Von jedem Patienten wurden 5 bis 10 ml venösen Blutes gewonnen. Die Koagulation wurde mit EDTA verhindert. Die DNA wurde aus Leukozyten nach Proteinase-K-Verdau mittels einer manuellen 3-Schritt Phenol/Chloroform-Extraktion (Sambrook et al. 1989) bzw. unter Verwendung eines halbautomatischen DNA-Extraktors (341A Applied Biosystems) gewonnen.

Hierzu wurde zunächst das Vollblut mit dem 3-fachen Volumen eines hypoosmolaren Puffers

155 mmol/l NH₄Cl, pH 8,0

10 mmol/l KHCO₃

0,1 mmol/l EDTA

versetzt und 30 min. bei 4°C inkubiert. Hierdurch platzten die Erythrozyten. Die Leukozyten konnten durch Zentrifugation bei 1.200 rpm pelletiert werden. Die Leukozyten wurden in 2 ml TEN-Puffer

20 mmol/l Tris/HCL pH7,5

2 mmol/l EDTA

30 mmol/l NaCl

resuspendiert, in zwei Gefässe aliquotiert und bei -20°C bis zur DNA-Extraktion aufbewahrt.

Den beiden Extraktionsverfahren, dem manuellen wie dem automatischen, liegt der Aufschluss der Leukozyten mittels Proteinase K und Natriumdodecylsulfat (SDS) zugrunde.

Beim manuellen Verfahren wurden die Leukozyten in 10ml TEN-Puffer resuspendiert, mit 100 µl 10 mg/ml Proteinase K (Roche Mannheim) und 0,5 ml 200g/l Natrium-Dodecylsulfat (SDS) versetzt und anschliessend bei 37° über Nacht inkubiert. Proteinbestandeile wurden durch Zugabe von 5 ml Tris-Puffer-gesättigter Phenollösung gefällt und durch Zugabe von 5 ml Chloroform von der wässrigen Lösung getrennt.

Gleichzeitig wurden hierdurch lipidhaltige Bestandteile abgetrennt. Die wässrige Phase wurde erneut einer Chloroform-Extraktion unterworfen und zentrifugiert. Die in eine frisches Gefäss überführte wässrige Phase wurde mit dem 2,5-fachen Volumen an 100% Ethanol versetzt und gleichzeitig 0,1 Volumen 2mol/l Natrium-Azetat pH 5,8 addiert.

Hierdurch präzipitierte die DNA und konnte entweder abzentrifugiert werden oder direkt mittels eines Glashakens aufgenommen werden. Die DNA wurde kurz in 70% Ethanol gewaschen, anschliessend getrocknet. Das Pellet wurde in 10 mmol/l Tris, 1 mmol/l EDTA-Puffer (pH 8,0) resuspendiert und bis zur weiteren Analyse bei 4°C aufbewahrt.

Die kodierende Sequenz des NAT2-Gens wurde mit Oligonukleotid-Primern P100 und P56 eingegrenzt und ein 1.211-bp-Fragment mit PCR amplifiziert. Hierzu wurden 0,5-1µl DNA-Lösung (50-100 ng DNA) zum 50 µl Reaktionsansatz hinzugegeben.

5 µl

10 fach

PCR-Puffer

(Perkin Elmer)

5 µl

2 mmol/l

dNTP

(Roche Mannheim)

1 µl

10 mmol/l

5`-Primer P100

(TIB-Molbiol)

1 µl

10 mmol/l

3`-Primer P56

(TIB-Molbiol)

4,8 µl

25 mmol/l

MgCl₂

(Perkin Elmer)

0,2 µl

5 units/µl

 

Taq-DNA-Polymerase

(Perkin Elmer)

33 µl

H₂0

Die Primer-Sequenzen sind in Tabelle 5 aufgeführt. Die Reaktionsgefässe wurden in den 94°C heissen Thermocycler (Perkin Elmer 9600 und Biometra Trio) gestellt und die PCR unmittelbar unter folgenden Bedingungen gestartet:

2 min. initiale Denaturierung bei 94°C; 35 Zyklen 0,5 min. Denaturierung bei 94°C; 1,5 min. Annealing und Elongation bei 67°C; gefolgt von 7 min. terminaler Elongation bei 72°C. Anschliessend wurden die Proben auf 4°C heruntergekühlt.

Der Erfolg der PCR wurde mit Hilfe einer Agarol-Gelelektrophorese überprüft. Hierzu wurden 7 ml PCR-Produkt mit 5µl Blue-Marker (Life Technologies) versetzt und auf einem 1,2% Agarose-Gel (Biozym) bei 120 V für 20 min. aufgetrennt.

