Wolf,, Susanne: Neurodegeneration und Neuroprotektion - ein Dialog zwischen Immunsystem und Gehirn auf Zellebene

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Kapitel 3. Material und Methoden

3.1 Die Hirnschnittkulturen - ein Modell für Neuroinflammation und Primärschaden von ZNS Gewebe

Sollte die Hirnschnittkultur zur Untersuchung von Neuroinflammation und Neurodegeneration dienen, wurden die Schnitte für 6 Tage kultiviert bevor sie mit den T Zellen kokultiviert worden sind. In der inneren Schicht der Hirnschnitte konnte nach 6 Tagen in Kultur (div) eine Runterregulation von Aktivitätsmarkern auf Mikrogliazellen beobachtet werden (Hailer et al. 1996). Diese innere Zone der Hirnschnitte wurde als unverletztes Hirngewebe angesehen, das alle Zellkompartimente in ihrer ursprünglichen Architektur und teilweisen Funktionalität enthielt.

Als Akutschnitt war die Hirnschnittkultur ein Modell für primären mechanischen Schaden von Hirngewebe, der durch die Präparation gesetzt wurde. Die Schnitte wurden dann unmittelbar nach der Präparation mit den entsprechenden T Zellen kokultiviert.

3.1.1 Zusammensetzung der Medien

3.1.1.1 Präparationsmedium (steril)

Agens

Menge auf 100 ml

Firma

Aqua bidest

98 ml

Selbst hergestellt

MEM 25 MM Hepes

1,6 g

Gibco, Life Technologies, UK

L-Glutamin 200mM

1 ml

Gibco

Trisbasis

800 µl Stammlösung*

Sigma, D

3.1.1.2 Kulturmedium (steril)

Agens

Menge auf 100ml

Firma

Penicillin/Streptomycin

1 ml

Sigma

Glucose20

1,2 ml

Braun, D

L-Glutamin 200 mM

2 ml

Gibco

MEM 25 MM Hepes

0,8 g

Gibco

Bikarbonat

580 µl

Gibco

Trisbasis

500 µl Stammlösung*

Sigma

L-ascorbic-acid (Vitamin C)

80 µl Stammlösung**

Sigma

Insulin

100 µl Stammlösung***

Gibco

normal horse serum (hitzeinaktiviert)

25 ml

Gibco

HBSS

25 ml

Gibco

Aqua bidest

44 ml

Selbst hergestellt

*Stammlösung Trisbasis: 0.2 M Trispuffer: 24,23 g Tris in 500 ml Aqua bidest lösen, mit konzentrierter HCL pH 7.6 einstel
len, mit Aqua bidest auf 1 l auffüllen. Um 0.05 M Trisbasis zu bekommen, verdünnt man 250 ml von 0.2 M Trispuffer mit
750 ml Aqua bidest.
**Stammlösung Vitamin C: 0,1 g Vitamin C in 100 ml Aqua bidest lösen.
***Stammlösung Insulin: 5 mg Insulin in 5 ml Aqua bidest lösen.


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3.1.1.3 M Phosphatpuffer (PB)

Agens

Menge

Firma

Na2HPO4x7H2O

21,71 g

Sigma

Na2HPO4xH2O

2,62 g

Sigma

Aqua bidest

1 l

Selbst hergestellt

3.1.2 Die entorhinal-hippocampale Hirnschnittkultur

3.1.2.1 Die Anatomie der entorhinal-hippocampalen Formation

Der Hippocampus ist ein phylogenetisch altes Gehirnareal, das sich aus dem Archipallium entwickelt hat und die zentrale Struktur des limbischen Systems bildet. Die Hippocampusformation erstreckt sich längs vom septalen Kerngebiet des basalen Vorderhirns bis zum ventrocaudalen Pol des Temporallappens. Am temporalen Pol der Formation schließt sich der entorhinale Kortex an, der vom Isokortex durch die rhinale Fissur abgegrenzt wird. Ein Querschnitt durch den Hippocampus senkrecht zu seiner Längsachse zeigt zwei u-förmig gebogene, ineinander greifende Hirnwindungen, das Cornu ammonis (CA) und den Gyrus dentatus (DG) (Abb.1 folgende Seite). Im Cornu ammonis bilden die Pyramidenzellen ein schmales Band von Neuronen mit basalen und apikalen Dendriten. Aufgrund der unterschiedlichen Morphologie und Verschaltung werden die Neurone in zwei Regionen, CA1 und CA3, eingeteilt. Die Körnerzellen im DG sind ebenfalls in einer schmalen Schicht angeordnet. Die Dendriten sind jedoch ausschließlich apikal in der Molekularschicht lokalisiert (Amaral und Witter 1995). Über den entorhinalen Kortex wird der Hauptanteil der isokortikalen Informationen an den Hippocampus weiter geleitet. Mehrere Areale des Isokortex innervieren Neurone im entorhinalen Kortex. Einige wenige Verbindungen bestehen auch zwischen dem Isokortex und dem Subikulum oder der SA1-Region. Der Fasertrakt, der den entorhinalen Kortex mit dem Hippocampus verbindet, wird als Tractus perforans bezeichnet. Neurone aus den Schichten II und III des entorhinalen Kortex projizieren über diesen Trakt zur Molekularschicht des DG und zum Stratum lacunosum-moleculare der CA1-Region. Die Körnerzellen des DG, deren Axone als Moosfasern bezeichnet werden, innervieren die proximalen apikalen Dendriten der Pyramidenzellen in der CA3-Region. Die Axon-Kollateralen der Pyramidenzellen in der CA3-Region, die Schaffer-Kollateralen, terminieren an den apikalen Dendriten der Neurone in der CA1-Region. Die Pyramidenzellen in dieser Region projizieren über das Subikulum zurück zum entorhinalen Kortex. Zusätzlich zu den Afferenzen aus dem entorhinalen Kortex erreichen den Hippocampus auch Afferenzen vor allem aus dem Septum und dem jeweils kontralateralen entorhinalen Kortex und Hippocampus (Amaral und Witter 1995). Diese letztgenannten Afferenzen sind in der Schnittkultur nicht mehr vorhanden, da die Hemisphären voneinander getrennt wurden.


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Abb. 1: Schematische Darstellung des entorhinalen Kortex und Hippocampus

in einem horizontalen Schnitt durch den temporalen Pol der Hippocampus-Formation. Graue Flächen beinhalten hauptsächlich Zellkörper, weiße Flächen kennzeichnen die Bereiche, in denen vor allem Zellfortsätze vorkommen. Im Gyrus dentatus und im Cornu ammonis ist beispielhaft die Morphologie der Dendriten von Projektionsneuronen (principal cells) wiedergegeben. F, Fimbria; CA1, Cornu ammonis Region 1; CA3, Cornu ammonis Region 3; So, Stratum oriens; Sp, Stratum pyramidale; Sl, Stratum lucidum; Sr, Stratum radiatum; Slm, Stratum lacunosum moleculare; Sg, Stratum granulosum; Sm, Stratum moleculare; Pm, Pia mater; Fh, Fissura hippocampi; A, Alveus S, Subiculum; Fr, Fissura rhinalis.

