Für die Pathogenese des Mammakarzinoms, dem häufigsten Tumor der Frau, scheinen genetische Faktoren eine wichtige Rolle zu spielen. Hierzu rechnet man seltene aber hochpenetrante genetische Mutationen wie das BRCA1-Gens (Chromosom 17q21), das weniger stark mit dem Risiko eines Mammakarzinoms korrelierende BRCA2-Gen (13q) und darüberhinaus Amplifikationen des c-myc-Protoonkogens sowie ein Heterozygotitätsverlust von Genen auf dem kurzen Arm von Chromosoms 3 in der Region 3p21-p25 (Schmoll et al., 1999).
Darüberhinaus ist zwischen dem genetisch determinierten Acetyliererstatus und dem Auftreten unerwünschter Arzneimittelwirkungen sowie dem erhöhten Risiko, an malignen Tumoren zu erkranken, seit langem ein Zusammenhang bekannt (Evans, 1992). Der Metabolisierungsschritt der N-Acetylierung spielt eine wichtige Rolle in der Biotransformation verschiedener Medikamente, Präkanzerogene und anderer Fremdstoffe mit Arylamin- oder Hydralazinstruktur.
Für bestimmte Karzinome wurde eine Beziehung zwischen Schadstoffexposition und Polymorphismen von Fremdstoff-metabolisierenden Enzymen nachgewiesen.
Xenobiotika zählen zu den wichtigsten Substraten der Arylamin-N-Acetyltransferasen. Erbliche Unterschiede in den Aktivitäten der Fremdstoff-metabolisierenden Arylamin-N-Acetyltransferasen NAT1 und NAT2 können zu unterschiedlichen Aktivierungen und Detoxifizierungen von Arylaminen, die im Zigarettenrauch oder zubereitetem Fleisch enthalten sind, führen und direkt zur Bildung von DNA-Addukten beitragen (Hein et al. 1993).
Dies bedeutet, dass der Polymorphismus der NAT2-Gene die Suszeptibilität gegenüber Effekten z. B. des Zigarettenrauchens beeinflussen kann. Der genetisch determinierte Acetyliererstatus könnte die Pathogenese des Mammakarzinoms prägen.
Vorliegende Studie soll die Assoziation zwischen dem Mammakarzinom und dem Acetyliererstatus prüfen.
Das Mammakarzinom stellt mit etwa 23% aller malignen Erkrankungen den häufigsten Tumor der Frau dar. In der westlichen Welt erkrankt derzeit jede 8. bis 10. Frau an diesem Tumor. Für Frauen in den westlichen Ländern beträgt die kumulative Wahrscheinlichkeit, an Brustkrebs im Verlauf des Lebens zu erkranken, 5 – 12% (Schmoll et al., 1999).
In Deutschland treten jährlich ca. 43.000 Neuerkrankungen des Mammakarzinoms auf. Inzidenzunterschiede sind auffallend: in Nord- und Westeuropa werden 70 bis 110 Erkrankungen pro 100.000, in Süd- und Osteuropa 25 bis 40 Erkrankungen pro 100.000 Frauen beobachtet. Die Mortalität beträgt 15 pro 100.000 Frauen in Südeuropa, und 29 pro 100.000 Frauen in Nordeuropa. (Schmoll et al., 1999).
Epidemiologisch findet sich darüberhinaus weltweit eine erhebliche Variationsbreite der Inzidenzraten. Mammakarzinome werden in Nordamerika und in Nord- und Mitteleuropa etwa fünfmal häufiger beobachtet als in Asien und Südamerika (Schmoll et al., 1999).
Daten des „Surveillance, Epidemiology, and End Results“ (SEER) Programms zeigten auf, dass weisshäutige US-amerikanische Frauen ein Risiko von 13,1% besitzen, eine Brustkrebserkrankung im Laufe Ihres Lebens zu entwickeln, im Unterschied zu amerikanischen Frauen afrikanischer Herkunft, bei denen dieses Risiko 9,6% beträgt. Dabei beträgt das Mortalitätsrisiko gleichermassen 3,4% sowohl für weisse US-amerikanische Frauen als auch für amerikanische Frauen afrikanischer Herkunft (Ries et al. 1999).
Die Inzidenz des Mammakarzinoms hat in den letzten Jahren stetig zugenommen. Wahrscheinlich, wenngleich nicht gesichert, sind Änderungen der Risikoprofile ausschlaggebend. Dies bedeutet einmal eine insgesamt verlängerte Menstruationsdauer mit früherem Beginn der Menarche und späterem Einsetzen der Menopause, zum anderen eine geringere Anzahl und erst zunehmend häufiger im späteren Lebensalter ausgetragene Schwangerschaften. Schliesslich sind veränderte Lebens- und Essgewohnheiten massgeblich (Schmoll et al., 1999).
Bermerkenswert ist, dass die Anzahl von In-situ-Karzinomen, insbesondere der duktalen Karzinome in situ (DCIS) ansteigend ist. Demgegenüber hat die Inzidenz invasiver Mammakarzinome ein Plateau erreicht. Die Daten des „SEER-Programms“ ergaben einen Zuwachs von 130% der In-situ-Karzinome bei weissen US-amerikanischen Frauen und eine Zunahme von 190% bei US-amerikanischen Frauen afrikanischer Herkunft in den Jahren zwischen 1983 und 1996 (Ries et al. 1999).
Man nimmt an, dass im Jahre 1999 bei nahezu 40.000 Frauen in den Vereinigten Staaten In-situ-Karzinome diagnostiziert wurden. Diese Zunahme von In-situ-Karzinomen, insbesondere der DCIS, ist in erster Linie als Ergebnis eines immer häufigeren Gebrauchs des Mammographiescreenings anzusehen (De Vita, 2001).
Der Erkrankungsgipfel des Mammakarzinoms bei der Frau wird zwischen dem 45. und 65. Lebensjahr erreicht.
Bei der Karzinogenese des Mammakarzinoms wird ein multifaktorielles Geschehen angenommen. Zu den ätiologisch bedeutsamen Faktoren werden zunehmendes Alter, familiäre Belastung, die Exposition gegenüber endogenen und exogenen weiblichen Hormonen, diätetische Faktoren, benigne Brusterkrankungen und belastende Faktoren aus der Umgebung gezählt (De Vita, 2001).
Da das Mammakarzinom überwiegend eine Krebserkrankung der Frauen darstellt, wird das weibliche Geschlecht oft nicht als eigenständiger Risikofaktor hervorgehoben. Ebenso wird die Bedeutung des Alters gelegentlich übersehen. Besonders jüngere Frauen überschätzen ihr potentielles Risiko, ein Mammakarzinom entwickeln zu können (Philips et al., 1999).
Nach den Daten des „SEER-Programms“ tritt das Mammakarzinom bei Frauen unter 30 Jahren nur aussergewöhnlich selten auf. Beispielweise betrug die Inzidenz des Mammakarzinoms in der Zeit von 1992 bis 1996 bei der Gruppe von Frauen im Alter zwischen 35 bis 39 Jahren 59 pro 100.000 Frauen im Vergleich zu der Gruppe von Frauen im Alter zwischen 55 bis 59 Jahren, bei der das Mammakarzinom mit einer Inzidenz von 296 pro 100.000 Frauen auftrat. Die jährliche Inzidenz ist zunehmend, wenngleich weniger ausgeprägt, wenn Frauen ein Alter von 60 Jahren und 70 Jahren erreichen (Ries et al., 1999).
Obgleich familiäre Faktoren über eine lange Zeit als ein wichtiger Risikofaktor für die Entwicklung des Mammakarzinoms erachtet wurde, muss gleichwohl festgestellt werden, dass die Mehrheit der Mammakarzinompatientinnen ohne Familienangehörige mit einer Brustkrebserkrankung ist. Lediglich bei 5 bis 10% der an Brustkrebs erkrankten Patientinnen ist eine genetische Prädisposition für ein Mammakarzinom nachweisbar (Claus et al. 1996).
Dies bedeutet, dass viele Frauen mit einer positiven Familienanamnese ihr persönliches Risiko, ein Mammakarzinom zu entwickeln, überschätzen (Lerman et al. 1995). Ebenso überschätzen viele Frauen, die sich einem genetischen Test unterziehen, ihre Möglichkeit, den positiven Nachweis einer Mutation zu haben (Bluman et al. 1999).
Eine positive Familienanamnese stellt einen heterogenen Risikofaktor dar, dessen Bedeutung von der Anzahl der Angehörigen mit Brustkrebs abhängig ist, vom Grad der Verwandtschaft, vom Alter, in dem Angehörige an Brustkrebs erkrankten und schliesslich von der Anzahl der von der Brustkrebserkrankug nicht betroffenen Angehörigen. Dies bedeutet, dass von einer nur als minimal zu bezeichnenden Risikoerhöhung bei denjenigen Frauen auszugehen ist, bei denen unter den Angehörigen z. B. nur die Mutter an einem Mammakarzinom erkrankte, und die Mutter darüberhinaus von dieser Tumorerkrankung erst im fortgeschrittenen Alter betroffen wurde (De Vita, 2001).
Dagegen ist eine Frau mit mehreren an einem prämenopausalen Mammakarzinom erkrankten Verwandten durch die Möglichkeit eines Brustkrebses ungleich stärker gefährdet (Claus et al. 1996).
Eine Strahlenexposition (Atombombenbexplosion in Hiroshima und Nagasaki, medizinische Diagnostik, Strahlentherapie) korreliert eng mit der Inzidenz des Mammakarzinoms (Tokunada et al. 1987; Hildreth et al. 1989). Hierbei besteht ein Strahlen-Dosis-Effekt für die Induktion eines Mammakarzinoms nach einer Latenzzeit von ca. 20 Jahren. Frauen, die wegen Lungentuberkulose häufig durchleuchtet wurden oder wegen maligner Erkrankungen (Thymom, Morbus Hodgkin) eine Strahlentherapie erhielten, entwickelten in der Folgezeit signifikant häufiger Mammakarzinome als nicht strahlenexponierte Frauen (Hancock et al. 1993).
Daneben ist das Alter der Patientinnen zum Zeitpunkt der Exposition ausschlaggebend: Bei Frauen, die im Jahr der Atombombenexplosion in Hiroshima und Nagasaki 10-14 Jahre alt waren, wurde die höchste Inzidenz der Entwicklung eines Mammakar
Generell stellt die Strahlenexposition in früher Adoloszenz ein hohes Karzinomrisiko dar, bei dem ein lineares Dosis-Response-Risiko für die Entwicklung eines konsekutiven Mammakarzinoms unterstellt werden kann (Tokunada et al. 1987).
Desweiteren werden andere Umgebungsfaktoren diskutiert, die im Verdacht stehen, das Brustkrebsrisiko zu erhöhen. Hierzu werden die Exposition gegenüber elektromagnetischen Feldern oder gegenüber organischen Pestiziden gerechnet. Eine abschliessende Bewertung dieser möglichen Risikofaktoren steht derzeit allerdings aus (De Vita, 2001).
Eine mögliche Relation zwischen Brustkrebs und Nahrungsverhalten wurde angesichts der grossen Variabilität der Inzidenzraten des Mammakarzinoms weltweit vermutet.
Studien über Emigranten zeigten, dass diese Unterschiede nicht allein Folge genetischer Faktoren sind (Buell et al. 1973; McMichael et al. 1988). In die USA emigrierte japanische Frauen und in der ersten Generation geborene Frauen von emigrierten japanischen Frauen wiesen etwa die gleiche Inzidenzrate an Mammakarzinomen auf wie weisse US-Amerikanerinnen aus der entsprechenden Region. Diese Inzidenzraten liegen signifikant höher als die japanischer Frauen (Buell et al. 1973).
