Witting, Anke: Erkennung apoptotischer Neurone durch Mikrogliazellen in vitro

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Kapitel 5. Diskussion

Der apoptotische Zelltod ist ein wichtiger Bestandteil in der Entwicklung des Nervensystems und tritt unter nahezu allen pathologischen Situationen im ZNS auf ( Oppenheim, 1997 ; Nicotera und Lipton, 1999 ). Die schnelle Entfernung apoptotischer Zellen aus dem Gewebe durch Phagozyten ist ein wichtiges begleitendes Phänomen des apoptotischen Zelltods in vivo ( Waters 1996 ). Da die Mikrogliazellen die professionellen Phagozyten des zentralen Nervensystems darstellen, sind sie an der Entfernung von apoptotischen Zellen aus dem Gewebe beteiligt. Über die Interaktion von Mikrogliazellen und apoptotischen Zellen des zentralen Nervensystems ist bisher wenig bekannt. Aus diesen Gründen wurden in der vorliegenden Arbeit die Mechanismen untersucht, die zu einer Erkennung, Bindung und Phagozytose von apoptotischen Neuronen durch Mikrogliazellen führen. Die durchgeführten Versuche weisen darauf hin, daß die Erkennung von Phosphatidylserin auf der Außenseite der Plasmamembran von apoptotischen Neuronen die bedeutendste Rolle bei der Aufnahme dieser Zellen durch Mikroglia spielt. Daher wurden weitere Untersuchungen mit Hilfe eines vereinfachten Modellsystems für apoptotische Zellen in Form von Lipidvesikeln, die Phosphatidylserin (PS) enthielten, durchgeführt. Hierbei wurde die Bindung PS-haltiger Lipidvesikel an Mikrogliazellen, Astrozyten und Oligodendrozyten untersucht. Weiterhin wurde untersucht, ob die Bindung und/oder Phagozytose der Lipidvesikel, als Modellsystem für apoptotische Zellen, zu einem Kalziumsignal oder zu einer sekretorischen Aktivierung der Mikrogliazellen führt.

5.1 Stickstoffmonoxid induziert einen apoptotischen Zelltod in kultivierten Kleinhirnneuronen der Ratte

Zur Untersuchung der Bindungsmechanismen zwischen apoptotischen Zellen des zentralen Nervensystems und Mikrogliazellen war es notwendig, ein geeignetes neuronales Zellmodell zu etablieren, in dem ein apoptotischer Zelltod ausgelöst werden konnte. In dem hier gewählten apoptotischen Zellmodell wurden Kleinhirnneurone verwendet, da in diesen Kulturen die Auslösung eines apoptotischen Zelltods bereits charakterisiert war ( Leist et al., 1997 ; Chang und Wang, 1997 ). Ein apoptotischer Zelltod kann in den Kleinhirnneuronen durch Austausch des Kulturmediums mit hohen, depolarisierenden Kaliumkonzentrationen (25 mM) gegen Kulturmedium mit niedrigen


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Kaliumkonzentrationen (5 mM) ausgelöst werden ( Chang und Wang, 1997 ). Die Auslösung des apoptotischen Zelltods in Neuronen durch Verringerung der Kaliumkonzentration repräsentiert ein Modell zur Untersuchung von entwicklungsbedingtem Zelltod. In vivo erfolgt die Depolarisation der Neurone durch innervierende, afferente Neurone, die das Überleben der Neurone in der Entwicklung des Nervensystems ermöglichen ( Burek und Oppenheim, 1996 ). Daher ist die durch hohe Kaliumkonzentrationen hervorgerufene Depolarisation für das Überleben der Neurone in Kultur wichtig ( Chang und Wang, 1997 ). Durch einen Wechsel des Mediums zu niedrigen Kaliumkonzentrationen kommt es nicht mehr zu einer ständigen Depolarisation der Neurone, wodurch ein apoptotischer Zelltod ausgelöst wird.

Eine weitere Methode zur Induktion eines apoptotischen Zelltods in den Kleinhirnneuronen besteht in der Inkubation der Neurone mit einem Stickstoffmonoxid (NO)-Donator ( Leist et al., 1997 ). Stickstoffmonoxid (NO) ist ein physiologischer Botenstoff im zentralen Nervensystem, kann aber in hohen Konzentrationen eine toxische Wirkung ausüben ( Leist und Nicotera, 1997 ). Unter physiologischen Bedingungen reguliert NO unter anderem die Durchblutung und übt einen Einfluß auf die neuronale Weiterleitung von Signalen aus, indem NO die Neurotransmitterausschütung an den Präsynapsen von Neuronen stimuliert ( Leist et al., 1997 ; Lipton und Nicotera, 1998 ). Unter pathologischen Bedingungen werden hohe Konzentration von NO, welches unter anderem von aktivierten Mikrogliazellen freigesetzt werden kann, im Gewebe festgestellt ( Bonfoco et al., 1995 ). Die toxische Wirkung von NO basiert auf der Schädigung der DNA und irreversiblen Proteinmodifikationen, wie der S-Nitrosylierung ( Leist und Nicotera, 1998 ). Durch die Zugabe von NO-Donatoren, wie S-Nitrosocystein, zu Neuronenkulturen kommt es zur Bildung von Peroxynitrit (ONOO-) ( Leist et al., 1997 ). Peroxynitrit wird durch die Reaktion von NO. mit Sauerstoffsuperoxid (O2-) gebildet und führt ebenfalls zu DNA Schäden und irreversiblen Proteinmodifikationen ( Leist et al., 1997 ). Durch Peroxynitrit, das unter pathologischen Bedingungen wie Ischämie auftritt, kann ein apoptotischer Zelltod in kortikalen Neuronen ausgelöst werden ( Bonfoco et al., 1995 ). Der durch geringe Konzentrationen von NO oder Peroxynitrit ausgelöste apoptotische Zelltod in Kleinhirnneuronen kann durch NMDA Rezeptor Blocker verhindert werden ( Leist und Nicotera, 1998 ). Dieser toxische Effekt von NO auf Kleinhirnneurone könnte auf eine verstärkte Neurotransmitter Ausschüttung an den Präsynapsen der Neurone zurückzuführen sein ( Leist et al., 1997 ). Dadurch kommt es zu einer ständigen und starken


