[Seite 28↓]

2.  Material und Methode

2.1. Patientenkollektiv

In die Studie wurden 248 Patientinnen mit Mammakarzinom eingeschlossen, die in der Zeit von 1996 bis 1997 aus den Bavaria-Kliniken Kreischa (Sachsen) und Schaufling (Bayern) rekrutiert wurden.

Es galten folgende Ein- und Ausschlusskriterien:

  1. Patientinnen mit gesichertem Mammakarzinom
  2. Alter über 18 Jahre
  3. Deutschstämmigkeit, infolge bekannter interethnischer Unterschiede im Fremdstoffmetabolismus gefordert. Die Daten zur Herkunft der Patientinnen wurden durch Befragung und durch Bekanntheit des Geburtsnamens ermittelt.

Bei jeder Patientin wurde mit einem standardisierten Vordruck eine gezielte Anamnese erhoben, in der folgende Daten erfasst wurden:

[Seite 29↓]•Tumorklassifikation:

Für das Staging wurde die postoperative histopathologische TNM-Klassifikation (pTNM) der WHO benützt.

T-Kategorien

Tis

In situ

T1

< 2cm in grösster Ausdehnung

(T1a < 0,5cm; T1b > 0,5cm - 1cm; T1c >1–2 cm)

T2

> 2-5cm in grösster Ausdehnung

T3

> 5cm in grösster Ausdehnung

T4

Tumor jeder Grösse, auf Brustwand oder Haut direkt übergreifend.

 

T4a

Ausdehnung auf die Thoraxwand

 

T4b

Ödem, Ulzeration, Satelittenmetastasen an der Brustwand

 

T4c

Kriterien T4a + T4b

 

T4d

entzündliches Karzinom

N-Kategorien

pN

 

Regionäre Lymphknotenmetastasen

pN0

 

Keine regionären Lymphknotenmetastasen

pN1

 

Metastasen in beweglichen ipsilateralen axillären Lymphknoten

 

pN1a

Mikrometastasen <0,2cm

 

pN1b

Makrometastase (n) > 0,2cm

  

  • Metastasen in 1-3 Lymphknoten - >0,2-<2,0cm
  • Metastasen in < 4 Lymphknoten - >0,2-<2,0cm
  • Metastasenausdehnung über die Lymphknotenkapsel hinaus
  • Metastasen in Lymphknoten - >0,2cm

  
  

 
  

pN2

Ipsilaterale axilläre Lymphknoten untereinander oder an andere Strukturen

 

fixiert

pN3

Metastasen in Lymphknoten entlang der A. mammaria interna

M-Kategorien

PM: Fernmetastasen; pM0: keine Fernmetastasen; pM1: Fernmetastasen vorhanden;

MX: Das Vorliegen von Metastasen nicht beurteilt


[Seite 30↓]

Daneben wurde die Stadiengruppierung der AJC/UJCC verwendet. Die nachfolgende Tabelle enthält die Zuordnung der TNM-Klassifikation zur Stadieneinteilung der AJC/ UJCC:

Tabelle 4: Stadieneinteilung der AJC/UCC

Stadium (UICC)

TNM-Klassifikation

  

Stadium Iis

Carcinoma in situ

  

Stadium I

T1a, T1b

N0,N1a

M0

Stadium II

T0, T1a, T1b

N0,N1a, N1b

M0

 

T2a, T2b

N1b

M0

Stadium IIIA

T3a, T3b

N0,N1

M0

 

T1a,b, T2a,b, T3a,b

N2

M0

Stadium IIIB

T1a,b, T2a,b, T3a,b

N3

M0

 

T4a,b,c

jedes N

M0

Stadium IV

jedes T

jedes N

M1

•Raucherstatus:

Der Zigarettenkonsum wurde in Packungsjahren (PJ) angegeben (1PJ = täglicher Konsum von 20 Zigaretten über ein Jahr). Als Nichtraucher wurden Personen definiert, die noch nie geraucht hatten. Leichte Raucher wiesen 1-20 PJ in der Anamnese auf, mittlere Raucher 21-50 PJ und starke Raucher über 50 PJ.