Nach epidemiologischen Studien besteht in den westlichen Industriegesellschaften derzeit kein Anhalt für eine sichere Assoziation zwischen Brustkrebsrisiko und unterschiedlichem Fettgehalt in der Nahrung Erwachsener. (Philips et al. 1980; Kinlen et al. 1982; Willet et al. 1987; Hunter et al. 1996; Ambrosone et al. 1998; Holmes et al. 1999; De Vita, 2001).
Die protektive Wirkung des jugendlichen Übergewichts wird durch den Hinweis auf die bei diesen Frauen häufiger zu beobachtenden irregulären Ovarialzyklen mit der Folge niedrigerer Östrogenkonzentrationen gedeutet (Hankinson et al. 1994). Das gesteigerte Brustkrebsrisiko durch Gewichtszunahme im späteren Erwachsenenalter wurde durch erhöhte Östrogenspiegel als Folge einer verstärkten Östrogenproduktion im Fettgewebe erklärt (Huang et al. 1997).
Hormonelle Faktoren beeinflussen wahrscheinlich auch den günstigen Einfluss körperlicher Aktivität auf das Brustkrebsrisiko. Körperliche Aktivität bei jungen Frauen reduziert das Brustkrebsrisiko durch eine verspätete Menarche und eine verminderte Zahl von Ovulationszyklen (Thune et al. 1997; Rockhill et al. 1999).
Mehrere Studien lassen einen Zusammenhang zwischen Einnahmemenge von Alkohol und Brustkrebsrisiko vermuten. Nach den Befunden einer Meta-Analyse (Longnecker et al. 1992), die 12 Fall-Kontroll-Studien auswertete, vermag ein moderater Alkoholgenuss das Brustkrebsrisiko zu erhöhen (relatives Risiko zwischen 1,1 bei einem Konsum von 12g Alkohol pro Tag und 1,4 bei einem Konsum von 36 g Alkohol pro Tag).
Zusätzliche Daten aus prospektiven Studien bestätigen ein erhöhtes Risiko durch höhere Alkoholmengen (Garfinkel et al. 1988; Capstur et al. 1992; Friedenreich et al. 1993).
Das Mammakarzinom korreliert eindeutig mit dem Einfluss durch weibliche Hormone. Verschiedene Studien haben die Inzidenz des Mammakarzinoms mit dem Alter der Menarche, der Menopause und dem Zeitpunkt der ersten Schwangerschaft in Verbindung gebracht. Der Altersgipfel des Brustkrebses liegt in der Menopause (De Vita, 2001).
Allgemein wird angenommen, dass die Gesamtheit der Jahre, in denen Frauen durch einen regelmässigen ovariellen Zyklus endogenen Östrogenspiegeln ausgesetzt sind, für die Entstehung eines Mammakarzinoms bedeutsam ist. Danach erhöht eine frühe Menarche, gefolgt von einer späten Menopause, das Karzinomrisiko. Mit jedem Jahr, durch das die Menarche später eintritt, verringert sich die Wahrscheinlichkeit der Entwicklung eines Mammakarzinoms um 20% (Mac Mahon et al. 1973; Kelsey et al. 1993).
Bei postmenopausalen Mammakarzinompatientinnen sind Adipositas(Huang et al. 1997)und eine postmenopausal durchgeführte Hormontherapie (Collaborative Group on Hormonal Factors in Breast Cancer, 1997) mit einem erhöhten Brustkrebsrisiko assoziiert, da Adipositas und eine postmenopausal durchgeführte Hormontherapie positiv mit den Plasma-Östrogen- und Plasma-Östradiolspiegeln korrelieren.
Das Alter zum Zeitpunkt der Menopause spielt eine wichtige Rolle als Risikofaktor für ein Mammakarzinom. Das relative Risiko einer Frau mit einer natürlichen Menopause vor dem 45. Lebensjahr ist halb so gross wie das nach dem 55. Lebensjahr (Trichopoulos et al. 1972).
Die Alters-spezifische Inzidenz des Mammakarzinoms nimmt stufenweise mit dem Alter der Frauen bis zur Menopause zu. Nach der Menopause steigt zwar die Inzidenz weiterhin, jedoch sehr viel langsamer, d.h. nur etwa ein-sechstel so rasch im Verhältnis zur Inzidenzzunahme während der Prämenopoause. Diese auffällige Verlangsamung der Inzidenzzunahme in der Zeit nach der Menopause lässt vermuten, dass die Aktivität der Ovarien von ausschlaggebender Bedeutung für die Ätiologie des Mammakarzinoms ist (De Vita, 2001).
Brustkrebserkrankte Frauen, die sich im Zusammenhang mit einer adjuvanten Therapiemassnahme einer Ovarektomie unterzogen, erlitten weniger häufiger ein Rezidiv durch Befall der kontralateralen Mamma als Mammakarzinompatientinnen, die nicht ovarektomiert wurden (Nissen-Meyer et al. 1991).
Nach den 1999 durch Rebbeck et al. veröffentlichten Daten ist zu vermuten, dass Frauen mit BRCA1-Mutationen von der protektiven Wirkung einer prophylaktischen Ovarektomie grundsätzlich profitieren können.
Schwangerschaft und Alter bei der ersten Geburt stellen weitere Faktoren dar, die das Brustkrebsrisiko beeinflussen: Die Auswirkung einer ausgetragenen Schwangerschaft auf das Brustkrebsrisiko variiert mit dem Alter bei der ersten Geburt. Frauen mit der ersten Geburt in einem Alter über 30 Jahre besitzen ein 2-5-fach erhöhtes Brustkrebsrisiko gegenüber Frauen mit der ersten Geburt in einem Alter von 18 oder 19 Jahren (Mac Mahon et al. 1970; Brinton et al. 1983; Trichopoulos et al.1983).
Kinderlose Frauen besitzen ein um 1,4-fach erhöhtes relatives Risiko für ein Mammakarzinom im Vergleich mit Frauen, die Kinder geboren haben (Mac Mahon et al. 1970).
Diese offensichtlich gegensätzlichen Effekte der Schwangerschaft auf das Risiko eines Mammakarzinoms fanden unterschiedliche Erklärungsversuche Brustkrebses:
Die auf Dauer alterierten Hormonspiegel nach einer ausgetragenen Schwanger-schaft verändern möglicherweise die Proliferationsrate des Brustdrüsengewebes.
Bei einer inkompletten Schwangerschaft ist das Brustdrüsengewebe allein den hohen Östrogenspiegeln der frühen Episode einer Schwangerschaft ausgesetzt. Dies kann für diese Frauen einen erhöhten Risikofaktor für ein Mammakarzinom darstellen (Molgavkar et al. 1989).
Untersuchungen zu Auswirkungen der Laktation auf das Mammakarzinom ergaben unterschiedliche Resultate. Zuletzt erschienene Studien legen die Vermutung nahe, dass eine lange Dauer der Laktation das Brustkrebsrisiko bei prämenopausalen Frauen herabsetzt (Yuan et al. 1988, Newcomb et al. 1994).
Der potentiell protektive Effekt der Laktation auf das Brustkrebsrisiko ist möglicherweise als eine Folge der vollständigen Zelldifferenzierung aufzufassen, die durch hormonelle Veränderungen nach einer ausgetragenen Schwangerschaft eintritt, und die eine maligne Transformation dieser ausdifferenzierten Zellen des Brustdrüsengewebes weit weniger wahrscheinlich macht.
Der spontane oder gewollte Abbruch einer Schwangerschaft scheint nach verschiedenen Untersuchern den protektiven Effekt der Schwangerschaft zu schmälern, das heisst, das Risiko einer Entwicklung eines Brustkrebses zu erhöhen (Pike et al. 1983; Hadjimichael et al. 1986; Howe et al. 1989; Prind et al. 1996).
Andere Studien zeigten dagegen keine Risikoerhöhung durch einen Schwangerschaftsabbruch auf (Rosenberg et al. 1988; Adami et al. 1990; Newcomb et al. 1996). Eine von Melbye et al. 1997 durchgeführte grosse Kohorten-Studie, die 1,5 Mill. dänische Frauen umfasste, ergab ebenfalls keinen Nachweis eines erhöhten Langzeitrisikos für die Entstehung eines Mammakarzinoms bei Frauen, deren Schwangerschaft frühzeitig unterbrochen wurde.
Die Auswirkungen einer Hormonersatztherapie und oral-applizierter Kontrazeptiva auf das Brustkrebsrisiko wurden extensiv untersucht. Insgesamt betrachtet ist es ungewiss, ob das Brustkrebsrisiko bei Frauen, die oral applizierte Kontrazeptiva eingenommen haben, signifikant erhöht ist (Collaborative Group on Hormonal Factors in Breast Cancer, 1997; Hankinson et al. 1997).
Metaanalysen des Effektes einer Hormonersatz-Therapie weisen einen kleinen, statistisch aber signifikanten Zuwachs des relativen Risikos von 1,02 bis 1,35 (Collaborative Group on Hormonal Factors in Breast Cancer, 1997; Steinberg et al. 1985; Sillero-Arenas et al. 1992) nach. Das Risiko nimmt mit der Dauer der Verwendung zu. Diese Befunde stimmen mit Studienergebnissen überein, die zeigen, dass postmenopausale Frauen mit höheren Östrogen-Konzentrationen im Serum einem grösseren Risiko für ein Mammakarzinom ausgesetzt sind als Frauen mit niedrigen Östrogen-Konzentrationen (Hankinson et al. 1998; Cauley et al. 1999).
Das erhöhte Karzinomrisiko besteht nur für die Zeit der aktuellen Östrogensubstitution und sinkt nach Beendigung der Hormonersatztherapie wieder ab. Pro Jahr der Östrogenerstaztbehandlung steigt das Brustkrebsrisiko um 4% und liegt nach 10-jähriger Einnahme bei 46%. Fünf Jahre nach Beendigung der Hormontherapie ist das Mammakarzinomrisiko als nicht mehr erhöht anzusehen (Capstur et al. 1999).
Studien neueren Datums weisen auf einen statistisch signifikanten Zuwachs des Mammakarzinomrisikos bei Frauen hin, die Hormonkombinationspräparate einnehmen (Östrogen- plus Progesteronkomponente) im Unterschied zu Frauen, die für die Hormonersaztherapie nur reine Östrogenpräparate verwenden (Schairer et al. 2000; Ross et al. 2000).
Vermutlich weisen Mammakarzinome, die infolge einer Hormonersatztherapie entstanden sind, eine prognostisch günstigere Tumor-Histologie auf (Salmon et al. 1999; Capstur et al. 1999).
Unter den benignen Brusterkrankungen sind die proliferativen Formen ohne atypische Hyperplasie im Unterschied zu den nicht-proliferativen Formen durch eine gering erhöhte maligne Entartungsrate (relatives Risiko: 1,5 bis 2,0) belastet. Dagegen gehen proliferative Brusterkrankungen mit atypischer Hyperplasie mit einem erhöhten Brustkrebsrisiko einher (relatives Risiko: 4,0 bis 5,0) (Dupont et al. 1985).
