, ob derartige Mechanismen auch bei der Erkennung apoptotischer Neurone durch Mikrogliazellen gelten, wurden die Phagozytoseansätze in Gegenwart von verschiedenen Monosacchariden durchgeführt (Abb.11). Die verwendeten Konzentrationen der Monosaccharide orientieren sich an früheren Studien zur Aufnahme apoptotischer Zellen durch Makrophagen und semiprofessionelle Phagozyten aus dem peripheren Immunsystem ( Duvall et al., 1985 ; Pradhan et al., 1997 ; Hughes et al., 1997 ).

Eine signifikante Inhibition der Phagozytose von apoptotischen Neuronen durch Mikroglia konnte in Gegenwart von 20 mM Galaktose (Gal) beobachtet werden (75.0 ± 7.7 % der Kontrolle = apoptotische Neurone ohne Inhibitoren, n = 11). Die Zugabe von 20 mM des Aminozuckers N-Acetylglukosamin (GlkNac) zeigte eine inhibitorische Tendenz auf die Bindung bzw. Aufnahme apoptotischer Neurone durch Mikrogliazellen (75.8 ± 7.3 %;
n = 9). N-Acetylgalaktosamin (GalNac) (n = 9), Glukose (Glu) (n = 6), Mannose (Man)
(n = 7) und Fukose (Fuk) (n = 6; 20 mM jeweils) zeigten keinen inhibitorischen Effekt auf die Interaktion zwischen Mikrogliazellen und apoptotischen Neuronen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß eine Lektinbindung eine Rolle in der Erkennung apoptotischer Neurone durch Mikroglia spielt.


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Abbildung 11: Effekt von Monosacchariden auf die Phagozytose apoptotischer Körnerzellen des Kleinhirns durch Mikroglia.

Die Anzahl phagozytierender Mikroglia wurde, wie im Methodenteil beschrieben, sechs Stunden nach Koinkubationszeit der Mikroglia mit den apoptotischen Neuronen ermittelt. Keine Inhibition der Phagozytose war in Gegenwart von Glukose (Glu; n = 6), Fukose (Fuk; n = 6), Mannose (Man; n = 7) oder N-Acetylgalaktosamin (GalNac; n = 9) festzustellen. Eine signifikante Inhibition konnte bei Galaktose beobachtet werden (Gal; n = 11). N-Acetylglukosamin (GlkNac; n = 9) zeigte eine Tendenz zur Inhibition der Phagozytose (*) p = 0.051. Die Werte sind auf die Kontrolle des jeweiligen Experiments normiert und als Mittelwerte der prozentualen Phagozytose der Mikroglia ± SEM dargestellt. Der Schwankungsbereich der phagozytierenden Mikroglia in der Kontrolle lag zwischen 8.5 bis 50.8 %. * p < 0,05 versus Kontrollwerte.

4.4.2 RGDS Peptide üben einen inhibitorischen Effekt auf die Erkennung von apoptotischen Neuronen durch Mikrogliazellen aus

Spezifische inhibitorische Effekte von Argenin-Glycin-Asparagin-Peptiden (RGD Peptide) und kationischen Aminozuckern zeigten, daß ein Thrombospondin-vermittelter Mechanismus bei der Erkennung von apoptotischen Eosinophilen und Lymphozyten durch Makrophagen eine Rolle spielt ( Savill et al., 1992 ; Savill et al., 1993 ). RGD-Peptide binden an Integrine, wie dem Vitronektinrezeptor (alphaVbeta3), der eine Komponente des Thrombospondin Rezeptors des Phagozyten ist ( Savill et al., 1990 ; Savill et al., 1992 ). Kationische Aminozucker verhindern die Bindung von Thrombospondin, da sie anionische Thrombospondin Bindungsstellen auf den apoptotischen Zellen maskieren ( Savill et al., 1993 ). Um festzustellen, ob ein Thrombospondin-vermittelter Mechanismus bei der Erkennung apoptotischer Neurone durch Mikrogliazellen eine Rolle spielt, wurden die


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Phagozytoseansätze in Gegenwart von synthetischen Argenin-Glycin-Asparagin-Serin-Peptiden (RGDS Peptid) oder dem Aminozucker Glukosamin durchgeführt (Abb.12). Zusätzlich wurden synthetische Argenin-Glycin-Glutamin-Serin-Peptide (RGES Peptid) als Kontrollpeptide eingesetzt. RGES-Peptide binden nicht an Integrine und sollten daher auch keinen inhibitorischen Effekt auf die Thrombospondin-vermittelte Erkennung apoptotischer Zellen durch Phagozyten ausüben. Die angegebenen Konzentrationen der Substanzen orientieren sich an früheren Studien zur Aufnahme apoptotischer Zellen durch semiprofessionelle Phagozyten ( Hughes et al., 1997 ).