3.1.2.2 Präparation

Alle folgenden Arbeiten wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Organotypische entorhinal-hippocampale Schnittkulturen wurden aus Hirnen dekapitierter, 6 Tage alter Lewis Ratten (für MBP, OVA und Copaxone 1 spezifische T Zellen) oder B10.PL (für MBP und unspezifische T Zellen) oder BALB/c (für OVA T Zellen) 9 Tage alter Mäuse angelegt. Der den Hippocampus und entorhinalen Kortex enthaltende Hirnanteil wurde nach rostral vom restlichen Neokortex sowie nach kaudal vom Hirnstamm und vom Kleinhirn abpräpariert und in eiskaltes Präparationsmedium überführt. Nach Aufkleben des Hirnteils mit Gewebekleber (Braun) auf einen mit Agarblöckchen zur Stabilisation versehenen Sektionsblock wurden mit einem Vibratom (Technical Products International, USA) 350 µm dicke Koronarschnitte durch die kaudalen Hirnanteile angefertigt. Der Sektionsblock und das Hirngewebe waren von Präparationsmedium bedeckt. Die Schnitte erfolgten mit einer in das Vibratom eingespannten Rasierklinge und wurden nach dem Schneiden mit einer Pasteurpipette in Petrischalen überführt, die eiskaltes Präparationsmedium enthielten. Unter dem Binokular wurden die den DG enthaltenden Schnitte mit Hilfe zweier Skalpelle so zurechtgeschnitten, dass sie Hippocampus und entorhinalen Kortex enthielten (Abb. 2). Diese Schnitte wurden mit ei


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ner Pasteurpipette zu je vier Stück auf einen Zellkultureinsatz (Falcon, UK), welcher in einer 6-well-Platte mit auf 37°C vorgewärmtem Kulturmedium saß, aufgebracht. Die Ausbeute lag zwischen 10-12 Hirnschnittpräparaten pro Tier.

Abb. 2: Schematische Darstellung der Lage des Hippocampus

im Gehirn (graue Flächen im linken Bild) und der Lage des Tractus perforans im Hirnschnittpräparat (rote Fasern im rechten Bild). CA1, Cornu ammonis Region 1; CA3, Cornu ammonis Region 3; DG, Gyrus dentatus; EC, entorhinaler Kortex.

Nach Einführung einer neuen Präparationstechnik durch Dr. B. Heimrich, wurden die Schnitte für die Beobachtung von Neuroprotektion alle mit dieser neuen Technik angefertigt. Das aus dem Schädel der 9 Tage alten Mäuse präparierte Gehirn wurde ebenfalls vom Hirnstamm und Kleinhirn sowie von 1/3 des Frontalkortex befreit, die Hemisphären getrennt und in eiskaltes Präparationsmedium überführt. Mit Hilfe eines Binokulars wurde der Hippocampus inklusive entorhinalem Kortex herauspräpariert und mit einem Spatel auf die Unterlegscheibe eines Gewebeschneiders (Bachhofen, D) überführt. Mit dem Gewebeschneider, in dessen Schneidearm eine Rasierklinge eingespannt war, wurden 350 µm dicke Schnitte angefertigt, die mit einem Spatel in eiskaltes Präparationsmedium überführt und unter dem Binokular ausgewählt wurden. Die Schnitte, die den DG enthielten, wurden mit einer Pasteurpipette je vier Stück auf einen Zellkultureinsatz (Millipore, USA), welcher in einer 6-well-Platte mit auf 35°C vorgewärmtem Kulturmedium saß, aufgebracht. Mit der zweiten Hirnhemisphäre, die bis dahin in eiskaltem Präparationsmedium lagerte, wurde ebenso verfahren. Die Ausbeute lag zwischen 15-20 Hirnschnittpräparaten pro Tier.

3.1.2.3 Kultivierung

Die 6-well-Platten mit den Hirnschnitten wurden in einem Inkubator bei 35°C und 5% CO2 entsprechend dem experimentellen Ansatz 1-6 Tage kultiviert. Am Tag unmittelbar nach der Präparation und danach jeden zweiten Tag wurde das Kulturmedium unter sterilen Bedingungen gewechselt.

3.1.2.4 Tracen mit Mini Ruby

Für die Phagozytose-Experimente wurde das Faserbündel Tractus perforans, das vom entorhinalen Kortex in die Molekularschicht des Gyrus dentatus des Hippocampus projiziert, mit einem Farbstoff, der nur von lebenden Axonen anterograd transportiert wird, unmittelbar nach der Präparation markiert (Kluge et al. 1998) (Abb. 3). Dieser Farbstoff Mini Ruby (10kDA dextran amine; MoBiTec, D) ist mit Rhodamin und Biotin gekoppelt und konnte sowohl im Fluoreszenzmikroskop betrachtet,


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als auch mit einem Avidin-Biotin-Complex (Vector Laboratories, USA) und dem Chromogen 3,3‘Diaminobenzidine (DAB; Sigma) für die Durchlichtmikroskopie sichtbar gemacht werden. Ein bis drei Kristalle Mini Ruby wurden unter dem Mikroskop zwischen die Schicht II und III des entorhinalen Kortex jedes Hirnschnitts platziert. Im lebenden Hirnschnitt konnte die Mini-Ruby-Fluoreszenz bei einer Anregungswellenlänge von 520-550 nm mit einem inversen Licht- und Fluoreszenz-Mikroskop beobachtet und digital dokumentiert wurden (siehe Abschnitt 3.3.1.1.1.). Um die Kolokalisation von phagozytiertem axonalem Material und Mikrogliazellen zu zeigen, wurden die Mikrogliazellen mit dem Makrophagenmarker GFS-IB4 auf 20 µm dünne Kryostatschnitten gefärbt und mit einem konfokalen Laserscannermikroskop und der entsprechenden Hard- und Software dargestellt (siehe Abschnitt 3.3.1.1.2.).

Abb. 3: Schematische Darstellung der Tracing-Technik:

Im ersten Schritt wurden die Mini-Ruby-Kristalle in der Schicht I oder II des EC platziert. Nach 2 Tagen in Kultur (div) wurde der Farbstoff von den intakten Axonen des TP bis in die äußere Molekularschicht des DG transportiert. Dies konnte unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop beobachtet werden. Im dritten Schritt wurden nach der Fixierung Kryostatschnitte angefertigt und diese unter dem Fluoreszenzmikroskop oder nach einer ABC-DAB-Konvertierung unter einem Durchlichtmikroskop betrachtet. Die Mikrogliazellen waren, wenn sie axonales Material phagozytiert hatten, ebenfalls mit dem Tracer markiert. DG, Gyrus dentatus; ec, entorhinaler Kortex.