[Seite 31↓]

Tabelle 5: Anamnestische Daten der Patientinnen mit Mammakarzinom

Tumorgrading

I

8,2

II

59,1

III

32,7

 

%

Tumorstaging

keine Angabe

3,6

Stadium 0-2

85,1

Stadium 3-4

11,3

 

%

Tumorhistologie

invasiv-duktal

73,4

invasiv-lobulär

14,2

Andere

12,4

 

%

Hormonrezeptorstatus

Negativ

21,1

Positiv

78,0

  

%

Dauer der Menstruation

< 35 Jahre

46,4

>/= 35 Jahre

53,6

  

%

Raucherstatus

Nichtraucher

72,6

1-20 PJ

23,0

21-50 PJ

2,8

> 50 PJ

1,2

%

Menopausenstatus

Prämenopause

32,3

Postmenopause

67,7

  

%

Blutgruppe

0

50,7

A

28,4

B

14,2

AB

6,7

%

Rhesusfaktor

D pos.

82,0

D neg

18,0

  

%

Alter (Jahre)

< 58

51,6

> 58

48,4

  

%

Beruf

Schadstoff-exponiert

82,7

nicht schadstoff-exponiert

17,3

  

%


[Seite 32↓]

2.2.  Kontrollkollektiv

In das Kontrollkollektiv wurden 248 deutschstämmige Patientinnen aufgenommen, bei denen nach anamnestischen und klinischen Kriterien keine Anzeichen für ein Malignom bestanden. Das Kontrollkollektiv umfasste 88 Patientinnen mit internistischen Erkrankungen, 64 Patientinnen mit orthopädischen, 40 Patientinnen mit urologischen, 29 Patientinnen mit neurologischen Erkrankungen und 27 freiwillige gesunde Probandinnen.

Bei jeder Kontrollperson wurde ebenfalls nach einem standardisierten Vordruck eine gezielte Anamnese im Hinblick auf die Erfassung folgender Daten durchgeführt:

Alter, Gewicht, Grösse, Beruf, Schadstoffexposition, Raucherstatus, Daten zur Menstruation mit Angabe von: Beginn der Menarche und Beginn der Menopause. Daten zu schweren Begleiterkrankungen wie z. B.: schwere Herz-, Leber-, Nierenerkrankungen. Daten zur Blutgruppe mit Angabe von: ABO-System und Rhesus-Faktor.

Tabelle 5: Demographische Daten beim Mammakarzinom und bei den Kontrollen

 

Mammakarzinom-

Patientinnen

Kontroll-Patientinnen

Anzahl

248

248

Alter (Jahre)

32-85

26-84

Altersmedian (Jahre)

57

60


[Seite 33↓]

2.3.  Material

Reagentien

Taq-DNA-Polymerase (Perkin Elmer, Weiterstadt)

2-Desoxynukleotide: dGTP, dTTP, dATP, dCTP (Boehringer Mannheim, Mannheim)

Proteinase K (Boehringer Mannheim, Mannheim)

Oligonukleotid-Primer (TIB Molbiol, Berlin)

Restriktionsendonukleasen Alul, BamHl, Ddel, Fokl, Kpnl, Mspl, Taql (New England Biolabs, Schwalbach)

100 bp DNA-Längenleiter (Gibco BRL, Eggenheim)

DNA-Grössenstandard V, VI (Boehringer Mannheim, Mannheim)

Agarose UltraPURE (Gibco BRL, Eggenheim)

Agarose, Nusieve (Biozym Diagnostk, Hessisch Oldendorf)

[Seite 34↓]Lösungen

1.) Lösungen zur Leukozytenisolierung

Erythrozytenlysepuffer (155 mM NH4Cl; 10mM KHCO3; 0,1 mM EDTA)

TEN-Puffer (20 mM Tris; 2,5 mM EDTA; 30 mM NaCl; pH 7,5)

2.) Lösungen zur DNA-Präparation:

Natriumazetat (3 moll CH3COONa, pH 5,5)

Salpetersäure (1N)

Chloroform (Lichrosolv, Merck Darmstadt)

Phenol-Wasser-Chloroformlösung (Perkin Elmer 400765)

2 mal Lysis-Buffer (Perkin Elmer 400766)

Ethanol (80% Ethanol; 20% 5mmol/l CDTA-Wasser)

2-Propanolol (Licrosolv, Merck Darmstadt)

Tris/EDTA (100mmol/l Tris/HCl; 10mmol/l EDTA; pH 8,0)

3.) Lösungen für die Elektrophorese:

TBE-Puffer (90mM Tris; 90mM Borsäure; 2,5mM EDTA; pH 8,0

Orange-G-Lösung (Ficoll 20&%; 10mM Tris; 1mg/ml Orange-G; pH 7,5)

