Wolf,, Susanne: Neurodegeneration und Neuroprotektion - ein Dialog zwischen Immunsystem und Gehirn auf Zellebene

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Kapitel 4. Ergebnisse

4.1 Unterschiedlicher Einfluss von MBP spezifischen und unspezifischen T Zellen auf den Aktivierungszustand von Mikrogliazellen in der Hirnschnittkultur

4.1.1 Der Aktivierungsstatus der T Zellen

In diesem Abschnitt wurden T Zellen benutzt, die aus transgenen Tieren, die einen TCR spezifisch für MBP besitzen, isoliert wurden und in vitro ausschließlich mit MBP-Peptid (3 µg/ml) stimuliert worden sind. Diese Zellen werden fortan als MBP spezifische (mit MBP aktivierte) Zellen bezeichnet. T Zellen, welche aus dem Wildtypmausstamm B10.PL gewonnen wurden, sind in vitro mit PMA (5 ng/ml) und Ionomycin (1µg/ml) stimuliert worden. PMA wirkt intrazellulär stimulierend auf den Aktivierungsstatus der T Zellen unabhängig von ihrer Antigenspezifität. Ionomycin wirkt als Ionophor, um PMA in die Zelle zu schleusen. Die mit PMA und Ionomycin stimulierten Zellen werden fortan als unspezifische (mit PMA/Ionomycin aktivierte) T Zellen bezeichnet.

Um zu prüfen, wie die verschiedene Art der Aktivierung (antigenspezifisch versus unspezifisch) einen Einfluss auf den Aktivierungszustand der T Zellen vor der Kokultivierung mit den Hirnschnitten hat, wurden Proben aus den Zellkulturen zu Beginn und nach 48 h entnommen, fixiert und für die Oberflächenmarker CD25, CD44, CD49d, CD69 und CD71 gefärbt (Abb. 6). CD25 ist die alpha-Kette des IL-2 Rezeptors und wird nur von aktivierten T Zellen expremiert, um den hoch affinen IL-2 Rezeptor zu formieren, welcher die Proliferation der T Zellen ermöglicht. CD44 ist ein Adhäsionsmolekül, welches die Migration von T Zellen gestattet. Durch die Expression von CD49d, der alpha-Kette von VLA-4, können T Zellen die Blut-Hirn-Schranke passieren. CD71 ist der Transferrinrezeptor und CD69 das „very early antigen“; beide Marker werden nur von aktivierten T Zellen expremiert. Die Prüfung der Daten erfolgte paarweise für jeden Aktivierungsmarker einzeln mit dem Mann-Whitney-U Test.

Nach 48 h Stimulation waren die unspezifisch aktivierten T Zellen stärker aktiviert als die MBP-spezifisch aktivierten T Zellen. Der Unterschied dieser Aktivierung war signifikant für CD25 (p < 0.0001), CD44 (p < 0.0001) und CD49d (p < 0.02). Auch ein paarweiser Vergleich der Expression von Aktivierungsmarkern auf unspezifisch und MBP-spezifisch aktivierten T Zellen innerhalb der einzelnen Experimente zeigte eine konsistente stärkere Aktivierung der unspezifisch aktivierten T Zellen (nicht im Diagramm dargestellt). CD69 zeigte keine signifikante Veränderung - weder innerhalb der Einzelexperimente noch im Vergleich der beiden Zellpopulationen.


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Abb. 6: Aktivitätsstatus der unspezifisch mit PMA (5 ng/ml)/Ionomycin (1 µg/ml) und MBP-spezifisch (3 µg/ml) stimulierten T Zellen.

Im Diagramm ist die Expression der Aktivierungsmarker nach 48 h Stimulation dargestellt. Ein Asteriks kennzeichnet die signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Behandlungsgruppen. (*p = 0.05; n = 8 unabhängige Experimente)Die relative Zellzahl ist der Prozentsatz der Zellen, die innerhalb der Gesamtzellpopulation positiv für einen Aktivierungsmarker sind.

4.1.2 Die Zytokinproduktion der aktivierten T Zell-Populationen

Der unterschiedliche Aktivierungsstatus der T Zellen lässt auch vermuten, dass sich die Populationen in ihrem Zytokinmuster unterscheiden. Mit Sandwich-ELISAs wurden die Produktion von IFN-gamma, TNF-alpha und IL-4 aus den Überständen der mit den Zellen (ca. 3-5 104) kokultivierten Hirnschnitte bestimmt und die Daten aus 6 unabhängigen Experimenten mit einem t-Test auf signifikante Unterschiede zwischen den beiden Zellpopulationen geprüft (Abb. 7). Signifikant mehr IFN-gamma (p = 0.002) wurde von den unspezifisch aktivierten T Zellen im Vergleich zu den MBP spezifisch aktivierten T Zellen produziert. Die Produktion von TNF-alpha unterschied sich in beiden Kulturen nicht signifikant; IL-4 konnte nicht detektiert werden. Die eingesetzten Zellen entsprachen somit einem eindeutigen Th1 Profil, da IFN-gamma das Leitzytokin der Th1 Zellen ist.

Abb. 7: Die Zytokinproduktion der mit PMA (5ng/ml)/Ionomycin (1 µg/ml) oder MBP (3 µg/ml) stimulierten T Zellen nach 48 h Stimulation und 24 h Kokultivierung mit Hirnschnitten im Überstand der Kokulturen gemessen

Der Vergleich zwischen unspezifisch mit PMA/Ionomycin aktivierten und MBP spezifisch aktivierten T Zellen ergibt eine signifikant höhere Produktion an IFN-gamma durch unspezifisch aktivierte T Zellen. (*p = 0,05; n = 6 unabhängige Experimente)

4.1.3 Die Einwanderung der T Zellen in den Hirnschnitt

Um zu überprüfen, ob die T Zellen in die Hirnschnittkultur einwandern, wurden die T Zellen unmittelbar vor dem Beginn der Kokultivierung intrazellulär CFDA-SE-markiert. Zahlreiche T Zellen hatten schon nach 2 Stunden den Hirnschnitt invadiert und konnten bis zu 24 Stunden lebend in der gesamten Dicke des Schnittes gefunden werden. Nach 24 Stunden sind die T Zellen nach und nach zugrunde gegangen. Abb. 8a auf der nächsten Seite zeigt T Zellen in der mittleren Zone ei


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nes Hirnschnitts. Da T Zellen in den unterschiedlichsten Schichten des Hirnschnitts gefunden worden war, wurde angenommen, dass diese Zellen vertikal durch den Schnitt transmigriert sind. T Zellen wurden sowohl in der unmittelbaren Nähe von Mikrogliazellen (Abb. 8b) als auch nicht assoziiert mit Mikroglia gefunden. Es wurde daher davon ausgegangen, dass sowohl Zell-Zell-Kontakt als auch lösliche Faktoren bei den aufgetretenen Phänomenen zugrunde liegen können. Da eine konstante Zahl von T Zellen auf die Hirnschnitte gegeben worden war, wurde keine quantitative Analyse der eingewanderten T Zellen vorgenommen.

4.1.4 Das allgemeine Überleben des neuronalen Gewebes nach T Zell-Invasion

Um den allgemeinen Gewebeschaden zu überprüfen, der durch die Invasion von T Zellen entstanden ist, wurden je 3 Hirnschnittkulturen aus jedem der acht experimentellen Ansätze mit und ohne T Zellen nach 12, 24 und 48 h mit Propidiumjodid gefärbt, welches den Zellkern toter Zellen färbt. In allen Gruppen (Kontrolle, MBP-spezifisch, unspezifisch aktivierte T Zellen) konnte kein Unterschied im Gewebeschaden festgestellt werden. Eine leichte Propidiumjodidfärbung ist in jedem Hirnschnitt vorhanden, da der gesamte Schnitt gefärbt wird, welcher auch die primär geschädigten Regionen auf der Oberfläche enthält. Ein gewisser Zelltod/Gewebeschaden ist also immer vorhanden. In Abb. 8c, d, e auf der folgenden Seite sind beispielhaft drei mit PI gefärbte Kulturen gezeigt. Im Gegensatz zum Komplex Neuroprotektion, wo diese Methode den read out für die Beurteilung des neuronalen Überlebens darstellt, wurde sie bei diesen Experimenten nur bei Stichproben verwendet und die Daten wurden daher auch nicht quantifiziert.