3.1.2.5 Färben der toten Zellen im lebenden Hirnschnitt mit Propidiumjodid

Der Farbstoff Propidiumjodid (PI) gelangt ausschließlich durch die geschädigte Membran von toten Zellen, lagert sich dort an die DNA an und färbt die Zellen \|--\| respektive die Zellkerne \|--\| von toten Zellen. Es wurde PI (Sigma) verwendet, um den Zelltod im Hirnschnitt nach Behandlung mit T Zellen gegenüber der unbehandelten Kontrolle darzustellen.

In der Konzentration von 5 µg/ml wurde PI direkt in das Kulturmedium unter die Membran, auf der die Hirnschnitte kultiviert wurden, gegeben und für 30 min im Brutschrank inkubiert. Jeder Zellkultureinsatz wurde dreimal in frisches Kulturmedium, das sich in Petrischalen befand, eingetaucht und danach in eine neue 6-well-Platte mit frischem Kulturmedium überführt. Die Hirnschnitte wurden für 10 min im Brutschrank gewaschen. Der Waschschritt wurde mit frischem Kulturmedium wiederholt. Nach insgesamt 30 min Färbung und 20 min Waschen konnten die Hirnschnitte mit dem inversen Fluoreszenzmikroskop betrachtet und digitale Aufnahmen von den kompletten lebenden Hirnschnitten gemacht wurden.

3.1.2.6 Fixierung

Die Hirnschnittkulturen wurden je nach experimentellem Ansatz am Tag 0, 1, 6 oder 7 der Kultivierung mit 4% Paraformaldehyd (Sigma) in Aqua bidest über Nacht im Kühlschrank fixiert. Die fixier


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ten Kulturen wurden mit 0,1 M PB für je 10 min auf dem Schüttler gewaschen und danach in 0,8 M Saccharose überführt und bei 4°C gelagert. Nach 3 Tagen wurde die 0,8 M Saccharose gegen 1 M Saccharose und nach weiteren 3 Tagen gegen 1,4 M Saccharose ausgetauscht. Die Schnitte wurden dadurch in ihrer Dichte dem Gefriermedium angeglichen womit ein besserer Gewebeerhalt garantiert werden konnte.

Die Schnitte, welche mit den Antikörpern ICAM-I, MHC-II, CD40, B7-1 und B7-2 gefärbt werden sollten, wurden mit einem speziellen Fixationsmedium, das erfahrungsgemäß geeigneter für diese Antikörper ist, fixiert. Das Fixationsmedium bestand aus 4% Paraformaldehyd und 15% Pikrinsäure in 0,1 M PB. Unter Zusatz von 0,1% Glutaraldehyd (Serva, D) wurden die Schnitte für 15 min bei Raumtemperatur (RT) fixiert und für zweimal 10 min auf dem Schüttler mit 0,1 M PB gewaschen. Es folgte ein weiterer Fixationsschritt für 1 h aber ohne Glutaraldehyd. Abschließend wurden die Schnitte wieder 2 Mal für 10 min auf dem Schüttler bei RT mit 0,1 M PB gewaschen und wie oben beschrieben bis zum Schneiden mit dem Kryostaten bei 4°C in Saccharose gelagert.

3.1.2.7 Kryostatschnitte

Nach einer Lagerungszeit von mindestens 6 Tagen konnten die Schnitte am Jung Kryostaten 2800 Frigocut-E (Cambridge Instruments, D) bei -31°C 20 µm dick geschnitten werden. Diese Dünnschnitte wurden sofort auf gelatinierte Objektträger aufgebracht und über Nacht bei RT getrocknet. Die Immunhistochemie wurde an diesen Schnitten auf dem Objektträger durchgeführt.


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3.2 T Zellen

3.2.1 Zusammensetzung der Medien

3.2.1.1 Phosphatpuffer/Saline (PBS)

Agens

Menge

Firma

0,1 M Phosphatpuffer (PB)

50 ml

Selbst hergestellt

NaCl

8,76 g

Sigma

KCL

200 mg

Sigma

Aqua bidest

9950 ml

Selbst hergestellt

3.2.1.2 FACS-Puffer

Agens

Konzentration

Firma

PBS

 

Selbst hergestellt

Bovine Albumin Serum (BSA)

0,5%

Serva

Natriumazid NaN3

0,01%

Sigma

3.2.1.3 MACS-Puffer (steril)

Agens

Konzentration

Firma

PBS

 

Selbst hergestellt

fetal calf serum (FCS)

1%

Gibco

EDTA

2 mM

Sigma

3.2.1.4 T Zell Medium (cRPMI) für die Mauszellen (steril)

Agens

Konzentration

Firma

RPMI-1640

 

Gibco

L-Glutamin 200mM

2 mM

Gibco

2-Mercaptoethanol

50 µM

Sigma

Penicillin/Streptomycin

100 U/ml 100 µg/ml

Sigma

FCS

10%

Gibco

3.2.1.5 Propagationsmedium für die Rattenzellen (steril)

Agens

Konzentration

Firma

DMEM

500 ml

Biological Industries, Israel

L-Glutamin 200mM

2 mM

Biological Industries

Penicillin/Streptomycin

100 U /100 µg/ml

Biological Industries

beta-Mercaptoethanol

50 µM

Biological Industries

Sodium Pyruvate

1 mM

Biological Industries

non-essential amino acids

1%

Biological Industries

FCS

10%

Gibco


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T cell growth factor (TCGF) konditioniertes Medium

10%

selbst hergestellt aus dem Überstand von Convalin-A stimulierten Milzzellen (Mor et al. 1990)

3.2.1.6 Proliferationsmedium für die Rattenzellen (steril)

Agens

Konzentration

Firma

DMEM

500 ml

Biological Industries, Israel

L-Glutamin 200mM

2 mM

Biological Industries

Penicillin/Streptomycin

100 U /100 µg/ml

Biological Industries

beta-Mercaptoethanol

50 µM

Biological Industries

Sodium Pyruvate

1 mM

Biological Industries

non-essential amino acids

1%

Biological Industries

autologes Rattenserum

1%

selbst hergestellt (Mor et al. 1990)

3.2.1.7 Antigene zur Stimulation der Rattenzellen

Antigen

Form

Konzentration

Firma

OVA

komplettes Protein

10 µg/ml

Sigma, Israel

MBP

komplettes Protein

10 µg/ml

isoliert aus dem Rückenmark von Meerschweinchen (Ben-Nun und Cohen 1982)

Copaxone 1

synthetisches Peptid
(Teitelbaum et al. 1971)

10 µg/ml

Teva Pharmaceuticals, Israel

3.2.1.8 Antigene zur Stimulation der Mauszellen

Für die primäre Aktivierung und jede folgende Restimulation wurden 3 µg/ml MBP-Peptid Ac1-11 (MGNHSGKRELS) (Pepscan Immunoanalytic, D) oder 1 µg/ml cOVA323-339 (ISQAVHAAHAEINEAGR) (Pepscan Immunoanalytic, NL) in cRPMI eingesetzt.

