Witting, Anke: Erkennung apoptotischer Neurone durch Mikrogliazellen in vitro

Humboldt-Universität zu Berlin


Dissertation im Fach Biologie
Erkennung apoptotischer Neurone durch Mikrogliazellen in vitro

Zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium

Mathematisch-Naturwissenschafliche Fakultät Institut für Biologie

Dipl.-Biologin Anke Witting ,
geb. am 14.03.1972 in Barßel

Dekan der Fakultät Prof. Dr. Bernhard Ronacher

Gutachter:
1. Prof. A. Herrmann
2. Prof. H. Kettenmann
3. Prof. R. Nitsch

eingereicht: 19.07.2000

Datum der Promotion: 21.11.2000

Zusammenfassung

Mikrogliazellen stellen die professionellen Phagozyten des zentralen Nervensystems dar und sind maßgeblich bei der Entfernung apoptotischer Neurone aus dem Gewebe beteiligt. Die Erkennungsmechanismen, die zu einer Erkennung und Phagozytose apoptotischer Neurone durch Mikrogliazellen führen, sind bisher unbekannt. In dieser Arbeit wurde mit Hilfe eines Kokulturmodells die Erkennungsmechanismen zwischen primären Mikrogliazellen und apoptotischen Kleinhirnneuronen untersucht. Der apoptotische Zelltod, charakterisiert durch Schrumpfung und Fragmentation der Neuron, durch Kondensation des Chromatins, durch Fragmentation der DNA und durch Präsentation von Phosphatidylserin auf der extrazellulären Seite der Plasmamembran, wurde in den Kleinhirnneuronen durch eine Behandlung mit 100 µM S-Nitrosocystein induziert. Es konnte gezeigt werden, daß apoptotische Neurone keine löslichen Substanzen sekretierten, die chemotaktisch auf Mikrogliazellen wirken. Dies zeigt, daß die Erkennung apoptotischer Neurone über Zell-Zell-Kontakte erfolgt. Zur Untersuchung der beteiligten Erkennungsmechanismen wurden Mikrogliazellen zwei Stunden nach der Induktion des apoptotischen Zelltods zu den Neuronen gegeben und für sechs Stunden in Gegenwart oder Abwesenheit von Liganden kultiviert, die mögliche Rezeptoren zur Erkennung von apoptotischen Neuronen inhibieren. Die Bindung/Phagozytose der apoptotischen Kleinhirnneurone durch Mikrogliazellen wurde mit einer kombinierten DAPI/Propidiumjodid (für apoptotische/nekrotische Zellen) und einer Lektin Färbung (für Mikrogliazellen) durch Auszählung bestimmt. Die Aufnahme apoptotischer Neurone durch Mikrogliazellen wurde durch Galaktose und N-Acetylglukosamin reduziert, was auf eine Erkennung apoptotischer Zellen durch Lektine hindeutet. Weiterhin weist der inhibitorische Effekt von RGDS-Peptiden auf die Bindung/Phagozytose von apoptotischen Neuronen durch Mikrogliazellen auf eine Erkennung durch ein Vitronektinrezeptor hin. Da Mikrogliazellen spezifisch Lipidvesikel, die mit Phosphatidylserin angereichert waren, binden und O-Phospho-L-Serin die Aufnahme von apoptotischen Neuronen durch Mikrogliazellen deutlich inhibierte, erfolgte die Erkennung apoptotischer Neurone hauptsächlich durch einen Phosphatidylserin Rezeptor. Die Expression des PS-Rezeptors auf Mikrogliazellen ist unabhängig vom Aktivierungszustand der Mikrogliazellen in vitro. Die Bindung von PS ist mit einem Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration in der Mikrogliazelle verbunden und führt nicht zu einer sekretorischen Aktivierung der Mikrogliazelle. Da Astrozyten ebenfalls einen PS-Rezeptor exprimieren, könnten sie als semiprofessionelle Phagozyten ebenfalls eine Bedeutung bei der Aufnahme apoptotischer Neurone einnehmen.