4.1.5 Die Mikrogliale Phagozytose von vormarkierten Axonen

Ob intakte myelinisierte Axone durch das Einwandern von T Zellen zerstört werden, wurde durch das Beobachten der mikroglialen Phagozytose von mit Mini Ruby vormarkierten Axonen geklärt. Mini Ruby wird aktiv anterograd zum terminalen Ende der Axone transportiert. Wenn es im entorhinalen Kortex in den Schichten II/III appliziert wird, färbt Mini Ruby den Tractus perforans an, der in die äußere Molekularschicht des Gyrus dentatus projiziert (Kluge et al. 1998). Dies ist an einem Beispiel licht- und fluoreszenzmikroskopisch in Abb. 9 auf der folgenden Seite dargestellt. Das Fluoreszenzbild zeigt die Applikationsstelle von Mini Ruby im entorhinalen Kortex als hellen roten Punkt. Von diesem Punkt aus wurde der Farbstoff aktiv in die Axone transportiert, die den Tractus perforans darstellen. Seine Terminationszone, die äußere Molekularschicht des Gyrus dentatus ist als helles Band sichtbar. Die Phagozytose des markierten axonalen Materials ist detektierbar als Mini Ruby Fluoreszenz innerhalb von Mikrogliazellen des DG. Diese phagozytose-abhängige Markierungstechnik beruht darauf, dass die Zellen, welche vormarkiertes axonales Material aufnehmen, ebenfalls markiert werden (Thanos 1991; Thanos et al. 1994). In unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass Mini Ruby ein guter Marker im System der anterograden Degeneration in vivo (Bechmann und Nitsch 1997) und in Hirnschnittkulturen in vitro ist (Kluge et al. 1998). Aufgrund dieser weitreichenden Vorarbeiten, konnte ich die Technik ohne Schwierigkeiten auf meine Fragestellung anwenden.


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Abb. 8: Invasion von T Zellen und allgemeiner Gewebeschaden

a) Mit CFDA-SE vormarkierte T Zellen (grün) sind in die mittlere Schicht eines Hirnschnitts eingewandert. (Skalierungsmaßstab 10 µm)
b) T Zellen (grün) und Mikrogliazellen (rot) im Hirnschnitt (Skalierungsmaßstab 10 µm).
c-e) Der allgemeine Gewebeschaden (Zelltod mit Propidiumjodid in roter Fluoreszenz dargestellt) ist nach Einwanderung von sowohl unspezifisch mit PMA/Ionomycin als auch spezifisch mit MBP aktivierten T Zellen auf Kontrollniveau. (Skalierungsmaßstab 0.05 mm)

Abb. 9: Tracing des Tractus perforans (TP)

Im Fluoreszenzbild (F) kann man sehen, dass der rot fluoreszierende Tracer, der im cortex entorhinalis (EC) appliziert wurde, von den Axonen des TP zur stratum labcunosum moleculare (Slm; Pfeilspitzen) transportiert worden ist. Der DAB konvertierte Tracer Mini Ruby wird im Durchlichtbild (DAB) rotbraun sichtbar. Einzelne Axone und phagozytierende Mikroglia konnten auf diese Weise sowohl im Fluoreszenz- als auch im Durchlichtmikroskop beobachtet werden.


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Da die Mikrogliazellen FITC-markiert (grün) und das axonale Material durch die Mini Ruby Tracer mit Rhodamin (rot) markiert waren, wurde eine Mikrogliazelle dann gelb abgebildet, wenn sie phagozytiertes Material enthielt. Die gelben Zellen wurden als Prozentzahl aller Mikrogliazellen (grün und gelb) dargestellt. Nur die innere Zone der Hirnschnitte wurde betrachtet, da sich auf der Oberfläche immer tote Zellen und somit auch phagozytierende Zellen befinden. In den Kontrollschnitten wurde eine geringe Zahl von phagozytierenden Mikrogliazellen gefunden. In den Kulturen, in die T Zellen eingewandert waren, wurden zahlreiche phagozytierende Mikrogliazellen beobachtet (Abb. 10b, c). Die MBP-spezifisch aktivierten T Zellen induzierten signifikant mehr Phagozytose von axonalem Material (t-Test; p < 0.05) als unspezifisch aktivierte T Zellen (Abb. 11). Der Unterschied zwischen den beiden Populationen ist zwar signifikant, aber dennoch gering. Beachtet man allerdings, wie gering die MBP-spezifischen T Zelle gegenüber den unspezifisch aktivierten T Zellen aktiviert waren, ist ihre Potenz, Mikrogliazellen zur Phagozytose zu animieren, erstaunlich hoch.

4.1.6 Die Expression von MHC-II und ICAM-1 auf Mikrogliazellen

In diesem Abschnitt wurde untersucht, ob die Invasion von T Zellen auch zur Regulation von MHC-II und ICAM-1 als funktionelle Aktivierungsmarker führt. Mikrogliazellen sind mit GFS-IB4-FITC-markiert worden (grün); die Antikörper gegen die Oberflächenmoleküle sind mit Texas Red (rot) gekoppelt. Diese Moleküle sind als gelbe Punkte auf den grünen Zellen zu sehen. Es wurden die Zellen mit gelben Punkten gezählt. Diese wurden als Prozent der gesamten Mikrogliapopulation (alle grünen Zellen ) angegeben. Die Daten wurden mit drei 1-Weg-ANOVA Test für alle Gruppen (MHC-II, ICAM-1, Phagozytose) und mit einem paarweisen Kontrast-t-Test (Kontrolle versus PMA/Ionomycin, Kontrolle versus MBP, PMA/Ionomycin versus MBP) auf signifikante Unterschiede geprüft. Die Mikrogliazellen in den Kontrollkulturen expremierten wenig oder kein MHC-II (Abb. 11d) und ICAM-1 (Abb. 11g). Die Invasion von unspezifisch aktivierten und MBP-spezifisch aktivierten T Zellen führte zur Hochregulation von MHC-II (Abb. 11e, f) und ICAM-1 (Abb. 11h, i) auf Mikrogliazellen, wobei die Expression dieser Aktivierungsmarker signifikant höher nach der Kokultivierung mit MBP-spezifisch aktivierten T Zellen war (p < 0.05) (Abb. 10).

Abb. 10: Aktivierungsstatus der Mikroglia nach Behandlung mit PMA/Ionomycin- oder MBP-aktivierten T Zellen.

(*p = 0,05) n = 80 bedeutet 20 Hirnschnitte pro Behandlung und Gruppe aus 4 unabhängigen Experimenten für MHC-II und ICAM-1; n = 125 bedeutet 25 Hirnschnitte pro Behandlung und Gruppe aus 5 unabhängigen Experimenten für Phagozytose.) Ein Asteriks über einer Linie zeigt den signifikanten Unterschied zwischen den Behandlungen.