3.2.1.9 Zytokine

Um Th1 Zelllinien zu erhalten, wurden 1 µg/ml rekombinantes Maus IL-12 (R&D Systems, UK) und anti-Maus IL-4 (Pharmingen) in cRPMI benutzt. Um Th2 Zelllinien zu erhalten, wurden 1 mg/ml rekombinantes Maus IL-4 (Biosource, SA) und 1 µg/ml anti-Maus IL-12 (R & D Systems) in cRPMI benutzt.

Um die Wirkung von Zytokinen auf die Hirnschnittkultur zu testen, wurden diese mit rekombinantem, murinem IFN-gamma in den Konzentrationen 2, 10 und 50 ng/ml oder mit TNF-alpha in den Konzentrationen 100 und 500 pg/ml am Tag 6 der Kultur behandelt (beide Zytokine Pepro Tech Inc., USA; spezifische Aktivität: >107 U/mg).


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3.2.2 Die transgenen Mausstämme - Test auf Transgenität

Reine Th1 und Th2 Zelllinien wurden aus transgenen Tieren gewonnen, deren T Zellen einen Rezeptor (TCR) spezifisch für das entsprechende Antigen tragen. Die DO11.10 Tiere, deren TCR spezifisch für Ovalbumin (OVA) ist (Murphy et al. 1990), sind freundlicherweise von Frau Brunner-Weinzierl aus dem Rheumaforschungszentrum Berlin zur Verfügung gestellt worden. Die Tiere, die wir für unsere Experimente verwendet haben, wurden im Rheumaforschungszentrum mit der dort etablierten Standardmethode (RT-PCR) auf ihre Transgenität hin getestet.

Die transgenen MäuseTg4, deren T Zellen einen TCR spezifisch für das myelinbasische Protein (MBP) tragen, haben wir von David Wraith aus Bristol erhalten (Lui et al. 1995). Die letztgenannten Tiere wurden im hauseigenen Tierstall gezüchtet und von uns in einem Alter von 6-8 Wochen auf Transgenität getestet. Dazu wurden jeder Maus 50 µl Blut aus der Schwanzvene entnommen und in 500 µl 2 mM EDTA in einem Eppendorfgefäß aufgenommen. Zwei B10.PL Mäusen, dem genetischen Hintergrundstamm der Tg4 Tiere, wurde ebenfalls Blut abgenommen, das als Kontrolle bei der FACS Messung verwendet wurde. Diese Lösung wurde mit 500 µl Histopaque-1083 (Sigma) unterschichtet, um einen Dichtegradienten zu erzeugen und Erythrozyten von Leukozyten zu trennen. Nach einer 20minütigen Zentrifugationszeit bei 2000 rpm konnte der Lymphozytenring vorsichtig abpipettiert und in 1 ml FACS-Puffer in einem FACS-Röhrchen aufgenommen wurden. Die übrigen Proben wurde 6 min bei 1200 rpm zentrifugiert, der Überstand dekantiert und die Zellen im Pellet mit 2 primären Antikörpern gefärbt. Die Färbungen erfolgten immer in einem Volumen von 50 µl FACS-Puffer. Der biotinyliertem Antikörper Vß8.1/2 markiert alle T Zellen, die einen TCR spezifisch für MBP tragen und der direkt mit Fluoresceine Isothiocyanate (FITC) gekoppelte CD4 Antikörper alle CD4+ Zellen. Beide AK wurden in der Konzentration 1 µg/ml eingesetzt. Die Inkubationszeit betrug 10 min bei Raumtemperatur (RT). Alle FACS-Röhrchen wurden mit 1 ml FACS-Puffer aufgefüllt, 6 min bei 1200 rpm zentrifugiert und der Überstand dekantiert. Der Waschvorgang wurde wiederholt. Da der Vß8.1/2 AK nicht direkt an eine Fluoreszenz gebunden ist, wurde er mit Avidin-Strepavidin -Phycoerythrin (PE) gekoppelt, das bei einer Anregung von 568 nm rote Fluoreszenz emittiert. Die Zellen wurden im Dunkeln bei RT für 10 min mit dem AK inkubiert. Es folgten zwei Waschschritte und das resultierende Zellpellet wurde in 300 µl FACS-Puffer aufgenommen. Die Zellen wurden mit einem FACStracTM-Gerät (Becton Dickinson, San Jose, USA) gemessen. Die Abb. 4 auf der folgenden Seite zeigt ein typisches Verteilungsmuster der Zellen für ein positiv transgenes Tier: Die meisten T Zellen befinden sich im Quadranten UR, der doppelt markierte Zellen beinhaltet. Im Quadranten LL ist die Autofluoreszenz der Zellen dargestellt, die mit der ungefärbten Probe eingestellt wurde. Zum Einstellen der Einzelfluoreszenzen wurden die einzeln gefärbten Proben verwendet: in UL sieht man alle nur Vß8.1/2 positiven und in LR alle nur CD4 positiven Zellen.


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Abb. 4: Schematische Darstellung eines Dotplots für zwei Fluoreszenzen (FITC für z.B. CD4+ und PE für z.B. Vß8.1/2).

UL, upper left (oben links); UR, upper right (oben rechts); LL, lower left (unten links); LR, lower right (unten rechts). Im LL: Autofluoreszenz; LR: nur FITC-gefärbte Zellen (CD4+, Vß8.1/2-); UL: nur PE-gefärbte Zellen (Vß8.1/2+, CD4-); UR: doppelt positive Zellen (Vß8.1/2+, CD4+).

3.2.3 Präparation der T Zellen aus Milz und Lymphknoten

Alle folgenden Arbeiten sind unter sterilen Bedingungen und mit sterilen Arbeitsmaterialien durchgeführt worden. Die Tiere wurden in einem verschließbaren Glasgefäß, welches saugfähiges Papier mit Äther (Braun) enthielt, für 30-60 Sekunden betäubt. Durch kräftigen Gegenzug von Kopf und Schwanz wurde ihnen das Genick gebrochen. Unter einer Sterilbank (Lamina Flow) wurden die Tiere mit 70% Alkohol äußerlich gereinigt und mit der Bauchseite nach oben fixiert. Mit einer Operationsschere und -pinzette wurde die äußere Bauchhaut vom Schwanz bis zum Kopf aufpräpariert. Die Lymphknoten wurden mit einer spitzen Pinzette herauspräpariert und in eiskaltes RPMI-Medium überführt. Mit einer zweiten Operationsschere wurde die innere Bauchhaut geöffnet und die Milz in ein separates Gefäß mit RPMI überführt. Die Kapseln der Lymphknoten wurden mit einer Schere leicht aufgeschnitten und mit dem Stempel einer sterilen Spritze durch ein Sieb (Falcon) in ein neues Gefäß mit RPMI gedrückt. Die Milz wurde ebenfalls durch ein Sieb in ein weiteres Falconröhrchen mit RPMI gedrückt. So konnte der Gewebeverband aufgelockert und die Zellen vereinzelt werden.


