Wolf,, Susanne: Neurodegeneration und Neuroprotektion - ein Dialog zwischen Immunsystem und Gehirn auf Zellebene

60

Kapitel 5. Diskussion

5.1 Neuroinflammation

Das Anliegen dieser Studie war es, die Rolle der T Zellen bei neuroinflammatorischen Prozessen zu untersuchen. Dazu wurde das Hirnschnittsystem verwendet, in welches T Zellen verschiedener Subtyp- und Antigenspezifität invadierten oder mit diesem ohne direkten Kontakt kultiviert wurden. Dabei wurde drei Untersuchungskomplexe unterschieden: der Vergleich von

I) unspezifischen (PMA/Ionomycin aktivierten) T Zellen

versus MBP spezifischen T Zellen,

II) MBP spezifischen Th1 Zellen

versus MBP spezifischen Th2 Zellen,

III) MBP spezifischen Th1/Th2 Zellen

versus OVA spezifischen Th1/Th2 Zellen.

Als read out wurde der Aktivierungsstatus der Mikrogliazellen in den Hirnschnittkulturen betrachtet. Das Modellsystem, ursprünglich aus den Gebieten der Elektrophysiologie und Entwicklungsbiologie stammend, wurde in früheren Studien verwendet, die sich mit funktional relevanten Prozessen von neuronalen und nicht neuronalen Zellen beschäftigten (Diekmann et al. 1994; Hailer et al. 1997; Kluge et al. 1998). Eine besondere Eigenschaft dieses Modells ist, dass ruhende Mikrogliazellen in der mittleren Schicht der Hirnschnittkultur vorhanden sind (Hailer et al. 1996). Dies wurde durch die Abwesenheit der Aktivierungsmarker LFA-1-alpha/beta und VLA-4 auf diesen Mikroglia gezeigt. Jegliche Aktivierung der Mikrogliazellen in der mittleren Zone der Hirnschnitte wurde in der vorliegenden Arbeit auf die Behandlung mit den entsprechenden T Zellen zurückgeführt. In Abschnitt I) wurden die Aktivierungsmarker ICAM-1 und MHC-II sowie die Phagozytoseaktivität gemessen; in den Abschnitten II) und III) waren die absolute Anzahl der Mikrogliazellen, die Expression von ICAM-1, CD40, B7-1 und B7-2 die Kriterien für eine Aktivierung der Mikrogliazellen. Es konnte gezeigt werden, dass

  1. CD4+ T Zellen, die in das Hirngewebe invadierten, axonalen Schaden hervorrufen konnten,
  2. MBP-spezifische T Zellen, obwohl sie weniger aktiviert waren, die Mikrogliazellen stärker aktivierten und mehr axonalen Schaden anrichteten als unspezifisch aktivierte T Zellen,
  3. MBP-spezifische Th1 Zellen Mikroglia in vollem Ausmaß aktivieren konnten, während MBP-spezifische Th2 Zellen die intrinsischen antiinflammatorischen Eigenschaften des Hirngewebes unterstützten und
  4. nur Th1 Zellen die kostimulatorischen Signale B7-1 und B7-2 in starkem Maße modulieren konnten, was bei möglichem Zell-Zell-Kontakt nicht abhängig von der Antigenspezifität der Zelle war.

Die Invasion von T Zellen in Hirngewebe ist eines der Hauptmerkmale von Multipler Sklerose und ihrem Tiermodell EAE (Raine 1991, 1994; Brosnan und Raine 1996). Mit dem vorliegenden Modell der Invasion von T Zellen in Hirnschnitte ist es gelungen, solch eine in vivo Situation in vitro zu simulieren.