Frauen mit Nachweis einer atypischen Hyperplasie und familiärer Mammakarzinombelastung durch Angehörige I° sind einem 11-mal höheren Brustkrebsrisiko ausgesetzt als Frauen mit einer nicht-proliferativen Brustkrebserkrankung. Umgekehrt werden proliferative Brusterkrankungen häufiger bei Frauen mit familiärer Mammakarzinombelastung diagnostiziert. Dagegen wurde beobachtet, dass das Brustkrebsrisiko bei Frauen mit einer proliferativen Brusterkrankung, die nach der Gewebebiopsie der Brust Östrogen-Präparate einnahmen, nicht erhöht ist (Dupont et al. 1999).
Nach Untersuchungen der „Collaborative Group on Hormonal Factors in Breast Cancer“ (1997) können keine übereinstimmenden Ergebnisse zu Subgruppen von Patientinnen mit einer benignen Brusterkrankung gefunden werden.
Eine genetisch fixierte Prädisposition ist bei etwa 5-10% aller Frauen mit Brustkrebs anzunehmen. Wie bei vielen anderen malignen Erkrankungen wurden auch beim Mammakarzinom Dysfunktionen und Mutationen von Onkogenen und Tumorsuppressorgenen gefunden, die an der Entstehung, Entwicklung und/oder Propagation zumindest eines Teils der Mammakarzinome beteiligt sind. Von den Onkogenen sind inbezug auf das Mammakarzinom Amplifikationen des HER-2/ neu (Synomyme: c-erbB-2, p185) und des Epidermal-Groth-Factor-Rezeptor (EGFR; Synonym: erbB-1) -Gens und von den Tumorsuppressorgenen Mutationen von p53, BRCA-1, BRCA-2, AT (Ataxia teleangiektasia) und pTEN/ MMAC1 relevant (Schmoll et al. 1999).
Liegen Mutationen des BRCA-1- oder des BRCA-2-Gens vor, besitzen die Trägerinnen dieser Mutationen ein 56%-iges Risiko für die Entwicklung eines Mammakarzinoms innerhalb von 75 Jahren (Healey u. Couch, 1997). Früher veröffentlichte Daten, durch die das Risiko auf 85% geschätzt wurde, lassen sich durch die Tatsache erklären, dass nur Hochrisikofamilien berücksichtigt wurden. Bei über der Hälfte der Trägerinnen von mutierten BRCA-Genen wird das Mammakarzinom vor dem 50. Lebensjahr klinisch manifest. Gleichzeitig besteht für diese Patientinnen ein erhöhte Risiko, an einem Ovarial- oder Kolonkarzinom zu erkranken (Schmoll et al., 1999).
Pathogenetische Relevanz besitzen ebenso Amplifikationen des c-myc-Protoonkogens sowie ein Heterozygotitätsverlust von Genen auf dem kurzen Arm von Chromosom 3 in der Region 3p21-p25.
Die klinische Relevanz genetisch fixierter Risikofaktoren manifestiert sich augenfällig in sog. „Tumorfamilien“, in denen mehrere Verwandte ersten Grades über mehrere Generationen an Brustkrebs erkranken. Die Karzinome treten gehäuft bei jungen Frauen und gehäuft doppelseitig auf (Schmoll et al.,1999).
Zigarettenrauchen ist eine wichtige Quelle exogen induzierter Karzinogene. Der NAT2-Polymorphismus könnte die individuelle Suszeptibilität für das Mammakarzinom bei Frauen, die rauchen, erhöhen, da aromatische Amine, die ein wesentliches Substrat der NAT2 darstellen, im Zigarettenrauch enthalten sind. Arylamine werden durch die polymorphe NAT2 acetyliert. Nach weiterer Biotransformation entstehen Azetoxyester, die in reaktive Arylnitreniumionen zerfallen. Arylnitreniumionen können mit DNA-Molekülen interagieren und Addukte bilden. Zigarettenrauchen stellt für Aktiv- und Passivraucher grundsätzlich ein Krebsrisiko dar.
Die meisten epidemiologischen Studien haben bislang keine eindeutige Assoziation zwischen Zigarettenrauchen und Brustkrebsrisiko gefunden (Doll et al.1980; Baron et al.1986; Adami et al.1988; Hiatt et al. 1988; London et al. 1989; Schechter et al. 1989; Schatzkin et al. 1989; Ewartz et al. 1990; Vatten et al. 1990; Field et al. 1992).
Einige Studien berichten von einem erhöhten Risiko (Brinton et al. 1986; Hiatt et al. 1986; Stockwell et al. 1987; Brownson et al. 1988; Meara et al. 1989; Rohan et al. 1989; Chu et al.1990; Palmer et al. 1991; Morabia et al. 1996), andere von einem herabgesetzten Risiko (Salber et al. 1969; Vessey et al. 1983; O´Connel et al. 1987).
In diesen Studien war die genetische Variabilität als Faktor der Suszeptibilität für die im Zigarettenrauch enthaltenen Karzinogene jedoch nicht berücksichtigt worden. Inwieweit vererbliche Polymorphismen des Acetyliererstatus (NAT2-Genotyp) die Suszeptibilität für die Entwicklung eines Mammakarzinoms modulieren können, wird derzeit unterschiedlich diskutiert (Ambrosone et al. 1996; Hunter et al. 1997; Millikan et al. 1998).
Die Acetylierung stellt einen wichtigen Metabolisierungsschritt des menschlichen Organismus für Fremdstoffe mit Arylamin- und Hydralazinstruktur dar (Grant et al. 1992).
Grundsätzlich lassen sich die molekularen Mechanismen der Biotransformation endogener Substrate und exogener Substrate (Xenobiotika) in Phase-I- und in Phase-II-Reaktionen einteilen.
Die Phase-I-Reaktionen schliessen alle Reaktionen ein, durch die das unpolare (nicht-ionische) Substrat zu einem polaren Metaboliten durch Oxidation, Reduktion, Hydrolyse oder Isomerisierung überführt wird. Das wichtigste Enzymsystem der ersten oxidativen und reduktiven Phase der Biotransformation stellt das Cytochrom-P-450-abhängige Monooxigenase-System dar.
Die Phase-II-Reaktionen umfassen sämtliche Reaktionen, in welchen die entstandenen Metabolite durch Glukuronidierung, Glykosilierung, Sulfatierung, Methylierung, Acetylierung oder Konjugationen mit Aminosäuren, Gluthation und Fettsäuren in hochpolare Konjugate transformiert werden, die renal oder biliär ausgeschieden werden können (Greiling, Gressner; 1995).
Neben der Gluthation-S-Transferase und der UDP-Glukuronyl-Transferase stellt die Arylamin-N-Acetyltransferase (NAT) ein wichtiges Enzymsystem der Phase-II-Reaktionen dar. Die biochemische Funktion der NAT besteht darin, eine Konjugatbildung mit einem Essigsäurerest zu ermöglichen, der durch das Acetyl-Coenzym-A übertragen wird.
Die Acetylierung kann entweder zur Entgiftung oder zur Toxifikation von Substanzen führen. Präkarzinogene, die im Zigarettenrauch enthalten sind oder im zubereiteten Fleisch entstehen, können durch O-Acetylierung zu ultimativen Karzinogenen umgewandelt werden.
Die Acetylierungsreaktion wird von zwei Enzymen, NAT1 und NAT2, katalysiert. Beide Enzyme unterscheiden sich in ihrer Gewebespezifität und in ihrer Substratspezifität. Die NAT1 kommt ubiquitär in vielen Geweben vor, die NAT2 wird vorwiegend in der Leber und im Colon nachgewiesen (Grant et al. 1990; Hein et al. 1993).
Die NAT2 zeigt eine stärkere Affinität zu Verbindungen wie Koffein, Sulfamethazin, Procainamid, Dihydralazin, Isoniazid, Nitrazepam und anderen als Arzneimitteln eingesetzten Substanzen (Evans, 1992).Auch die im Zigarettenrauch enthaltenen Arylamine werden von der NAT2 metabolisiert.
Seit längerem ist ein erblicher Polymorphismus bekannt, der für die Ausbildung unterschiedlicher Akivitäten des Enzyms verantwortlich ist. Dieser Umstand erklärt das grosse Interesse an der NAT2. Man unterscheidet phänotypisch schnelle und langsame Acetylierer.
1990 wiesen Blum et al. das Vorhandensein dreier NAT-Gene nach: das NAT1-Gen, das die damals so bezeichnete monomorphe N-Acetyltransferase kodiert, das NAT2-Gen, das für die polymorphe N-Acetyltransferase kodiert, und das Pseudogen NATP, das kein funktionierendes Protein kodiert.
Die Länge der proteinkodierenden Abschnitte auf dem NAT1- und NAT2-Gen beträgt jeweils 870 Basenpaare. Die Nukleotidsequenz beider Gene stimmt zu 87% überein. Beide Gene befinden sich auf dem kurzen Arm des Chromosoms 8 in der Region 8p21.3-23.1 (Hickman et al.1994).
Über interindividuelle Unterschiede hinaus fanden sich dabei auch interethnische Differenzen: 59% der kaukasischen (Cascorbi et al. 1995) und 75% der afrikanischen Bevölkerung (Delomenie et al. 1996) sind Langsam-Acetylierer. Dagegen sind unter den Asiaten die schnellen Acetylierer mit ca. 90% stark überrepräsentiert (Evans, 1993).
Die Ausprägung des langsamen Acetylierertyps ist das Ergebnis einer oder mehrerer Punktmutationen im NAT2-Gen und der daraus resultierenden Bildung eines instabilen oder weniger aktiven Enzyms (Blum et al. 1991; Hein et al. 1994).
Bislang wurden mehr als sieben verschiedene Nukleotidtransitionen am NAT2-Genort nachgewiesen. Fünf dieser Mutationen verursachen Aminosäureveränderungen, zwei sind stumme Mutationen, die keinen Einfluss auf die Aminosäuresequenz haben (Tabelle 1).
Auch hier ergaben sich interethnische Unterschiede: Während die Mutation an Position 191 von Bell et al. (1993) bei Afrikanern gefunden wurde, scheint sie in der kaukasischen Bevölkerung nur selten vorzukommen (Cascorbi et al. 1995).
Darüberhinaus zeigte sich, dass das gemeinschaftliche Auftreten von Basensubstitutionen gewissen Regeln unterliegen muss. Eine Transition an Position 341 und 803 ist in 98% der Fälle mit einer Mutation an Position 481 assoziiert. Eine Veränderung an Posi
Durch das charakteristische Auftreten dieser Nukleotidtransitionen sind unterschiedliche Haplotypen am NAT2-Genlocus identifiziert worden (Tab. 2).
Nach der Nomenklatur von Vatsis et al (1995) werden heute die sechs wichtigsten in der kaukasischen Bevölkerung nachgewiesenen Haplotypen mit NAT2*4, *5A, *5B, *5C, *6A, und *7B bezeichnet (Cascorbi et al. 1999). Gegenwärtig sind mindestens 27 Haplotypen bekannt. Zusätzlich wurden die vor allem bei Afrikanern auftretenden Haplotypen NAT2*14A und *14B beschrieben. Beide Haplotypen beinhalten Mutationen an Position 191. Weitere Haplotypen wurden inzwischen beschrieben, sind aber nicht in der Konsensus-Publikation von Vatsis et al. (1995) enthalten (Agundez et al. 1996; Martinez et al. 1995). Alle Haplotypen folgen einem autosomal kodominanten Erbgang nach Mendelschen Gesetzen mit zwei Allelen an einem Genort.