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Arbeitsschritt

Medium/Puffer

Menge

Zeit

Temperatur

Zentrifugation

Komprimieren der Milzzellen

RPMI

5 ml

6 min

4°C

1100 rpm

Lysieren der Erythrozyten

0,83% NH4Cl

5 ml

5 min

RT

 

Stoppen der Lyse

RPMI

15 ml

 

RT

 

Komprimieren

RPMI

20 ml

6 min

4°C

1100 rpm

Zusammenführen der Zellen aus Milz und Lymphknoten

RPMI

10 ml

 

Auf Eis

 

Zählen der Zellen mit Neubauer-Zählkammer

1:2 RPMI und Trypanblau (färbt tote Zellen)

10 µl

 

RT

 

Komprimieren

RPMI

10 ml

6 min

4°C

1100 rpm

Aussäen der Zellen in 6-well-Platten

cRPMI + Antigene oder Zytokine oder PMA/Ionomycin

1x bis 2x 106 Zellen/ml 5ml / well

 

 

 

3.2.4 Das MACS-System zum Sortieren der Zellen vor der Kokultivierung

Das Magnetic Activated Cell Sorting (MACS; Miltenyi Biotech GmbH, D) arbeitet mit submikroskopisch kleinen, super-paramagnetischen, antikörpergekoppelten Kügelchen, die keinen Einfluss auf die Funktionalität der Zellen haben (Schumm et al. 1999). Das Zelleluat wird über eine Säule geleitet, die in einen Magneten eingespannt ist. Zellen, die mit dem AK markiert waren, wurden von diesem Magneten in der Säule zurückgehalten, die anderen Zellen flossen durch die Säule durch. Bei einer Negativselektion wurden die Zellen, die durch die Säule gelaufen waren, aufgefangen. Bei einer Positivselektion musste die Säule aus dem Magnetfeld entfernt, und die markierten Zellen mit einem Stempel und ca. 5 ml MACS-Puffer aus der Säule gedrückt werden. Für meine Experimente habe ich die Positivselektion mit dem Antikörper für CD4+ T Zellen verwendet. Für unterschiedliche Zelltypen. (Th1, Th2, MBP, OVA) wurden verschiedene steril einzelverpackte Säulen verwendet. Nachfolgend ist der experimentelle Ablauf dargestellt:


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Arbeitsschritt

Medium/Puffer

Menge

Zeit

Temperatur

Zentrifugation

Komprimieren

CRPMI

Gesamtes Volumen

6 min

4°C

1100 rpm

Waschen

MACS-Puffer

5 ml

6 min

4°C

1100 rpm

Zählen der Zellen

1:2 MACS-Puffer und Trypanblau

10 µl

 

RT

 

Komprimieren

MACS-Puffer

10 ml

6 min

4°C

1100 rpm

Inkubation mit dem Antikörper

MACS-Puffer :AK 10:1

10 µl AK x 107 Zellen

15 min

4°C

 

Komprimieren

MACS-Puffer

5 ml

6 min

4°C

1100 rpm

Säule(n) waschen

MACS-Puffer

3 ml

 

4°C

 

Zellpellet(s) auf die Säule(n) geben

MACS-Puffer

1 ml

 

4°C

 

Säule(n) waschen

MACS-Puffer

3 x 1 ml

 

4°C

 

Positivselektion Eluat aus der Säule auffangen

RPMI

10 ml

 

RT

 

Zählen der Zellen

1:2 RPMI und Trypanblau

10 µl

 

RT

 

Komprimieren

RPMI

10 ml

6 min

RT

1100 rpm

2 x Waschen

Kulturmedium Hirnschnitte

5 ml

6 min

RT

1100 rpm

Kokultur der T Zellen mit den Hirnschnitten

Kulturmedium Hirnschnitte

5 µl mit
3 x 104 Zellen

24-48 h

37°C

 

3.2.5 Intrazelluläres Markieren von T Zellen

Unmittelbar vor der Kokultivierung wurden in einigen Versuchsansätzen die T Zellen vormarkiert, um sie später im Hirnschnitt als eingewanderte T Zellen zu identifizieren. Dazu wurde das Zellpellet nach der MACS-Aufreinigung in einem Volumen von 300 µl PBS mit 50 µM Carboxyfluorescein Diacetat Succinimidyl Ester (5(6)-CFDA-SE, mixed isomers, MoBiTec) für 5 min bei RT inkubiert, zweimal mit Hirnschnitt-Kulturmedium gewaschen und darin in der entsprechenden Konzentration aufgenommen. Für die Invasion wurden die Zellen in einer Konzentration von 30.000 Zellen in 5 µl und für die Subkultivierung unter den Membranen mit den Hirnschnitten in einer Konzentration von 106/ml eingesetzt.


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3.2.6 MBP-spezifische und unspezifisch aktivierte T Zellen

Dem Medium für die Zellen aus den MBP transgenen Tieren wurde 3 µg/ml MBP-Peptid zugesetzt, um nur die MBP spezifischen T Zellen zur Proliferation anzuregen.

Zur unspezifischen Stimulation wurden die Zellen aus den B10.PL-Mäusen in T Zell Medium (5 ml/ well) mit 5 ng/ml phorbol myristate acetate (PMA) (Sigma) und 1 µg/ml Ionomycin (Sigma) für 2-12 Stunden inkubiert. Danach wurden durch zwei Zentrifugationsschritte die Agenzien wieder ausgewaschen.

Nach 48 Stunden wurde ein Teil der spezifischen und unspezifischen Zellen mit dem MACS-System nach CD4+ sortiert und die Kokultur mit den Hirnschnitten gestartet. Zur Charakterisierung der T Zellen wurden zum selben Zeitpunkt ca. 1 Millionen Zellen in 2% Paraformaldehyd in PBS für 15 min bei RT fixiert, zweimal mit PBS gewaschen und in FACS-Puffer bis zur FACS-Analyse bei 4°C aufbewahrt. Die Überstände aus der Zellkultur wurden bei -20°C bis zum Test mit ELISAs (Punkt 3.3.2.) gelagert.

3.2.7 MBP- und OVA-spezifische Th1 und Th2 Zellen

Die Vorteile von OVA spezifischen gegenüber unspezifischen T Zellen bestehen darin, dass eine ZNS-Kreuzreaktion absolut ausgeschlossen werden kann, dass die Zellen antigenspezifisch stimuliert werden können und mit einer zusätzlichen Gabe des OVA-Antigens während der Experimente die nicht-ZNS-spezifische Antigenabhängigkeit getestet werden kann.