61

5.1.1 CD4+ T Zellen invadieren Hirngewebe und induzieren axonalen Schaden: unspezifisch aktivierte T Zellen versus MBP-spezifisch aktivierte T Zellen

Eine MHC-II Expression zeigt an, dass die Mikrogliazellen den T Zellen Antigen präsentieren können. Das erste Signal, welches zur Aktivierung von T Zellen notwenig ist, wird über MHC-II und den TCR ausgetauscht. Mikrogliazellen expremieren MHC-II aber nicht wie die peripheren Makrophagen konstitutiv, sondern nur nach entsprechender Stimulation (Gehrmann et al. 1995; Carson et al. 1998). Diese Stimulation muss also dem Bilden der immunologischen Synapse (MHC-II/TCR) vorausgehen. Dies lässt vermuten, dass lösliche Faktoren eine Rolle bei dieser initialen Stimulation spielen. Tatsächlich kann IFN-gamma die MHC-II Expression auf Mikrogliazellen induzieren (Panek et al. 1995). Die vorliegende Arbeit zeigte, dass beide Populationen sowohl MBP-spezifische als auch unspezifisch aktivierte T Zellen IFN-gamma produzierten und eine MHC-II Expression induzierten. Die unspezifischen T Zellen produzierten zwar mehr IFN-gamma, induzierten aber weniger MHC-II und ICAM-1 sowie eine geringere Phagozytoseaktivität und somit weniger axonalen Schaden. Obwohl die alleinige Zugabe von IFN-gamma zu den Hirnschnitten in einer Expression von MHC-II und ICAM-1 resultierte, induzierte diese keine Phagozytose. TNF-alpha hingegen konnte sowohl die Mikrogliazellen aktivieren als auch Phagozytose induzieren. In einer Studie mit makrophagendepletierten Mäusen wird berichtet, dass durch das Fehlen von TNF-alpha keine EAE ausgelöst werden konnte, obwohl die IFN-gamma Produktion nicht beeinträchtigt war (Tran et al. 1998). Die Daten der vorliegenden Arbeit sprechen auch gegen einen direkten Effekt von IFN-gamma auf den axonalen Schaden. Der Grund für die Induktion einer größeren axonalen Schädigung durch MBP-spezifische T Zellen liegt eher in ihrer ZNS-Spezifität begründet als an der Produktion von Zytokinen. Die MBP-spezifischen T Zellen können mit einer hohen Affinität mit ihrem ZNS-spezifischen TCR an den MHC-II-Komplex binden und damit die Vorraussetzung für die Expression von kostimulatorischen Signalen schaffen, welche das zweite Signal zur Aktivierung von T Zellen darstellen. ZNS-spezifische T Zellen besitzen daher ein höheres Potential, im Hirngewebe reaktiviert zu werden, und somit eine fortschreitende immunologische Kaskade anzustoßen. Der von den unspezifisch aktivierten Zellen angerichtete Schaden ist jedoch nicht zu vernachlässigen. Diesem Phänomen liegen möglicherweise andere Mechanismen zugrunde. Chabot et al. (1997) berichteten, dass Mikroglia nach einem direkten Kontakt mit CD49d expremierenden T Zellen TNF-alpha produzierten. Da diese Experimente mit menschlichen T Zellen durchgeführt worden sind, bei denen Spender- mit Empfängerzellen genetisch nicht übereinstimmten, ist eine schwache Affinität des MHC-II/TCR-Komplexes anzunehmen. In den vorliegenden Experimenten ist ebenfalls mit eine schwachen Affinität des MHC-II/TCR-Komplexes zwischen den unspezifischen T Zellen und den Mikrogliazellen zu rechnen, da die präsentierten Antigene ZNS-spezifisch sind, die T Zellen jedoch nicht. Die unspezifisch aktivierten T Zellen expremierten auf ihrer Oberfläche eine hohe Zahl von CD49d Molekülen. Es besteht daher die Möglichkeit, dass hier die gleichen Mechanismen greifen: durch die Expression von CD49d und trotz oder wegen einer schwachen Affinität der MHC-II/TCR-Bindung konnten die Mikrogliazellen zur Produktion von TNF-alpha angeregt werden. Diese mikrogliale TNF-alpha Produktion ist nicht abhängig von der TNF-alpha Produktion der T Zellen, denn in einer EAE Studie wurde gezeigt, dass Th1 Zellen, welche selbst kein TNF-alpha produzierten, eine mikrogliale TNF-alpha