Neuere Mutationen, die im NAT-Gen gefunden wurden, sind in nachstehender Tabelle erwähnt. Diese Tabelle enthält eine Liste derzeit bekannter NAT2-Haplotypen, die im Jahre 2000 als ein „Update“ im Rahmen einer Konsensuserklärung durch das für die Nomenklatur und Registrierung der Arylamin-N-Acetyltransferasen zuständige Komitee (Hein DW, Grant DM, Sim E, 2000) erstellt wurde. Nachfolgende Tabelle enthält darüber hinaus Angaben zum vorhersagbaren Phänotyp im Sinne der funktionalen Charak
Eine Ausnahme bildet dabei das von Lin et al. (1993) identifizierte Allel NAT2*12A. Es weist nur eine Nukleotidtransition an Position 803 auf und führt als einziges mutiertes Allel zum schnellen Acetylierertyp (Cascorbi et al.1996).
Die in der kaukasischen Bevölkerung am weitesten verbreiteten Haplotypen sind NAT2*5B, *6A und *7B. In mindestens 95% der Fälle ist diese Gruppe von Haplotypen für einen langsamen Acetyliererstatus verantwortlich.
Der Metabolisierungsschritt der N-Acetylierung spielt eine wichtige Rolle in der Biotransformation verschiedener Medikamente, Präkanzerogene und anderer Fremdstoffe mit Arylamin- oder Hydralazinstruktur. Zwischen dem genetisch determinierten Acetyliererstatus und dem Auftreten unerwünschter Arzneimittelwirkungen sowie dem erhöhten Risiko, an malignen Tumoren zu erkranken, ist seit langem ein Zusammenhang bekannt (Evans, 1992).
Verschiedene Studien unterstreichen die richtungsweisende Bedeutung dieser Hypothese:
Untersuchungen zeigen, dass der Polymorphismus des NAT2-Genotyps nicht als unabhängiger Risikofaktor für das Mammakarzinom anzusehen ist, dass der NAT-Status jedoch möglicherweise einen modulierenden Einfluss auf den Metabolismus von Xenobiotika, insbesondere der aromatischen Amine, ausübt und somit die individuelle Suszeptibilität von Frauen gegenüber den Inhaltsstoffen im Zigarettenrauch beeinflussen kann (Ambrosone et al. 1996; Hunter et al. 1997; Millikan et al. 1998).
Es ist bekannt, dass Schnell-Acetylierer eine Prädisposition für die Entwicklung eines Kolonkarzinoms besitzen (Ilett et al.1994; Roberts-Thomson et al. 1996; Gil und Lechner, 1998).
Bezüglich des Larynxkarzinom liegen nach jüngsten genotypischen Untersuchungen Hinweise darauf vor, dass die homozygot schnellen Acetylierergenotypen signifikant überrepräsentiert sind. Die Ergebnisse früherer Untersuchungen des Acetyliererphänotyps von 128 polnischen Fällen mit einem Larynxkarzinom (Drodz et al. 1987), die eine signifikante Überrepräsentierung der Langsam-Acetylierer ergab, konnten damit nicht bestätigt werden. Bereits 1992 fanden Roots et al. Schnell-Acetylierer bei einem kleinen Kollektiv mit Larynxkarzinom (n=70) leicht in der Überzahl.
Henning et al. (1999) wiesen den Träger des homozygot schnellen Acetylierergenotypen als Risikofaktor für das Larynxkarzinom nach. Diese Studie zeigte, dass Träger der Allele NAT2*4/*4 und NAT2*4/ *12A eine erhöhte Suszeptibilität besitzen, an einem Larynxkarzinom zu erkranken (OR=2,18, P=0,016).
Inbezug auf das Harnblasenkarzinom besitzen Langsam-Acetylierer ein erhöhtes Risiko (Evans et al. 1993; Risch et al. 1995). Inwieweit durch einen unterschiedlichen NAT2-Status das mit dem Zigarettenrauchen assoziierte Risiko variiert, wird in klinischen Studien unterschiedlich gewertet.
Desweiteren wurde gezeigt, dass der Langsam-Acetyliererphänotyp unter den Fällen mit einem Harnblasenkarzinom überrepräsentiert ist besonders in Verbindung mit Nikotinabusus und beruflicher Exposition gegenüber Arylaminen (Lower et al. 1979; Mommsen et al. 1985; Roots et al. 1992; Brockmöller et al. 1996; Schöps et al. 1997).
Die Möglichkeit der Genotypisierung besteht nach Aufklärung der DNA-Sequenz der NAT2 (Blum et al.1990; Deguchi et al.1990; Vatsis et al. 1991; Bell et al. 1993). Hierdurch konnte in der Folge aufgewiesen werden, dass auf der Basis des bekannten Genotyps der Phänotyp mit einer 95%-igen Wahrscheinlichkeit vorhergesagt werden kann (Hickman and Sim, 1991; Cascorbi et al.1995; Mrozikiewicz et al.1996).
In mehreren Studien wurde die Verteilung der NAT2-Genotypen bei Bronchialkarzinompatienten untersucht:
Roots et al. (1988) fanden eine leichte, jedoch statistisch nicht signifikante Überrepräsentierung der phänotypischen Schnell-Acetylierer bei 220 Fällen mit einem Bronchialkarzinom. Cascorbi et al. (1996) charakterisierten das NAT2-Gen von 155 Patienten mit einem Bronchialkarzinom. In dieser Gruppe, die sowohl die homozygot wie auch
Die isolierte Betrachtung zeigte aber, dass die homozygoten Träger des Wildtypallels (NAT2*4) mit 11,4% deutlich stärker vertreten war. Die zuvor beobachtete relativ geringfügige Überrepräsentierung schneller Acetylierer konnte somit als Ausdruck einer Überrepräsentation der kleinen Untergruppe homozgoter Wildtypträger gewertet werden. Homozygote Träger des schnellen Wildtypallels zeigten weiterhin eine signifikant höhere Acetylierungsgeschwindigkeit als die heterozygoten.
Dieser Befund ist insofern von grosser Bedeutung, als er die Möglichkeit aufweist, dass durch eine Umgewichtung von Enzymaktivitäten eine Umwandlung von Stoffen zu ultimativen Karzinogenen erfolgen kann. Daneben gelten offensichtlich für unterschiedliche Gewebe jeweils differenzierte Prozesse der Toxifizierung.
Dagegen ergab die Studie von Martinez et al. (1995), dass Patienten vom langsamen Acetylierergenotyp, die homozygot für die Allelvarianten 341C + 481T + 803T waren, ein erhöhtes Risiko für ein Bronchialkarzinom besitzen.
Bouchardy et al. (1998) fanden keine signifikante Korrelation zwischen dem NAT2-Genotyp und dem Bronchialkarzinom (n=150).
Ziel der Untersuchung ist es nachzuweisen, ob der Acetyliererstatus mit dem Risiko der Entstehung eines Mammakarzinoms signifikant assoziiert ist.
Es soll der Nachweis erbracht werden, ob der Polymorphismus des NAT2-Genotyps einen eigenständigen Risikofaktor in der Ätiopathogenese des Mammakarzinoms darstellt oder nicht.
Dies soll die Frage nach einer möglichen Überrepräsentierung des Langsam- oder Schnell-Acetylierers bei Mammakarzinompatientinnen beantworten.
Zum anderen soll überprüft werden, ob der NAT2-Genotyp das Tumorrisiko bei Frauen mit bekannten Risikofaktoren (Alter, Menopausenstatus, Dauer der Menstruation) erhöht. Desweiteren soll die Assoziation zwischen NAT2-Genotyp und Nikotinabusus untersucht werden sowie die Assoziation mit Blutgruppenmerkmalen.
Schliesslich soll überprüft werden, ob der NAT2-Genotyp mit bestimmten Merkmalen des Mammakarzinoms (Hormonrezeptorstatus, Grading, TNM-Stadium, Histologie) korreliert ist, d.h. es soll untersucht werden, ob ein bestimmter NAT2-Genotyp (langsamer oder schneller Acetylierer) modulierenden Einfluss auf die besondere Ausprägung bestimmter Tumormerkmale besitzt.
Im Rahmen einer prospektiven Fall-Kontroll-Studie soll das Kollektiv der Mammakarzinom-Patientinnen inbezug auf die Häufigkeit hereditärer Polymorphismen an den Genorten der NAT2 mit einer altersgematchten Kontrollgruppe verglichen werden.
In die Studie wurden 248 Patientinnen mit Mammakarzinom eingeschlossen, die in der Zeit von 1996 bis 1997 aus den Bavaria-Kliniken Kreischa (Sachsen) und Schaufling (Bayern) rekrutiert wurden.
Es galten folgende Ein- und Ausschlusskriterien:
Patientinnen mit gesichertem Mammakarzinom
Alter über 18 Jahre
Deutschstämmigkeit, infolge bekannter interethnischer Unterschiede im Fremdstoffmetabolismus gefordert. Die Daten zur Herkunft der Patientinnen wurden durch Befragung und durch Bekanntheit des Geburtsnamens ermittelt.
Bei jeder Patientin wurde mit einem standardisierten Vordruck eine gezielte Anamnese erhoben, in der folgende Daten erfasst wurden:
Alter, Gewicht, Grösse, Beruf, Schadstoffexposition, Raucherstatus, Tumordaten mit Angabe von: Diagnose, Lokalisation des Tumors, histologischem Befund, histopathologischem Staging, Art der Tumoroperation, Hormonrezeptorstatus, Tumorgrading.
Familiäre Belastungen mit Angabe von: Mammakarzinom bei I°-Angehörigen, bilateralem prämenopausalen Mammakarzinom bei der Mutter der Patientin.
Daten zur Menstruation mit Angabe von: Beginn der Menarche und Beginn der Meno-pause.
Daten zu schweren Begleiterkrankungen wie z. B.: schwere Herz-, Leber-, Nierenerkrankungen.
Daten zur Blutgruppe mit Angabe von: ABO-System und Rhesus-Faktor.
Für das Staging wurde die postoperative histopathologische TNM-Klassifikation (pTNM) der WHO benützt.
T-Kategorien
N-Kategorien
M-Kategorien
PM: Fernmetastasen; pM0: keine Fernmetastasen; pM1: Fernmetastasen vorhanden;
MX: Das Vorliegen von Metastasen nicht beurteilt
•Raucherstatus:
Der Zigarettenkonsum wurde in Packungsjahren (PJ) angegeben (1PJ = täglicher Konsum von 20 Zigaretten über ein Jahr). Als Nichtraucher wurden Personen definiert, die noch nie geraucht hatten. Leichte Raucher wiesen 1-20 PJ in der Anamnese auf, mittlere Raucher 21-50 PJ und starke Raucher über 50 PJ.
In das Kontrollkollektiv wurden 248 deutschstämmige Patientinnen aufgenommen, bei denen nach anamnestischen und klinischen Kriterien keine Anzeichen für ein Malignom bestanden. Das Kontrollkollektiv umfasste 88 Patientinnen mit internistischen Erkrankungen, 64 Patientinnen mit orthopädischen, 40 Patientinnen mit urologischen, 29 Patientinnen mit neurologischen Erkrankungen und 27 freiwillige gesunde Probandinnen.
Bei jeder Kontrollperson wurde ebenfalls nach einem standardisierten Vordruck eine gezielte Anamnese im Hinblick auf die Erfassung folgender Daten durchgeführt:
Alter, Gewicht, Grösse, Beruf, Schadstoffexposition, Raucherstatus, Daten zur Menstruation mit Angabe von: Beginn der Menarche und Beginn der Menopause. Daten zu schweren Begleiterkrankungen wie z. B.: schwere Herz-, Leber-, Nierenerkrankungen. Daten zur Blutgruppe mit Angabe von: ABO-System und Rhesus-Faktor.