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Aktivierung des NMDA-Rezeptors. Eine ständige und/oder starke Aktivierung von Glutamatrezeptoren ist ein Merkmal vieler inflammatorischer Erkrankungen des Nervensystems (siehe Einleitung 1.2). Die Auslösung des apoptotischen Zelltods durch NO-Donatoren in Kleinhirnneuronen repräsentiert daher ein Modell zur Untersuchung des pathopysiologischen apoptotischen Zelltods.

In dieser Arbeit wurde ein apoptotischer Zelltod in den Kleinhirnneuronen nicht durch eine Erniedrigung der Kaliumkonzentrationen induziert, da ein apoptotischer Zelltod in diesem Modell nicht in allen Kleinhirnneuronen synchron eingeleitet werden kann ( Chang und Wang, 1997 ). Ein Tag nach dem Mediumwechsel sind in diesem Modellsystem nur ungefähr 50 Prozent der Neurone apoptotisch ( Chang und Wang, 1997 ). Da in Zellkultur dem apoptotischen Zelltod ein sekundärer nekrotischer Zelltod folgt, liegen zu einem gegeben Zeitpunkt nach dem Mediumwechsel immer apoptotische und sekundär nekrotische Kleinhirnneurone nebeneinander vor.

In dem Apoptosemodell, in dem die Neurone mit NO-Donatoren behandelt werden, wird dagegen ein apoptotischer Zelltod innerhalb sehr kurzer Zeit in der Mehrzahl der Neurone ausgelöst ( Leist et al., 1997 ). So konnte zwei bis drei Stunden nach einer Behandlung der Kleinhirnneurone mit 150 µM S-Nitrosocystein (SNOC) ein apoptotischer Zelltod in 85-100 Prozent der Zellen festgestellt werden ( Leist et al., 1997 ). Ein sekundär nekrotischer Zelltod ist in diesen Kulturen erst viele Stunden nach der SNOC-Behandlung nachweisbar ( Leist et al., 1997 ). Ob überwiegend ein apoptotischer oder nekrotischer Zelltod von Neuronen durch NO-Donatoren ausgelöst wird, hängt von den eingesetzten Konzentrationen der Donatoren und den Kulturbedingungen der Neurone ab ( Bonfoco et al., 1995 ). Bei sehr hohen Konzentrationen (100 µM Peroxynitrit) wird überwiegend ein Zelltod mit nekrotischen Merkmalen ausgelöst, während bei niedrigeren Konzentrationen (10 µM Peroxynitrit oder 200 µM SNOC) überwiegend ein Zelltod mit apoptotischen Merkmalen ausgelöst wird ( Bonfoco et al., 1995 ).

In dem hier verwendeten Modell konnten durch 100 µM SNOC charakteristische Merkmale des apoptotischen Zelltods, wie Zerfall des Neuritennetzwerkes, Schrumpfung der Zellkörper, Kondensation des Chromatins, Fragmentation der DNA und Präsentation von Phosphatidylserin auf der Außenseite der Plasmamembran innerhalb weniger Stunden nach Zugabe von SNOC nachgewiesen werden. Eine Quantifikation der apoptotischen und nekrotischen Neuronen in dieser Arbeit zeigte, daß sechs Stunden nach der SNOC-


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Behandlung 86 % der Kleinhirnneurone kondensiertes Chromatin im Zellkern, aber keine PI-durchlässige Zellmembran aufwiesen, daher also überwiegend apoptotisch waren. Eine sekundäre Nekrose in 24 % der Zellen trat erst deutlich später (18 Stunden) nach der SNOC-Behandlung auf. Die in dieser Arbeit verwendeten Parameter der SNOC-Behandlung induzierten daher innerhalb kurzer Zeit einen hohen Prozentsatz apoptotischer Neurone, während es zu keiner Auslösung eines nekrotischer Zelltod durch die SNOC-Behandlung kam. Dieses Modellsystem war daher geeignet, um es für die Erkennung und Phagozytose von apoptotischen Neuronen durch Mikrogliazellen einzusetzen. Allerdings konnte auch in den unbehandelten Kontrollkulturen, abhängig von der jeweiligen Präparation an unterschiedlichen Tagen, eine spontane Apoptose im unterschiedlichem Ausmaß festgestellt werden (18.3 ± 2.2 %, von 6.6 bis 45.7 %). Diese Variabilität in den einzelnen Neuronenkulturen, basierte auf die schwierigen Kulturbedingungen der Kleinhirnneurone und konnte nicht vermieden werden. Daher mußten die Einzelexperimente auf die jeweiligen Kontrollen normiert werden.