Abbildung 12: RGDS Peptide inhibieren die Phagozytose von apoptotischen Kleinhirnneuronen durch Mikroglia.

Die Anzahl phagozytierender Mikrogliazellen wurde sechs Stunden nach Koinkubation der Mikroglia mit apoptotischen Neuronen ermittelt. 10 mM Glukosamin (Glkn) besaß keinen inhibitorischen Effekt auf das Phagozytoseverhalten der Mikrogliazellen. Die Blockierung der Mikroglia Phagozytose durch 20 mM Glukosamin (Glkn; n = 6) war unspezifisch, da 20 mM Glukosamin einen toxischen Effekt auf Mikrogliazellen ausübte (#) (siehe Tabelle1, Seite 51). Ein inhibitorischer Effekt des Kontrollpeptids RGES konnte nicht festgetellt werden (n = 7). Eine signifikante Inhibition konnte für 2 mM RGDS (n = 8) beobachtet werden, jedoch nicht für 1 mM RGDS (n = 6). Die Werte sind auf die Phagozytoserate der Kontrolle des jeweiligen Experiments normiert und als Mittelwerte der prozentualen Phagozytose der Mikroglia ± SEM dargestellt. p < 0,05 versus Kontrollwerte.


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Mit dem Kontrollpeptid (2 mM RGES) konnte kein inhibitorischer Effekt festgestellt werden. Durch Zugabe des RGDS Peptids in das Interaktionsmedium wurde die Phagozytose apoptotischer Neurone durch Mikrogliazellen signifikant inhibiert. Die Inhibition von RGDS war signifikant bei einer Konzentration von 2 mM (76.1 ± 7.8 %,
n = 8), konnte jedoch nicht bei einer Konzentration von 1 mM RGDS (n = 6) beobachtet werden. Dies stimmt mit den inhibitorischen Konzentrationen überein, die auch bei semiprofessionellen Phagozyten beobachtet wurden ( Savill et al., 1990 ; Hughes et al., 1997 ). Dieser RGDS Effekt zeigte eine Zeitabhängigkeit: während eine Inhibition durch
2 mM RGDS nach einer dreistündigen Inkubationszeit von Neuronen mit Mikroglia nicht festgestellt werden konnte, war die Inhibition nach einer sechstündigen Inkubationszeit signifikant (nicht dargestellt).

Diese Beobachtungen weisen darauf hin, daß eine Bindung von Thrombospondin an Vitronektin Rezeptoren bei der Erkennung apoptotische Neurone durch Mikrogliazellen eine Rolle spielt. Diese Integrin-vermittelte Erkennung ist möglicherweise erst später im apoptotischen Programm wichtig, wie für periphere Makrophagen und semiprofessionelle Phagozyten gezeigt wurde ( Pradhan et al., 1997 ; Hughes et al., 1997 ).

Die kationischen Aminozucker Glukosamin und Mannosamin üben einen inhibitorischen Effekt auf die Thrombospondin-vermittelte Phagozytose von apoptotischen Neutrophilen durch semiprofessionelle Phagozyten aus ( Hughes et al., 1997 ). 10 mM Glukosamin (Glkn) inhibierte in diesem Interaktionsmodell die Phagozytose von apoptotischen Neuronen durch Mikrogliazellen nicht signifikant. Durch eine Konzentration von 20 mM Glukosamin, wie sie auch in anderen Phagozytosemodellen verwendet wurde, wurde die Aufnahme von apoptotischen Neuronen durch Mikrogliazellen geblockt. Diese Blockierung war unspezifisch, da im Neutralrottest gezeigt werden konnte, daß 20 mM Glukosamin einen toxischen Effekt auf Mikroglia ausübte (siehe 4.4.4).