Reagentien
Taq-DNA-Polymerase (Perkin Elmer, Weiterstadt)
2-Desoxynukleotide: dGTP, dTTP, dATP, dCTP (Boehringer Mannheim, Mannheim)
Proteinase K (Boehringer Mannheim, Mannheim)
Oligonukleotid-Primer (TIB Molbiol, Berlin)
Restriktionsendonukleasen Alul, BamHl, Ddel, Fokl, Kpnl, Mspl, Taql (New England Biolabs, Schwalbach)
100 bp DNA-Längenleiter (Gibco BRL, Eggenheim)
DNA-Grössenstandard V, VI (Boehringer Mannheim, Mannheim)
Agarose UltraPURE (Gibco BRL, Eggenheim)
Agarose, Nusieve (Biozym Diagnostk, Hessisch Oldendorf)
1.) Lösungen zur Leukozytenisolierung
Erythrozytenlysepuffer (155 mM NH4Cl; 10mM KHCO3; 0,1 mM EDTA)
TEN-Puffer (20 mM Tris; 2,5 mM EDTA; 30 mM NaCl; pH 7,5)
2.) Lösungen zur DNA-Präparation:
Natriumazetat (3 moll CH3COONa, pH 5,5)
Salpetersäure (1N)
Chloroform (Lichrosolv, Merck Darmstadt)
Phenol-Wasser-Chloroformlösung (Perkin Elmer 400765)
2 mal Lysis-Buffer (Perkin Elmer 400766)
Ethanol (80% Ethanol; 20% 5mmol/l CDTA-Wasser)
2-Propanolol (Licrosolv, Merck Darmstadt)
Tris/EDTA (100mmol/l Tris/HCl; 10mmol/l EDTA; pH 8,0)
3.) Lösungen für die Elektrophorese:
TBE-Puffer (90mM Tris; 90mM Borsäure; 2,5mM EDTA; pH 8,0
Orange-G-Lösung (Ficoll 20&%; 10mM Tris; 1mg/ml Orange-G; pH 7,5)
Gene Amp 9600 (Perkin Elmer) Weiterstadt
DNA-Extraktor ABI 341 (Perkin Elmer, Weiterstadt)
Elektrophoresekammer (BioRad, München)
Elektrophoresekammer (Pharmacia, Freiburg)
Zentrifuge 5415C (Eppendorf, Hamburg)
Digitale Bildverabeitung Eagle Eye II (Stratagene, Heidelberg)
Von jedem Patienten wurden 5 bis 10 ml venösen Blutes gewonnen. Die Koagulation wurde mit EDTA verhindert. Die DNA wurde aus Leukozyten nach Proteinase-K-Verdau mittels einer manuellen 3-Schritt Phenol/Chloroform-Extraktion (Sambrook et al. 1989) bzw. unter Verwendung eines halbautomatischen DNA-Extraktors (341A Applied Biosystems) gewonnen.
Hierzu wurde zunächst das Vollblut mit dem 3-fachen Volumen eines hypoosmolaren Puffers
versetzt und 30 min. bei 4°C inkubiert. Hierdurch platzten die Erythrozyten. Die Leukozyten konnten durch Zentrifugation bei 1.200 rpm pelletiert werden. Die Leukozyten wurden in 2 ml TEN-Puffer
resuspendiert, in zwei Gefässe aliquotiert und bei -20°C bis zur DNA-Extraktion aufbewahrt.
Den beiden Extraktionsverfahren, dem manuellen wie dem automatischen, liegt der Aufschluss der Leukozyten mittels Proteinase K und Natriumdodecylsulfat (SDS) zugrunde.
Beim manuellen Verfahren wurden die Leukozyten in 10ml TEN-Puffer resuspendiert, mit 100 µl 10 mg/ml Proteinase K (Roche Mannheim) und 0,5 ml 200g/l Natrium-Dodecylsulfat (SDS) versetzt und anschliessend bei 37° über Nacht inkubiert. Protein
Gleichzeitig wurden hierdurch lipidhaltige Bestandteile abgetrennt. Die wässrige Phase wurde erneut einer Chloroform-Extraktion unterworfen und zentrifugiert. Die in eine frisches Gefäss überführte wässrige Phase wurde mit dem 2,5-fachen Volumen an 100% Ethanol versetzt und gleichzeitig 0,1 Volumen 2mol/l Natrium-Azetat pH 5,8 addiert.
Hierdurch präzipitierte die DNA und konnte entweder abzentrifugiert werden oder direkt mittels eines Glashakens aufgenommen werden. Die DNA wurde kurz in 70% Ethanol gewaschen, anschliessend getrocknet. Das Pellet wurde in 10 mmol/l Tris, 1 mmol/l EDTA-Puffer (pH 8,0) resuspendiert und bis zur weiteren Analyse bei 4°C aufbewahrt.
Die kodierende Sequenz des NAT2-Gens wurde mit Oligonukleotid-Primern P100 und P56 eingegrenzt und ein 1.211-bp-Fragment mit PCR amplifiziert. Hierzu wurden 0,5-1µl DNA-Lösung (50-100 ng DNA) zum 50 µl Reaktionsansatz hinzugegeben.
2 min. initiale Denaturierung bei 94°C; 35 Zyklen 0,5 min. Denaturierung bei 94°C; 1,5 min. Annealing und Elongation bei 67°C; gefolgt von 7 min. terminaler Elongation bei 72°C. Anschliessend wurden die Proben auf 4°C heruntergekühlt.
Der Erfolg der PCR wurde mit Hilfe einer Agarol-Gelelektrophorese überprüft. Hierzu wurden 7 ml PCR-Produkt mit 5µl Blue-Marker (Life Technologies) versetzt und auf einem 1,2% Agarose-Gel (Biozym) bei 120 V für 20 min. aufgetrennt.
Als Elektrophoresepuffer diente ein üblicher TBE-Puffer:
Aus dem 1.211-bp-Fragment konnten direkt die Positionen 481 und 857 nt auf die Mutationen C/T bzw. A/G mit den Restriktionsenzymen Kpnl und BamHI geprüft werden. Die Mutationen führten jeweils zum Verlust der Schnittstelle der Endonuklease.
Kpnl-Verdau zur Bestimmung der C481T-Transition
Inkubation über Nacht bei 37°C.
BamHl-Verdau zur Bestimmung der A857G-Transition
Inkubation über Nacht bei 37°C.
12,5 µl des Reaktionsprodukts wurden mit 10 µl Bluemarker versetzt und auf ein 2%-Agarose-Gel (Biozym) aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgte für 40 min. bei 80 V. Als Grössenstandard wurden 5 µl DNA-Marker V (Boehringer Mannheim) parallel aufgetrennt. Das Fragment-Muster wurde mit einem EagleEye Still-Videosystem (Stratagene) dokumentiert (Abb. 5).
Zur besseren Detektierung der weiteren Mutation wurden von dem bestehenden 1.211-bp-Template eine sogenannte seminested PCR durchgeführt. Auf diese Weise konnte z. B. die randständig sitzende G191A-Mutation besser sichtbar gemacht werden und die Zahl konstitutiver Schnittstellen der Restriktionsenzyme Ddel und Taql gesenkt werden.
Der entscheidende Vorteil war jedoch die Möglichkeit, mit einem Restriktionsverdau die T341C-Transition nachzuweisen, indem in den 3´-Primer eine mismatch-Base und so eine Ddel-Schnittstelle in Abhängigkeit von der Mutation eingefügt wurde.
Diese Designed-Primer-Technik hat den Vorteil, bei Nicht-Vorliegen einer Restriktionsstelle auf Allel-spezifische Verfahren zu verzichten, die das Risiko falsch-positiver oder falsch-negativer Ergebnisse in sich bergen. Hierzu wurde ein 442-bp-Fragment, welches die Mutationen 191, 282 und 341 nt enthielt, mit den Primern P100 und P341N
PCR-Bedingungen: 2 min. 94°C; 14 Zyklen (0,5 min. 94°C, 1,5 min. 67°C); 7 min. 72°C.
Mspl-Verdau zur Bestimmung der G191A-Transition
Inkubation über Nacht bei 37°C.
Fokl-Verdau zur Bestimmung der C282T-Transition
Inkubation über Nacht bei 37°C.
Inkubation über Nacht bei 37°C.
Zur Determinierung möglicher Mutationen an den Positionen 590 nt und 803 nt wurde ähnlich vorgegangen. Nach Amplifikation eines 421-bp-Fragmentes wurde dieses zwei verschiedenen Restriktionsverfahren unterworfen. Es wurden wieder 1µl des 1:10 verdünnten initialen 1.211-bp-Templates eingesetzt.
PCR-Bedingungen: 2min.94°C; 14 Zyklen (0,5 min. 94°C, 1,0min. 60°C, 1min.
72°C); 7min. 72°C.
Taqål-Verdau zur Bestimmung der G590A-Transition
Inkubation 3-4 Stunden bei 65°C.
Inkubation über Nacht bei 37°C.
Als Schätzgrösse für das relative Risiko wurde die Odds ratio (beobachtete Häufigkeit/erwarteter Häufigkeit) gewählt. Die Berechnung der Odds ratio und des 95%-Vertrauensbereichs erfolgte mit der Methode nach Thomas und Gard (1977).
Als Signifikanzniveau galt P = 0,05. Es waren mindestens 200 Patienten für diese Fall-Kontroll-Studie notwendig, um bei einem Fehler erster Art von 0,05 und einem Fehler zweiter Art von 0,2 eine als klinisch relevant geltende Odds ratio von 1,75 zu erfassen zu können.
Die erwarteten Genfrequenzen innerhalb der Kontrollgruppe wurden nach den auftretenden Allelhäufigkeiten mit dem Hardy-Weinberg-Gesetz (p2+2pq+q2=1) ermittelt. Unterschiede in der Präsenz der Gene und Allele wurden mit dem exakten Fisher-Test geprüft und als Odds ratio mit den 95%-Konfidenzintervallen sowie dem Fehler erster Ordnung angegeben.
Die logistische Regressionsanalyse berücksichtigte das Alter, BMI und Anzahl der Packungsjahre als kontinuierliche Variable, den Acetyliererstatus als kategoriale Variable. Die Kalkulation erfolgte mittels SPSS 9,0.
Die Patienten wurden über die Zielsetzung der Studie informiert; sie gaben danach ihr Einverständnis in schriftlicher Form. Die Patientendaten wurden in anonymisierter Form (fortlaufende Nummer, Initialen und ID-Nr.) erhoben und gespeichert. Die DNA wurde ausschliesslich für diagnostische Zwecke verwendet und in Probengefässen mit fortlaufender Nummerierung ohne weitere Kennzeichnung verwahrt. Die vorliegende Studie wurde von der Ethikkommission der Landesärztekammer Sachsen mit einem positiven Votum bedacht.
Es wurde die Häufigkeit der in der kaukasischen Bevölkerung hauptsächlich vorkommenden Haplotypen NAT2*4, *5A, *5B, *5C, *6A, *7B und der seltenen Haplotypen NAT2*12A und *14B in beiden Patientenkollektiven bestimmt (s. Tabelle 8).
Die Untersuchung zeigte, dass das Wildtypallel NAT2*4 im Kollektiv der Mammakarzinompatientinnen etwas häufiger als im Kontrollkollektiv auftrat. Dies gilt ebenso für das NAT2*6A-Allel. Die meisten übrigen Haplotypen (NAT2*5A, *5B, *5C) traten geringfügig seltener in der Gruppe der Mammakarzinome auf.