Arbeitsschritt

Medium/Puffer

Menge

Zeit

Temperatur

Zentrifugation

Inkubation

(Proliferation)

Th1/Th2 Zytokine + 3 µg/ml MBP oder + 1 µg/ml OVA

5 ml pro well

2-3 Tage

37°C

 

Inkubation

(Propagation)

CRPMI

100 U/ml IL-2

5 ml pro well

3-4 Tage

37°C

 

Die spezifische Restimulation erfolgt über die Präsentation von MBP- oder OVA-Peptid durch Antigen präsentierende Zellen aus den Milzen von Tieren des entsprechenden genetischen Hintergrundstammes B10.PL oder BALB/c (siehe Punkt 3.2.3).

Bestrahlung,

RPMI

10 ml

ca. 15 min

Auf Eis

26 Gray

Zählen der APCs

1:2 RPMI und Trypanblau

10 µl

 

RT

 

Komprimieren der T Zellen

CRPMI

 

6 min

RT

1100 rpm

Zählen

1:2 RPMI:Trypanblau

10 µl

 

RT

 

Zusammenführen der APCs mit den kultivierten T Zellen (min 2:1)

CRPMI

10 ml

 

Auf Eis

 

Komprimieren

CRPMI

10 ml

6 min

4°C

1100 rpm


26

Aussäen der Zellen in 6-well-Platten

Th1/Th2 Zytokine + 3 µg/ml MBP oder + 1 µg/ml OVA

1 x bis 2 x 106Zellen/ml

 

 

 

Inkubation

(Proliferation)

Th1/Th2 Zytokine + 3 µg/ml MBP oder + 1 µg/ml OVA

5 ml pro well

2-3 Tage

37°C

 

Inkubation

(Propagation)

CRPMI

100 U/ml IL-2

5 ml pro well

3-4 Tage

37°C

 

2. Restimulation

 

 

 

 

 

Inkubation

cRPMI + Antigen

 

24-48 h

37°C

 

Die zweite Restimulation erfolgt nur mit dem entsprechenden Antigen ohne Zytokine, da die T Zellen zu diesem Zeitpunkt schon in Th1 oder Th2 Richtung ausdifferenziert sind. 24-48 h nach der zweiten Restimulation wurden mit dem MACS-System die CD4+ Zellen separiert und mit den Hirnschnitten kokultiviert. Ein geringer Teil der Zellen wurde fixiert, in FACS-Puffer aufgenommen und bis zur Analyse mit dem Durchflusszytometer (FACS) bei 4°C gelagert. Der Überstand der Zellen wurde für ELISA Tests (Punkt 3.3.2.) auf IFN-gamma (Th1) und IL-4 (Th2) bei -20°C gelagert. Wurden die Zellen nicht sofort verwendet, konnten sie zum Zeitpunkt der Restimulation für spätere Versuche in Gefriermedium (PBS, 1% FCS, 1% DMSO) eingefroren und bei -80°C (bis zu einer Woche) oder in flüssigem Stickstoff (mehrere Monate) gelagert werden.

3.2.8 MBP-, Copaxone 1- und OVA-spezifische T Zelllinien

Die T Zelllinien wurden aus Zellen generiert, die aus den abfließenden Lymphknoten von mit MBP, OVA oder Copaxone 1 immunisierten erwachsenen Lewis Ratten isoliert wurden (Ben-Nun 1982; Moalem 1999). Das entsprechende Antigen wurde in PBS gelöst (1 mg/ml), mit incomplete Freunds adjuvant (Difco Laboratories, USA) emulgiert und mit 5 mg/ml Mycobacterium tuberculosis (Difco) angereichert. Zehn Tage nach der Injektion in die Hinterläufe der Ratten (100 µl Emulsion), wurden die Ratten getötet, die abfließenden Lymphknoten entfernt und die Zellen vereinzelt. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, mit dem entsprechenden Antigen aktiviert (10 µg/ml) und in Proliferationsmedium kultiviert. Nach 72 Stunden wurden die Zellen in Propagationsmedium für weitere 4-10 Tage überführt. Anschließend erfolgte eine Restimulation mit ihrem Antigen (10 µg/ml) in Anwesenheit von bestrahlten Thymuszellen (107 Zellen/ml; 2000 rad) in Proliferationsmedium. Die Zelllinien konnten durch wiederholte Stimulation und Propagation expandiert werden. Die in diesem Experiment verwendeten Zelllinien wurden in Israel eingefroren, auf Trockeneis hierher transportiert, bei 37°C im Wasserbad aufgetaut und über Nacht in Propagationsmedium kultiviert. Erst unmittelbar vor dem Beginn der Kokultur mit den Hirnschnitten, erhielten die Zellen ihr entsprechendes Antigen und bestrahlte Thymuszellen einer adulten Lewis Ratte als APCs. Die Konzentration der T Zellen auf dem Hirnschnitt betrug 30 000/5 µl und unter dem Hirnschnitt 500 000/ml. Der Versuchsablaufs ist auf der folgenden Seite in Abb. 5. zusammengefasst.


27

Abb. 5: Schematische Darstellung des Versuchsablaufs.


28

3.3 Diagnostische Methoden

3.3.1 Immunhistochemie

Die Immunhistochemie nutz das Antigen-Antikörper-Prinzip. Der Antikörper für ein bestimmtes Antigen einer Tierart (z.B. Maus-CD80) wird in einer anderen Tierart (z.B. Ratten) hergestellt. Dafür werden die Ratten mit dem Maus-Antigen immunisiert. Es findet eine Immunreaktion statt und die produzierten Antikörper (anti-Maus-CD80) können aus dem Blut der Ratten isoliert und aufgereinigt werden. Antikörper werden entweder direkt mit einer Fluoreszenz oder Biotin gekoppelt oder sie werden ungekoppelt angeboten. Die an ihr Antigen gebundenen biotinylierten AK wurden bei den Untersuchungen über einen Avidin-Biotin-Complex und das Chromogen 3,3‘Diaminobenzidine (DAB) für die Durchlichtmikroskopie als schwarz/brauner Niederschlag sichtbar gemacht. Ungekoppelte primäre AK wurden mit einem sekundären, fluoreszierenden AK markiert, der sich gegen Immunglobuline der Tierart richtete, in welcher der primäre AK hergestellt wurde. Es folgt der Ablauf einer immunhistochemischen Färbung am Beispiel des Antikörpers Ratte-anti-Maus-B7-1 (CD80):

Arbeitsschritt

Medium/Puffer

Menge

Zeit

Temperatur

Blockieren der endogenen Peroxidase

3% H2O2 in 0.1 M PB

150 ml in Küvette

20 min

RT

Waschen

0.1 M PB

150 ml in Küvette

2 x 10 min

RT/Schüttler

Blockieren unspezifischer Fc Bindungsstellen

Fc-Block CD16/32 1:10 in 0.1 M PB

je 40 µl pro Schnitt auf Objektträgern (OT)

30 min

RT

Fc-Block entfernen

ablaufen lassen

 

 