62

Produktion induzieren können (Renno et al. 1995). Da TNF-alpha sowohl zur Demyelinisierung führt, (Selmaj et al. 1991) als auch neurotoxisch wirkt (Shi et al. 1998) und in Einzelzellkulturen (von Zahn et al. 1997) und dieser Studie mikrogliale Phagozytose induziert, liegt die Vermutung nahe, dass die unspezifisch aktivierten T Zellen über diesen Weg den axonalen Schaden hervorrufen können. Das entspricht auch den Befunden von Dubey et al. (1996), die zeigten, dass die Expression von ICAM-1 und CD80 (B7-1) auf APC eine schwach affine MHC-II/TCR-Bindung kompensieren und Th1 Effektorzellen zur Proliferation stimulieren können. Tatsächlich konnten im hier verwendeten System nicht-ZNS-spezifische Th1 Zellen bei möglichem Zell-Zell-Kontakt CD80 (B7-1) auf Mikrogliazellen im Hirnschnitt induzieren. Es ist nicht auszuschließen, und ich würde es sogar als nahe liegend bezeichnen, dass auch die ZNS-spezifischen T Zellen sowohl über den TNF-alpha-Weg, als auch durch die Induktion von ICAM-1 und CD80 (B7-1) axonalen Schaden anrichten. Nur der zusätzliche Schaden ist - wie oben beschrieben \|--\| auf ihre Antigenspezifität zurückzuführen. Initial sind sie geringer aktiviert als die unspezifisch aktivierten T Zellen. Im Hirngewebe erleben sie eine Reaktivierung, da sie vermutlich ihr Antigen von den Mikrogliazellen präsentiert bekommen. Das macht sie den unspezifisch aktivierten T Zellen in ihrem Potential, die Mikroglia zu aktivieren und axonalen Schaden anzurichten, nicht nur gleich, sondern lässt sie die unspezifisch aktivierten T Zellen darin sogar übertreffen. Dieser Teil der Studie zeigt, dass sowohl spezifische als auch unspezifische Interaktionen von Mikrogliazellen und T Zellen bedeutend für das Phänomen der axonalen Schädigung bei neuroinflammatorischen Erkrankungen sind. Es wird aber auch deutlich, dass die Produktion von proinflammatorischen Zytokinen und MHC-II Expression auf Mikrogliazellen eine der Voraussetzungen für eine autoimmune Attacke im ZNS ist, sie jedoch nicht notwendigerweise nach sich zieht. Der zweite Teil dieser Arbeit zeigt, dass offensichtlich eine kostimulatorische Interaktion durch ICAM-1 oder B7 auf den Mikrogliazellen notwendig ist, um axonale Schäden hervorzurufen, denn nur Th1 Zellen - unabhängig von ihrer Antigenspezifität \|--\| können die Mikrogliazellen in starkem Maße aktivieren, kostimulatorische Signale induzieren und Axone schädigen.

5.1.2 Der Einfluss der Subtypspezifität auf den Aktivierungszustand der Mikroglia: Th1 versus Th2

Es ist bekannt, dass Th2 Zellen, obwohl sie ZNS-spezifisch sind, in normalen, nicht genetisch veränderten Tieren keine EAE auslösen (Khoruts et al. 1995; Lafaille et al.1997; Stohlmann et al. 1999). Je nach experimentellem Ansatz können Th2 Zellen in EAE-Modellen sogar therapeutisch wirksam sein. Eine durch adoptiven Transfer von MBP-spezifischen T Zellen hervorgerufene EAE kann durch die Gabe von IL-4 produzierenden T Zellen vor dem Beginn der Krankheit verringert werden (Shaw et al. 1997). Auch eine tägliche IL-4 Injektion beginnend am Tag des adoptiven Transfers oder am Tag der ersten Krankheitssymptome führt zur Besserung und der Induktion von MBP-spezifischen Th2 Zellen, verringert die Demyelinisierung und inhibiert die Produktion inflammatorischer Zytokine im ZNS (Racke et al. 1994). Adoptiv transferierte Th2 Zellen schützen Mäuse vor einer mit PLP, einem ZNS-Antigen, induzierten EAE (Kuchroo et al. 1995). Eine andere Studie hingegen zeigt, dass eine durch adoptiven Transfer von MBP-spezifischenTh1 Zellen ausgelöste EAE nicht durch den simultanen Transfer von MBP-spezifischen Th2 Zellen aufgehoben oder gebessert werden kann. Allerdings waren schwach polarisierte T Zelllinien, die Th1 und Th2 Zellen