[Seite 35↓]Geräte

Gene Amp 9600 (Perkin Elmer) Weiterstadt

DNA-Extraktor ABI 341 (Perkin Elmer, Weiterstadt)

Elektrophoresekammer (BioRad, München)

Elektrophoresekammer (Pharmacia, Freiburg)

Zentrifuge 5415C (Eppendorf, Hamburg)

Digitale Bildverabeitung Eagle Eye II (Stratagene, Heidelberg)


[Seite 36↓]

2.4.  Methode

2.4.1. DNA-Isolierung

Von jedem Patienten wurden 5 bis 10 ml venösen Blutes gewonnen. Die Koagulation wurde mit EDTA verhindert. Die DNA wurde aus Leukozyten nach Proteinase-K-Verdau mittels einer manuellen 3-Schritt Phenol/Chloroform-Extraktion (Sambrook et al. 1989) bzw. unter Verwendung eines halbautomatischen DNA-Extraktors (341A Applied Biosystems) gewonnen.

Hierzu wurde zunächst das Vollblut mit dem 3-fachen Volumen eines hypoosmolaren Puffers

 

155 mmol/l NH4Cl, pH 8,0

 

10 mmol/l KHCO3

 

0,1 mmol/l EDTA

versetzt und 30 min. bei 4°C inkubiert. Hierdurch platzten die Erythrozyten. Die Leukozyten konnten durch Zentrifugation bei 1.200 rpm pelletiert werden. Die Leukozyten wurden in 2 ml TEN-Puffer

 

20 mmol/l Tris/HCL pH7,5

 

2 mmol/l EDTA

 

30 mmol/l NaCl

resuspendiert, in zwei Gefässe aliquotiert und bei -20°C bis zur DNA-Extraktion aufbewahrt.

Den beiden Extraktionsverfahren, dem manuellen wie dem automatischen, liegt der Aufschluss der Leukozyten mittels Proteinase K und Natriumdodecylsulfat (SDS) zugrunde.

Beim manuellen Verfahren wurden die Leukozyten in 10ml TEN-Puffer resuspendiert, mit 100 µl 10 mg/ml Proteinase K (Roche Mannheim) und 0,5 ml 200g/l Natrium-Dodecylsulfat (SDS) versetzt und anschliessend bei 37° über Nacht inkubiert. Protein[Seite 37↓]bestandeile wurden durch Zugabe von 5 ml Tris-Puffer-gesättigter Phenollösung gefällt und durch Zugabe von 5 ml Chloroform von der wässrigen Lösung getrennt.

Gleichzeitig wurden hierdurch lipidhaltige Bestandteile abgetrennt. Die wässrige Phase wurde erneut einer Chloroform-Extraktion unterworfen und zentrifugiert. Die in eine frisches Gefäss überführte wässrige Phase wurde mit dem 2,5-fachen Volumen an 100% Ethanol versetzt und gleichzeitig 0,1 Volumen 2mol/l Natrium-Azetat pH 5,8 addiert.

Hierdurch präzipitierte die DNA und konnte entweder abzentrifugiert werden oder direkt mittels eines Glashakens aufgenommen werden. Die DNA wurde kurz in 70% Ethanol gewaschen, anschliessend getrocknet. Das Pellet wurde in 10 mmol/l Tris, 1 mmol/l EDTA-Puffer (pH 8,0) resuspendiert und bis zur weiteren Analyse bei 4°C aufbewahrt.

2.4.2. Genotypisierung der NAT2-Mutationen

Die kodierende Sequenz des NAT2-Gens wurde mit Oligonukleotid-Primern P100 und P56 eingegrenzt und ein 1.211-bp-Fragment mit PCR amplifiziert. Hierzu wurden 0,5-1µl DNA-Lösung (50-100 ng DNA) zum 50 µl Reaktionsansatz hinzugegeben.