5.2 Direkter Zell-Zell-Kontakt ist notwendig für die Erkennung apoptotischer Neurone durch Mikrogliazellen

Apoptotische Zellen im peripheren Immunsystem produzieren keine löslichen Signale, durch die Phagozyten angelockt werden ( Duvall et al., 1985 ; Savill et al., 1993 ). Aus diesem Grund werden apoptotische Zellen über direkte Zell-Zell-Interaktionen mit professionellen bzw. semiprofessionellen Phagozyten in der unmittelbaren Umgebung der apoptotischen Zelle erkannt ( Savill 1997 ).

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß apoptotische Kleinhirnneurone ebenfalls keine löslichen Signale produzierten, die chemoattraktiv auf Mikrogliazellen wirken (Abb.8 in 4.2). Eine deutliche chemotaktische Reaktion der Mikrogliazellen konnte dagegen in drei von sieben Versuchen mit Überständen von nekrotischen Neuronen festgestellt werden. Dies zeigt, daß zytoplasmatische Bestandteile von nekrotischen Zellen Substanzen enthalten, die chemoattraktiv auf Mikrogliazellen wirken. Im Gegensatz zu apoptotischen Neuronen könnten nekrotische Neurone eine Aktivierung der Mikrogliazellen in Bezug auf eine Migration der Mikroglia zum Ort des Zelltods im Gewebe auslösen und vermutlich eine inflammatorische Reaktion induzieren. Eine Erkennung apoptotischer Neurone durch Mikrogliazellen beruht, wie im peripheren Immunsystem, auf einen direkten Zellkontakt


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zu benachbarten Mikrogliazellen. Dieses konnte durch Videozeitraffer Studien bestätigt werden. In Kokulturen mit SNOC behandelten Neuronen wanderten die Mikrogliazellen nicht gerichtet auf apoptotische Neurone zu (Abb.9 in 4.2). Die Lamellipodien der Mikrogliazelle nahmen Kontakt mit den Neuronen in der direkten Nachbarschaft auf, wobei nur apoptotische Neurone phagozytiert wurden.

5.3 Mikrogliazellen erkennen und binden/phagozytieren apoptotische Neurone

In den meisten in vitro Studien zur Erkennung apoptotischer Zellen durch Phagozyten werden adhärente Phagozyten mit einer Suspension aus apoptotische Zielzellen inkubiert ( Hughes et al., 1997 ; Adayev et al., 1998 ). Dieser Ansatz konnte in dieser Arbeit nicht verwendet werden, da eine Ablösung der Kleinhirnneurone zu einem massiven nekrotischen Zelltod führte. Um eine Verletzung der Neuronenpopulation durch die Ablösung zu vermeiden, wurden frisch abgeschüttelte Mikrogliazellen zu apoptotischen- und Kontrollneuronen, die sich auf Deckgläsern befanden, gegeben. Da eine Apoptose einiger Neurone ebenfalls in den unbehandelten Kontrollkulturen auftrat, konnte eine Bindung und Phagozytose apoptotischer Neurone durch Mikrogliazellen auch in diesen Kontrollkulturen festgestellt werden. Eine Bindung nicht apoptotischer Neurone durch Mikrogliazellen konnte nicht beobachtet werden. In den Kokulturen mit den SNOC-behandelten, apoptotischen Neuronen wurde eine signifikant höhere Bindung und Phagozytose apoptotischer Neurone durch die Mikrogliazellen im Vergleich zu den Kokulturen mit Kontrollneuronen festgestellt (Abb.10 in 4.3). Apoptotische Neurone werden daher spezifisch von den Mikrogliazellen erkannt und phagozytiert. Bei der Quantifikation der Bindung und Phagozytose wurden nur die kondensierten Zellkerne gezählt, die nach mehrmaligem Waschen noch mit der jeweiligen Mikrogliazelle assoziiert waren. Da mit dieser Methode nicht eindeutig zwischen einer Bindung oder einer bereits erfolgten Phagozytose von apoptotischen Neuronen durch die Mikroglia unterschieden werden konnte, stellen die Ergebnisse immer eine Bindung und/oder Phagozytose der apoptotischen Neurone durch Mikrogliazellen dar.In dem hier verwendeten Modellansatz phagozytierten 27 % der Mikroglia apoptotische Neurone. Dies ist im Vergleich zu dem Modellansatz, in denen apoptotische Zellen zu adhärenten Phagozyten gegeben wurden, gering (78 %) ( Duvall et al., 1985 ). Dies kann durch die geringe Migration/Translokation


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der Mikroglia erklärt werden. In dem hier verwendeten Modell mußten sich die Mikrogliazellen zunächst auf dem Substrat absetzen und nahmen dann Kontakt zu den Neuronen in der unmittelbaren Umgebung auf. In dem umgekehrten Modellansatz wurden apoptotische Zellen auf bereits adhärierte Phagozyten gegeben, wodurch ein schneller Kontakt zwischen vielen, sich in der Suspension befindenden, apoptotischen Zellen und adhärenten Phagozyten ermöglicht wurde ( Duvall et al., 1985 ). So kam es bereits 15 Minuten nach Zugabe von apoptotischen Thymozyten zu einer Bindung an Makrophagen ( Duvall et al., 1985 ). Zur Erhöhung der Phagozytoserate in dem in dieser Arbeit verwendeten Modell wäre eine längere Inkubationsphase nicht sinnvoll gewesen, da phagozytierte apoptotische Zellen innerhalb der Phagozyten innerhalb kurzer Zeit abgebaut werden und dann nicht mehr anhand ihrer Kernmorphologie identifiziert werden können. Für apoptotische Zellen in C.elegans wurde beispielsweise eine Abbauzeit von einer Stunde ermittelt ( Ellis et al., 1991 ). Daher muß berücksichtigt werden, daß innerhalb der drei bis sechs Stunden des Phagozytoseassays bereits phagozytierte Zellen abgebaut wurden und die tatsächliche Rate der Phagozytose daher wahrscheinlich höher liegt.