Diese Ergebnisse zeigen, daß apoptotische Neurone ein komplexes Oberflächenmuster exprimieren, welches durch unterschiedliche Rezeptorsysteme der Mikrogliazelle erkannt werden kann. Die Erkennung von PS auf apoptotischen Neuronen durch Mikroglia scheint bei diesen untersuchten Rezeptorsystemen die wichtigste Rolle zu spielen.

Schlagwörter:
Mikrogliazellen, Apoptose, Erkennungsmechanismen, Kleinhirnneurone

Abstract

Microglia are the professional phagocytes of the central nervous system and play a crucial role in removal of apoptotic neurons out offrom the tissue. The recognition mechanisms leading to the recognition and phagocytosis of these apoptotic neurons by microglia are not yet characterized. Here IIn the present work established a co-culture model was established to examine the receptor systems involved in the recognition of apoptotic cerebellar neurons by primary microglia. Treatment with 100 µM S-nitrosocysteine induced apoptosis of cerebellar neurons as indicated by condensation and fragmentation of the neurons, condensation of the chromatin, fragmentation of the DNA and phosphatidylserine exposure to the exoplasmic leaflet of the plasma membrane. It was shown that apoptotic neurons do not release soluble signals that serve to attract microglia. Consequently, contact-dependent interaction between the microglial cell and the apoptotic neuron is required for recognition. For the examination of the receptor systems involved in recognition, microglial cells were added to neurons 2 h after induction of apoptosis induction and co-cultured for 6 h in the presence of ligands that inhibit recognition by binding to their respective receptors. Binding/phagocytosis was determined after combined DAPI/propidium iodide (for apoptotic/necrotic neurons) and lectin staining (for microglia). Uptake of neurons was reduced by galactose or N-acetylglucosamine, suggesting that recognition involves lectins. Furthermore, the inhibition of microglial binding/uptake of apoptotic neurons by RGDS peptide suggesteds a rolethe involvement of a microglial vitronectin receptor. The selective Binding of phosphatidylserine-enriched lipid vesicles on microglial cells and the strong interference of O-phospho-L-serine with the uptake of apoptotic neurons was indicative of an important role for the phosphatidylserine receptor (PS-receptor)As microglia selectively bind lipid vesicles enriches in phosphatidylserine and O-phospho-L-serine interfered in a strong way with the uptake of apoptotic neurons, the recognition of apoptotic neurons is manly dependent on a phosphatidylserine receptor. The expression of the PS-receptor is independent of the activation state of the microglial cell in vitro. The bindigbinding of PS induces an elevation of the intracellular calcium concentration in the microglia but doesid not induce an activationsectretion of (Liste der getesteten Zytokine einsetzen) of the microglial cell in an secretory way. Because of the expression of a PS-receptor, Astrocytes could also play a role in the uptake of apoptotic neurons as semiprofessional phagocytes.

In summaryCollectively, these results suggest that apoptotic neurons generate a complex surface signal recognized by different receptor systems on microglia. The recognition of PS on the surface of apoptotic neurons by microglial cells seems to play a major role in the recognition of these apoptotic neuronscells..