5 µl

10 fach

 

PCR-Puffer

(Perkin Elmer)

5 µl

2 mmol/l

 

dNTP

(Roche Mannheim)

1 µl

10 mmol/l

 

5`-Primer P100

(TIB-Molbiol)

1 µl

10 mmol/l

 

3`-Primer P56

(TIB-Molbiol)

4,8 µl

25 mmol/l

 

MgCl2

(Perkin Elmer)

0,2 µl

5 units/µl

 

Taq-DNA-Polymerase

(Perkin Elmer)

33 µl

  

H20

 


[Seite 38↓]

Die Primer-Sequenzen sind in Tabelle 5 aufgeführt. Die Reaktionsgefässe wurden in den 94°C heissen Thermocycler (Perkin Elmer 9600 und Biometra Trio) gestellt und die PCR unmittelbar unter folgenden Bedingungen gestartet:

2 min. initiale Denaturierung bei 94°C; 35 Zyklen 0,5 min. Denaturierung bei 94°C; 1,5 min. Annealing und Elongation bei 67°C; gefolgt von 7 min. terminaler Elongation bei 72°C. Anschliessend wurden die Proben auf 4°C heruntergekühlt.

Der Erfolg der PCR wurde mit Hilfe einer Agarol-Gelelektrophorese überprüft. Hierzu wurden 7 ml PCR-Produkt mit 5µl Blue-Marker (Life Technologies) versetzt und auf einem 1,2% Agarose-Gel (Biozym) bei 120 V für 20 min. aufgetrennt.

Als Elektrophoresepuffer diente ein üblicher TBE-Puffer:

 

90 mmol/l Tris pH 8,0-8,3

 

90 mmol/l Borsäure

 

2,5 mmol/l EDTA

Tabelle 6: Oligonukleotid-Primer zur Amplifikation des kodierenden Abschnitts des NAT2-Gens und Amplifikation von kleinen Fragmenten, die mögliche Mutationen bei Positionen 191, 282, 341, 590 und 803 enthalten. Positionen 481 und 857 wurden direkt am 1.211-bp-Fragment geprüft.

Primer

Primer-

länge (nt)

Fragment-

länge (bp)

Sequenz

Spezifität

P100

-69 - 48

1211

5´-GTC ACA CGA GGA

AAT CAA ATC C

NAT2-Gen (5`)

P56

1142-1119

-

5´-GTT TTC TAG CAT GAA

TCA CTC TGC

NAT2-Gen (3`)

P341N*

342 - 373

442

5´-ACC CAG CAT CGA CAA TGT AAT TCC TGC CCT CA

Ddel-site 341 nt (3`)

P87

480 - 490

421

5´-CCT GGA CCA AAT CAG GAG AG

Taql und Ddel-site 803 nt (5`)

P90

900 - 879

-

5´-ACA CAA GGG TTT ATT

TTG TTC C

(3`)


[Seite 39↓]

Aus dem 1.211-bp-Fragment konnten direkt die Positionen 481 und 857 nt auf die Mutationen C/T bzw. A/G mit den Restriktionsenzymen Kpnl und BamHI geprüft werden. Die Mutationen führten jeweils zum Verlust der Schnittstelle der Endonuklease.

Kpnl-Verdau zur Bestimmung der C481T-Transition

12,5 µ

  

PCR-Produkt (P100/P56)

2,5 µl

110 fach

 

Puffer 1 (New England Biolabs)

0,5 µl

60 units/µl

 

Kpnl (New England Biolabs)

9,5 µl

  

H20

Inkubation über Nacht bei 37°C.

BamHl-Verdau zur Bestimmung der A857G-Transition

12,5 µ

  

PCR-Produkt (P100/P56)

2,5 µl

10 fach

 

Puffer BamHI (New England Biolabs)

0,5 µl

200 units/µl

 

BamHI (New England Biolabs)

9,5 µl

  

H20

Inkubation über Nacht bei 37°C.

12,5 µl des Reaktionsprodukts wurden mit 10 µl Bluemarker versetzt und auf ein 2%-Agarose-Gel (Biozym) aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgte für 40 min. bei 80 V. Als Grössenstandard wurden 5 µl DNA-Marker V (Boehringer Mannheim) parallel aufgetrennt. Das Fragment-Muster wurde mit einem EagleEye Still-Videosystem (Stratagene) dokumentiert (Abb. 5).


[Seite 40↓]

Abb.1: 2% Agarose-Gelelektrophorese von 1.211-bp-Fragmenten, die zur Überprüfung der Mutationen an NAT2-Genposition 481 nt mit Kpnl bzw. 857 nt mit BamHI verdaut wurden. Die Fragmente wurden durch Anfärbung mit 1mg/l Ethidiumbromid sichtbar gemacht.