4.4.3 O-Phospho-L-Serin inhibiert die Bindung/Phagozytose von apoptotischen Neuronen durch Mikroglia

Apoptotische Neurone präsentieren Phosphatidylserin (PS) auf der Außenseite ihrer Plasmamembran ( van Engeland et al., 1998 ). Diese Präsentation von PS auf der Plasmamembran stellt ein Erkennungssignal für Phagozyten dar, wie durch wasserlösliche PS-Analoga, die an die Phosphatidylserinrezeptoren der Phagozyten binden und dadurch


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die Erkennung apoptotischer Lymphozyten durch Makrophagen inhibieren, gezeigt werden konnte ( Fadok et al., 1992 ). In dieser Arbeit wurde untersucht, ob die PS-Präsentation durch apoptotische Kleinhirnneurone ebenfalls ein Signal zur Erkennung und Phagozytose dieser Zellen durch Mikrogliazellen darstellt.

Hierfür wurde der Phagozytoseassay in Gegenwart von 10 mM O-Phospho-L-Serin (OPS), der wasserlöslichen Kopfgruppe des Phosphatidylserins, durchgeführt.

Abbildung 13: Der inhibitorische Effekt von O-Phospho-L-Serin auf die Mikroglia Phagozytose von apoptotischen Kleinhirnneuronen.

Die Anzahl phagozytierender Mikrogliazellen wurde sechs Stunden nach Koinkubation der Mikroglia mit apoptotischen Neuronen ermittelt. Eine Inhibition der Phagozytose konnte mit 10 mM O-Phospho-L-Serin (OPS; n = 6) beobachtet werden. Die Werte sind auf die Kontrolle des jeweiligen Experiments normiert und als Mittelwerte der prozentualen Phagozytose der Mikroglia ± SEM dargestellt. Die Anzahl der phagozytierenden Mikroglia in der Kontrolle lag zwischen 8.5 und 50.8 %. p < 0,05 versus Kontrollwerte.

Die Anzahl der Mikroglia, die apoptotische Neurone phagozytierten, wurde durch die Anwesenheit von OPS im Interaktionsmedium im Vergleich zu der Kontrolle ohne Inhibitoren im Interaktionsmedium signifikant verringert (60.0 ± 5.6 %; n = 6) (Abb.13). Dies weist darauf hin, daß es durch OPS zu einer Blockierung der PS-Rezeptoren kommt, wodurch ein Teil der apoptotischen Neurone nicht mehr von Mikrogliazellen erkannt werden konnte.


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4.4.4 Vitalitätstest mit Neutralrot in Gegenwart der verwendeten inhibitorischen Substanzen

Eine mögliche inhibitorische Wirkung der eingesetzten Substanzen auf die Phagozytose von apoptotischen Zellen durch Mikrogliazellen könnte auf eine unspezifische toxische Wirkung der Substanzen auf Mikroglia beruhen. Aus diesem Grund wurde mit Hilfe eines Vitalitätstest mit Neutralrot (NR) untersucht, ob die eingesetzten Substanzen einen unspezifischen, toxischen Effekt auf Mikrogliazellen ausübten (siehe Methodenteil 3.8). NR wird durch die sogenannte „fluid phase“ Endozytose von den Zellen aufgenommen ( Konopski et al., 1995 ). Endozytose ist die vesikuläre Aufnahme von Flüssigkeit, Makromolekülen oder Partikeln in (endo) die Zelle (cyto).

Tabelle 1: Neutralrot Test zur Bestimmung der Überlebensfähigkeit der Mikroglia in der Anwesenheit der löslichen Inhibitoren.

>

Konzentrationen der phagozytotisch inhibitorischen Substanzen

Abs.540 nm

(Mittelwert in % der Kontrolle ± SEM)

20 mM Glukose

96.7 ± 2.5

20 mM Fukose

98.7 ± 3.4

20 mM Mannose

96.3 ± 2.4

20 mM Galaktose

100.6 ± 3.3

20 mM N-Acetylglukosamin

95.5 ± 1.3

20 mM N-Acetylgalaktosamin

95.6 ± 3.0

10 mM O-Phospho-L-Serin

96.7 ± 2.4

20 mM O-Phospho-L-Serin

97.0 ± 2.2

10 mM Glukosamin

94.2 ± 4.1

20 mM Glukosamin

77.2 (n = 1) ?

10 mM Mannosamin

61.4 ± 13.3 ?

20 mM Mannosamin

55.2 (n = 1) ?