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Abb.11 : Aktivierungsstatus der Mikroglia nach T Zellinvasion

Mikrogliazellen sind mit GFS-IB4 gefärbt (grün), die Aktivitätsmarker ICAM-1 und MHC-II erscheinen rot. Der Tracer Mini Ruby (MR) erscheint ebenfalls als rote Fluoreszenz. Durch die hohe Intensität der Fluoreszenz dieses Markers, erscheint eine Zelle, die viel phagozytiertes Material enthält, fast ausschließlich rot. Durch morphologische Vergleiche mit den umliegenden Zellen und einer im 488 nm Filter schwach sichtbaren GFS-B4-Markierung konnten diese roten Zellen ebenfalls als Mikroglizellen identifiziert werden.
a) Mit Mini Ruby markierter Tractus perforans in einem Kontrollschnitt.
b) Zur Phagozytose angeregte Mikroglia nach Behandlung mit PMA/Ionomycin-aktivierten T Zellen
c) Zur Phagozytose angeregte Mikroglia nach Behandlung mit MBP-aktivierten T Zellen.
d) Keine MHC-II Expression in den Kontrollen; erhöhte MHC-II Expression nach Invasion von mit PMA/Ionomycin e) oder MBP f) aktivierten Zellen.
g) Keine ICAM-1 Expression in den Kontrollen; stark erhöhte ICAM-1 Expression nach Invasion von mit PMA/Ionomycin h) und MBP (i) aktivierten Zellen.
(Skalierungsmaßstab 10 µm; Maßstab in Bild d gilt für alle Bilder b-i)


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4.1.7 Der Einfluss von TNF-alpha und IFN-gamma auf die Aktivierung und Phagozytoseaktivität von Mikrogliazellen

Das inflammatorische Zytokin IFN-gamma wird von Th1 Zellen produziert. TNF-alpha von mit IFN-gamma oder IL-18 stimulierten Makrophagen, aktivierten Mikrogliazellen und Th1/Th2 Zellen produziert. Deshalb wurde der Einfluss dieser beiden Zytokine auf den Aktivierungsstatus von Mikrogliazellen getestet. Dies ist ein minimalistischer Ansatz, da er die Expression und die Aktivität der Rezeptoren für IFN-gamma und TNF-alpha auf den Mikroglia nicht untersucht. IFN-gamma (2, 10, 50 ng/ml) und TNF-alpha (100, 500 pg/ml) wurden in rekombinanter Form zu den Hirnschnitten gegeben. Diese mit Zytokin behandelten Hirnschnitte wurden nicht mit T Zellen kokultiviert. Jede getestete Konzentration beider Zytokine führte zu einer Hochregulation von MHC-II (Abb. 12a, b folgende Seite) und ICAM-1 (Abb. 12c, d). Die Applikation von IFN-gamma führte jedoch nicht zur Phagozytose von axonalem Material (Abb. 12f), während TNF-alpha in einer Konzentration von 500 pg/ml die Mikrogliazellen zur Phagozytose stimulierte (Abb. 12g).

Die Ergebnisse aus den Punkten 4.1.5. (erhöhte Phagozytoseaktivität nach Behandlung mit PMA/Ionomycin-aktivierten gegenüber MBP-aktivierten T Zellen) und 4.1.6. (erhöhte MHC-II und ICAM-1 Expression nach Behandlung mit PMA/Ionomycin-aktivierten gegenüber MBP-aktivierten T Zellen) veranlassen mich zur Annahme meiner ersten Hypothese: MBP-spezifische T Zellen können die Mikrogliazellen stärker aktivieren als unspezifisch aktivierte T Zellen.

Der Unterschied zwischen unspezifischen und ZNS-spezifischen T Zellen in ihrem Potential, Mikrogliazellen zu aktivieren, ist gezeigt worden. Beide T Zell-Populationen waren jedoch vom Subtyp Th1, der als proinflammatorisch gilt. In den folgenden Untersuchungen sollte die Wirkung von MBP-spezifischen Th1 und Th2 Zellen auf Mikrogliazellen verglichen werden.


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Abb. 12: Aktivierung der Mikroglia durch Zytokine

Die Mikrogliazellen sind mit GFS-IB4 grün markiert; ICAM-1 und MHC-II erscheinen rot. Eine Kolokalisation der Antikörper mit dem Marker ist als gelbe Färbung der Zelle zu sehen.
a-b) Die MHC-II Expression nach Behandlung mit IFN-gamma (50 ng/ml) und TNF-alpha (100 pg/ml) ist erhöht.
c-d) Auch die ICAM-1 Expression ist durch IFN-gamma (50 ng/ml) und TNF-alpha (100 pg/ml) erhöht worden.
(Abb. 11d und 11g zeigt die Situation in repräsentativen Kontrollschnitten.) (Skalierungsmaßstab 10 µm).In den DAB-konvertierten Schnitten erscheint der Tracer Mini Ruby dunkelbraun bis schwarz. Dunkel gefärbte Zellen, die den Tracer enthalten, sind im Bild g) zu sehen. Aufgrund ihrer Morphologie wurden diese Zellen als Mikrogliazellen identifiziert.
e) Kontrolle für die Phagozytoseaktivität; keine phagozytierenden Mikrogliazellen vorhanden
f) Keine Phagozytoseaktivität nach IFN-gamma (50 ng/ml) Behandlung; keine phagozytierenden Mikrogliazellen vorhanden
g) Erhöhte Phagozytoseaktivität nach Gabe von TNF-alpha (500 pg/ml)
(Skalierungsmaßstab 20 µm).


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4.2 Das Potential von Th1 und Th2 Zellen, Mikrogliazellen zu aktivieren und die Expression von kostimulatorischen Molekülen zu modulieren

4.2.1 Aktivierungsstatus, Zytokinproduktion und Transmigration der Th1 und Th2 Zellen

Im folgenden Abschnitt (4.2.1 bis 4.2.5) wurden ausschließlich mit MBP aktivierte T Zelle aus transgenen Tieren, deren TCR spezifisch für MBP ist, verwendet. Durch die Zugabe von IL-12 und anti-IL-4 in das Medium wurden Th1 Zellen generiert; durch die Zugabe von IL-4 und anti-IL12 konnten Th2 Zellen gewonnen werden (3.2.1.9 und 3.2.7). Um sicherzustellen, dass beide Subtypen Th1 und Th2 gleich aktiviert waren, wurden kurz vor der Kokultivierung (48 h nach der zweiten Restimulation der Zellen) Proben entnommen, fixiert und die Expression der Aktivierungsmarker CD25, CD44, CD49d, CD69, CD71 und CD154 (CD40L) mit dem Durchflusszytometer (FACS) quantifiziert. Bis auf den letzten, wurden die Aktivierungsmarker auch im vorherigen Experimentteil benutzt und beschrieben (4.1.1.). CD154 (CD40L) bindet mit CD40 auf APC und kann die IL-12 Produktion induzieren (Aloisi et al. 1999). Die FACS-Daten zeigen, dass beide Zell-Populationen gleich stark aktiviert waren bevor sie mit den Hirnschnitten kokultiviert wurden (Mann-Whintney-U Test (Abb. 13).

Abb. 13: Aktivierungsstatus der MBP-spezifischen Th1 und Th2 Zellen nach Stimulation mit MBP.

Für die Marker CD25, CD44, CD49d, CD69 und CD71 sind die Daten aus 8 unabhängigen Experimenten zusammengefasst. Für CD154 stammen die Daten aus 4 unabhängigen Experimenten. Die relative Zellzahl stellt den Prozentsatz der für einen Aktivierungsmarker positiven Zellen innerhalb der Gesamtzellpopulation dar. Zum Vergleich: OVA-spezifische Th1 und Th2 Zellen nach Stimulation mit OVA sind in Abb. 21 dargestellt. Das Ergebnis einer Stimulation mit PMA/Ionomycin (unspezifisch) von Th1 und Th2 Zellen beider Antigenspezifität kann in Abb. 27 betrachtet werden.