Zur besseren Detektierung der weiteren Mutation wurden von dem bestehenden 1.211-bp-Template eine sogenannte seminested PCR durchgeführt. Auf diese Weise konnte z. B. die randständig sitzende G191A-Mutation besser sichtbar gemacht werden und die Zahl konstitutiver Schnittstellen der Restriktionsenzyme Ddel und Taql gesenkt werden.

Der entscheidende Vorteil war jedoch die Möglichkeit, mit einem Restriktionsverdau die T341C-Transition nachzuweisen, indem in den 3´-Primer eine mismatch-Base und so eine Ddel-Schnittstelle in Abhängigkeit von der Mutation eingefügt wurde.

Diese Designed-Primer-Technik hat den Vorteil, bei Nicht-Vorliegen einer Restriktionsstelle auf Allel-spezifische Verfahren zu verzichten, die das Risiko falsch-positiver oder falsch-negativer Ergebnisse in sich bergen. Hierzu wurde ein 442-bp-Fragment, welches die Mutationen 191, 282 und 341 nt enthielt, mit den Primern P100 und P341N [Seite 41↓]amplifiziert. 1 µl des 1:10 verdünnten PCR-Amplifikates wurde zum 50 µl Reaktionsansatz hinzugegeben.

5 µl

10 mal

 

PCR-Puffer

(Perkin Elmer)

5 µl

2 mmol/l

 

dNTP

(Roche)

1 µl

10 mmol/l

 

5`-Primer P100

(TIB-Molbiol)

1 µl

10 mmol/l

 

3`-Primer P341N

(TIB-Molbiol)

4,8 µl

25 mmol/l

 

MgCl2

(Perkin Elmer)

0,2 µl

5 units/µl

 

Taq-DNA Polymerase

(Perkin Elmer)

33 µl

  

H20

 

PCR-Bedingungen: 2 min. 94°C; 14 Zyklen (0,5 min. 94°C, 1,5 min. 67°C); 7 min. 72°C.

Mspl-Verdau zur Bestimmung der G191A-Transition

12,5 µl

  

PCR-Produkt (100/341N)

2,5 µ

10 fach

 

Puffer 2(New England Biolabs)

0,5 µl

100 units/µl

 

Mspl(New England Biolabs)

9,5 µ

  

H20

Inkubation über Nacht bei 37°C.

Fokl-Verdau zur Bestimmung der C282T-Transition

12,5 µl

  

PCR-Produkt (100/341N)

2,5 µ

10 fach

 

Puffer 4(New England Biolabs)

0,5 µl

20 units/µl

 

Fokl(New England Biolabs)

9,5 µ

  

H20

Inkubation über Nacht bei 37°C.


[Seite 42↓]

Ddel-Verdau zur Bestimmung der T341C-Transition

12,5 µl

  

PCR-Produkt (100/341N)

2,5 µ

10 fach

 

Puffer 3(New England Biolabs)

0,5 µl

10 units/µl

 

Ddel(New England Biolabs)

9,5 µ

  

H20

Inkubation über Nacht bei 37°C.

Abb.2: 3% Agarose-Gelelektrophorese von 442-bp-Fragmenten, die zur Überprüfung der Mutationen an NAT2-Genposition 191 nt mit Mspl, 282 nt mit Fokl bzw. mit Ddel verdaut wurden. Die Fragmente wurden durch Anfärbung mit 1mg/l Ethidiumbromid sichtbar gemacht.

Zur Determinierung möglicher Mutationen an den Positionen 590 nt und 803 nt wurde ähnlich vorgegangen. Nach Amplifikation eines 421-bp-Fragmentes wurde dieses zwei verschiedenen Restriktionsverfahren unterworfen. Es wurden wieder 1µl des 1:10 verdünnten initialen 1.211-bp-Templates eingesetzt.


[Seite 43↓]

5 µl

10 fach

 

PCR-Puffer

(Perkin Elmer)

5 µl

2 mmol/l

 

dNTP

(Boehringer Mannheim)

1 µl

10 mmol/l

 

5`-Primer P87

(TIB-Molbiol)

1 µl

10 mmol/l

 

3`-Primer P90

(TIB-Molbiol)

4,8 µl

25 mmol/l

 

MgCl2

(Perkin Elmer)

0,2 µ

5units/µl

 

Taq-DNA-Polymerase

(Perkin Elmer)

33 µl

  

H20

 

PCR-Bedingungen: 2min.94°C; 14 Zyklen (0,5 min. 94°C, 1,0min. 60°C, 1min.