Fixierte Zellen

61.7 (n = 1)

Die Endozytose von Neutralrot wird mit Ausnahme von Glukosamin und Mannosamin nicht durch die löslichen Inhibitoren beeinflußt. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte in % der Kontrolle ± SEM von fünf Experimenten ausgedrückt. In jedem einzelnen Experiment wurde jede Substanz in sechs parallelen Ansätzen getestet. Die Kontrollwerte entsprechen Mikrogliazellen, die unter gleichen Bedingungen ohne jegliche Testsubstanz inkubiert wurden. Mit 2 % Paraformaldehyd fixierte Zellen wurden als Negativkontrolle verwendet.


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Die Konzentrationen der verwendeten Peptide, OPS und der meisten Monosaccharide wirkten nicht toxisch auf Mikrogliazellen (Tabelle 1). 20 mM Glukosamin, 10 mM und 20 mM Mannosamin, die in anderen Phagozytosemodellen einen inhibitorischen Effekt ausübten ( Hughes et al., 1997 ), zeigten hingegen in diesem Modell eine toxische Wirkung.

4.5 Charakterisierung der Phosphatidylserinbindung

Aufgrund des starken inhibitorischen Effekts durch OPS auf die Aufnahme von apoptotischen Kleinhirnneurone durch Mikrogliazellen ist eine Erkennung von PS auf der Außenseite der Plasmamembran von apoptotischen Kleinhirnneuronen ein bedeutender Mechanismus, durch den diese apoptotischen Zellen durch Mikrogliazellen erkannt und phagozytiert werden. Daher wurden Versuche durchgeführt, die den Mechanismus der Phosphatidylserinbindung durch Mikrogliazellen näher charakterisieren sollten. Zu diesem Zweck wurden Lipidvesikel („large unilamellated vesicles“ (LUVs)), die unterschiedliche Konzentrationen (10 %; 1 % und 0,1 %) von PS (PS-LUVs) enthielten, als ein apoptotisches Zellmodell verwendet. Lipidvesikel, die nur aus Phosphatidylcholin (PC-LUVs) bestanden, dienten als Modell für normale, nicht apoptotische Zellen. Zur Detektion der PS- und PC-LUVs enthielten diese 1 mol% Rhodamin-konjugiertes Phosphatidylethanolamin.

4.5.1 Spezifische Erkennung von Phosphatidylserin durch Mikroglia

Die Natur des Phosphatidylserin Rezeptors, der zur Aufnahme von apoptotischen Zellen durch Phagozyten führt, ist noch ungeklärt ( Fadok et al., 1998 ). Mögliche Kandidaten könnten Scavenger Rezeptoren oder der LPS-Rezeptor CD14 darstellen ( Fadok et al., 1998 ). Beide Rezeptortypen werden von Mikrogliazellen exprimiert ( Becher et al., 1996 ; Paresce et al., 1996 ). Da einige Phagozyten PS exprimierende Zellen binden ohne sie zu phagozytieren, scheint die Phagozytose von PS exprimierenden Zellen durch Phagozyten noch von weiteren Faktoren abhängig zu sein ( Savill 1997 ). Mit Hilfe der Lipidvesikel sollte untersucht werden, ob Mikrogliazellen Rezeptoren exprimieren, die spezifisch PS erkennen und ob diese Erkennung zu einer Phagozytose der Lipidvesikel führt.

Zu diesem Zweck wurden Mikrogliazellen mit den jeweiligen Lipidvesikeln (PS-LUVs bzw. PC-LUVs) für eine Stunde inkubiert (siehe Methoden 3.9).


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Abbildung 14: Mikrogliazellen binden und phagozytieren Lipidvesikel, die Phosphatidylserin enthalten.

A: Mikrogliazellen wurden mit Rhodamin markierten LUVs für 60 Minuten inkubiert. LUVs mit 10 mol% Phosphatidylserin wurden von Mikrogliazellen gebunden (rechte obere Abbildung). Kulturen inkubiert mit PC-Kontroll-Vesikeln (kein Phosphatidylserin) zeigen eine geringe unspezifische Bindung (linke obere Abbildung). In den unteren Abbildungen sind die entsprechenden Phasenkontrastbilder zu den oberen Fluoreszenzbildern dargestellt. Die Abbildungen zeigen einen repräsentativen Versuch aus fünf unabhängigen Versuchen.

B: Konfokale Aufnahme einer Mikrogliazelle, die mit IL-B4-FITC (grün) angefärbt wurde. Die Rhodamin markierten PS-LUVs (rot) befinden sich im Cytoplasma der Mikroglia.