63

enthielten, weniger enzephalitogen als pure Th1 Zellen (Khoruts et al. 1995). Bei einer etablierten EAE wird von einem Shift von Th1 zu Th2 berichtet, der entweder mit einer Remission der Krankheit (Chen et al. 1998) oder mit krankheitsverbessernden Behandlungen mit Copaxone 1 (Aharoni et al. 1997; Neuhaus et al. 2000) und Linomide (Karussis et al. 1999) einher geht. Diese Befunde sprechen dafür, dass Th2 Zellen aktiv an der Krankheitsremission teilhaben. Diese Idee wird durch die Beobachtung unterstützt, dass Th2 Zellen mit einer nicht-neuronalen Spezifität durch eine Art von bystander Unterdrückung der enzephalitogenen Th1 Zellen vor EAE schützen (Falcone und Bloom 1997).

Diese Ergebnisse veranlassten mich dazu, gemeinsam mit meinen Kollegen, dem Phänomen der Th2 Protektivität im Kontext der Neuroinflammation mit Hilfe der organotypischen Schnittkultur nachzuspüren. Pohl-Koppe et al. (1998) konnten IL-4 mRNA im ZNS nachweisen. Da IL-4 ausschließlich von Th2 Zellen produziert werden kann, ist anzunehmen, dass auch die IL-4 mRNA nur in Th2 Zellen vorkommt. Dies ist ein indirekter Beweis, dass Th2 Zellen im ZNS vorkommen. In der vorliegenden Arbeit konnte kein IL-4 im Medium nachgewiesen werden, obwohl eingewanderte, lebende Th2 Zellen (deren Th2-Haftigkeit genau bekannt war) in den Schnitten gefunden wurden. IL-4 gehört zu den Zytokinen, die recht instabil und dadurch auch schlechter nachzuweisen sind als z.B. IFN-gamma (Assenmacher et al 1998; Richter et al 1999). Dies unterstützt die Annahme, dass Th2 Zellen die Blut-Hirn-Schranke passieren und mit den Zellen des ZNS in Kontakt treten können. Da in der Hirnschnittkultur die Blut-Hirn-Schranke nicht vorhanden ist, eignet sich dieses Modell dazu, die Kommunikation zwischen Th2 Zellen und im vorliegenden Falle den Mikrogliazellen zu untersuchen.

Th2 Zellen konnten genauso wie Th1 Zellen den Schnitt infiltrieren und CD40 auf Mikrogliazellen induzieren. Bisher ist gezeigt worden, dass CD40 durch IFN-gamma (Nguyen et al. 2000) und beta-amyloid (Tan et al. 1999) hochreguliert und durch TGF-beta (Nguyen et al. 1998) runterreguliert werden kann. Die Induktion von CD40 durch Th1 Zellen kann auf die Produktion von IFN-gamma zurückgeführt werden. Die durch Th2 Zellen hervorgerufene CD40-Expression könnte durch die geringe Konzentration von IFN-gamma-produzierenden T Zellen in der Th2-Population erklärt werden. Da die T Zellen und die Mikrogliazellen im Schnitt teilweise engen Kontakt hatten, war diese geringe IFN-gamma Konzentration vielleicht ausreichend, um CD40 zu induzieren. Erwartungsgemäß hätten die Th1 Zellen durch ihre hohe IFN-gamma-Produktion auch eine höhere Expression von CD40 hervorrufen müssen. Daher ist der Einfluss von anderen unbekannten Faktoren bei der Th2-vermittelten CD40-Induktion nicht auszuschließen. Beide T-Zell-Subsets expremierten CD40L und hätten darüber an CD40 ligieren können. Die nachfolgenden Überlegungen zeigen, dass vermutlich nur die Th1 Zellen den CD40/CD40L-Weg beschritten haben, während die Wirkung der Th2 Zellen eher auf der Produktion von Zytokinen beruhte.