Die NAT2*12A-, NAT2*7B- und die NAT2*14B-Allele waren etwa gleich verteilt.
Statistisch signifikante Unterschiede in der Häufigkeitsverteilung der NAT2-Haplotypen konnten zwischen den untersuchten Kollektiven jedoch nicht festgestellt werden.
Die Verteilung der Genotypen im Kontrollkollektiv entsprach der erwarteten, nach dem Hardy-Weinberg-Gesetz berechneten Häufigkeitsverteilung. Somit stellte die Kontrollgruppe eine repräsentative Stichprobe dar.
Die homozygot schnellen Acetylierergenotypen NAT2*4/*4 und *4/*12A waren in der Gruppe der Mammakarzinom-Patientinnen nicht überrepräsentiert. Deshalb wird bei der Fall- und Kontroll-Gruppe im folgenden alleine zwischen Schnell- und Langsam-Acetylierern unterschieden.
In der Gruppe der Mammakarzinom-Patientinnen waren 55,6% der Fälle und in der Gruppe der Kontrollen 58,5% der Fälle genotypische Langsam-Acetylierertypen.
Die schnellen Acetylierer, die entweder homozygot oder heterozygot für das unmutierte Wildtypallel NAT2*4 sowie für die NAT2*12A sind, waren in 44,4% der Fälle mit Mammakarzinom und in 41,1% der Kontrollen nachweisbar.
Die Verteilung der Schnell- und der Langsam-Acetylierern erwies sich in beiden Gruppen als etwa gleich. Schnell-Acetylierer fanden sich etwas häufiger; dies erreichte aber keine statistische Signifikanz.
Die Stratifizierung nach Untergruppen ergab, dass schnelle Acetylierer nur in der Gruppe der jüngeren Patientinnen mit Mammakarzinom überrepräsentiert waren. Innerhalb der Kontrollgruppe variierte die Häufigkeit.
Im Hinblick auf den Parameter Alter wurde die Häufigkeit der schnellen Acetylierertypen in der Gruppe der Mammakarzinome und in der Gruppe der Kontrollen verglichen.
Das durchschnittliche Alter der Patientinnen mit Mammakarzinom betrug 58 Jahre. Beim Vergleich der Mammakarzinomgruppe mit den Kontrollen wurde weder bei den Patientinnen über 58 Jahre noch bei den Patientinnen unter 58 Jahre ein signifikanter Unterschied inbezug auf den Status des schnellen Acetylierer beobachtet.
247 Mammakarzinom-Patientinnen wurden detailliert zu ihren Rauchgewohnheiten (Art und Menge) gefragt.
72,9 % (180/247) der Patientinnen mit Mammakarzinom waren Nichtraucherinnen. 27,1%der Mammakarzinom-Patientinnen wiesen eine positive Raucheranamnese auf.
Die überwiegende Mehrzahl der Raucherinnen (n=57; 85,1%) war der Gruppe der leichten Raucher (1-20 PJ) zuzuordnen, ein kleiner Teil (n=7; 10,4%) der Gruppe der mittelstarken Raucher (20-50 PJ) und ein noch geringerer Teil (n=3; 4,5%) der Gruppe der starken Raucher (> 50 PJ). Der Vergleich wurde mit Kontrollen durchgeführt, die rauchten und dem schnellen NAT2-Genotyp zuzuordnen waren.
Die logistische Regressionsanalyse unter Einbeziehung der Parameter: Alter, BMI, Nikotin (PJ) erbrachte für die schnellen Acetylierer im Vergleich zu den langsamen Acetylierern kein signifikant erhöhtes relatives Risiko, an einem Mammakarzinom zu erkranken (relatives Risiko 1,05; 95%-VB: 0,67-1,67; P:0,82).
Für die schnellen Acetylierer war im Vergleich mit den langsamen Acetylierern das relative Risiko, an einem Mammakarzinom zu erkranken, auch unter der Voraussetzung nicht signifikant erhöht, wenn für die logistische Regressionsanalyse allein die Parameter Alter und Gewicht der Patientinnen berücksichtigt wurden (relatives Risiko: 1,10; VB-95%: 0,70-1,74; P:0,67).
Bei 59,7% (148/248) der Mammakarzinompatientinnen und bei 41,9% (104/ 248) der Kontrollen wurden Blutgruppenmerkmale des AB0-Systems ermittelt. Darüberhinaus
Wie Tabelle 13 zeigt, fällt die hohe Frequenz der schnellen Acetylierer bei den Trägerinnen der Blutgruppe B auf. Einschränkend muss jedoch auf die geringe Anzahl von Fällen mit Blutgruppe B (n=21) hingewiesen werden.
Signifikante Differenzen zwischen schnellen Acetylierern der Tumorgruppe und den Kontrollen wurden nicht beobachtet.
Die NAT2-Genotypen wurden im Hinblick auf bestimmte Subtypen der Fälle mit einem Mammakarzinom untersucht: Menopausenstatus, Dauer der Menstruation, histologisches Grading, Stadium der Tumorerkrankung, Hormonrezeptorstatus, Tumorhistologie.
Zwischen prä- und postmenopausalen Mammakarzinom-Patientinnen fanden sich keine signifikanten Differenzen bezüglich des schnellen NAT2-Genotyps.
Zwischen Mammakarzinom-Patientinnen mit einer Menstruationsdauer >35 Jahre und solchen mit einer Menstruationsdauer <35 Jahre fanden sich keine signifikanten Differenzen bezüglich des schnellen Acetyliererstatus.
In Anlehnung an das TNM-Stadium der WHO-Klassifikation wurden die Patientinnen mit Mammakarzinom in 2 Gruppen unterteilt. Eine exakte Bestimmung des TNM-Stadiums konnte bei 96% (239/248) der Patientinnen vorgenommen werden.
Der ersten Gruppe, die mit 88,3% (211/239) die Mehrheit des Kollektivs darstellte, wurden alle Patientinnen mit Carcinoma in situ, Stadium I und Stadium II zugeordnet, der zweiten Gruppe 11,7% (28/239) der Tumorpatientinnen mit fortgeschrittenem Tumorstadium III und IV.
Das Vorherrschen eines bestimmten NAT2-Genotyps bei den lokoregionär begrenzten oder den fortgeschrittenen Stadien konnte nicht beobachtet werden.
Beim vorliegenden Kollektiv war die ungleiche Verteilung früher und später Tumorstadien mit einem deutlichen Überwiegen der frühen Stadien auffallend. Diese Beobachtung wird durch den Umstand erklärt, dass sich die Proben aus dem Bereich onkologischer Rehabilitationseinrichtungen rekrutieren, die in aller Regel von Patientinnen mit früheren Tumorstadien in Anspruch genommen werden.
Bei 88,4% (220/249) der Patientinnen lagen Angaben zum Differenzierungsgrad des Mammakarzinoms vor.
Nachfolgende Tabelle macht die Verteilung des Gradings unter den Probandinnen deutlich sowie auch die statistische Wertigkeit dieser Verteilung.
Wie die nachstehende Tabelle 18 zeigt, konnte bei 93,6% (233/249) der Patientinnen mit einem Mammakarzinom die spezifische Tumorhistologie ermittelt werden.
Die Auswertung ergab eine signifikante Überrepräsentierung der schnellen Acetylierergenotypen in der Gruppe der Patientinnen mit einem invasiv-lobulären Mammakarzinom im Vergleich mit der Gruppe, die eine invasiv-duktale Tumorhistologie aufwies.
Bei 84,3% (209/248) der Patientinnen war der Hormonrezeptorstatus des Mammakarzinoms bekannt. Danach hatten 21,1% (44/209) der Patientinnen einen negativen und 79,9% (165/209) einen positiven Hormonrezeptorstatus. 27,3% (12/44) der Patientin
Inbezug auf den schnellen Acetyliererstatus fand sich zwischen der Gruppe Hormonrezeptor-positiver und Hormonrezeptor-negativer Mammakarzinom-Patientinnen ein signifikanter Unterschied (Odds ratio: 2,77; 95%-VB: 1,32-5,74; P=0,005).
Unter den Hormonrezeptor-positiven Fällen wurden signifikant häufiger Schnell-Acetylierer als unter den Hormonrezeptor-negativen Mammakarzinom-Fällen beobachtet. Ein auffallender Befund war die geringe Anzahl der schnellen Acetylierer unter den Hormonrezeptor-negativen Fällen. Langsam-Acetylierer kamen unter den Hormonrezeptor-negativen Mammakarzinom-Fällen erheblich häufiger vor als unter den Hormonrezeptor-positiven Fällen.
Hiernach haben schnelle Acetylierer ein deutlich erhöhtes Risiko, an einem Mammakarzinom mit positivem Hormonrezeptorstatus zu erkranken als langsame Acetylierer.
Unter Einbeziehung des positiven Hormonrezeptorstatus, der Histologie eines invasiv-lobulären Mammakarzinoms und des Alters erbrachte die logistische Regressionsanalyse für Träger des schnellen Acetylierertyps ein relatives Risiko von 2,4 (95%-VB:1,04-5,61; P: 0,04).
Das heisst, dass, wenn man das Alter und den Hormonrezeptorstatus mitberücksichtigt, der schnelle Acetylierertyp ein 2,4-fach höheres Risiko besitzt, ein invasiv-lobuläres Mammakarzinom zu entwickeln. Dabei kommt dem Alter keine entscheidende Rolle zu; mit dem Parameter des positiven Hormonrezeptorstatus dagegen wird das relative Risiko für ein Mammakarzinom deutlich erhöht.
Die vorliegende Studie zeigt, dass die Verteilung der Schnell- und Langsamacetylierer keinen unabhängigen Risikofaktor für das Mammakarzinom darstellt. Zwar waren die Träger des schnellen NAT2-Genotyps (Wildtyp) etwas häufiger bei den Mammakarzinomfällen als in den Kontrollen vertreten; dies erreichte jedoch keine statistische Signifikanz.
Der schnelle NAT2-Genotyp erscheint somit nicht als ein Parameter, der als unabhängiger Risikofaktor für das Mammakarzinom eingestuft werden kann.
Darüberhinaus zeigte vorliegende Studie, dass die homozygot schnellen Acetylierergenotypen, d.h. die Träger der Allele NAT2*4/*4 und NAT2*4/*12, nicht nennenswert vertreten waren. Für das Mammakarzinom sind sie damit nicht als ein Faktor der erhöhten Suszeptibilität anzusehen. Sie besitzen nicht die gleiche Bedeutung wie für das Bronchialkarzinom und das Larynxkarzinom (Henning et al. 1999).
Dieses Ergebnis stimmt mit den Befunden jüngerer genotypischer Arbeiten zu diesem Thema überein (Agundez et al.1995; Ambrosone et al. 1996; Hunter et al. 1997; Millikan et al. 1998), die ebenfalls zeigten, dass der Polymorphismus des NAT2-Genotyps nicht als unabhängiger Risikofaktor für das Mammakarzinom anzusehen ist und darüberhinaus in seinem Potential als Risikofaktor (Huang et al. 1999) nicht vergleichbar ist mit den bekannten konventionellen Risikofaktoren ("major risk factors": genetische Prädisposition; hormonelle Einflüsse), deren Anteil am Brustkrebsrisiko bei 45-55% liegt (Madigan et al. 1995).
In diesem Zusammenhang gelangten Dunning et al. (1999) in einem "Review über genetische Polymorphismen und Brustkrebsrisiko" zu dem Schluss, dass keine eindeutige Gewissheit darüber besteht, dass irgendeiner der bekannten genetischen Polymorphismen streng mit dem Risiko eines Mammakarzinoms assoziiert ist.