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PS-LUVs wurden von den Mikrogliazellen stark gebunden und, wie durch konfokale Mikroskopie nachgewiesen werden konnte, auch phagozytiert (Abb.14). PC-LUVs wurden nur schwach von den Mikrogliazellen gebunden (Abb.14). Mikrogliazellen exprimieren daher einen Rezeptor, der PS binden kann. Damit konnte auch ausgeschlossen werden, daß das zur Fluoreszenzdetektion in den LUVs eingebaute Rhodamin konjugierte Phosphatidylethanolamin die Bindung der LUVs an die Mikrogliazelle beeinflußte.

4.5.2 Spezifische Erkennung von Phosphatidylserin durch Astrozyten

Nicht nur professionelle Phagozyten, wie Makrophagen und Mikroglia sondern auch semiprofessionelle Phagozyten, wie Hepatozyten, sind in der Lage, apoptotische Zellen zu erkennen und zu phagozytieren ( Dini et al., 1992 ). Auch für Astrozyten wurde eine phagozytotische Aktivität beschrieben ( Bechmann und Nitsch, 1997 ). Aus diesem Grund wurde untersucht, ob Astrozyten oder Oligodendrozyten selektiv PS-LUVs erkennen. Hierzu wurden Gliamischkulturen, in denen sich neben Mikrogliazellen auch Astrozyten und Oligodendrozyten befanden, mit Lipidvesikeln inkubiert (siehe Methoden 3.9).

Eine deutlich stärkere Bindung der PS-LUVs, im Gegensatz zu den PC-LUVs, konnte ebenfalls bei kultivierten Astrozyten festgestellt werden (Abb.15). Dies deutet darauf hin, daß Astrozyten als semiprofessionelle Phagozyten in der Lage sind, apoptotische Zellen zu erkennen. Oligodendrozyten hingegen zeigten keine Bindung der PS-LUVs (Abb. 15)


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Abbildung 15: Bindung von PS-LUVs durch Astrozyten:

Gliakulturen die sowohl Mikrogliazellen (mg), Astrozyten (as) als auch Oligodendrozyten (ol) enthielten, wurden mit Rhodamin markierten LUVs für 60 Minuten inkubiert. LUVs mit 10 mol% Phosphatidylserin wurden stark durch Mikrogliazellen gebunden (linke Abblidung). Astrozyten (as) wurden ebenfalls markiert, während Oligodendrozyten (ol) unmarkiert blieben. Kulturen inkubiert mit PC-LUVs zeigten eine schwache unspezifische Bindung (rechte Abbildung). Die unteren Abbildungen stellen die entsprechenden Phasenkontrastbilder zu den oberen Fluoreszenzbildern dar. Die Abbildungen zeigen einen repräsentativen Versuch aus zwei unabhängigen Versuchen.

4.5.3 Zeitabhängigkeit der Bindung von Phosphatidylserin-LUVs durch Mikrogliazellen

Apoptotische Zellen werden im Gewebe schnell durch Phagozyten erkannt ( Savill 1997 ). Zur Untersuchung der Frage, wie schnell es zu einer Bindung von PS-LUVs durch den PS-Rezeptor der Mikrogliazelle kommt, wurden Mikrogliazellen unterschiedlich lange mit den Lipidvesikeln inkubiert (siehe Methodenteil 3.9).


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Abbildung 16: Zeitabhängige Bindung der Phosphatidylserin-LUVs an Mikrogliazellen.


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Mikrogliazellen wurden zeitabhängig mit Rhodamin markierten PS-LUVs, die 10 mol% PS enthielten, inkubiert. Bereits nach fünf Minuten Inkubationszeit der Mikrogliazellen mit PS-LUVs konnte eine Bindung der LUVs beobachtet werden. Nach einer 15 minütigen Inkubationszeit der Mikrogliazellen mit PS-LUVs konnte eine Fluoreszenz in den Vesikeln der Mikroglia beobachtet werden. Nach 30 und 60 Minuten war eine deutliche Akkumulation der Fluoreszenz in den Mikrogliazellen festzustellen. Die Abbildungen zeigen einen Versuch aus drei unabhängigen Versuchen.