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Zellen getestet. Th1 Zellen produzierten eine hohe Menge an IFN-gamma und kein IL-4; in den Th2 Zellkulturen konnte hingegen eine hohe Menge an IL-4 und ein geringer Anteil an IFN-gamma gemessen werden (Abb. 14).

Abb. 14: Zytokinproduktion der MBP- und OVA-spezifischen Th1 und Th2 Zellen (3-5 Millionen Zellen).

In diese Abbildung ist zum Vergleich die Zytokinproduktion der OVA-spezifischen T Zellen dargestellt. Die Experimente mit OVA-spezifisch aktivierten T Zellen werden im Abschnitt 4.2.6. beschrieben. Die Daten der MBP-spezifischen T Zellen stammen aus 8 unabhängigen Experimenten. Die Daten der OVA-spezifischen T Zellen stammen aus 5 unabhängigen Experimenten.

In Vorexperimenten wurde überprüft, ob beide Subtypen gleichermaßen in die Hirnschnittkultur einwandern. Sowohl zahlreiche Th1 als auch Th2 Zellen konnten in allen Schichten der Schnittkulturen gefunden werden (Abb. 15). Zur Analyse der Aktivität wurde wie in den vorangegangenen Experimenten die innere Zone der Hirnschnitte verwendet, da die Schnittoberfläche durch die Präparation verletzt wurde und die dadurch hervorgerufene Aktivierung der Mikrogliazellen nicht in die Datenanalyse mit eingehen sollte. Eine „Beruhigung“ der inneren Zone, die sich durch die Runterregulation von Aktivierungsmarkern zeigte, trat nach 6 div ein (Hailer et al. 1996).


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Abb. 15: Invasion von T Zellen in den Hirnschnitt

Die T Zellen sind mit CFDA-SE vormarkiert (FITC)
a) Invasion von vormarkierten MBP-spezifischen Th1 Zellen
b) Invasion von vormarkierten MBP-spezifischen Th2 Zellen
c) Invasion von vormarkierten OVA-spezifischen Th1 Zellen
d) Invasion von vormarkierten OVA-spezifischen Th2 Zellen
(Skalierungsmaßstab 20 µm)


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4.2.2 Erhöhte GFS-IB4 Reaktivität der Mikrogliazellen wird von Th1 Zellen induziert

Die Schnittdicke der Kryostatschnitte wurde bei diesem experimentellen Ansatz von normalerweise 20 µm auf 14 µm verringert, damit ca. eine Zellschicht im Schnitt erfasst wurde. Da Mikrogliazellen einen Durchmesser von 10-15 µm haben und durch Vermessen von je 20 Mikrogliazellen pro Hirnschnitt in 5 Hirnschnitten pro Gruppe keine Größenunterschiede zwischen den Mikrogliazellen in den einzelnen Untersuchungsgruppen gefunden wurden, sind die unterschiedlichen Zahlen mit hoher Wahrscheinlichkeit auf einen tatsächlichen Unterschied in der Anzahl der Zellen zurückzuführen. Aufgrund einer zu starken Abweichung von einer Normalverteilung wurde für die Analyse der Daten der absoluten Zellzahlen ein Friedman-Test für die Überprüfung signifikanter Unterschiede innerhalb der Gruppe „absolute Zellzahl“ benutzt. Nur die Behandlungen Th1 und Th2 unterscheiden sich signifikant voneinander (p = 0.01). Keine der beiden Behandlungen unterscheidet sich signifikant von der Kontrolle (Abb. 16).

Abb. 16: Aktivitätsstatus der Mikroglia nach Behandlung mit MBP-spezifischen Th1 oder Th2 Zellen

Die CD40 und die ICAM-1 Expression wurde aus je 10 Hirnschnitten pro Behandlung in 5 unabhängigen Experimenten
ermittelt. Angegeben ist der Prozentsatz der für ein Oberflächenmolekül positiven Zellen innerhalb aller gezählten Mikroglia
zellen (relative Zellzahl). Als signifikant *p = 0.05) ist dargestellt der Unterschied zwischen den Behandlungen und der Kontrolle und zwischen den Behandlungen selbst. Eine zweite y-Achse ist der Maßstab für die absolute Zellzahl der Mikrogliazellen/Schnitt. Die Zellzahl wurde aus je 5 Hirnschnitten pro Behandlung in 5 unabhängigen Experimenten ermittelt. Nur die Behandlungsgruppen Th1 und Th2 unterschieden sich signifikant voneinander.

4.2.3 Th1 und Th2 Zellen induzieren beide die CD40 Expression

CD40 wurde auf der Oberfläche von Mikrogliazellen sowohl in der Kokultur mit Th1 als auch mit Th2 Zellen gefunden (Abb. 17b, c übernächste Seite). Das Oberflächenmolekül ist als gelber Punkt auf den grün fluoreszierenden Mikrogliazellen zu sehen. Es wurden alle Zellen gezählt, die das Oberflächenmolekül expremierten. Parallel wurden alle grün fluoreszierenden Zellen (Mikrogliazellen) gezählt. Daraus ergab sich ein prozentualer Anteil CD40 positiver Zellen an der Gesamtzellpopulation. Der 1-Weg-ANOVA-Test zeigte einen signifikanten Unterschied innerhalb der Gruppe (p = 0.01). Die paarweise Analyse mit Kontrast-t-Tests erbrachte keinen signifikanten Unterschied zwischen den Behandlungen, jedoch eine signifikante Erhöhung der CD40 Expression gegenüber der Kontrolle sowohl für Th1 als auch für Th2 (p = 0.001; Abb. 16).

4.2.4 ICAM-1 wird durch Th1 Zellen induziert und durch Th2 Zellen supprimiert

ICAM-1 ist ein wichtiges Adhäsionsmolekül und ein kostimulatorisches Molekül. Es ist eines der Hauptmoleküle, die eine starke Aktivierung anzeigen, deshalb wurde es für diese Untersuchung


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ausgewählt. Die Kontrollschnittkulturen zeigten keine Expression von ICAM-1. Die Daten wurden mit einem 1-Weg-ANOVA Test auf signifikante Unterschiede der beiden Behandlungen und der Kontrolle innerhalb der Gruppe geprüft (p = 0.003). Mit paarweisen Kontrast-t-Tests wurden die Behandlungen (Th1, Th2, Kontrolle) auf signifikante Unterschiede getestet. Nach einer Kokultivierung mit Th1 Zellen, wurde ICAM-1 signifikant hochreguliert (p = 0.001; Abb. 17e; folgende Seite). Th2 Zellen konnten nur auf wenigen Zellen ICAM-1 induzieren (Abb. 17f). Der Unterschied zur Kontrolle ist zwar signifikant (p < 0.05; Abb. 17d), aber in seiner Ausprägung vernachlässigbar, da die ICAM-1 Expression nach Behandlung mit Th1 Zellen sechsfach gegenüber der Kontrolle und gegenüber der Behandlung mit Th2 Zellen erhöht ist (Abb. 16). Die Erhöhung der ICAM-1 Expression durch Th2 Zelle gegenüber der Kontrolle ist nur zweifach.

Wurden 24 Stunden vor oder nach der Kokultivierung mit Th1 Zellen die Schnitte mit Th2 Zellen vor- oder nachbehandelt, konnte nur noch eine minimale Expression von ICAM-1 beobachtet werden (Abb. 17g, h). Die Th2 Zellen konnten somit eine Aktivierung von Mikrogliazellen verhindern.

Nach diesen Experimenten konnte ich den ersten Teil meiner zweite Hypothese annehmen: Th1 Zellen können Mikrogliazellen stärker aktivieren als Th2 Zellen.

Da beide Zelltypen ICAM 1 modulieren konnten, welches unter anderem eine kostimulatorische Funktion hat, wollte ich überprüfen, ob dies auch für die kostimulatorischen Moleküle B7 1 und B7 2 gilt und damit den zweiten Teil meiner zweiten Hypothese überprüfen: Beide Zelltypen können jedoch die kostimulatorischen Moleküle B7-1 und B7-2 modulieren.