Keywords:
Microglia, apoptosis, recognition, cerebellar neurons


Seiten: [10] [11] [12] [13] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79] [80] [81] [82] [83] [84] [85] [86] [87] [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94] [95] [96] [97] [98] [99] [100] [101] [102] [103] [104] [105] [106] [107] [109] [110] [111] [112] [113] [114]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteErkennung apoptotischer Neurone durch Mikrogliazellen in vitro
Danksagung
1 Einleitung
1.1Apoptose und Nekrose
1.1.1Apoptose
1.1.2Nekrose
1.2Apoptose im Nervensystem
1.3Mikroglia
1.4Erkennung apoptotischer Zellen durch Phagozyten
1.4.1Erkennungsmechanismen
1.4.1.1Erkennung spezifischer Zuckerstrukturen
1.4.1.2Erkennung von Phosphatidylserin
1.4.1.3Thrombospondin-vermittelte Erkennung
1.4.1.4Weitere Erkennungsmechanismen
2 Zielstellung
3 Methoden
3.1Zellkultur
3.1.1Präparation der Körnerzellkulturen
3.1.2Präparation der Mikrogliazellkulturen
3.1.3Medien
3.2Auslösung der Apoptose in Kleinhirnneuronen
3.3Nachweis und Charakterisierung des apoptotischen Zelltods
3.3.1Untersuchung morphologischer Veränderungen mit Hilfe des Phasenkontrastmikroskops
3.3.2Untersuchung der Membranintegrität und der Zellkernmorphologie mit Hilfe von DNA-Farbstoffen
3.3.3Untersuchung der DNA-Fragmentation mit Hilfe des in situ Apoptose Detektions Tests
3.3.4Untersuchung der Phosphatidylserin Präsentation auf der Außenseite der Plasmamembran mit Hilfe von Annexin-V
3.4Videomikroskopie
3.5Mikrochemotaxis Test
3.6Phagozytoseassay
3.7Effekt löslicher Inhibitoren
3.8Neutralrottest
3.9Bindung von Lipidvesikeln an Gliazellen
3.10Freisetzung von Zytokinen und Chemokinen durch Mikroglia
3.11Messung von Änderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration mit Fluoreszenzfarbstoffen
3.12Quantifikation/ Statistik
4 Ergebnisse
4.1Kleinhirnneurone als apoptotisches Modellsystem
4.1.1Nachweis des apoptotischen Zelltods in den Kleinhirnneuronen
4.1.1.1Nachweis der für Apoptose spezifischen morphologischen Veränderungen
4.1.1.2Nachweis einer DNA-Fragmentation
4.1.1.3Nachweis einer Chromatinkondensation
4.1.1.4Nachweis von Phosphatidylserin auf der Außenseite der Plasmamembran
4.2Apoptotische Neurone produzieren keine löslichen Signale, die eine chemotaktische Reaktion in Mikrogliazellen hervorrufen.
4.3Mikrogliazellen binden/phagozytieren apoptotische Zellen
4.4Identifikation der Bindungsmechanismen zwischen apoptotischen Neuronen und Mikrogliazellen
4.4.1Spezifische Kohlenhydrate inhibieren die Bindung/Aufnahme von apoptotischen Neurone durch Mikroglia
4.4.2RGDS Peptide üben einen inhibitorischen Effekt auf die Erkennung von apoptotischen Neuronen durch Mikrogliazellen aus
4.4.3O-Phospho-L-Serin inhibiert die Bindung/Phagozytose von apoptotischen Neuronen durch Mikroglia
4.4.4Vitalitätstest mit Neutralrot in Gegenwart der verwendeten inhibitorischen Substanzen
4.5Charakterisierung der Phosphatidylserinbindung
4.5.1Spezifische Erkennung von Phosphatidylserin durch Mikroglia
4.5.2Spezifische Erkennung von Phosphatidylserin durch Astrozyten
4.5.3Zeitabhängigkeit der Bindung von Phosphatidylserin-LUVs durch Mikrogliazellen
4.5.4Konzentrationsabhängige Bindung der Phosphatidylserin-LUVs an die Mikroglia
4.5.5Die Bindung der Phosphatidylserin-LUVs ist unabhängig vom Aktivierungszustand der Mikroglia
4.6Die Bindung und Phagozytose von Phosphatidylserin-LUVs ist nicht mit einer Ausschüttung von Zytokinen und Chemokinen durch Mikrogliazellen verbunden
4.7Induktion einer Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration in Mikrogliazellen durch Phosphatidylserin-LUVs
5 Diskussion
5.1Stickstoffmonoxid induziert einen apoptotischen Zelltod in kultivierten Kleinhirnneuronen der Ratte
5.2Direkter Zell-Zell-Kontakt ist notwendig für die Erkennung apoptotischer Neurone durch Mikrogliazellen
5.3Mikrogliazellen erkennen und binden/phagozytieren apoptotische Neurone
5.4Die Erkennung der Neurone durch Mikrogliazellen hängt von spezifischen Kohlenhydraten auf der Oberfläche apoptotischer Neurone ab
5.5Die Thrombospondin vermittelte Erkennung von apoptotischen Neuronen durch Mikrogliazellen
5.6Die neuronale Phosphatidylserin Präsentation ist beteiligt bei der spezifischen Erkennung apoptotischer Neurone durch Mikrogliazellen.
5.7Phosphatidylserin Rezeptoren sind konstitutiv auf den Mikrogliazellen exprimiert
5.8Eine Phagozytose von Lipidvesikeln, die Phosphatidylserin enthalten, löst keine sekretorische Aktivierung von Mikrogliazellen aus
5.9Erkennung und Phagozytose von Phosphatidylserin durch Astrozyten
5.10Die Erkennung von Phosphatidylserin ist mit einem Kalziumsignal in der Mikrogliazelle verbunden
5.11Ausblick
6 Zusammenfassung
Bibliographie Literaturverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis
Lebenslauf
Selbständigkeitserklärung
Anhang A Publikationen und Posterbeiträge