Die PS-LUVs wurden bereits nach fünf Minuten schwach von den Mikrogliazellen gebunden. Die Fluoreszenz war jedoch scheinbar hauptsächlich auf die Oberfläche der Mikrogliazelle beschränkt. Die Bindung der LUVs erfolgte daher sehr schnell. Bereits nach einer 15 minütigen Inkubationszeit befand sich die Fluoreszenz der LUVs auch im Zytoplasma der Mikrogliazelle, was auf eine Phagozytose der LUVs hindeutet (Abb.16). Innerhalb der nächsten 30-60 Minuten kam es zu einer weiteren Akkumulation von fluoreszierenden Partikeln im Zytoplasma.

4.5.4 Konzentrationsabhängige Bindung der Phosphatidylserin-LUVs an die Mikroglia

Da Lipidmoleküle spontan zwischen der inneren und der äußeren Seite der Plasmamembran wechseln können (flip-flop), kommen geringe Konzentrationen von PS wahrscheinlich auch unter normalen, nicht apoptotischen Bedingungen auf der extrazellulären Seite der Zytoplasmamembran vor ( van Meer et al., 1981 ; Roelofsen und Op den Kamp, 1994 ). Die Erkennung von Phosphatidylserin sollte daher von der Konzentration des exponierten Phosphatidylserins abhängig sein. Um diese mögliche untere Schwellenkonzentration von Phosphatidylserin in Membranen zu bestimmen, die für eine spezifische Erkennung durch Mikroglia notwendig ist, wurden Lipidvesikel mit unterschiedlichen Konzentrationen von PS (10, 1 oder 0,1 mol% PS) mit Mikrogliazellen inkubiert (siehe Methodenteil 3.9).

Zwischen PS-LUVs die 1 mol% und 10 mol% Phosphatidylserin enthielten, konnte kein Unterschied in der Fluoreszenz festgestellt werden (Abb.17). Vesikel mit 0.1 mol% PS


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hingegen konnten nur schwach detektiert werden, das heißt die PS-LUVs wurden von der Mikrogliazelle gering gebunden. Diese Mikroglia assoziierte Fluoreszenz entsprach der Kontrolle (PC-LUVs) (Abb.17). Eine spezifische Erkennung und Bindung von Phosphatidylserin durch Mikrogliazellen dürfte daher bei etwa 1 mol% Phosphatidylserin liegen. Dies korrespondiert mit Beobachtungen an seneszenten Erythrozyten, deren PS-Konzentration auf der extrazellulären Seite der Plasmamembran bei 0,6 mol% liegt ( Roelofsen und Op den Kamp, 1994 )


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Abbildung 17: Konzentrationsabhängigkeit der Phosphatidylserinbindung.

Mikrogliakulturen wurden mit Rhodamin markierten LUVs, die unterschiedliche Konzentrationen von Phosphatidylserin enthielten, für 60 Minuten inkubiert. Auf der linken Seite sind die Fluoreszenzaufnahmen dargestellt, auf der rechten Seite die entsprechenden Phasenkontrastaufnahmen. Eine Inkubation der Mikroglia mit 10 mol% PS-LUVs oder 1 mol% PS-LUVs führte zu einer spezifischen Färbung der Mikrogliazellen, während eine Inkubation der Mikroglia mit 0.1 mol% PS-LUVs nicht von einer Inkubation mit den Kontroll-Vesikeln (PC-LUVs) zu unterscheiden war. Die Abbildungsserie zeigt einen repräsentativen Versuch aus drei unabhängigen Versuchen.


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4.5.5 Die Bindung der Phosphatidylserin-LUVs ist unabhängig vom Aktivierungszustand der Mikroglia

Der bevorzugte Bindungsmechanismus zwischen apoptotischen Zellen und Makrophagen hängt auch vom Aktivierungszustand der Makrophagenzelle ab ( Ren und Savill, 1995 ). Mikrogliazellen kommen im Gewebe in unterschiedlichen Aktivierungszuständen, die auch mit morphologischen Veränderung der Mikrogliazellen verbunden sind, vor (siehe Einleitung 1.3). Durch den Prozess der Kultivierung werden Mikrogliazellen aktiviert und liegen als amöboide Zellen vor. Durch die Behandlung mit astrozytenkonditioniertem Medium bilden kultivierte Mikrogliazellen der Maus eine ramifizierte Morphologie aus ( Eder et al., 1999 ). Eine Behandlung der kultivierten Mikrogliazellen mit Lipopolysaccharid (LPS) führt zu einer verstärkten Aktivierung dieser Zellen, was mit einer Zunahme der phagozytotischen Aktivität verbunden ist ( abd-el Basset und Fedoroff, 1995 ).