RT

Inkubation mit primärem Antikörper

CD80, biotinyliert 1:100 in 0.1 M PB

40 µl pro Schnitt auf OT

über Nacht

RT

Waschen

0.1 M PB

150 ml in Küvette

3 x 10 min

RT/Schüttler

sekundäre Kopplung Avidin-Biotin-Komplex (ABC)

je 15 µl A und B Reagenz auf 1ml 0.1 M PB

40 µl pro Schnitt auf OT

1 h

RT

Waschen

0.1 M PB

150 ml in Küvette

2 x 10 min

RT/Schüttler

Farbsubstratreaktion

DAB 0,7 mg/ml; H2O2 0,1% in 0.1 M PB

40 µl pro Schnitt auf OT

ca. 10 min

RT unter dem Abzug (DAB gilt als kanzerogen)

Reaktion stoppen

0.1 M PB

150 ml in Küvette

 

RT

Waschen

0.1 M PB

150 ml in Küvette

2 x 10 min

RT/Schüttler

Eindeckeln der OT

Immumount, Deckgläschen

2-3 Tropfen pro OT

 

RT

Trocknen

 

 

über Nacht

RT


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Die folgenden Antikörper und Reagenzien wurden in meiner Arbeit verwendet:

Primäre Antikörper

Host species

Kopplung

Verdünnung

Firma

Funktion

CD40

Ratte

keine

1:100

Pharmingen, USA

Kostimulation

ICAM-1

Ratte

keine

1:100

Serotech, USA

Adhäsion, Kostimulation

MHC-II

Ratte

Keine

1:100

Serotech

Antigenpräsentation/Aktivierung

B7-1 (CD80)

Hamster

Biotin

1:100

Pharmingen

Kostimulation/Aktivierung

B7-2 (CD86)

Hamster

Biotin

1:100

Pharmingen

Kostimulation/Aktivierung

CD16/32

Hamster

keine

1:10

Pharmingen

Fc-Rezeptor Block

Sekundäre AK und Reagenzien

Host species

Kopplung

Verdünnung

Firma

Anti-rat-Ig-Alexa 568

Ziege

PE

1:200
(10 µg/ml)

MoBiTech

Strepavidine

keine

Texas Red

1:200

MoBiTech

ABC-Kit

keine

horse reddish peroxidase (HRP)

 

Vector Laboratories, UK

DAB

keine

keine

0.7 µg/ml

Sigma

Marker

Kopplung

Verdünnung

Firma

Funktion

Mini Ruby

Rhodamin und Biotin

keine

MoBiTech

Anterograder Transport in Axonen im lebenden Schnitt

Propidiumjodid

keine

5 µg/ml

Sigma

Marker für tote Zellen (DNA-Fragmente) - im lebenden Schnitt

GFS-IB4

FITC oder Biotin

1:40

Sigma

Mikrogliamarker


30

3.3.1.1 Bildgebende Verfahren - Mikroskopie

3.3.1.1.1 Konfokale-Laserscanner-Mikroskopie

Die Kolokalisation von Signalen wurde mit einem Leica DM IRBE inversen konfokalen Laserscanner-Mikroskop (Leica Camera AG, D), das mit einem Argon/Kryptonlaser, halbapochromatischen Objektiven (Plan Fluotar, Leica) mit numerischen Aperturen von 0,3 (10x), 1,0 (40x) und 1,3 (100x) und der Software ScanWare 5.10. ausgestattet war, dokumentiert. Die doppelt gefärbten und eingedeckelten 20 µm Schnitte wurden gleichzeitig durch zwei Filter mit den exitatorischen Wellenlängen 488nm und 568nm gescannt. Die Einstellungen der Detektionssysteme wurde mit Kontrollschnitten überprüft, um auszuschließen, dass die Emissionen der kurzwelligen Fluochrome auch im langwelligen Bereich detektiert wurden und vice versa. Dazu wurden einfach-markierte Gewebeschnitte mit beiden Anregungswellenlängen analysiert. Die Sensitivität der beiden Filter wurde so eingestellt, dass sie die Fluorochrome selektiv einzeln detektierten.

3.3.1.1.2 Fluoreszenz- und Durchlichtmikroskopie

Durchlicht- und Einzelfluoreszenzaufnahmen wurden mit einem Fluoreszenz- und Durchlichtmikroskop aufgenommen, das mit drei Filtern (für grüne, rote und Doppeltfluoreszenz) und Objektiven mit 2,5x, 10x, 20x, 40x, 60x, 100x Vergrößerung ausgestattet war. An das Mikroskop (Olympus, BX50, Japan) war eine digitale Kamera (Olympus) angeschlossen, die mit der Software SensiCam 3.0 gesteuert wurde. Alle Aufnahmen wurden im Schwarz/Weiß Modus entweder mit 200x oder 400x Vergrößerung erstellt und als Bitmaps gespeichert. Die Bilder wurden in Photoshop 5.0 in den RGB-Modus umgewandelt und - wenn Kolokalisationen beobachtet werden sollten - übereinandergelagert.

Zur Dokumentation des Tracings oder der PI Färbung im lebenden Hirnschnitt wurde ein inverses Durchlicht- und Fluoreszenzmikroskop (Olympus, IX70) verwendet, an das eine digitale Kamera (Olympus) angeschlossen war, die mit der Software SensiCam 3.0 gesteuert wurde. Die farbigen Aufnahmen wurden mit 25x oder 100x Vergrößerung durch einen Filter mit der exitatorischen Wellenlänge von 520-550nm gemacht. Sollte die Emission der Fluoreszenzen ausgewertet werden, wurden alle RGB-Bilder in Graustufenbilder umgewandelt (Photoshop 5.0) und mit dem Bildverarbeitungsprogramm Metamorph analysiert.

3.3.2 Enzym-Linked-Immuno-Sorbent-Assay (ELISA)

Zur Detektion freigesetzter Zytokine wurden sogenannte „Sandwich-ELISAs“ eingesetzt. „Sandwich-ELISAs“ bestehen im Prinzip aus zwei Antikörpern gegen dasselbe Antigen. Einer der beiden Antikörper ist als „capture“-Antikörper an ein Reaktionsgefäß (üblicherweise eine 96-well Zellkulturplatte) gebunden. Nach Zugaben des zu vermessenden Zellkulturüberstandes fängt dieser Antikörper das Antigen (hier Zytokine) aus der Lösung heraus. Nach Auswaschen des Zellkulturüberstandes wird der zweite „detecture“-Antikörper zugegeben, der das Antigen an einem anderen Epitop bindet. An den zweiten Antikörper ist Horseradishperoxidase (HRP) gekoppelt. Nach der Zugabe eines Chromogens, das durch HRP und ebenfalls zugesetztes Wasserstoffperoxyd zu einem Farbstoff oxidiert wurde, konnte die Antigenkonzentration anhand der Farbintensität in einem