5.4 Die Erkennung der Neurone durch Mikrogliazellen hängt von spezifischen Kohlenhydraten auf der Oberfläche apoptotischer Neurone ab

Veränderungen des Glykosilierungsmusters auf der Oberfläche von apoptotischen Zellen stellen ein Signal für die Phagozytose durch Makrophagen und semiprofessionelle Phagozyten dar (siehe 1.4.1.1). Hierbei kommt es wahrscheinlich zum Verlust von terminalen Sialinsäureresten der Zuckerstrukturen der Glykoproteine, wodurch N-Acetylglukosamin, N-Acetylgalaktosamin und Galaktose auf der Außenseite der Plasmamembran exponiert werden ( Duvall et al., 1985 ). Diese Zuckerreste wiederum können durch Lektine, die auf Makrophagen exprimiert sind, erkannt werden ( Dini et al., 1992 ; Savill et al., 1993 ; Savill 1997 ). Diese Bindung kann durch spezifische Zucker, wie N-Acetylglukosamin, die an die Lektine der Makrophagen binden, kompetetiv inhibiert werden ( Savill et al., 1989 ). In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß die Phagozytose apoptotischer Neurone durch Mikrogliazellen durch Galaktose, und in einem geringerem Maße auch durch N-Acetylglukosamin inhibiert wurde. Andere Zucker, wie Mannose, Fukose oder Glukose konnten die Phagozytose apoptotischer Neurone nicht blockieren.


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Dies deutet darauf hin, daß zur Erkennung apoptotischer Neurone durch Mikrogliazellen eine Interaktion zwischen einem neuronalen Kohlenhydratrest und einem Lektin der Mikroglia möglich ist. Das Mikroglialektin für diese Erkennung ist bisher noch nicht charakterisiert. Da Galaktose und N-Acetylglukosamin die Aufnahme bzw. Bindung apoptotischer Neurone durch Mikrogliazellen inhibieren, könnte ein spezifischer Galaktose- oder/und ein Asialoglykoprotein ähnlicher Rezeptor bei der Erkennung apoptotischer Neurone durch Mikrogliazellen eine Rolle spielen. Diese Rezeptoren, die sich durch Galaktose und N-Acetylglukosamin kompetetiv inhibieren lassen, spielen auch bei der Erkennung apoptotischer Zellen durch semiprofessionelle Phagozyten des peripheren Immunsystems eine Rolle ( Dini et al., 1992 ). Weitere Untersuchungen müssen zeigen, ob dieses Inhibitionsmuster durch Monosaccharide mit der Exposition der möglichen Kohlenhydratreste auf der Oberfläche der apoptotischen Neurone übereinstimmt. Diese Kohlenhydratreste treten möglicherweise erst in späteren Phasen des apoptotischen Prozesses auf (siehe 1.4.1.1). Aus diesem Grund könnte eine Erkennung und Bindung von apoptotischen Neuronen durch Mikrogliazellen mit Hilfe von Lektinen einen untergeordneten Erkennungsmechanismus darstellen, was den eher geringen inhibitorischen Effekt durch Galaktose und N-Acetylglukosamin erklären würde. Andererseits könnte der geringe Inhibitionseffekt von Monosacchariden auf die Phagozytose von apoptotischen Neuronen durch Mikroglia auch bedeuten, daß Monosaccharide schlechte Inhibitoren für eine Lektinbindung darstellen, da die Lektine komplexere Zuckerstrukturen als einzelne Zuckerreste erkennen könnten ( Duvall et al., 1985 ).

5.5 Die Thrombospondin vermittelte Erkennung von apoptotischen Neuronen durch Mikrogliazellen

Die Erkennung apoptotischer Neutrophiler durch Makrophagen erfolgt mit Hilfe des Zelladhäsionsmoleküls Thrombospondin-1 (TSP1), welches sowohl an der apoptotischen Zelle als auch an dem Makrophagen binden kann (siehe 1.4.1.3). TSP1 bindet auf Seiten der apoptotischen Zelle an anionische TSP1 Bindungsstellen und auf Seiten des Makrophagen an einen TSP1-Rezeptor (TSP-R), der sich aus dem CD36 und dem Vitronektin Rezeptor alphavbeta3-Integrin zusammensetzt ( Savill et al., 1990 ). Die Erkennung apoptotischer Neutrophiler durch Makrophagen kann spezifisch durch kationische


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Aminozucker, wie Mannosamin, inhibiert werden, die die anionischen TSP1 Bindungsstellen auf den apoptotischen Zellen maskieren ( Savill et al., 1990 ; Savill et al., 1992 ; Savill et al., 1993 ; Ren et al., 1995 ) Die kationischen Aminozucker Mannosamin und Glukosamin übten in dieser Arbeit einen unspezifischen toxischen Effekt auf Mikrogliazellen aus. Dieser toxische Effekt könnte auf die freie Aminogruppe in diesen Monosacchariden zurückzuführen sein, die mit Molekülen auf der Mikroglia reagieren könnten. In subtoxischen Konzentrationen konnte durch diese Zucker keine Inhibition auf die Phagozytose von apoptotischen Neuronen durch Mikrogliazellen festgestellt werden.