In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob Mikrogliazellen unabhängig vom Aktivierungszustand einen PS-Rezeptor exprimieren. Diese Versuche wurden mit Mikrogliazellen aus der Maus durchgeführt, da eine ramifizierte Morphologie der Mikrogliazellen in Kultur mit Hilfe von astrozytenkonditioniertem Medium nur im Maussystem erreicht werden kann. Zunächst wurde bestätigt, daß PS-LUVs deutlich stärker als PC-LUVs auch von Mikrogliazellen der Maus gebunden wurden (nicht dargestellt). Dann wurden unbehandelte Mikrogliazellen der Maus, LPS behandelte Mikrogliazellen (100 ng/ml LPS für 24 Stunden) und Mikrogliazellen die mit astrozytenkonditioniertem Medium kultiviert wurden, für eine Stunde mit PS-LUVs inkubiert.


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Abbildung 18: Die Bindung der PS-LUVs ist unabhängig vom Aktivierungszustand der Mikrogliazellen.

Mikrogliazellen wurden für eine Stunde mit PS-LUVs inkubiert. Ramifizierte Mikrogliazellen wurden mit astrozytenkonditioniertem Medium kultiviert. Aktivierte Mikrogliazellen wurden für 24 Stunden mit 100 ng/ml Lipopolysaccharid (LPS) stimuliert. Eine Bindung/Aufnahme von PS-LUVs konnte in allen unterschiedlich Kultursystemen beobachtet werden.

Eine Bindung der PS-LUVs konnte in allen Kultivierungsansätzen festgestellt werden (Abb.18). Die Rezeptoren für Phosphatidylserin sind also in jedem Aktivierungszustand der Mikrogliazelle in Kultur vorhanden.

4.6 Die Bindung und Phagozytose von Phosphatidylserin-LUVs ist nicht mit einer Ausschüttung von Zytokinen und Chemokinen durch Mikrogliazellen verbunden

Da es im Verlauf der Phagozytose von apoptotischen Zellen nicht zu einer Aktivierung der Phagozyten kommt, wird ein apoptotischer Zelltod nicht von einem inflammatorischen Prozess begleitet ( Fadok et al., 1998 ). In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob die Phagozytose von apoptotischen Zellen durch Mikrogliazellen ebenfalls durch eine ausbleibende Aktivierung der Mikroglia gekennzeichnet ist. Als Modellsystem für apoptotische Zellen wurden PS-LUVs verwendet. Als Aktivierungsmarker wurde die Ausschüttung von proinflammatorischen Zytokinen, wie TNF-alpha, IL-6 und IL-12 und


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Chemokinen, wie KC und MIP-1alpha durch die Mikrogliazellen untersucht. Diese Untersuchungen wurden an Mikrogliazellen der Maus durchgeführt, da entsprechende ELISAs im Labor der Arbeitsgruppe von Prof. Kettenmann etabliert waren und die entsprechenden Zytokin-Tests für das Rattensystem nicht alle kommerziell erhältlich waren. Mikrogliazellen wurden über Nacht mit den Lipidvesikeln inkubiert und anschließend der Überstand auf die oben genannten Zytokine oder Chemokine hin untersucht (siehe Methodenteil 3.10). Als Positivkontrolle dienten Überstände von Mikrogliazellen, die mit 100 ng/ml LPS behandelt wurden.

Abbildung 19: Eine Inkubation der Mikrogliazellen mit Lipidvesikeln führt nicht zu einer Stimulation der Zytokin/Chemokin- Sekretion

Der Gehalt von Zytokinen und Chemokinen im Überstand von Mikrogliazellen, die über Nacht mit LPS, PC-LUVs oder PS-LUVs inkubiert wurden, konten mit Hilfe spezifischer ELISAs ermittelt werden. Für TNF-alpha, IL-12 und KC wurden 20 Werte in zwei unabhängigen Versuchen ermittelt. Für IL-12 und MIP-1alpha wurden 12 Werte ermittelt. Die dargestellten Werte sind Mittelwerte ± SEM ausgedrückt als % der Zytokin bzw. Chemokin Ausschüttung durch Mikroglia nach einer LPS-Behandlung.


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Weder die Inkubation der Mikrogliazellen mit PS-LUVs, noch die Inkubation mit PC-LUVs führte zu einer erhöhten Zytokin- oder Chemokin Sekretion im Vergleich zu unbehandelten Mikrogliazellen (Abb.19). LPS hingegen führte eindeutig zu einer Freisetzung aller untersuchten Faktoren. Eine Erkennung von Phosphatidylserin durch Mikrogliazellen führt daher nicht zu einer Aktivierung dieser Zellen im Sinne einer erhöhten sekretorischen Aktivität.