Hierin haben sie ihre Bedeutung, die sie von anderen Polymorphismen: ER; EDH17B2; CYP2D6; CYP2EI; GSSTT1; HSP70; PR; TNF-alpha unterscheidet, die für eine Risikoabschätzung des Brustkrebses zu ungenau sind.
Frühere Studien zur Korrelation zwischen Acetylierertyp und Brustkrebsrisiko waren Fall-Kontroll-Studien mit meist kleineren Fallzahlen.
Zum Acetylierer-Phänotyp bei Frauen mit Mammakarzinom liegen mehrere Studien vor:
Die erste Studie von Bulowskaya et al. (1978) zeigte eine Überrepräsentierung des schnellen Acetylierertyps (68%) bei Patientinnen mit einem meist fortgeschrittenen Mammakarzinom (n= 41) im Vergleich mit einer altersgematchten Kontrollgruppe nicht krebserkrankter Probandinnen (n=38, überwiegend Herzkreislauferkrankungen), unter denen der schnelle Acetylierertyp nur in 38% der Fälle auftrat (Testsubstanz: Sulfamethazin).
Vermutlich besass die Mehrheit der Mammakarzinompatientinnen ein Stadium IV der Erkrankung; eine exakte Tumorstadieneinteilung war in der Studie nicht vorgegeben. In der Folge wurde deshalb kritisch angemerkt, ob nicht der schnelle Acetyliererstatus nur ein Epiphänomen des fortgeschrittenen Tumorstadiums beim Mammakarzinom darstellte. Zudem lag es nahe, einen paraneoplastischen Effekt inbezug auf die polymorphe NAT-Aktivität zu unterstellen, da auffallenderweise bei sechs der Patientinnen nach Mastektomie der Acetyliererphänotyp sich änderte
In der Folge durchgeführte phänotypische Studien (Huober et al. 1991, Ladero et al.1987; Ladero et al.1991; Philip et al. 1987; Webster et al. 1989), die ebenfalls mit überwiegend kleinen Fallzahlen durchgeführt wurden, bestätigten das Ergebnis von Bulowskaya nicht.
Im Gegenteil: alle Studien widerlegten die Vermutung, der Polymorphismus des hepatischen Acetylierer-Typs korreliere mit einem erhöhten Risiko für das Mammakarzinom,
Die meisten der zurückliegenden Untersuchungen benützten phänotypische Methoden, deren Ergebnisse nicht frei von dem Verdacht der Beeinflussung durch die Brustkrebserkrankung oder durch eine Chemotherapie waren.
Drei grosse von Ambrosone et al. 1996, Hunter et al. 1997 und Millikan et al. 1998 prospektiv durchgeführte genotypische Untersuchungen stimmten mit den Ergebnissen der phänotypischen Vorgängerstudien grundsätzlich darin überein, dass eine unabhängige Interaktion zwischen NAT2-Genotyp und Mammakarzinomrisiko nicht besteht oder allenfalls schwach ausgeprägt ist.
Ein auffallendes Ergebnis war die signifikante Überrepräsentierung der schnellen Acetylierergenotypen in der Gruppe der invasiv-lobulären Tumorhistologien (n=33) im Vergleich mit invasiv-duktalen Tumorhistologien (OR: 2,59; 95%-VB: 1,20-5,60). Der Stellenwert dieses Befundes wird jedoch durch die geringe Anzahl eingeschränkt, sodass eine Überprüfung des Ergebnisses auf dem Boden statistisch relevanter Fallzahlen erforderlich erscheint, um gegebenenfalls von einem tatsächlich erhöhten Risiko des schnellen Acetylierertyps inbezug auf die Entwicklung eines Mammakarzinoms mit einer invasiv-lobulären Histologie ausgehen zu können.
Dieser Befund stimmt mit der Beobachtung von Agundez et al. (1995) überein, der bei einer allerdings sehr kleinen Anzahl (n=7) von Fällen mit einem invasiv-lobulären Mammakarzinom durchgängig den schnellen NAT2-Genotyp feststellte. In dieser genotypischen Studie fanden sich darüberhinaus keine weiteren unterstützenden Hinweise auf eine Korrelation zwischen dem NAT2-Polymorphismus und anderen histologischen Subtypen des Mammakarzinoms.
In der weiteren jüngeren Literatur (Ambrosone et al. 1996; Millikan et al. 1998; Huang et al. 1999) finden sich keine Hinweise auf diese auffällige Korrelation.
Die Bedeutung dieses Zusammenhanges ist derzeit unklar. Die Ergebnisse lassen allenfalls vermuten, dass Unterschiede in der Ätiopathogenese des invasiv-lobulären Mammakarzinoms und des invasiv-duktalen Mammakarzinom bestehen.
Es fiel auf, dass unter den Hormonrezeptor-positiven Fällen mit Mammakarzinom der schnelle NAT2-Genotypsignifikant häufiger vertreten war als unter den Hormonrezeptor-negativen Fällen. Der langsame Acetylierergenotyp kam dagegen unter den Hormonrezeptor-negativen Fällen erheblich häufiger vor. Darüberhinaus imponierte die geringe Anzahl der schnellen Acetylierer unter den Hormonrezeptor-negativen Fällen.
Der Befund ist bemerkenswert, da im Falle einer Bestätigung dieses Ergebnisses durch statistisch aussagekräftige Fallzahlen davon auszugehen wäre, dass der schnelle NAT2-Genotypmit positivem Hormonrezeptorstatus im Vergleich zum langsamen NAT2-Genotyp ein erhöhtes Risiko hätte, an einem Mammakarzinom zu erkranken.
Die Studien aus den letzten 5 Jahren, die in erster Linie das Problem beleuchten, ob und inwieweit der NAT2-Genotypdie potentiell karzinogenen Effekte des Zigarettenrauchens modifiziert, enthalten keine Hinweise auf die mögliche Korrelation zwischen NAT2-Genotypund Hormonrezeptorstatus.
Dieser Befund der Korrelation zwischen Hormonrezeptor-positiven Fällen eines Mammakarzinoms mit dem schnellen NAT2-Genotypweist möglicherweise auf Besonderheiten im Pathomechanismus bei der Entstehung des Mammakarzinoms hin, der derzeit unklar ist.
Nach dem Ergebnis vorliegender Untersuchung konnte in der Gruppe der Mammakarzinompatientinnen eine leichte Zunahme der Schnell-Acetylierer mit steigendem Zigarettenkonsum (PJ) beobachtet werden. Dieser Befund erlangte jedoch keine statistische Signifikanz. Menge und Dauer des Zigarettenkonsums erhöhten weder bei den schnellen noch bei den langsamen Acetylierergenotypen signifikant das Brustkrebsrisiko.
Dieses Ergebnis kommt den Befunden nahe, die in den Studien von Hunter et al. 1997 und Millikan et al. 1998 erhoben wurden, nicht jedoch den Beobachtungen aus den Untersuchungen von Ambrosone et al. 1996.
Auch Hunter et al. 1997 fanden eine nichtsignifikante Risikoerhöhung unter den Mammakarzinompatientinnen mit einem schnellen Acetylierertyp, die mehr als 5 Jahre vor der ersten ausgetragenen Schwangerschaft geraucht hatten (RR=1,5; 95%-CI 0,9-2,6).
Im Gegensatz hierzu stehen die Ergebnisse aus der Untersuchung von Ambrosone et al. (1996), wonach das Zigarettenrauchen signifikant das Brustkrebsrisiko bei postmenopausalen Frauen vom langsamen Acetylierertyp erhöht. Der langsame NAT2-Genotyp verstärkt danach die Suszeptibilität für die Effekte des Zigarettenrauchens und damit das Brustkrebsrisiko. Dagegen fanden sich keine Hinweise auf ein erhöhtes Brustkrebsrisiko durch Zigarettenrauchen bei prämenopausalen Frauen.
Die Untersuchungen von Ambrosone et al. 1996 zeigten darüberhinaus, dass unter den Frauen vom langsamen Acetylierertyp sowohl aktuelles wie auch früheres Zigarettenrauchen Dosis-abhängig signifikant das Brustkrebsrisiko erhöhten.
Unter den Frauen mit einem schnellen Acetylierertyp stellte das Zigarettenrauchen dagegen keinen erhöhten Risikofaktor dar.
Wurde der NAT2-Genotyp nicht berücksichtigt, war eine Assoziation zwischen Zigarettenrauchen und Brustkrebs nach Ambrosone et al. 1996 nicht feststellbar.
Bereits 1995 hatten Ambrosone et al. unter dem Gesichtspunkt, dass der NAT2-Genotyp die Effekte des Zigarettenkonsums inbezug auf die Entstehung des Mammakarzinom modifizieren kann, beobachtet, dass der langsame NAT2-Genotyp Frauen für die karzinogenen Effekte des Zigarettenrauchens in einem besonderen Mass sensibilisiert. Dagegen kam der Interaktion zwischen Zigarettenrauchen und schnellem NAT2-Genotyp als Risikofaktor für ein Mammakarzinom in dieser Untersuchung keine Bedeutung zu.
Hunter et al. konnten 1997 die Ergebnisse Ambrosones et al. in einer Nachfolgestudie, wie oben bereits angedeutet, nicht bestätigen. Dies trifft auch für die Gruppe postmenopausaler Mammakarzinompatientinnen (n=706) vom langsamen NAT2-Genotyp zu, die zum Zeitpunkt der Tumordiagnose oder noch kurz zuvor geraucht hatten.
Millikan et al. 1998 gelangten zu dem gleichen Ergebnis, das zeigte, dass bei postmenopausalen Frauen vom langsamen Acetylierertyp lediglich der Trend zu einer nicht-signifikanten Risikoerhöhung für ein Mammakarzinom durch eine zunehmende Anzahl von gerauchten Zigaretten bestand.
Darüberhinaus fanden Millikan et al., dass unabhängig vom NAT2-Genotyp und unabhängig vom Menopausenstatus lediglich eine mässige aber nicht-signifikante Risikoerhöhung in Abhängigkeit von der Dauer des Nikotinkonsums (insbesondere > 20 Jahre) feststellbar war.
In der grössten, von Baron et al. (1996) vorgelegten Fall-Kontroll-Studie fand sich keine Korrelation zwischen gegenwärtigem Zigarettenrauchen und Mammakarzinom-Risiko. Dagegen wurde ein leicht erhöhtes Risiko für Zigarettenrauchen in der Vergangenheit beschrieben.
In einer anderen 1996 von Morabia et al. vorgelegten Fall-Kontroll-Studie waren Informationen über die Exposition von Nichtrauchern gegenüber Zigarettenrauch in der Umgebung enthalten.
Nach Ausschluss der Frauen mit einer Exposition gegenüber Zigarettenrauch in der Umgebung (zu Hause, am Arbeitsplatz, während der Freizeit) beobachteten die Autoren eine strenge positive Korrelation zwischen aktivem Zigarettenrauchen bei Frauen, die aktuell und in der Vergangenheit rauchten, und Brustkrebsrisiko.
Dabei nahm das Risiko mit der Anzahl gerauchter Zigaretten zu. Ein erhöhtes Brustkrebsrisiko wurde auch bei Patientinnen beobachtet, die als Nichtraucherinnen gegenüber Zigarettenrauch in der Umgebung exponiert waren.
In der vorliegenden Studie waren anamnestische Daten zur Exposition von Nichtraucherinnen gegenüber Zigarettenrauch in der Umgebung nicht erhoben worden, so dass die von Morabia erhobenen Befunde nicht kommentiert werden können.