Die CD40/CD40L Interaktion ist notwendig für die EAE Induktion (Gewal et al. 1996) und löst die Produktion von IL-12 durch Makrophagen und dendritische Zellen aus (Maruo et al. 1997), welches wiederum naive und Th1 Zellen, aber nicht Th2 Zellen zur Produktion von IFN-gamma anregt, da Th2 Zellen die hoch affine IL-12 Rezeptoruntereinheit fehlt (Shevach et al. 1999). Mikrogliazellen produzieren IL-12 nach dem Kontakt mit Th1 Zellen, aber nicht nach dem Kontakt mit Th2 Zellen (Aloisi et


64

al. 1999). Weiterhin führt eine CD40/CD40L Interaktion zur Hochregulation von ICAM-1 (Yellin et al. 1995; Shinde et al. 1996). ICAM-1 kann kostimulatorische Signale an T Zellen vermitteln, auch (oder vielleicht gerade) wenn B7-1 und B7-2 nicht expremiert werden (Croft und Dubey 1997). Es wird ebenso wie B7-1 in akuten MS-Läsionen expremiert (De Simone et al. 1995). ICAM-1 stellt ein kostimulatorisches Signal für die TCR-abhängige Proliferation und IL-2 Rezeptor (CD25) Expression von ruhenden T Zellen dar. Th1 Zellen brauchen die Kostimulation, um IL-2 zu produzieren und die Produktion von IFN-gamma zu steigern, während Th2 Zellen auch in Abwesenheit von kostimulatorischen Signalen weiterhin IL-4 produzieren (Croft und Dubey 1997; Howard et al. 1999). Es konnte gezeigt werden, dass die Unterbrechung des kostimulatorischen Signals via ICAM-1 auf der Mikrogliazelle und LFA-1 auf der T Zelle durch die Gabe eines blockierenden anti-LFA-1 Antikörpers (Willenborg et al. 1996) und die Unterbrechung des kostimulatorischen Signals via B7/CD28 durch CTLA-4IgG (Khoury et al. 1995) Ratten vor EAE schützt und die Th1 Zytokinproduktion hemmt, während die Th2 Zytokinproduktion nicht beeinträchtigt wird. Als eine weitere Auswirkung der Ligation von CD40 und CD40L ist die Hochregulation der kostimulatorischen Moleküle B7-1 und B7-2 beschrieben worden (Grewal und Flavell et al. 1996).

War ein direkter Kontakt zwischen T Zellen und Hirngewebe möglich, konnten Th1 Zellen in der vorliegenden Studie unabhängig von ihrer Antigenspezifität B7-1 induzieren. Dies kann auf eine Ligation von CD40 mit CD40L zurückgeführt werden. Die Induktion von B7-1 und eine Ligation zwischen ICAM-1 und LFA-1 können die niederaffine MHC-II/TCR-Bindung zwischen APC und nicht ZNS-spezifischen T Zellen kompensieren (Dubey et al. 1996), dadurch die Ligation von CD49d an VCAM-1 ermöglichen und eine Produktion von TNF-alpha auslösen (Chabot et al. 1997), das wiederum axonale Schäden hervorrufen kann (Selmaj et al. 1991; Shi et al. 1998). Da in der vorliegenden Arbeit nicht ZNS-spezifische Th1 Zellen CD40L und CD49d expremierten, ICAM-1 und B7-1 induzierten und axonalen Schaden hervorriefen, liegt die Vermutung nahe, dass die Subtypspezifität der T Zellen bedeutender als ihre Antigenspezifität ist, um Hirngewebe zu schädigen.

In der vorliegenden Studie induzieren Th2 Zellen in nur geringem Maße ICAM-1 und B7-1. Auf die Expression von B7-2 hatten Th2 Zellen keinen Einfluss. Th1 Zellen modulierten unabhängig von ihrer Antigenspezifität bei möglichem Zell-Zell-Kontakt alle drei kostimulatorischen Moleküle und riefen axonalen Schaden hervor. Die Regulation der kostimulatorischen Moleküle ist unmittelbar von der Ligation von CD40/CD40L abhängig. Da nur Th1 Zellen die Expression der kostimulatorischen Moleküle beeinflussten, ist es wahrscheinlich, dass auch nur Th1 Zellen über CD40L an CD40 ligierten. Th2 Zellen reduzierten die Th1 induzierte ICAM-1 Expression. Diese Umkehr der ICAM-1 Induktion könnte eine mögliche Erklärung für den protektiven Effekt von Th2 Zellen bei EAE durch die Produktion antiinflammatorischer Zytokine wie IL-4 sein. Die Mikrogliazellen könnten durch die Th2 Zellen - zumindest vorübergehend - ihre Kompetenz als APC verlieren und somit könnte eine beginnende Th1 Antwort unterdrückt werden.