RGD Peptide, die an den Vitronektin Rezeptor binden, sowie Antikörper gegen den Vitronektin Rezeptor, das CD36 und das TSP1 üben inhibitorische Effekte auf die Erkennung von apoptotischen Eosinophilen und Lymphozyten durch Makrophagen aus ( Savill et al., 1992 ). Die Aufnahme von apoptotischen Kleinhirnneuronen durch Mikrogliazellen konnte in dieser Arbeit durch das Tetrapeptid RGDS reduziert werden. Dies deutet auf eine Integrin-vermittelte Erkennung hin. Dieses Integrin könnte den Vitronektinrezeptor darstellen, der bei der TSP1 vermittelten Erkennung von apoptotischen Zellen durch Makrophagen eine Rolle spielt und auch von den Mikrogliazellen exprimiert wird ( Akiyama et al., 1991 ; Savill et al., 1993 ). Aufgrund der immunohistochemischen Lokalisation von TSP1 auf reaktiven Mikroglia in vivo dient TSP1 als Marker für phagozytierende Mikroglia ( Moller et al., 1996 ; Kreutzberg 1996 ). TSP1 könnte daher Mikrogliazellen und apoptotische Neurone verbinden. Ob TSP1 zusätzlich auch an das CD36 Molekül bindet, wie für Makrophagen gezeigt wurde, konnte in dieser Arbeit nicht untersucht werden, da inhibitorische Antikörper gegen die CD36 Komponenten des
TSP1-R für das Rattensystem nicht erhältlich waren. Da CD36 wahrscheinlich einen verstärkenden Effekt bei der Erkennung von apoptotischen Zellen durch Phagozyten ausübt, könnte der geringe Inhibitionseffekt durch das RGDS-Peptid auf den fehlenden Beitrag des CD36 Moleküls hindeuten ( Savill 1997 ). Der TSP1-vermittelte- und der PS- Erkennungsmechanismus ist bei der Erkennung von apoptotischen Lymphozyten durch nicht aktivierte Makrophagen von Bedeutung. Bei aktivierten Makrophagen führt hauptsächlich die Erkennung von Zuckerstrukturen und PS zur Phagozytose von apoptotischen Lymphozyten durch Makrophagen ( Pradhan et al., 1997 ). Liegen ähnliche Gesetzmäßigkeiten auch bei Mikrogliazellen vor, könnte dies ebenfalls eine Erklärung für den geringen inhibitorischen Effekt von dem RGDS-Peptid sein, da die Versuche mit kultivierten, und somit bereits aktivierten Mikrogliazellen durchgeführt wurden.


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5.6 Die neuronale Phosphatidylserin Präsentation ist beteiligt bei der spezifischen Erkennung apoptotischer Neurone durch Mikrogliazellen.

Das Phosphatidylserin (PS) auf der Außenseite der Plasmamembran von apoptotische Zellen kann durch Phosphatidylserinrezeptoren der Makrophagen erkannt werden und zu einer Phagozytose führen (siehe 1.4.1.2). Liposome aus PS oder das wasserlösliche PS Analogon O-Phospho-L-Serin (OPS) können die Erkennung apoptotischer Lymphozyten durch Makrophagen kompetetiv inhibieren ( Fadok et al., 1992 ). Im neuronalen System konnte bereits gezeigt werden, daß die Präsentation von PS durch die neuronale Zelllinie HN2-5, welche durch ischämische Bedingungen zur Apoptose gebracht wurden, wichtig für die Phagozytose dieser Zellen durch Mikrogliazellen ist ( Adayev et al., 1998 ). Jedoch erfolgte die PS Präsentation in der HN2-5 Zelllinie nur in späteren Stadien des apoptotischen Prozesses ( Adayev et al., 1998 ). Die PS präsentierende neuronale Population in diesem Modell wies bereits einen Verlust der Membranintegrität auf, was auf eine sekundäre Nekrose hinweist. Folglich könnten diese Zellen verstärkt Ziel einer phagozytotischen Aufnahme geworden sein (siehe 4.2). Im Gegensatz zu dem Modell der neuronalen Apoptose an HN2-5 Zellen ist die Präsentation von PS in anderen apoptotischen Modellen ein früher Marker der Apoptose und tritt zeitlich früher als die DNA Fragmentation und der Verlust der Membranintegrität auf ( Martin et al., 1995 ). In dem in dieser Arbeit verwendeten Modell der Apoptoseauslösung in Neuronen des Kleinhirns durch den NO-Donator SNOC wurde ebenfalls eine Präsentation von Phosphatidylserin auf der Außenseite der Plasmamembran bei den Kleinhirnneuronen festgestellt. PS war auf der Oberfläche der Neurone bereits wenige Stunden nach dem apoptotischen Stimulus nachweisbar und daher in diesem Modellsystem ein früher Marker des apoptotischen Prozesses. Der Zeitverlauf der Annexin-V Färbung korrelierte mit den Veränderungen in der Zellkernmorphologie, was Vincent und Maiese, 1999 auch in primären Neuronen des Hippokampus beobachteten.