31

Spektrophotometer/ELISA-Reader bestimmt werden. Durch das Mitführen von Standardproben bekannter Konzentration wurde eine Referenzgerade erstellt, mit der die Konzentration der Proben berechnet wurde. Der Leerwert, die sieben Standards und die Proben wurden in Duplikaten in einer 96-well Platte gemessen. Die Proben (2x100 µl) wurden aus den innerhalb einer Gruppe (Th1 oder Th2) gepoolten Überständen von 30 bis 50 Millionen Zellen entnommen, die in einer Konzentration von 2 Millionen Zellen/ml in 6-well Platten (5 ml pro well; 10 Millionen Zellen pro well) kultiviert wurden. Die ELISAs wurden vornehmlich zum Testen der Th1/Th2 Charakteristik verwendet. Folgende Zytokine wurden bestimmt:

Zytokin

Funktion

Firma

IFN-gamma

inflammatorisch (Th1)

Pharmingen; OptEIATM -Kit

TNF-alpha

inflammatorisch/zytotoxisch (T Zellen und Makrophagen)

Pharmingen; OptEIATM -Kit

IL-4

anti-inflammatorisch (Th2)

Pharmingen; OptEIATM -Kit

3.3.3 Fluorescence activated cell sorting (FACS)

Mit einem Fluorescence Activated Cell Sorter kann man Einzelzellen charakterisieren. Die Zellen wurden mit einem an Fluoresceine (FITC) oder Phycoerythrin (PE) gekoppeltem Antikörper markiert und in den Strahlengang zweier Laser gebracht. Die Laser regen die entsprechenden Fluoreszenzfarbstoffe zur Emission eines Lichts bestimmter Wellenlänge an. Die Anregungswellenlängen (Excitation) sind für FITC 488 nm und für PE 585 nm. Durch die passenden Filter hindurch, erkennt ein Photosensormeter die Signale, die von den Zellen ausgehen und misst diese. Mit einem an das Gerät angeschlossenen Computer und der Software CellQuest der Firma Becton Dickinson wurden diese Signale in einem Dot-Plot oder Histogramm dargestellt. Ein ausführliches Beispiel für die Verfahrensweise wird in Punkt 3.2.2. gegeben. Für meine Fragestellungen bestimmte ich die Expression folgender Aktivierungsmarker auf T Zellen:

Antikörper

Kopplung des AK

Verdünnung

Firma

Funktion

CD4

FITC

1 µg/ml

Pharmingen

T Zell Marker

CD25

PE

1 µg/ml

Pharmingen

Proliferation

CD44

PE

1 µg/ml

Pharmingen

Adhäsion

CD49d

PE

1 µg/ml

Pharmingen

Passieren der Blut-Hirn-Schranke

CD69

PE

1 µg/ml

Pharmingen

Aktivierung

CD71

PE

1 µg/ml

Pharmingen

Proliferation

CD154 (CD40L)

PE

1 µg/ml

Pharmingen

Kostimulation

Vß8.1/2

Biotinyliert (2. AK SA/PE)

1 µg/ml

Pharmingen

Transgener T Zell Rezeptor


32

3.3.4 Auswertung und Analyse der Daten

Die Bildanalyse erfolgte für alle Experimente des Komplexes Neurodegeneration durch Auszählen von Zellen. Die genaue Anzahl der Experimente ist für jeden Abschnitt im Ergebnisteil angegeben. Das Auszählen erfolgte durch einen unabhängigen Beobachter. Zusätzlich wurde ein Zahlencode verwendet, um eine Beeinflussung durch Kenntnis der Behandlungsgruppe zu verhindern. Dabei wurden entweder die absolute Anzahl der Zellen bestimmt oder die Menge der Zellen, welche im gesamten Pool der Mikrogliazellen einen Marker expremieren. Diese Angaben erfolgten in Prozent. Alle Zellen sind pro Schnitt direkt am Mikroskop oder am Bildschirm ausgezählt worden.

Zur Auswertung der Propidiumjodid-Bilder im Komplex Neuroprotektion, die von den Kryostatschnitten aufgenommen wurden (20 µm bei 200xVergrößerung), wurde ein Computerprogramm verwendet, welches von unserem Spezialisten für Morphometrie Dr. K. Roth entwickelt worden ist und auf den Softwarebausteinen von AMBA beruht. Dieses Programm hat in einem von mir vorgegebenen Polygon, welches die Zellbänder des Gyrus dentatus enthielt, Pixel gemessen und gezählt, die einen bestimmten, von mir nach Erfahrungswerten gesetzten Schwellenwert überstiegen. Die Fläche des Polygons und die Pixelzahl wurden automatisch in eine Textdatei geschrieben, die zusätzlich den Namen des analysierten Bildes, die Pixelzahl in Zellzahlen umgerechnet (angenommene durchschnittliche Zellfläche: 60 µm2) und diese Zellzahl auf die Polygonfläche und eine genormte Fläche von 100 000 µm2 bezogen enthielt. Die auf 100 000 µm2 normalisierte Anzahl der Zellen wurde für die weitere Analyse verwendet. Die Auswertung der PI Bilder der lebenden Hirnschnitte (ca. 250-300 µm bei 100xVergrößerung), die mit dem inversen Fluoreszenzmikroskop aufgenommen wurden, erfolgten mit dem Programm Metamorph. Im Areal des Gyrus dentatus wurde von jedem einzelnen Graustufenbild (Bitmap) die Intensität gemessen und in eine EXCEL Tabelle eingefügt. Da die ausgewerteten Zellbänder zu 99% ausschließlich Neurone enthalten, wurde davon ausgegangen, dass jede mit PI angefärbte Zelle in diesen Arealen ein Neuron war.

Wurden mehr als zwei Gruppen normalverteilter Daten miteinander verglichen, wurde zuerst ein 1-Weg-ANOVA-Test (parametrische Varianzanalyse) verwendet. Die Gruppen untereinander wurden paarweise mit einem Kontrast-t-Test geprüft. Bei einem Vergleich von Daten aus mehr als zwei Gruppen, die nicht normalverteilt waren, wurde der parameterfreie Friedman-Test benutzt. Die Analyse von Daten mit mehreren voneinander abhängigen Variablen sind von einer Biostatistikerin aus dem Weizmann Institut (Israel) zusätzlich mit einem 3-Wege-ANOVA-Test geprüft worden. Nicht normalverteilte Daten aus zwei Gruppen wurden mit dem parameterfreien Rangsummentest nach Mann und Whitney geprüft. Normalverteilte Daten aus zwei Gruppen wurden mit dem t-Test geprüft. Das Signifikanzniveau wurde auf p = 0.05 festgelegt. Dies bedeutet, dass nur 5% der gefundenen signifikanten Unterschiede zwischen Gruppen von Daten zufällig sind. Die jeweilige Art des statistischen Prüfverfahrens ist in jedem Abschnitt des Ergebnisteils angegeben. Als Programme sind entweder EXCEL oder StatView 3.0 benutzt worden. Der Fehlerindikator in allen Diagrammen stellt die jeweilige Standardabweichung dar.


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