5.1.3 Modulation der kostimulatorischen Moleküle B7-1 und B7-2: Th1 versus Th2 und der Einfluss der Antigenspezifität

In vivo Daten anderer Arbeitsgruppen zeigten eine Expression von B7-1 auf akuten MS-Läsionen (Williams et al. 1994; De Simone et al. 1995; Windhagen et al. 1995), und eine konstitutive B7-2-


65

Expression auf einer geringen Anzahl von Zellen im gesunden ZNS (Dangond et al. 1997). Sowohl in der Zone anterograder Degeneration (Bechmann et al. 2001) als auch nach einer traumatischen Schädigung der Wirbelsäule (Butovsky et al. 2001) wird B7-2 hochreguliert und mit einer protektiven Immunität assoziiert. Da Th1 Zellen EAE und MS auslösen, liegt es nahe, dass die B7-1-Hochregulation auch durch Th1 Zellen induziert wird. Diese Idee konnte durch die vorliegende Studie unterstützt werden. Ebenfalls für die prominente Rolle von B7-1 in EAE sprechen Studien mit blockierenden Antikörpern gegen B7-1 oder B7-2. Eine anti-B7-1 F(ab)-Fragment Therapie, aber nicht eine anti-B7-2 F(ab)-Fragment Therapie blockierte klinische Rückfälle und verringerte die ZNS Pathologie (Miller et al. 1995; Perrin et al. 1996; Vanderlugt et al. 1997). Eine Behandlung mit anti-B7-1 monoklonalen Antikörpern konnte EAE verhindern, während eine Behandlung mit anti-B7-2 mAK die Symptome der Krankheit verstärkte (Kuchroo et al. 1995). In anderen Studien wird berichtet, dass eine Therapie mit anti-B7-2 mAk in einem NOD Modell für autoimmune Diabetes die Neuropathie verhindern kann (Lenschow et al. 1995b). Weiterhin wurde von Girvin et al. (2000) berichtet, dass der klinische Verlauf in B7-1 defizienten Tieren etwa dem bei Wildtyptieren entspricht, während B7-2 defiziente Tiere einen wesentlich abgeschwächteren Krankheitsverlauf zeigen. Wenn beide Moleküle B7-1 und B7-2 fehlen oder der kostimulatorische Weg durch eine CD28 Defizienz blockiert ist, sind die Tiere vor EAE geschützt. Sowohl die Antikörper- als auch die knock-out-Methode haben ihre Schwächen und Stärken. Obwohl als antagonistisch beschrieben, ist eine agonistische Wirkung der Antikörper nicht auszuschließen. Ob die Antikörperdosis und -zirkulation hoch genug war, um sich an jedes B7 Molekül aller Zellen anzulagern, bleibt ebenfalls ungeklärt. Bei genetisch veränderten Tieren, die mit ihrer Defizienz schon geboren werden, ist nie auszuschließen, dass ein anderer Weg, ein anderes Molekül das knock-out-Molekül teilweise oder ganz kompensieren können. Es ist außerdem von Bedeutung, in welchem Tier- und Krankheitsmodell der EAE die Untersuchungen durchgeführt werden. Die Rolle von B7-1 und B7-2 sind während des Krankheitsverlaufes abhängig von der relativen Expression von CD28/CTLA-4 auf den T Zellen, der Art und Konzentration der beteiligten Zytokine und der Charakteristik der APC (Lenschow et al. 1996). Diese Parameter können sich von Modell zu Modell unterscheiden. Eindeutig geht jedoch aus der Literatur hervor, dass kostimulatorische Wege wie B7/CD28 und ICAM-1/LFA-1 entscheidend für den Beginn und Verlauf von autoimmunen Krankheiten wie der EAE oder Diabetes sind.