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Abb. 17: Aktivierungsstatus der Mikroglia nach Invasion von MBP-spezifischen Th1 und Th2 Zellen

Die Mikroglia sind mit GFS-IB4 grün markiert, ICAM-1 und CD40 sind rot dargestellt.
a) In den Kontrollabschnitten gab es keine CD40 Expression.
b-c) Die Invasion von MBP-spezifischen Th1 und Th2 Zellen führte zur Expression von CD40.
d) In den Kontrollabschnitten wurde kein ICAM-1 expremiert.
e) MBP-spezifische Th1 Zellen induzierten die ICAM-1 Expression, während MBP-spezifische Th2 Zellen dies nicht vermochten f). Im Bild e) ist nur wenig direkte Überlappung der grünen und roten Markierung zu sehen. Es bleibt jedoch eindeutig, dass beide Moleküle auf der gleichen Zelle lokalisiert sind.
g-h) Wurden die Hirnschnitte mit Th2 Zellen vor- oder nachbehandelt (24 h), wurde die Th1 induzierte ICAM-1 Expression
unterdrückt.
(Skalierungsmaßstab 10 µm in a) gilt auch für b-e); in g) gilt auch für h))


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4.2.5 Die Expression von B7-1 und B7-2 wird von Th1 Zellen moduliert, von Th2 Zellen nicht

In diesem Teil der Experimente, wurden die T Zellen - wie schon vorher - gemeinsam mit dem Hirnschnitt kultiviert. Um abzugrenzen, ob es sich um einen löslichen Faktor handelt, der die Expression der kostimulatorischen Moleküle beeinflussen kann, wurden zusätzlich T Zellen unter der Membran kultiviert, auf welcher der Hirnschnitt auflag. Die unter dem Hirnschnitt kultivierten (subkultivierten) T Zellen erhielten in allen Ansätzen ihr Antigen MBP und Milzzellen als APC.

Durch Ausblendung des blauen und grünen Kanals in den RGB-Graustufenbildern im Programm Photoshop 5.0 mit der Option Tonstufeneinstellung erschienen die vorher schwarzen, mit DAB markierten Strukturen nun rot. So ergab sich der Vorteil, dass diese Bilder mit den Bildern der grün fluoreszierenden Mikroglia übereinander gelagert werden und so die Kolokalisation der Oberflächenmoleküle und des Mikrogliamarkers auf die bisherige Weise dargestellt werden konnten: Alle Mikrogliazellen, die eines der Oberflächenmoleküle expremieren, zeigen gelbe Punkte oder sind vollständig gelb. Es wurde der Prozentsatz dieser Zellen von allen Mikrogliazellen (grün und gelb) ermittelt. Dieses Verfahren war notwendig, da der zur Probe eingesetzte sekundäre, direkt an eine rote Fluoreszenz gekoppelte (PE) Antikörper einen zu hohen Hintergrund erzeugte. Deshalb wurde ein biotinylierter Erstantikörper benutzt. Die Daten wurden einzeln für B7-1 und B7-2 zunächst mit einem 3-Wege-ANOVA Test getestet mit dem Zelltyp (Th1 und Th2), Kontakt (+/-) und Zugabe von Antigen (+/-) als relevante Faktoren. Nachdem eine signifikante Wechselwirkung zwischen Zelltyp und der Expression beider B7 Moleküle festgestellt wurde (p = 0.002), sind 4 einzelne 1-Weg-ANOVA Test für jeweils beide B7 Moleküle durchgeführt worden, um den Unterschied zwischen den Zelltypen unter unterschiedlichen Bedingungen (+/- Kontakt; +/- Antigen) zu testen. Es wurde jeweils ein signifikanter Einfluss der Subtypspezifität festgestellt (p = 0,05). Die Unterschiede von jeweils Th1 und Th2 zur Kontrolle sind paarweise mit einem Kontrast-t-Test geprüft worden. Alle in den Abb. 18 und 19 mit einem Asteriks (*) gekennzeichneten Datenmengen waren mit dem t-Test auf einem Niveau von p = 0.05 signifikant von den jeweiligen Kontrollen verschieden.


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Abb. 18: Expression der B7-Moleküle auf Mikroglia nach Behandlung mit MBP-spezifischen Th1 und Th2 Zellen mit (+Ag) und ohne (-Ag) Antigen; mit (K+) und ohne (K-) Zell-Zell-Kontakt.

Ein Asteriks direkt über dem Balken zeigt einen signifikanten Unterschied der jeweiligen Behandlungsgruppe zu den entsprechenden Kontrollen (+/- Ag) an. Ein Asteriks oberhalb einer Linie zeigt den Unterschied zwischen den Behandlungsgruppen Th1/Th2 24 h später sowie Th2/Th1 24 h später und ihren entsprechenden Kontrollen an. Die Kontrolle für Th2/Th1
24 h später ist Th2 K+; die Kontrolle für Th1/Th2 24 h später ist Th1 K+. Die Behandlung mit Th1 und Th2 Zellen auf dem gleichen Schnitt erfolgte immer mit Zell-Zell-Kontakt.
(*p = 0.05: n = 55 bedeutet 11 unabhängige Experimente mit je 5 ausgezählten Hirnschnitten pro Gruppe).

In den Hirnschnittkulturen wurde B7-2 sehr rasch hochreguliert, so dass nahezu alle Mikrogliazellen dieses Molekül expremierten (Abb.18, 19; 20b übernächsten Seite). Diese Expression konnte allein auf die Präparation zurückgeführt werden. In Schnitten aus perfundiertem Gehirn sowohl 9 Tage alter als auch erwachsener Tiere konnte B7-2 nur auf einzelnen Zellen beobachtet werden (Abb. 18). Das B7-1 Molekül hingegen wurde weder auf den Kontrollhirnschnitten noch im Gesamthirn gefunden (Abb. 18; 20a). Nach der Kokultivierung mit Th1 Zellen - mit und ohne Zell-Zell-Kontakt - wurde B7-2 runter- und B7-1 hochreguliert (Abb. 18; Abb. 20c1, d1, h2). Th2 Zellen konnten die Expression von B7-2 und B7-1 nur in geringem Maße beeinflussen (Abb. 18; Abb. 20c2, d2). Wie bei den ICAM-1 Experimenten, wurden die Th1 Kokulturen nach 24 h mit Th2 Zellen behandelt. Das durch die Th1 Zellen hervorgerufene B7-Expressionsmuster der Mikrogliazellen wurde durch die Th2 Zellen nicht verändert. Wurden die zunächst mit Th2 Zellen behandelten Kulturen nach 24 h mit Th1 Zellen kokultiviert, konnten die Th1 Zellen in gleichem Maße wie ohne Vorbehandlung mit Th2 Zellen B7-1 hoch- und B7-2 runterregulieren (Abb. 18).

Somit muss ich den zweiten Teil meiner zweiten Hypothese (Th1 und Th2 Zellen können in gleichem Maße kostimulatorische Moleküle modulieren.) ablehnen. Denn Th1 Zellen könne in viel stärkerem Maße die Expression der kostimulatorischen Moleküle B7-1 und B7-2 beeinflussen.

Die bisherigen Untersuchungen sind ausschließlich mit MBP-spezifischen oder unspezifischen T Zellen durchgeführt worden. In den weiteren Experimenten wurden Ovalbumin (OVA) spezifische T Zellen mit einbezogen, die spezifisch für ein Antigen sind, welches nicht im ZNS vorkommt. Es wurde getestet, ob die Phänomene abhängig von der Antigenspezifität und/oder vom Aktivierungszustand der T Zellen sind.