72°C); 7min. 72°C.

Taqål-Verdau zur Bestimmung der G590A-Transition

12,5 µl

  

PCR-Produkt (87/90)

 

2,5 µl

10 mal

 

Puffer Taqål

(New England Biolabs)

0,5 µl

20 units/µl

 

Taqål

(New England Biolabs)

9,5 µl

  

H20

 

Inkubation 3-4 Stunden bei 65°C.

Abb.3: 3% Agarose-Gelelektrophorese von 421-bp-Fragmenten, die zur Überprüfung der Mutationen an NAT2-Genposition 590 nt mit Taqål und 803 nt mit Ddel verdaut wurden. Die Fragmente wurden durch Anfärbung mit 1mg/l Ethidiumbromid sichtbar gemacht.


[Seite 44↓]

Ddel-Verdau zur Bestimmung der A803G-Transition

12,5 µl

  

PCR-Produkt (87/90)

 

2,5 µl

10 fach

 

Puffer 3

(New England Biolabs)

0,5 µl

10 units/µl

 

Ddel

(New England Biolabs)

9,5 µl

  

H20

 

Inkubation über Nacht bei 37°C.

Tabelle 7: Restriktionsendonukleasen zur Erkennung der NAT2-Mutation

Position

Transition

Restrik-

tionsen-

donuk-

leasen

Erkennungs-

sequenz

Präamplifi-

kation mit

Primer

Schnittposi-

tionen (nt)

Wildtyp

Mutation

Fragment-

Länge(bp) Wildtyp

Mutation

191

G->A

Mspl

G´GC_C

AG´CT

100/341N*

96 189

96

184 165 93

277 165

282

C->T

Fokl

GGATGnnnnn

Nnnn´nnnn_

100/341N*

268

337 165

442

341

T->C

Ddel

C´TnA_G

100/341N*

-2 153

-2 153 341

220 163 59

188 163 59 32

481

C->T

Kpnl

C´GTAC´C

100/56

480

662 549

1211

590

G->A

Taql

T´CG_A

87/90

588 730

730

170 142 109

279 142

803

A->G

Ddel

C´TnA_G

87/90

776

776 803

297 124

297 97 27

857

G->A

BamHI

C´GTAC_C

100/56

856

925 286

1211


[Seite 45↓]

2.5.  Statistik

Als Schätzgrösse für das relative Risiko wurde die Odds ratio (beobachtete Häufigkeit/erwarteter Häufigkeit) gewählt. Die Berechnung der Odds ratio und des 95%-Vertrauensbereichs erfolgte mit der Methode nach Thomas und Gard (1977).

Als Signifikanzniveau galt P = 0,05. Es waren mindestens 200 Patienten für diese Fall-Kontroll-Studie notwendig, um bei einem Fehler erster Art von 0,05 und einem Fehler zweiter Art von 0,2 eine als klinisch relevant geltende Odds ratio von 1,75 zu erfassen zu können.

Die erwarteten Genfrequenzen innerhalb der Kontrollgruppe wurden nach den auftretenden Allelhäufigkeiten mit dem Hardy-Weinberg-Gesetz (p2+2pq+q2=1) ermittelt. Unterschiede in der Präsenz der Gene und Allele wurden mit dem exakten Fisher-Test geprüft und als Odds ratio mit den 95%-Konfidenzintervallen sowie dem Fehler erster Ordnung angegeben.

Die logistische Regressionsanalyse berücksichtigte das Alter, BMI und Anzahl der Packungsjahre als kontinuierliche Variable, den Acetyliererstatus als kategoriale Variable. Die Kalkulation erfolgte mittels SPSS 9,0.

2.6. Ethische Grundlagen und Datenschutz

Die Patienten wurden über die Zielsetzung der Studie informiert; sie gaben danach ihr Einverständnis in schriftlicher Form. Die Patientendaten wurden in anonymisierter Form (fortlaufende Nummer, Initialen und ID-Nr.) erhoben und gespeichert. Die DNA wurde ausschliesslich für diagnostische Zwecke verwendet und in Probengefässen mit fortlaufender Nummerierung ohne weitere Kennzeichnung verwahrt. Die vorliegende Studie wurde von der Ethikkommission der Landesärztekammer Sachsen mit einem positiven Votum bedacht.


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23.07.2004