Die vorliegende Arbeit zeigt auch, dass neben der Ligation von CD40/CD40L vor allem lösliche Faktoren zur Regulation von kostimulatorischen Molekülen beitragen können, da auch ohne Zell-Zell-Kontakt durch MBP-spezifische Th1 Zellen B7-1 hoch- und B7-2 runterreguliert wurde. Die Produktion dieser löslichen Faktoren, die ohne direkten Kontakt mit Hirngewebe von den T Zellen sezerniert wurden und die Expression der B7-Moleküle modulierten, sind sowohl subtypabhängig als auch antigen- also stimulationsabhängig, da die OVA-spezifischen Th1 Zellen erst nach Gabe ihres Antigens die Expression der B7-Moleküle signifikant beeinflussen konnten. Es konnte keiner dieser Faktoren ermittelt, aber IFN-gamma kann aus mehreren Gründen ausgeschlossen werden. Erstens produzierten die OVA-spezifischen Th1 Zellen IFN-gamma, konnten aber ohne Zell-Zell-Kontakt und ohne Antigen die B7-1 Expression nicht signifikant erhöhen. Zweitens wurde bei direkter Gabe von IFN-gamma auf den Hirnschnitt keine signifikante Erhöhung von B7-1 gefunden (Gimsa, persönliche Mitteilung). Dies wiederum stimmt mit den Ergebnissen von Menendez-Iglesias et al. (1997) überein,


66

die zeigten, dass auch kultivierte Mikrogliazellen nach Behandlung mit IFN-gamma B7-2, aber nicht B7-1 expremierten. TNF-alpha, welches von T Zellen und von Mikrogliazellen produziert werden kann, sowie auch das T-Zell-Zytokin GM-CSF und das von Makrophagen produzierte IL-1â können keine B7-2 oder B7-1 Expression induzieren. Wei et. al. (1999) berichteten, dass im gleichen System GM-CSF beide kostimulatorischen Moleküle induzierte, und dass IFN-gamma die Expression von B7-2, aber nicht von B7-1 induzieren konnte. Beide Studien stimmen mit der vorliegenden Arbeit darin überein, dass mikrogliales B7-1 nicht durch IFN-gamma induziert werden kann. Da im Hirnschnitt-System B7-2 konstitutiv expremiert wird, kann daher die Induzierbarkeit durch IFN-gamma nicht verifiziert werde.

Th1 Zellen sind stärker von der Kostimulation abhängig als Th2 Zellen (Croft und Dubey 1997). In Einzelzellkulturen sind Mikroglia nicht in der Lage, Th2 Zellen zu restimulieren, während Th1 Zellen vollständig aktiviert wurden (Aloisi et al.1998). Die gleiche Studie zeigt, dass Th2 Zellen eher mit Astrozyten kommunizieren, die wiederum durch die Produktion von TGF-beta regulatorisch auf die Mikrogliazellen einwirken können. Im Zusammenhang mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit liegt die Vermutung nahe, dass die von der Kostimulation abhängigen Th1 Zellen selbst optimale Bedingungen für ihre Restimulation wie ICAM-1, MHC-II und B7-1 Induktion schaffen, während die Th2 Zellen diese Voraussetzungen zur Aktivierung von Th1 Zellen unterdrücken. Die Th2 Zellen wirken durch ihre Leitzytokine direkt deaktivierend auf die Mikroglia und indirekt suppressiv auf Th1 Zellen.

Wenn durch diese Arbeit auch einige Fragen beantwortet werden konnten, wurden - wie in der Wissenschaft üblich - mindestens genauso viele Fragen aufgeworfen. Mich interessieren dabei besonders folgende Punkte:

Kann die Ligation von B7-1 oder B7-2 mit CD28 oder CTLA-4 in der Mikrogliazelle unterschiedliche intrazelluläre Wege induzieren?

Welche Konsequenz hat die Ligation des einen oder anderen Rezeptors für die Mikrogliazelle selbst? Sind beide B7 Moleküle in einem regulatorischen Weg miteinander verbunden?

Und direkt auf das Hirnschnittkultursystem bezogen: Haben tatsächlich in allen experimentellen Ansetzen TCR/MHC-II, CD40/CD40L, B7/CD28 oder ICAM-1/LFA-1 Interaktionen stattgefunden? Welches sind die löslichen Faktoren, die zur Induktion von B7-1 führen?