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4.2.6 Die Abhängigkeit der Modulation der kostimulatorischen Moleküle B7-1 und B7-2 von der Antigenspezifität der T Zellen

Die Daten wurden einzeln für B7-1 und B7-2 zunächst mit einem 3-Wege-ANOVA Test getestet mit dem Zelltyp (Th1 und Th2), Kontakt (+/-) und Zugabe von Antigen (+/-) als relevante Faktoren. Nachdem eine signifikante Wechselwirkung zwischen Zelltyp und der Expression beider B7 Moleküle festgestellt wurde (p = 0.03), sind 4 einzelne 1-Weg-ANOVA Test durchgeführt worden (jeweils für B7-1 und B7-2), um den Unterschied zwischen den Zelltypen unter unterschiedlichen Bedingungen (+/- Kontakt; +/- Antigen) zu testen. Die einzelnen Unterschiede von jeweils Th1 und Th2 zur Kontrolle sind paarweise mit einem Kontrast-t-Test geprüft worden. Die OVA-spezifischen Th2 Zellen konnten die Expression der B7 Moleküle in nur geringem Maße beeinflussen (Abb. 20e2, f2) Es gab keine Unterschiede zwischen den Behandlungen bei direktem oder ohne Zell-Zell-Kontakt bezogen auf die Antigenzugabe (Abb. 19). War jedoch ein direkter Zell-Zell-Kontakt zwischen Th1 Zellen und Hirngewebe möglich, konnten die OVA-spezifischen Th1 Zellen die B7-2 Expression runter- und die B7-1 Expression hochregulieren (Abb. 20e1, f1). Gab es keinen direkten Kontakt zwischen OVA-spezifischen Th1 Zellen und Hirngewebe, war die Zugabe von Antigen notwendig, um den gleichen Effekt wie die MBP-spezifischen Th1 zu erzielen. Der Effekt der Antigenzugabe war signifikant (1-Weg-ANOVA; p = 0.02) (Abb. 20g2, h2). Ohne Antigen konnten die OVA-spezifischen Th1 Zellen in viel geringerem Maße als mit Antigen B7-1 induzieren (t-Test; p = 0.05) (Abb. 20g1, h1). Die Expression von B7-2 blieb ohne Antigenzugabe auf Kontrollniveau und unterschied sich signifikant von der runterregulierten B7-2 Expression nach Antigenzugabe (p = 0.005) (Abb.19).

Abb. 19: Expression der B7-Moleküle auf Mikroglia nach Behandlung mit OVA-spezifischen Th1 und Th2 Zellen mit (+Ag) und ohne (-Ag) Antigen; mit (K+) und ohne (K-) Zell-Zell-Kontakt.

Es sind nur die Signifikanzen (*p = 0.05) der Behandlungsgruppen gegenüber den Kontrollen und zwischen +/- Ag bei der Behandlung mit Th1 Zellen ohne Kontakt dargestellt. Ein Asteriks direkt über dem Balken stellt einen signifikanten Unterschied zur entsprechenden Kontrolle (+/- Ag) dar. Signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungen mit Th1 Zellen (ohne Zell-Zell-Kontakt) mit und ohne Antigenzugabe sind mit einem Asteriks gekennzeichnet, der sich über den Linien befindet, der die miteinander verglichenen Gruppen verbindet. Die Daten wurden in 8 unabhängigen Experimenten durch Auszählung von 5 Hirnschnitten pro Behandlungsgruppe erhoben. Die relative Zellzahl ist der Prozentsatz der für ein B7 Molekül positiven Zellen innerhalb der Gesamtzellzahlpopulation.


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Abb. 20: Die Modulation der kostimulatorischen Moleküle B7-1 und B7-2 durch MBP- und OVA-spezifische Th1 und Th2 Zellen.

Das Schema fasst kurz das methodische Vorgehen zusammen. Die Bilder zeigen die Kolokalisation von B7-Molekülen (rot) und Mikroglia (grün) in Hirnschnitten mit und ohne Zell-Zell-Kontakt. Die Pfeilspitzen zeigen repräsentative Zellen, die eine Kolokalisation von B7 Molekülen und Mikrogliamarker aufweisen.
a) B7-1 war in den Kontrollschnitten nicht detektierbar. b) B7-2 wurde in den Kontrollhirnschnitten im Vergleich zu perfundiertem Gehirn hochreguliert. Die Bilder c1-f2) demonstrieren die Expression von B7 nach der Invasion der T Zellen in den Schnitt. c1) b7-1 wurden den Kokulturen mit MBP-spezifischen Th1 Zellen hochreguliert. c2) Die Kokultur mit MBP-spezifischen Th2 Zellen veränderte die B7-1 Expression nicht. d1) die Kokultivierung von Schnitten mit MBP-spezifischen Th1 Zellen resultierte in einer Runterregulation des B7-2 Moleküls. d2) Die Kokultivierung mit Th2 Zellen änderte die B7-2 Expression nicht. e1) B7-1 wurde in der Kokultur mit OVA-spezifischen Th1 Zellen hochreguliert. e2) Die Kokultivierung der Schnitte mit OVA-spezifischen Th2 Zellen änderte die Expression von B7-1 nicht. f1) Die Kokultivierung mit OVA-spezifischen Th1 Zellen regulierte die Expression von B7-2 runter. f2) OVA-spezifische Th2 Zellen konnten die Expression von B7-2 nicht beeinflussen.
Die Bilder g1-h2) demonstrieren die Expression der B7-Moleküle ohne direkten Zell-Zell-Kontakt.
g1) Ohne ihr Antigen konnten die OVA-spezifischen Th1 Zellen B7-1 nicht signifikant hochregulieren. g2) In Anwesenheit ihres Antigens waren die OVA-spezifischen th1 Zellen in der Lage, B7-1 im selben Maße wie die MBP-spezifischen Th1 Zellen ohne (h1) und mit (h2) Antigen hochzuregulieren.


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Die OVA-spezifischen T Zellen wurden ebenfalls auf ihren Aktivierungszustand (Abb. 21) ihre Zytokinproduktion (Abb. 14) und ihre Fähigkeit, in den Hirnschnitt zu migrieren (Abb. 15) getestet (siehe Punkt 4.2.1.). Sie haben sich in all diesen Variablen nicht signifikant von den MBP-spezifischen T Zellen unterschieden (Mann-Whintney-U Test). Es war ebenfalls kein Unterschied zwischen den Th1 und Th2 Zellen zu messen.

Abb. 21: Aktivierungsstatus der OVA-spezifischen Th1 und Th2 Zellen nach Stimulation mit Antigen.

Die Expression aller Aktivierungsmarker wurden in je 5 unabhängigen Experimenten für beide Zelltypen analysiert. Die Anzahl der Zellen, die positiv für die jeweiligen Oberflächenmoleküle waren, wurden ins Verhältnis zur Gesamtzellzahl gestellt(relative Zellzahl).

Meine dritte Hypothese kann ich nur in der Situation ohne direkten Zell-Zell-Kontakt und nur bei Behandlung mit Th1 Zellen annehmen: Die Modulation der kostimulatorischen Moleküle B7-1 und B7-2 ist von der Antigenspezifität der T Zellen abhängig. ZNS-spezifische T Zellen (MBP) können B7-1 und B7-2 in stärkerem Maße modulieren als nicht ZNS-spezifische T Zellen (OVA). Die Zugabe von Antigen ist notwendig, damit OVA-spezifische Th1 Zellen die Expression der B7 Moleküle auf Mikrogliazellen in starkem Maße modulieren könne. Ist ein direkter Zell-Zell-Kontakt möglich, muss ich die dritte Hypothese ablehnen. Dies gilt ebenso für Th2 Zellen. Bei diesem Phänomen ist die Subtypspezifität der T Zellen ausschlaggebend.