In dieser Arbeit konnte die Aufnahme apoptotischer Neurone durch Mikrogliazellen durch das wasserlösliche PS Analoga OPS reduziert werden. Dieses spricht für eine Erkennung von Phosphatidylserin auf apoptotischen Neuronen durch Mikrogliazellen. OPS übte im Vergleich zu Zuckern und RGDS Peptiden den stärksten inhibitorischen Effekt aus. Dieser Erkennungsmechanismus könnte somit in dem hier untersuchten Zeitfenster eine entscheidende Rolle bei der Erkennung von apoptotischen Neuronen durch Mikrogliazellen spielen. Da die Phosphatidylserinexpression in diesem Modell ein früher


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Marker des apoptotischen Zelltods ist, können die apoptotischen Neurone durch diesen Erkennungsmechanismus schnell durch Mikroglia erkannt und phagozytiert werden. Mikrogliazellen konnten weiterhin spezifisch Lipidvesikel, die PS enthielten, binden und phagozytieren. Mikroglia exprimieren daher einen Rezeptor, der PS erkennen und binden kann. Die Bindung und Phagozytose der Phosphatidylserin angereicherten Lipidvesikel erfolgt durch die Mikrogliazellen sehr schnell (Bindung bereits nach fünf Minuten), was auf eine spezifische Erkennung des Phosphatidylserins hindeutet. Ob die Interaktion durch einen bestimmten Mikrogliarezeptor für PS oder durch bereits bekannte Rezeptoren vermittelt wird, muß noch untersucht werden. Viele Rezeptorsysteme kommen für eine PS Erkennung durch Makrophagen in Frage (siehe 1.4.1.2). Es werden beispielsweise die Scavenger Rezeptoren CD36 und CD68 und der LPS-Rezeptor CD14 diskutiert ( Platt et al., 1998 ; Fadok et al., 1998 ). Die meisten dieser Moleküle wurden auch auf Mikrogliazellen gefunden ( Becher et al., 1996 ; Nakamura et al., 1999 ). Ob PS direkt durch Phagozyten erkannt wird, oder nur in Verbindung mit weiteren Molekülen, die einen Ligandenkomplex bilden, ist bisher noch nicht bekannt. Da einige Phagozyten PS exprimierende Zellen binden, ohne sie zu phagozytieren, scheint die Phagozytose der apoptotischen Zellen durch Phagozyten noch von weiteren Faktoren abhängig zu sein ( Savill 1997 ). Mit Hilfe konfokaler Mikroskopie konnte in dieser Arbeit jedoch die Phagozytose von PS-LUVs nachgewiesen werden. Da die PS-LUVs sonst nur aus Phospholipiden bestehen, die von den Mikrogliazellen nicht erkannt werden, (kaum nachweisbare Bindung von PC-LUVs), scheint PS zur Initiation der Phagozytose auszureichen. Auch unter physiologischen Bedingungen könnten einige PS-Moleküle in der äußeren Schicht der Plasmamembrandoppelschicht vorkommen (0,6 mol% der Phospholipide) ( Roelofsen und Op den Kamp, 1994 ). Dies könnte darauf hinweisen, daß ausschließlich Zellen phagozytiert werden, die eine bestimmte Konzentration von Phosphatidylserin auf der Außenseite exprimieren. Diese Annahme konnte in dieser Arbeit bestätigt werden, da nur LUVs gebunden und phagozytiert wurden, die aus 10 bzw. 1 mol% PS bestanden. LUVs mit 0,1 mol% konnten dagegen nicht spezifisch durch die Mikrogliazellen gebunden werden. Die Bindung und Phagozytose der Lipidvesikel hängt daher von der Konzentration des exponierten PS ab, denn es wurden nur Lipidvesikel phagozytiert, die bereits eine hohe Phosphatidylserinkonzentration aufwiesen, wie sie wahrscheinlich auch bei apoptotischen Zellen in der äußeren Plasmamembranschicht vorkommen (2-4 mol% der Phospholipide).


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Die verwendeten Inhibitoren Galaktose, N-Acetylglukosamin, RGDS oder OPS konnten die Phagozytose apoptotischer Neurone nicht vollständig blockieren. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, daß die anderen hier untersuchten Erkennungsmechanismen den jeweils blockierten Erkennungsmechanismus kompensieren konnten. Ob ein einzelner Erkennungsmechanismus ausreichend für die Entfernung von apoptotischen Neuronen aus dem Gewebe ist, muß noch untersucht werden. Ob die in dieser Arbeit untersuchten Erkennungsmechanismen die einzigen sind, durch die apoptotische Neurone durch Mikrogliazellen erkannt werden können, ist ebenfalls noch unbekannt. Da die einzelnen Inhibitoren, insbesondere die Zucker, in sehr hohen Konzentrationen verwendet wurden, konnten sie nicht gleichzeitig im Interaktionsmodell eingesetzt werden, da dann ein toxischer Effekt eintrat. Daher läßt sich bislang nicht sagen, ob die Blockierung unter diesen Bedingungen vollständig war, womit andere Erkennungsmechanismen ausgeschlossen werden würden. Mit Hilfe spezifischer Antikörper, die auch in geringen Konzentrationen einsetzbar wären, könnte diese Frage geklärt werden. Da jedoch die Lektine und auch die Phosphatidylserinrezeptoren der Phagozyten noch nicht näher identifiziert sind und daher spezifische Antikörper nicht vorliegen, konnten diese Versuche nicht durchgeführt werden.

5.7 Phosphatidylserin Rezeptoren sind konstitutiv auf den Mikrogliazellen exprimiert

Apoptotische Zellen, die auch unter physiologischen Bedingungen im zentralen Nervensystem vorkommen, müssen durch Phagozyten erkannt werden ( Savill 1997 ). Die Expression von Rezeptoren zur Erkennung von apoptotischen Zellen sollte somit konstitutiv auf den Phagozyten exprimiert und vom Aktivierungszustand des Phagozyten unabhängig sein. Ramifizierte Mikrogliazellen, die sich ebenfalls zu einem geringen Prozentsatz in den Mikrogliakulturen befanden, phagozytierten apoptotische, PS exprimierende Neurone nicht ( Adayev et al., 1998 ). Diese Neuronen wiesen jedoch bereits eine durchlässige Plasmamembran auf, ein Merkmal nekrotischer Zellen, wodurch sie wahrscheinlich eher zum Ziel für bereits aktivierte Mikroglia wurden.