4.7 Induktion einer Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration in Mikrogliazellen durch Phosphatidylserin-LUVs

Die Interaktion zwischen dendritischen Zellen und apoptotischen Zellen induziert eine Erhöhung des intrazellulären Kalziums, ein Prozess, an dem der Vitronektin Rezeptor beteiligt ist ( Rubartelli et al., 1997 ). Mit Hilfe von Kalziumchelatoren konnte gezeigt werden, daß dieses Kalziumsignal für die Phagozytose der apoptotischen Zellen durch dendritischen Zellen notwendig ist, während Makrophagen keine Mobilisierung des intrazellulären Kalziums benötigen ( Rubartelli et al., 1997 ). In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob die Interaktion zwischen apoptotischen Zellen und Mikrogliazellen ebenfalls mit einem Kalziumsignal verbunden ist. Als apoptotisches Modellsystem wurden PS enthaltende Lipidvesikel verwendet.

Die Lipidvesikel wurden in einer Konzentration von 100 µM lokal in der Nähe von Mikrogliazellen mit einer Glasmikropipette appliziert und der Verlauf der intrazellulären Kalziumkonzentration beobachtet (siehe Methodenteil 3.11). Eine Erhöhung des Verhältnisses der Fluoreszenz von 340 nm zu 380 nm um 2/3 des Ausgangswertes wurde als Kalziumsignal gewertet. Die Lipidvesikel wurden an zwei, zu unterschiedlichen Zeitpunkten präparierten Mikrogliazellkulturen mit jeweils mindestens 60 Zellen getestet.


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Abbildung 20: Die Bindung von PS-LUVs induziert Kalziumsignale in Mikrogliazellen.

Die Abbildung zeigt zwei typische, durch Applikation von 100 µM PS-LUVs ausgelöste, intrazelluläre Kalziumsignale. Die Kalziumsignale zeigen einen schnellen Anstieg, der wieder auf den Ruhewert absinkt. Rechts ist die Reaktion einer Mikrogliazelle mit zwei peakförmigen Antworten dargestellt, die Zelle links zeigt nach einer pekförmigen Antwort noch eine Plateauphase.

Exemplarisch sind zwei durch die Applikation von PS-LUVs (5 µl) ausgelösten Kalziumsignale in Abbildung 20 dargestellt. Der Verlauf des intrazellulären Kalziumsignals zeigt in der Regel zunächst einen schnellen Anstieg bis zu einem Maximalwert und sinkt dann, nach einer kurzen Plateauphase, schnell wieder auf den Ruhewert ab (Abb.20). In einigen Mikrogliazellen konnten auch mehrere Antworten beobachtet werden (Abb.20).

Eine Applikation von PS-LUVs führte, im Gegensatz zu einer Applikation von PC-LUVs (9,7 % ± 6,9 %) in 66,5 % ± 20,0 % der Mikrogliazellen zur Induktion eines Kalziumsignals (Abb.21). Um Applikations-Artefakte auszuschließen, wurde HEPES-Puffer appliziert. Dies führte nur in wenigen Zellen zu einer Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration (8,5 ± 9,0 %). Dieser durch HEPES-Puffer ausgelöste Prozentsatz von Mikrogliazellen mit einem Kalziumsignal lag in dem Bereich, in dem auch Mikroglia mit spontanen Kalziumsignalen beobachtet wurden (23,7 % ± 21,7 %). Eine Bindung von PS durch Mikroglia führt daher, wie bei der Aufnahme apoptotischer Zellen durch dendritische Zellen, zu einem intrazellulären Kalziumsignal in der Mikrogliazelle. Die Applikationsmethode selbst führte nicht zur Auslösung von Kalziumsignalen in Mikrogliazellen.


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Abbildung 21: PS-LUVs induzieren ein Kalziumsignal in Mikrogliazellen

Eine Applikation von PS-LUVs führte in den Mikrogliazellen im Gegensatz zu einer Applikation von PC-LUVs oder HEPES-Puffer zu einem Anstieg der intzrazellulären Kalziumkonzentration. Die Ergebnisse sind Mittelwerte der Kalziumantworten in den Mikrogliazellen in Prozent ± SD.


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