Durch die Experimente von Schwartz et al. (1999) und Moalem et al. (1999) ist bekannt geworden, dass ZNS-spezifische T Zellen den Sekundärschaden nach einer traumatischen Schädigung verringern können. Ich wollte im zweiten Teil meiner Studie untersuchen, ob sich die Unterschiede zwischen Th1 und Th2 Zellen im Destruktionspotential auch im Regenerationspotential widerspiegeln.


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4.3 Haben Th1 und Th2 Zellen ein unterschiedliches Potential, nach einer Verletzung von Hirngewebe den Sekundärschaden zu verhindern?

Die Zellen, die für die Experimente in Punkt 4.3.3 bis 4.3.3.verwendet wurden, gleichen den Zellen aus Punkt 4.2.1. und 4.2.6. Die verwendeten T Zellen hatten einen klaren Th1 oder Th2 Subtyp (Abb. 14, Punkt 4.2.1.), waren aktiviert (Abb. 21, vorherige Seite) und transmigrierten durch den Hirnschnitt (Abb. 15, Punkt 4.2.1.), wenn sie in direktem Kontakt mit dem Gewebe waren. Wurden die Zellen unter der Membran, auf der der Hirnschnitt auflag, kultiviert, erhielten sie - je nach Behandlung - ihr Antigen und bestrahlte Milzzellen als APC. Der Unterschied zu den vorangegangenen Experimenten bestand im Zeitpunkt der Kokultivierung. Hier wurde der Hirnschnitt als Modell für eine primäre Schädigung als Akutschnitt verwendet. Die T Zellen wurden unmittelbar nach der Präparation mit dem Schnitt in Kultur gebracht, und der Schnitt wurde schon nach 24 h fixiert. Die Zellen für die Experimente in Punkt 4.3.4. wurden mit 5 ng/ml PMA und 1 µg/ml Ionomycin stimuliert. Die Anzahl der toten Zellen, die mit Propidiumjodid markiert waren, wurde als Maßstab für neuronalen Schaden/neuronales Überleben benutzt.

4.3.1 MBP-spezifische und Copaxone 1-spezifische T Zellen schützen vor neuronalem Schaden

Die ersten Experimente zu dieser Thematik wurde mit Zellen aus dem Labor von Michal Schwartz an hippocampalen Schnittkulturen aus 6 Tage alten Lewis-Ratten durchgeführt. Copaxone 1 (COP) ist ein Therapeutika zur Behandlung von MS und wurde deshalb für diese Studien als zusätzliches Antigen zu MBP ausgewählt. Da zu diesem Zeitpunkt das Programm zur quantitativen Analyse noch nicht vorhanden war, können nur qualitative Aussagen gemacht werden, die in Abb. 22 auf der folgenden Seite zusammengefasst sind. MBP-spezifische und COP-spezifische T Zellen können neuronalen Schaden antigenabhängig verhindern (Abb. 22a, b); OVA-spezifische T Zellen nicht (Abb. 22c, d). Hier wurde keine Differenzierung nach Th1 oder Th2 vorgenommen.


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Abb. 22: Neuronales Überleben nach Behandlung mit OVA-, MBP- und COP- spezifischen T Zellen.

Die Bilder zeigen mit Propidiumjodid gefärbte Hirnschnitte (gesamter Schnitt ca. 300 µm dick). Tote Zellen sind rot angefärbt. Nach Zell-Zell-Kontakt (+K) schützten die MBP-spezifischen und Copaxone 1-spezifischen T Zellen ohne (a, g) und mit (d, j) Antigen vor sekundärem neuronalen Schaden. Ohne direkten Kontakt zum Hirngewebe (-K) wurde dieser Schutz noch verstärkt (b, h), und in Anwesenheit von Antigen sind die Copaxone1- und MBP-spezifischen T Zellen am protektivsten. Die OVA-spezifischen T Zellen wirkten nicht protektiv (m, n; p, q). Die Kontrollen sind für jede Behandlung extra dargestellt (dritte Spalte).
(Skalierungsmaßstab in Bild a) 0.5 mm gilt für alle Bilder)


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4.3.2 MBP-spezifische Th2 Zellen können den Sekundärschaden stärker verhindern als MBP-spezifische Th1 Zellen

Beide Subtypen von T Zellen waren in der Lage, den Sekundärschaden zu verringern (Abb. 24; folgende Seite). Mit zwei Friedman-Tests wurde auf signifikante Unterschiede zwischen den Zelltypen und der Kontrolle in den Gruppen mit und ohne Kontakt getestet. Ein Vergleich der Behandlungen mit den Kontrollen in der Gruppe ohne Kontakt ergab, dass eine signifikante Reduktion des Zellschadens sowohl durch die Kokultivierung der Hirnschnitte mit Th1 als auch mit Th2 Zellen erzielt werden konnte (p = 0.05). Durch die Behandlung mit Th2 Zellen (ohne Kontakt) konnten doppelt so viele Neurone vor einem Sekundärschaden bewahrt werden wie durch die Behandlung mit Th1 Zellen (p = 0.01). Ein paarweiser Vergleich innerhalb der Gruppen Th1, Th2 in Bezug auf den Zell-Zell-Kontakt mit einem Mann-Whitney-U Test ergab, dass sich sowohl Th1 als auch Th2 Zellen ohne Kontakt signifikant von Th1 und Th2 Zellen mit Kontakt in ihrem Protektionspotential unterscheiden (p = 0.02). Die Anzahl der überlebenden Neurone/100 000 µm2 erhöht sich bei Behandlung mit Th1 und Th2 ohne Kontakt gegenüber der Behandlung mit Th1 und Th2 mit Kontakt dreifach. Es sind demnach eindeutig lösliche Faktoren, die eine Neuroprotektion herbeiführen.; Abb. 23).

Abb. 23: Neuronales Überleben nach Behandlung mit MBP-spezifischen Th1 und Th2 Zellen mit (K+) und ohne (K-) Zell-
Zell-Kontakt.

n = 16 bedeutet 2 unabhängige Experimente mit je 8 Hirnschnitten pro Gruppe. Die Nulllinie stellt die überlebenden Neurone in den Kontrollen dar. Die Balken stellen den zusätzlichen Schutz vor sekundärem Schaden nach einer Behandlung dar (100-(100*Behandlung/Kontrolle)). Ein Asteriks direkt über dem Balken zeigt eine signifikanten Unterschied der Behandlungen gegenüber der Kontrolle (*p = 0.05). Der Asteriks über der Linie zeigt den signifikanten Unterschied zwischen Th1 und Th2 innerhalb der Gruppe ohne Kontakt (K-) (*p = 0.01) und den Unterschied zwischen +/- Kontakt in den Gruppen Th1 und Th2 (*p = 0.02).

Ich konnte meine vierte Hypothese bezogen auf MBP-spezifische T Zellen annehmen: Th2 Zellen haben ein höheres Potential als Th1 Zellen, nach einer Verletzung von Hirngewebe den Sekundärschaden zu verhindern.


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Abb. 24: Neuroprotektion nach Behandlung mit MBP-spezifischen Th1 und Th2 Zellen

Tote Zellen sind mit Propidiumjodid rot angefärbt.
Nach Zell-Zell-Kontakt (+K) sind sowohl Th1 (tendenziell) (a) als auch Th2 (tendenziell) (b) Zellen in geringem Maße neuroprotektiv.
Kommt es zu keinem direkten Kontakt zwischen T Zellen und Hirngewebe (-K), können beide Subsets signifikant protektiv wirken. Th2 Zellen (e) sind etwa doppelt so stark protektiv wie Th1 Zellen (d).
Beide Bilder der Kontrollen zeigen den Zustand ohne Behandlung (c, f).
(Skalierungsmaßstab in Bild a) 0.5 mm gilt für alle Bilder)


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4.3.3 MBP-spezifische T Zellen regen die Mikroglia nicht zur Phagozytose an

Um den Zustand der Mikrogliazellen in diesem experimentellen Zusammenhang zu überprüfen, wurde die in Punkt 3.1.2.4. beschriebene Tracing-Technik des Tractus perforans angewendet. Wie in Abb. 25 zu sehen, bleibt die Phagozytoseaktivität in beiden Gruppen auf Kontrollniveau.