Die Stratifizierung nach Untergruppen zeigte, dass keine signifikante Interaktion zwischen Alter, prä- und postmenopausalen Fällen, Menstruationsdauer (>/< 35 Jahre), Tumorgrading und Tumorstadium mit dem schnellen NAT2-Genotyp zu erkennen war.
Hunter et al. (1997) beobachteten ebenfalls das Fehlen einer signifikanten Interaktion zwischen dem NAT2-Acetyliererstatus und etablierten Risikofaktoren wie: Alter der Patientin zum Zeitpunkt der Tumordiagnose, Body-Mass-Index (BMI), Alter zum Zeitpunkt der Menopause, Alter bei der ersten Geburt, Alter zum Zeitpunkt der Menarche, familiäre Belastung durch ein Mammakarzinom der Mutter und/oder der Schwester, Anamnese einer vorbestehenden benignen Brusterkrankung.
Danach erscheint es unwahrscheinlich, dass dem NAT2-Genotyp in Verbindung mit bekannten Risikofaktoren für das Mammakarzinom eine modifizierende Bedeutung zukommt.
Unterschiedliche endogene und exogene Faktoren werden für die Entstehung des Mammakarzinoms als Ursache in Betracht gezogen. Es liegen Hinweise vor, dass dem Zigarettenrauchen eine wichtige Bedeutung zukommt. Dabei werden die im Zigarettenrauch enthaltenen aromatischen Amine (Arylamine) als Karzinogene für das Brustkrebsrisiko verantwortlich gemacht.
Der Weg zum ultimativen Karzinogen beruht auf dem Zusammenwirken verschiedener Enzymsysteme (Abb. 4; Hein et al. 1993).
Nach Aufnahme in den Organismus durchlaufen die Arylamine als Präkanzerogene unterschiedliche, miteinander konkurrierende Reaktionen, die zur Entgiftung oder Giftung der Substanzen führen.
Sie können primär durch die NAT1/NAT2 N-acetyliert werden. Dies stellt den Detoxifizierungsprozess dar.
Bei den Acetoxyestern handelt es sich um instabile Verbindungen, aus denen sich durch Wasserabspaltung hochreaktive Arylnitreniuionen bilden. Diese elektrophilen Intermediärprodukte reagieren mit nukleophilen Gruppen der DNA und entfalten so ihre genotoxischen Wirkungen. Durch Zelltransformation kommt es zur Tumorentstehung (Maier et al. 1990).
Auch aromatische Kohlenwasserstoffe werden nach Resorption durch die Schleimhaut durch oben genannte Enzymsysteme in ihre Epoxidform überführt, in der sie mit DNA- und RNA-Molekülen interagieren können.
Aromatische Kohlenwasserstoffe sind ausserdem in der Lage, CYP1A2 durch Enzyminduktion erheblich in seiner Aktivität zu steigern, wodurch vermehrt Zwischenprodukte für die O-Acetylierung anfallen, die zu hochreaktiven Arylnitreniumionen führen.
Betrachtet man die Funktion der NAT2 als Katalysator für verschiedene Reaktionen auf dem Weg zu ultimativen Karzinogenen, lässt sich leicht verdeutlichen, welche Folgen eine genetisch bedingte Aktivitätssteigerung des Enzyms bewirken kann.
Laborversuche haben gezeigt, dass aromatische Amine Mutagene des Brustdrüsengewebes darstellen, die bei Hunden und bei Menschen eine karzinogene Wirkung entfalten können (King et al. 1979, Tonelli et al. 1979, Shirai et al. 1981; Allaben et al. 1982, Allaben et al. 1983, Wang et al. 1988, Eldridge et al. 1994, Swaminathan et al. 1994).
Karzinogene im Zigarettenrauch gelangen in direkten Kontakt mit dem Epithel des Mammagewebes. In Flüsigkeitsaspiraten aus Brustwarzen von Raucherinnen wurden Metaboliten von Inhaltsstoffen aus dem Zigarettenrauch nachgewiesen (Petrakis et al. 1978). Diese Flüssigkeitsaspirate besitzen darüberhinaus mutagene Eigenschaften (Petrakis et al. 1980).
Aromatische Amine können, wie gezeigt wurde, bei Hunden karzinogen auf das Brustdrüsengewebe wirken, wenn sie unter experimentellen Bedingungen in der Leber der Tiere aktiviert werden (Shirai et al. 1981). Es wurde deshalb diskutiert, ob der langsame Acetylierergenotyp, der über eine geringere Kapazität zur Detoxifizierung aromatischer Amine verfügt, auch höhere Konzentrationen reaktiver Intermediate aufweist. Im Brustdrüsengewebe vollzieht sich wahrscheinlich die weitere Aktivierung mit der Folge, dass promutagene, karzinogene DNA-Addukte entstehen, die die endgültige Karzinogenese einleiten (Sadrieh et al. 1996; Josephy et al. 1996).
Aromatische Amine werden bioaktiviert und/oder entgiftet durch Enzyme des Fremdstoffwechsels. Zu diesen Xenobiotika metabolisierenden Enzymen werden das Cytochrom P4501A2 (CYP1A2) und die N-Acetyltransferasen (NAT1 und NAT2) gerechnet.
Die N-Acetylierung von aromatischen Aminen durch die NAT2 ist ein Schritt der Detoxifikation, der durch die hepatischen NAT-Enzyme katalysiert wird. Dieser Stoffwechselweg konkurriert mit dem für die N-Oxidation durch CYP1A2. Hierdurch können reaktive N-OH-Metabolite in die Blutzirkulation eintreten, werden dabei weiter aktiviert und können im Zielgewebe an DNA-Strukturen binden.
Es wurde die Vermutung geäussert, die Aktivität der NAT1 im Brustgewebe überträfe die der NAT2. Die Bedeutung aber, die der Funktion der hepatischen Detoxifikation zukommt, sollte nicht unterschätzt werden (Ambrosone et al. 1996).
Die Rolle, die aromatische Amine bei der Karzinogenese des Mammakarzinoms spielen, kann der bei Harnblasenkarzinomen analog sein. Zigarettenrauchen stellt einen Risikofaktor für das Harnblasenkarzinom dar. Menschen mit einem langsamen NAT2-Genotyp weisen höhere Spiegel der 4-Aminobiphenyl-Hämoglobin-Addukte auf. Dies deutet darauf hin, dass die Clearance von reaktiven Arylamin-Metaboliten herabgesetzt ist (Ambrosone et al. 1996).
Die Bedeutung des Polymorphismus des NAT-Genotyps als eines eigenständigen Risikofaktors in der Ätiopathogenese des Mammakarzinoms ist derzeit Gegenstand kontroverser Diskussionen.
In dieser Studie sollte die Häufigkeit hereditärer Polymorphismen an den Genorten der NAT2 im Vergleich mit einer altersgematchten Kontrollgruppe untersucht werden.
Dies sollte zum einen die Frage nach einer möglichen Überrepräsentierung des Langsam- oder Schnell-Acetylierers bei Mammakarzinompatientinnen beantworten.
Zum anderen sollte überprüft werden, ob der NAT-Genotyp das Tumorrisiko bei Frauen mit bekannten Risikofaktoren (Menopausenstatus, Dauer der Menstruation, Alter) erhöht. Auch die Assoziation zwischen NAT-Genotyp und Nikotinabusus wurde dabei untersucht, sowie die Assoziation mit Blutgruppenmerkmalen.
Schliesslich sollte überprüft werden, ob der NAT-Genotyp mit bestimmten Merkmalen des Mammakarzinoms (Hormonrezeptorstatus, Grading, TNM-Stadium, Histologie) korreliert ist, d.h. es sollte untersucht werden, inwieweit ein bestimmter NAT-Genotyp modulierenden Einfluss auf die besondere Ausprägung bestimmter Tumormerkmale besitzt.
In Übereinstimmung mit der jüngeren Literatur (Ambrosone et al.1996, Hunter et al.1997 und Millikan et al.1998; Huang et al.1999) zeigte vorliegende Studie, dass eine signifikante Überrepräsentierung eines bestimmten NAT2-Genotyps beim Mammakarzinom nicht zu beobachten war.
Sie zeigte, dass der NAT2-Genotyp keinen unabhängigen Suszeptibilitatsfaktor in der Ätiopathogenese des Mammakarzinoms darstellt. Lediglich ein Trend zu einem leichten Überwiegen der schnellen Acetylierer bei Mammakarzinomfällen im Vergleich mit den nicht Tumor-erkrankten Kontrollen war erkennbar.
Danach prädisponiert der schnelle NAT2-Genotyp Frauen zu einem Mammakarzinom mit invasiv-lobulärer Histologie und mit positiven Hormonrezeptorstatus. Diese Befunde wiesen am ehesten auf Besonderheiten im Pathomechanismus der Karzinogenese des Brustkrebses hin, die weiterer Abklärung bedürfen.
In Verbindung mit dem zusätzlichen Risikofaktor Zigarettenrauchen war eine leichte Zunahme der Schnell-Acetylierer mit steigendem Zigarettenkonsum (PY) zu beobachten. Diese Assoziation war jedoch ohne statistische Signifikanz.
Auffallend war die hohe Frequenz der Schnell-Acetylierer bei Trägern der Blutgruppe B (n=21). Hierzu fehlen Vorbefunde aus der Literatur. Eine Wertung dieses Befundes erscheint schwierig.
Mit Rücksicht auf die in den letzten 5 Jahren sämtlich prospektiv durchgeführten, genotypischen Studien mit grossen Fallzahlen besteht ein überwiegender Konsens darüber, dass dem Polymorphismus des NAT-Genotyps als einem unabhängigen Risikofaktor in der Entstehung des Mammakarzinoms keine mit den beim Brustkrebs bekannten Risikofaktoren vergleichbare Bedeutung zukommt.
Die vorliegende Arbeit wurde am Institut für Klinische Pharmakologie der Charite angefertigt. Ich danke Herrn Prof. Roots sehr für die Überlassung des Themas und die günstigen Arbeitsbedingungen an seinem Institut.
Herrn Dr. K-H. Röhl, 1995 Chefarzt der Abteilung Hämatologie-Onkologie der Rehabilitationsklinik Bavaria Kreischa, danke ich für die Anregung zur Beschäftigung mit der grundsätzlichen Frage nach dem Zusammenhang zwischen individuellem Metabolisiererstatus und der Entstehung von Karzinomen.
Herrn Dr. B. Orth danke ich für die Möglichkeit der Patientenakquisition in der Abteilung Hämatologie-Onkologie der Rehabilitations-Klinik Bavaria Kreischa.
Ebenso gilt mein Dank Herrn Dr. Krüger für die Möglichkeit der Patientenakquisition in der Abteilung Hämatologie-Onkologie der Rehabilitationsklinik Bavaria Freyung.
Mein besonderer Dank gilt meinem Betreuer Herrn Prof. Dr. Dr. I. Cascorbi, der in grosszügiger Weise die Fertigstellung der Arbeit förderte.
Frau H. Maszynski danke ich für die freundliche Beratung als Gast im genetischen Labor.
Hiermit erkläre ich an Eides Statt, dass die vorliegende Dissertationsschrift selbständig und ohne unzulässige Hilfe Dritter von mir verfasst wurde. Sie stellt auch in Teilen keine Kopie anderer Arbeiten dar. Die benutzten Hilfsmittel sowie die Literatur sind vollständig angegeben.
Reinhard Wolf