In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß Lipidvesikel, die PS enthielten, von unterschiedlich aktivierten Mikrogliazellen in Kultur erkannt und gebunden wurden. Dies zeigt, daß die Expression des PS Rezeptors vom Aktivierungszustand der Mikrogliazelle unabhängig ist.


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Da jedoch die Versuche zu dieser Fragestellung mit kultivierten Mikroglia durchgeführt wurden, kann nicht ausgeschlossen werden, daß die ruhenden Mikroglia im Gewebe den spezifischen Rezeptor für PS nicht exprimieren. Kultivierte, ramifizierte Mikrogliazellen sind aufgrund ihres elektrophysiologischen Profils bereits aktiviert, obwohl sie morphologisch ruhenden Mikrogliazellen im Gewebe ähneln ( Eder et al., 1999 ). Eine Quantifikation der Bindung und Phagozytose der PS-Lipidvesikel durch die unterschiedlich kultivierten Mikrogliazellen wurde nicht vorgenommen, weshalb letztendlich keine Aussage darüber gemacht werden kann, ob die Bindung oder Phagozytose der PS-Lipidvesikel in unterschiedlichen Aktivierungszuständen der Mikrogliazelle unterschiedlich stark ist.

5.8 Eine Phagozytose von Lipidvesikeln, die Phosphatidylserin enthalten, löst keine sekretorische Aktivierung von Mikrogliazellen aus

Die Phagozytose von apoptotischen Zellen ist im peripheren System nicht mit einer Aktivierung von Phagozyten verbunden, wodurch ein inflammatorischer Prozess vermieden wird ( Fadok et al., 1998 b; Devitt et al., 1998 ) Vielmehr kommt es zur Produktion von antiinflammatorischen Zytokinen, wie TGF-beta, wenn Phagozyten apoptotische Zellen aufnehmen ( Green und Beere, 2000 ) Ein Aktivierungsprozess von Mikrogliazellen aufgrund pathologischer Ereignisse ist mit einer verstärkten Expression von immunrelevanten Oberflächenmolekülen auf der Mikrogliazelle verbunden ( Kreutzberg 1996 ). Zusätzlich kommt es zu einer Sekretion von inflammatorischen Zytokinen, wie TNF-alpha, IL-6 und IL-12, und Chemokinen, wie MIP-1a und KC ( Nakamura et al., 1999 ; Prinz et al., 1999 ). Durch zytotoxische Zytokine (z.B. TNF-alpha) und andere Zytotoxine (z.B. Sauerstoffradikale) werden benachbarte Zellen, wie Oligodendrozyten geschädigt ( Selmaj et al., 1991 ; Downen et al., 1999 ). Dadurch können aktivierte Mikrogliazellen eine inflammatorische Antwort auslösen. Die Erkennung und Phagozytose von PS-LUVs, als Modell für apoptotische, PS-präsentierende Zellen, konnte in dieser Arbeit nicht mit einer erhöhten Sekretion von den Zytokinen TNF-alpha, IL-6 und IL-12 und den Chemokinen MIP-1-alpha und KC durch Mikrogliazellen in Zusammenhang gebracht werden. Dies läßt darauf schließen, daß die Erkennung von Phosphatidylserin und die daraufhin eingeleitete Phagozytose nicht mit einer sekretorischen Aktivierung der Mikrogliazelle verbunden ist. Aufgrund einer raschen, PS-Rezeptor vermittelten


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Erkennung und Phagozytose apoptotischer Zellen könnte daher, wie im peripheren Immunsystem, ein inflammatorischer Prozess vermieden werden. Ob die Erkennung und Phagozytose von apoptotischen Zellen durch Mikrogliazellen einen antiinflammatorischen Effekt ausübt, im Sinne einer reduzierten Sekretion konstitutiv produzierter Zytokine und Chemokine oder einer gesteigerten Freisetzung antiinflammatorischer Zytokine, wie im peripheren Immunsystem gezeigt ( Fadok et al., 1998 ), muß noch untersucht werden.

5.9 Erkennung und Phagozytose von Phosphatidylserin durch Astrozyten

Auch semiprofessionelle Phagozyten können apoptotische Zellen erkennen und phagozytieren ( Dini et al., 1992 ). Astrozyten, die phagozytotisch aktiv werden, ( Bechmann und Nitsch, 1997 ), könnten ebenfalls eine Rolle bei der Phagozytose von apoptotischen Zellen spielen. Für die sogenannten semiprofessionellen Phagozyten wird angenommen, daß apoptotische Zellen überwiegend an ihre Erkennung von veränderten Zuckerstrukturen auf der Oberfläche erkannt werden ( Dini et al., 1992 ). Da die Exposition der veränderten Zuckerstrukturen wahrscheinlich eine Folge von späten Ereignissen des apoptotischen Prozesses ist ( Savill 1997 ), erkennen semiprofessionelle Phagozyten apoptotische Zellen möglicherweise erst in späteren Phasen der Apoptose. Wie in dieser Arbeit gezeigt wurde, sind auch Astrozyten im Gegensatz zu Oligodendrozyten, in der Lage, PS-haltige Lipidvesikel zu binden und zu phagozytieren. Somit könnten auch Astrozyten spezifische Phosphatidylserinrezeptoren besitzen, wodurch sie apoptotische Zellen erkennen könnten, die Phosphatidylserin auf der Außenseite der Plasmamembran exponieren. Da die Präsentation von Phosphatidylserin ein sehr früher Marker der Apoptose ist, könnten die semiprofessionellen Astrozyten apoptotische Zellen sehr früh erkennen und phagozytieren. In wie weit Astrozyten bei der Phagozytose von apoptotischen Zellen in vivo und in vitro beteiligt sind, muß jedoch noch gezeigt werden.