Abb. 25: Neuroprotektion: keine Phagozytose nach Th1 und Th2 Behandlung

Der Tractus perforans wurde mit Mini Ruby (rot) markiert. a), c) und e) zeigen den Tractus perforans (rot) und assoziierte Mikrogliazellen (grün mit GFS-IB4 markiert), die nur in geringem Maße phagozytierten. Die Phagozytose bleibt nach Th1-b) und nach Th2-d) Behandlung auf Kontrollniveau f).
(Skalierungsmaßstab in Bild a) 20 µm gilt für alle Bilder)


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4.3.4 Die Neuroprotektion der OVA-spezifischen T Zellen nach einem Primärschaden des ZNS wird durch antigenspezifische Stimulation verstärkt

In diesem Experiment wurden die MBP-spezifischen und OVA-spezifischen Th1 und Th2 Zellen mit und ohne Antigen unter der Membran kokultiviert, auf welcher die Hirnschnitte auflag. Zunächst wurde mit Friedman-Tests auf signifikante Unterschiede (Th1, Th2, Kontrolle) in den Gruppen (+/- Antigen) getestet. Alle Zellen, außer die OVA-spezifischen Th1 Zellen ohne Antigen, hatten die Fähigkeit zur Neuroprotektion, wobei MBP-spezifische Th2 das höchste Potential besaßen (p = 0.01). In der Gruppe ohne Antigenzugabe konnten die MBP-spezifischen Th2 Zellen signifikant mehr Zellschaden verhindern als die OVA-spezifischen Th2 Zellen. In der Gruppe nach Zugabe von Antigen waren die Unterschiede zwischen MBP- und OVA-spezifischen Th2 Zellen nicht mehr signifikant. Die OVA-spezifischen Th2 Zellen konnten tendenziell den Zellschaden in höherem Maße als die OVA-spezifischen Th1 Zellen verhindern (nicht signifikant in beiden Gruppen +/- Ag). Die MBP-spezifischen Th2 Zellen zeigten sowohl in der Gruppe mit als auch ohne Antigen eine signifikant höherer Protektivität als MBP-spezifische Th1 Zellen (p = 0.03). Die OVA- und MBP-spezifischen Th1 Zellen unterschieden sich in ihrem Protektionspotential in beiden Gruppen nicht signifikant voneinander. Mit dem Mann-Whitney-U Test wurden die Daten auf signifikante Unterschiede paarweise (+/- Ag) in den Gruppen (Th1, Th2, Kontrolle) geprüft. Eine Zugabe von Antigen zu den Zellen veränderte das Ergebnis nicht signifikant gegenüber den Kulturen ohne Antigen. (Abb. 26).

Abb. 26: Neuronales Überleben nach Behandlung mit MBP- und OVA-spezifischen Th1 und Th2 Zellen mit (+Ag) und ohne (-Ag) Antigen ohne Zell-Zell-Kontakt (K-).

Ein Asteriks (*p = 0.05) direkt über den Balken zeigt den signifikanten Unterschied der Behandlungen zu den Kontrollen (Abstand von der Nulllinie) an. Der Asteriks über den Linien zeigt den signifikanten Unterschied zwischen den Behandlungen mit MBP-spezifischen Th1 und Th2 Zellen (+/- Ag) und zwischen MBP- und OVA-spezifischen Th2 Zellen ohne Antigen an. Die Nulllinie stellt die überlebenden Neurone in den Kontrollen dar. Die Balken stellen den zusätzlichen Schutz vor sekundärem Schaden nach einer Behandlung dar (100-(100*Behandlung/Kontrolle)). In 2 unabhängigen Experimenten wurden je 5 Hirnschnitte pro Gruppe analysiert: n=10).


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4.3.5 Die Protektion ist vom Aktivierungsgrad der eingesetzten T Zellen abhängig

Wurden die Zellen unmittelbar vor der Subkultivierung nicht mit ihrem Antigen, sondern mit PMA (5 ng/ml)/Ionomycin (1 µg/ml) stimuliert, wurden die T Zellen, wie in Punkt 4.1.1. gezeigt, stark aktiviert (Abb. 27). Mit einzelnen Friedman-Tests für jeden Aktivitätsmarker konnte gezeigt werden, dass sich die Zelltypen (MBP- und OVA-spezifische Th1 und Th2 Zellen) in ihrem Aktivierungsstatus nicht signifikant voneinander unterschieden.

Um einen signifikanten Unterschied der Zellen in ihrem Protektionspotential insgesamt zu finden, wurde ein 1-Weg-ANOVA-Test angewendet. Das daraus resultierende Signifikanzniveau lag bei p = 0.003. Die paarweisen Kontrast-t-Tests (Behandlung/Kontrolle) ergaben einen signifikanten Unterschied zwischen allen Behandlungsgruppen und den Kontrollen (p = 0.005). Alle Zellen - unabhängig von ihrer Subtyp- und Antigenspezifität - wirkten in gleichem Maße neuroprotektiv. Der Test zwischen den Behandlungen Th1 und Th2 ergab keinen signifikanten Unterschied (Abb. 28). Diese Art von Überstimulation entsprach nicht der physiologischen Situation, zeigte aber, dass die Faktoren, welche die Zellen produzierten, prinzipiell von allen CD4+ T Zellen sezerniert werden können.

Abb. 27: Aktivierungsstatus der MBP- und OVA-spezifischen Th1 und Th2 Zellen nach Stimulation mit 5 ng/ml PMA und 1 µg/ml Ionomycin.

Jeder Aktivierungsmarker wurde in je 4 unabhängigen Experimenten pro Zellpopulation gemessen. Die Anzahl der für einen Marker positiven Zellen wurde ins Verhältnis zur Gesamtzellzahl gesetzt (relative Zellzahl). Die Zellen unterscheiden sich nicht in ihrem Aktivierungsstatus.


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Abb. 28: Neuronales Überleben nach Behandlung mit MBP- und OVA-spezifischen Th1 und Th2 Zellen nach Stimulation mit PMA und Ionomycin ohne Zell-Zell-Kontakt.

Alle Zellpopulationen unterscheiden sich signifikant in ihrem Potential zur Protektion von den Kontrollen (*p = 0.005). Die Nulllinie stellt die überlebenden Neurone in den Kontrollen dar. Die Balken stellen den zusätzlichen Schutz vor sekundärem Schaden nach einer Behandlung dar (100-(100*Behandlung/Kontrolle)). In 2 unabhängigen Experimenten wurden je 8 Hirnschnitte pro Gruppe analysiert und auf die jeweiligen Kontrollen normalisiert. Die Mittelwerte dieser normalisierten Werte sind im Diagramm zusammengefasst.

Die fünfte Hypothese (Die Neuroprotektion hängt von der Antigenspezifität der T Zellen ab.) kann ich nur teilweise annehmen. Die OVA-spezifischen Th2 Zellen wirken protektiv auch ohne ihr Antigen. ZNS-spezifische T Zellen können einen sekundären Schaden stärker verhindern als nicht-ZNS-spezifische T Zellen gilt nur für MBP-spezifische Th2 versus OVA-spezifische Th2 Zellen ohne Antigen und ohne Zell-Zell-Kontakt. Das Protektionspotential ist vor allem auch vom Aktivierungszustand und von der Subtypspezifität der T Zellen abhängig.


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