Als Elektrophoresepuffer diente ein üblicher TBE-Puffer:

90 mmol/l Tris pH 8,0-8,3

90 mmol/l Borsäure

2,5 mmol/l EDTA

Primer

Primer-

länge (nt)

Fragment-

länge (bp)

Sequenz

Spezifität

P100

-69 - 48

1211

5“-GTC ACA CGA GGA

AAT CAA ATC C

NAT2-Gen (5`)

P56

1142-1119

-

5“-GTT TTC TAG CAT GAA

TCA CTC TGC

NAT2-Gen (3`)

P341N*

342 - 373

442

5“-ACC CAG CAT CGA CAA TGT AAT TCC TGC CCT CA

Ddel-site 341 nt (3`)

P87

480 - 490

421

5“-CCT GGA CCA AAT CAG GAG AG

Taql und Ddel-site 803 nt (5`)

P90

900 - 879

-

5“-ACA CAA GGG TTT ATT

TTG TTC C

(3`)

Tabelle 6: Oligonukleotid-Primer zur Amplifikation des kodierenden Abschnitts des NAT2-Gens und Amplifikation von kleinen Fragmenten, die mögliche Mutationen bei Positionen 191, 282, 341, 590 und 803 enthalten. Positionen 481 und 857 wurden direkt am 1.211-bp-Fragment geprüft.

Aus dem 1.211-bp-Fragment konnten direkt die Positionen 481 und 857 nt auf die Mutationen C/T bzw. A/G mit den Restriktionsenzymen Kpnl und BamHI geprüft werden. Die Mutationen führten jeweils zum Verlust der Schnittstelle der Endonuklease.

Kpnl-Verdau zur Bestimmung der C⁴⁸¹T-Transition

12,5 µ

PCR-Produkt (P100/P56)

2,5 µl

110 fach

Puffer 1 (New England Biolabs)

0,5 µl

60 units/µl

 

Kpnl (New England Biolabs)

9,5 µl

H₂0

Inkubation über Nacht bei 37°C.

BamHl-Verdau zur Bestimmung der A⁸⁵⁷G-Transition

12,5 µ

PCR-Produkt (P100/P56)

2,5 µl

10 fach

Puffer BamHI (New England Biolabs)

0,5 µl

200 units/µl

 

BamHI (New England Biolabs)

9,5 µl

H₂0

Inkubation über Nacht bei 37°C.

12,5 µl des Reaktionsprodukts wurden mit 10 µl Bluemarker versetzt und auf ein 2%-Agarose-Gel (Biozym) aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgte für 40 min. bei 80 V. Als Grössenstandard wurden 5 µl DNA-Marker V (Boehringer Mannheim) parallel aufgetrennt. Das Fragment-Muster wurde mit einem EagleEye Still-Videosystem (Stratagene) dokumentiert (Abb. 5).

Abb.1: 2% Agarose-Gelelektrophorese von 1.211-bp-Fragmenten, die zur Überprüfung der Mutationen an NAT2-Genposition 481 nt mit Kpnl bzw. 857 nt mit BamHI verdaut wurden. Die Fragmente wurden durch Anfärbung mit 1mg/l Ethidiumbromid sichtbar gemacht.

Zur besseren Detektierung der weiteren Mutation wurden von dem bestehenden 1.211-bp-Template eine sogenannte seminested PCR durchgeführt. Auf diese Weise konnte z. B. die randständig sitzende G¹⁹¹A-Mutation besser sichtbar gemacht werden und die Zahl konstitutiver Schnittstellen der Restriktionsenzyme Ddel und Taql gesenkt werden.

Der entscheidende Vorteil war jedoch die Möglichkeit, mit einem Restriktionsverdau die T³⁴¹C-Transition nachzuweisen, indem in den 3“-Primer eine mismatch-Base und so eine Ddel-Schnittstelle in Abhängigkeit von der Mutation eingefügt wurde.

Diese Designed-Primer-Technik hat den Vorteil, bei Nicht-Vorliegen einer Restriktionsstelle auf Allel-spezifische Verfahren zu verzichten, die das Risiko falsch-positiver oder falsch-negativer Ergebnisse in sich bergen. Hierzu wurde ein 442-bp-Fragment, welches die Mutationen 191, 282 und 341 nt enthielt, mit den Primern P100 und P341N amplifiziert. 1 µl des 1:10 verdünnten PCR-Amplifikates wurde zum 50 µl Reaktionsansatz hinzugegeben.

5 µl

10 mal

PCR-Puffer

(Perkin Elmer)

5 µl

2 mmol/l

dNTP

(Roche)

1 µl

10 mmol/l

5`-Primer P100

(TIB-Molbiol)

1 µl

10 mmol/l

3`-Primer P341N

(TIB-Molbiol)

4,8 µl

25 mmol/l

MgCl₂

(Perkin Elmer)

0,2 µl

5 units/µl

 

Taq-DNA Polymerase

(Perkin Elmer)

33 µl

H₂0

PCR-Bedingungen: 2 min. 94°C; 14 Zyklen (0,5 min. 94°C, 1,5 min. 67°C); 7 min. 72°C.