5.10 Die Erkennung von Phosphatidylserin ist mit einem Kalziumsignal in der Mikrogliazelle verbunden

Die Phagozytose von apoptotischen Zellen durch dendritische Zellen ist im Gegensatz zu der Phagozytose durch Makrophagen mit einer intrazellulären Erhöhung der Kalziumkonzentration verbunden ( Rubartelli et al., 1997 ). In dieser Arbeit wurde gezeigt,


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daß die Bindung von PS-Lipidvesikeln mit einer Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration in der Mikrogliazelle verbunden ist. Die Bindung apoptotischer Zellen durch einen PS-Rezeptor auf Seiten der Mikrogliazelle könnte daher ebenfalls zu einem Kalziumsignal in der Mikrogliazelle führen. Die durch PS-LUVs induzierten Kalziumsignale zeigten einen schnellen Anstieg, der sehr schnell wieder auf den Anfangswert vor der Stimulation zurück ging. Dieses Kalziumsignal unterscheidet sich von dem Kalziumsignal, welches bei der Phagozytose von apoptotischen Zellen durch dendritische Zellen beobachtet wurde ( Rubartelli et al., 1997 ). Letzteres zeichnet sich ebenfalls durch einen schnellen Anstieg aus, jedoch bleibt die intrazelluläre Kalziumkonzentration in diesen Zellen anschließend erhöht ( Rubartelli et al., 1997 ). Möglicherweise kommt es in dendritischen Zellen deshalb zu einem anderen zeitlichen Verlauf des intrazellulären Kalziumsignals, weil die Bindung/Aufnahme apoptotischer Zellen durch dendritische Zellen und damit die intrazellulären Signalkaskaden, auf einem TSP-vermittelten Mechanismus beruhen. An der Aufnahme der PS-LUVs durch Mikrogliazellen könnten Scavenger Rezeptoren oder das CD14-Molekül beteiligt sein. Bei der Aktivierung von Scavenger Rezeptoren wurden im Gegensatz zu einer Aktivierung des CD14 Moleküls intrazelluläre Kalziumsignale festgestellt ( Hurme et al., 1992 ; Pollaud et al., 1997 ). Ob das intrazelluläre Kalziumsignal ebenfalls, wie bei dendritischen Zellen, bei der Phagozytose von PS-LUVs oder PS-präsentierenden apoptotischen Neuronen durch Mikrogliazellen notwendig ist, könnte mit Hilfe von Kalziumchelatoren noch untersucht werden.

5.11 Ausblick

Die Erkennung und Phagozytose apoptotischer Zellen ist schnell, effizient und verhindert eine inflammatorische und immunologische Antwort ( Savill 1997 ). In dieser Arbeit konnte erstmalig in einem in vitro Modell des ZNS gezeigt werden, daß bei der Erkennung apoptotischer Neurone durch Mikrogliazellen gleiche Prinzipien gelten, wie im peripheren Immunsystem. Unterschiedliche Rezeptorsysteme der Mikrogliazellen sind hierbei an der Erkennung und Aufnahme beteiligt. Ob das spezifische Rezeptorsystem zur Erkennung apoptotischer Zellen im ZNS ebenfalls vom Typ der zu phagozytierenden apoptotischen Zelle abhängt, wie im peripheren Immunsystem gezeigt werden konnte, ist bisher nicht bekannt. Weiterhin muß noch überprüft werden, ob die in dieser Arbeit gefundenen Erkennungsmechanismen apoptotischer Zellen in vitro auch in vivo gelten.


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Ein Ausbleiben der Phagozytose apoptotischer Zellen durch Phagozyten aufgrund von Fehlern in der Erkennung apoptotischer Zellen könnte ein bisher unbekannter Faktor in der Pathogenese von inflammatorischen oder immunologischen Krankheiten darstellen ( Ren und Savill, 1998 ). Sekundär nekrotische Zellen induzieren eine inflammatorische Antwort und führen zum Absterben benachbarter Zellen im Gewebe. Nach einer Ischämie treten im Gewebe nekrotische Zellen auf, die auch apoptotische Merkmale aufweisen ( Martin et al., 1998 ). Bei diesen Zellen könnte es sich um apoptotische Zellen handeln, die nicht phagozytiert worden sind. Es wäre daher sinnvoll, Therapien zu entwickeln, durch die es zu einer erhöhten phagozytotischen Entfernung von apoptotischen Zellen kommt. Möglicherweise haben aktivierende Zytokine dabei einen selektiven Einfluß auf die phagozytotische Aktivität. Außerdem ergeben sich aus der Charakterisierung der Erkennungsmechanismen apoptotischer Zellen durch Phagozyten zukünftig vielleicht auch therapeutische Ansätze, in denen unerwünschte Zellen, wie Tumorzellen, durch die Induktion eines Erkennungssignals für Phagozyten markiert werden und somit effektiver beseitigt werden könnten.
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Fri Jan 26 13:08:51 2001