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Neutralrot Test zur Bestimmung der Überlebensfähigkeit der Mikroglia in der Anwesenheit der löslichen Inhibitoren.

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Morphologische Merkmale des apoptotischen und nekrotischen Zelltods.
Abbildung 2: Verschiedene Erkennungsmechanismen, die zur Phagozytose von apoptotischen Zellen durch Phagozyten führen können.
Abbildung 3: Schematische Darstellung des Chemotaxisansatzes
Abbildung 4: Für Apoptose spezifische morphologische Veränderungen der Kleinhirnneurone nach einer SNOC-Behandlung.
Abbildung 5: ApopTag-positive Kleinhirnneurone nach einer Behandlung mit 100 µM SNOC.
Abbildung 6: Apoptotischer und nekrotischer Zelltod in den Körnerzellen des Kleinhirns nach einer Behandlung mit 100 µM S-Nitroso-L-Cystein.
Abbildung 7: Phosphatidylserin wird im Verlauf der SNOC induzierten Apoptose früh auf der Oberfläche der Neurone präsentiert.
Abbildung 8: Kulturüberstände von apoptotischen Neurone besitzen keine chemotaktische Wirkung auf Mikroglia.
Abbildung 9: Video Zeitraffer Aufnahmen von Mikrogliazellen, die zu apoptotischen Neuronen gegeben wurden.
Abbildung 10: Die Bindung/Phagozytose von Neuronen durch Mikrogliazellen nimmt in Kokultur mit SNOC-behandelten Neuronen zu.
Abbildung 11: Effekt von Monosacchariden auf die Phagozytose apoptotischer Körnerzellen des Kleinhirns durch Mikroglia.
Abbildung 12: RGDS Peptide inhibieren die Phagozytose von apoptotischen Kleinhirnneuronen durch Mikroglia.
Abbildung 13: Der inhibitorische Effekt von O-Phospho-L-Serin auf die Mikroglia Phagozytose von apoptotischen Kleinhirnneuronen.
Abbildung 14: Mikrogliazellen binden und phagozytieren Lipidvesikel, die Phosphatidylserin enthalten.
Abbildung 15: Bindung von PS-LUVs durch Astrozyten:
Abbildung 16: Zeitabhängige Bindung der Phosphatidylserin-LUVs an Mikrogliazellen.
Abbildung 17: Konzentrationsabhängigkeit der Phosphatidylserinbindung.
Abbildung 18: Die Bindung der PS-LUVs ist unabhängig vom Aktivierungszustand der Mikrogliazellen.
Abbildung 19: Eine Inkubation der Mikrogliazellen mit Lipidvesikeln führt nicht zu einer Stimulation der Zytokin/Chemokin- Sekretion
Abbildung 20: Die Bindung von PS-LUVs induziert Kalziumsignale in Mikrogliazellen.
Abbildung 21: PS-LUVs induzieren ein Kalziumsignal in Mikrogliazellen

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Fri Jan 26 13:08:51 2001