Mspl-Verdau zur Bestimmung der G¹⁹¹A-Transition

12,5 µl

PCR-Produkt (100/341N)

2,5 µ

10 fach

Puffer 2(New England Biolabs)

0,5 µl

100 units/µl

 

Mspl(New England Biolabs)

9,5 µ

H₂0

Inkubation über Nacht bei 37°C.

Fokl-Verdau zur Bestimmung der C²⁸²T-Transition

12,5 µl

PCR-Produkt (100/341N)

2,5 µ

10 fach

Puffer 4(New England Biolabs)

0,5 µl

20 units/µl

Fokl(New England Biolabs)

9,5 µ

H₂0

Inkubation über Nacht bei 37°C.

Ddel-Verdau zur Bestimmung der T³⁴¹C-Transition

12,5 µl

PCR-Produkt (100/341N)

2,5 µ

10 fach

Puffer 3(New England Biolabs)

0,5 µl

10 units/µl

 

Ddel(New England Biolabs)

9,5 µ

H₂0

Inkubation über Nacht bei 37°C.

Abb.2: 3% Agarose-Gelelektrophorese von 442-bp-Fragmenten, die zur Überprüfung der Mutationen an NAT2-Genposition 191 nt mit Mspl, 282 nt mit Fokl bzw. mit Ddel verdaut wurden. Die Fragmente wurden durch Anfärbung mit 1mg/l Ethidiumbromid sichtbar gemacht.

Zur Determinierung möglicher Mutationen an den Positionen 590 nt und 803 nt wurde ähnlich vorgegangen. Nach Amplifikation eines 421-bp-Fragmentes wurde dieses zwei verschiedenen Restriktionsverfahren unterworfen. Es wurden wieder 1µl des 1:10 verdünnten initialen 1.211-bp-Templates eingesetzt.

5 µl

10 fach

PCR-Puffer

(Perkin Elmer)

5 µl

2 mmol/l

dNTP

(Boehringer Mannheim)

1 µl

10 mmol/l

5`-Primer P87

(TIB-Molbiol)

1 µl

10 mmol/l

3`-Primer P90

(TIB-Molbiol)

4,8 µl

25 mmol/l

MgCl₂

(Perkin Elmer)

0,2 µ

5units/µl

 

Taq-DNA-Polymerase

(Perkin Elmer)

33 µl

H₂0

PCR-Bedingungen: 2min.94°C; 14 Zyklen (0,5 min. 94°C, 1,0min. 60°C, 1min.

72°C); 7min. 72°C.

Taqål-Verdau zur Bestimmung der G⁵⁹⁰A-Transition

12,5 µl

PCR-Produkt (87/90)

2,5 µl

10 mal

Puffer Taqål

(New England Biolabs)

0,5 µl

20 units/µl

 

Taqål

(New England Biolabs)

9,5 µl

H₂0

Inkubation 3-4 Stunden bei 65°C.

Abb.3: 3% Agarose-Gelelektrophorese von 421-bp-Fragmenten, die zur Überprüfung der Mutationen an NAT2-Genposition 590 nt mit Taqål und 803 nt mit Ddel verdaut wurden. Die Fragmente wurden durch Anfärbung mit 1mg/l Ethidiumbromid sichtbar gemacht.

Ddel-Verdau zur Bestimmung der A⁸⁰³G-Transition

12,5 µl

PCR-Produkt (87/90)

2,5 µl

10 fach

Puffer 3

(New England Biolabs)

0,5 µl

10 units/µl

 

Ddel

(New England Biolabs)

9,5 µl

H₂0

Inkubation über Nacht bei 37°C.

Position

Transition

Restrik-

tionsen-

donuk-

leasen

Erkennungs-

sequenz

Präamplifi-

kation mit

Primer

Schnittposi-

tionen (nt)

Wildtyp

Mutation

Fragment-

Länge(bp) Wildtyp

Mutation

191

G->A

Mspl

G“GC_C

AG“CT

100/341N*

96 189

96

184 165 93

277 165

282

C->T

Fokl

GGATGnnnnn

Nnnn“nnnn_

100/341N*

268

337 165

442

341

T->C

Ddel

C“TnA_G

100/341N*

-2 153

-2 153 341

220 163 59

188 163 59 32

481

C->T

Kpnl

C“GTAC“C

100/56

480

662 549

1211

590

G->A

Taql

T“CG_A

87/90

588 730

730

170 142 109

279 142

803

A->G

Ddel

C“TnA_G

87/90

776

776 803

297 124

297 97 27

857

G->A

BamHI

C“GTAC_C

100/56

856

925 286

1211

Tabelle 7: Restriktionsendonukleasen zur Erkennung der NAT2-Mutation