5.2 Neuroprotektion

Im zweiten Teil der Studie wurde analysiert,

  1. ob die in vivo gefundenen Ergebnisse auf die in vitro Hirnschnittkultur anwendbar sind,
  2. welches protektive Potential MBP-spezifische Th1 versus MBP-spezifische Th2 Zellen haben,
  3. inwieweit das Phänomen antigen und antigenspezifitätsabhängig ist und
  4. welche Rolle der Aktivierungsgrad der Zellen in diesem Zusammenhang spielt.


67

Die positive Antwort, die sich aus Punkt I) ergibt, war die Vorraussetzung für die weiteren Untersuchungen. Genauso wie in vivo gezeigt, waren ZNS-spezifische oder Copaxone 1-spezifische T Zellen auch im Hirnschnitt in der Lage, sekundären neuronalen Schaden zu verhindern (Kipnis et al. 1999; Moalem et al. 1999; Butovsky et al. 2000). Die Ratten-T-Zellen hatten mit Sicherheit ein anderes Profil als die T Zellen, die aus den Mäusen gewonnen wurden. Das Profil ist mir nicht bekannt, es ist aber zu vermuten, dass durch die fehlende Restimulation die Zellen nicht optimal aktiviert waren. Hieraus lässt sich auch der Unterschied zur Wirkung der OVA-spezifischen T Zellen erklären. Die OVA-spezifischen T Zellen aus den transgenen Mäusen wurden - wie alle T Zellen 48 h nach der Restimulation eingesetzt, da dies der Zeitpunkt der optimalen Aktivierung war. Das bedeutete, dass die Aktivierungsmarker auf einem mittleren Level expremiert waren und die Leitzytokine wie IFN-gamma und IL-4 in hohem Maße produziert wurden. Aus den Ergebnissen in Punkt 4.3.6. wird deutlich, dass der Aktivierungsgrad der Zellen ihr Protektivitätspotential entscheidend beeinflusst. Die optimal voraktivierten Maus-OVA-Zellen waren protektiver als die nicht voraktivierten Ratten-OVA-Zellen.

Die Punkte II-IV) beschränken sich auf die Beschreibung des Phänomens der Protektion, ohne die dafür verantwortlichen Faktoren nennen zu können. MBP-spezifische Th2 Zellen haben ein höheres Protektionspotential als MBP- und OVA-spezifische Th1 Zellen und als OVA-spezifische Th2 Zellen ohne Antigenzugabe. Wird Antigen gegeben, sind MBP- und OVA-spezifische Th2 Zellen in gleichem Maße neuroprotektiv. Es konnte gezeigt werden, dass die Produktion neuroprotektiver Faktoren ohne Zell-Zell-Kontakt zwischen T Zellen und Hirngewebe in stärkerem Maße induziert wird und dass es lösliche Faktoren sind. Aus Punkt 4.3.6. wird deutlich, das diese Faktoren prinzipiell durch alle Arten von T Zellen nach entsprechender Stimulation produziert werden können, da alle Zellen nach unspezifischer Stimulation neuroprotektiv wirkten - unabhängig von ihrer Subtyp- und Antigenspezifität. Th2 Zellen produzieren mehr von diesen Faktoren als Th1 Zellen, da sie im „physiologisch“ aktivierten Zustand protektiver sind. Damit können viele Botenstoffe wie IL-2, IL-4, IL-5, IL-13, IFN-gamma, TNF-alpha, TNF-beta, GM-CSF ausgeschlossen werden, da sie entweder spezifische Th1 oder Th2 Zytokine sind. Interessante Kandidaten sind zum Beispiel IL-6, IL-10, TGF-beta und die neurotrophen Faktoren, da sie von beiden Zelltypen expremiert werden oder von ihnen induziert werden können und ihre neuroprotektive Wirkung sowohl in neuroinflammatorischen Erkrankungen als auch bei mechanischen Schädigungen des ZNS bekannt sind (Erhard et al. 1993; Santambrogio et al. 1994; Lambiase et al. 1997; Kerschensteiner et al. 2000).

Das ZNS ist ein immunprivilegiertes Organ, in dem die lokale Immunantwort begrenzt ist (Streilein et al. 1993, 1995) und die Reparaturkapazitäten gering sind (Faden et al. 1992,1993; McIntosh1993). Wie in anderen Organen auch ist jedoch das Eingreifen des Immunsystems notwendig, um eine Heilung und Genesung im ZNS herbeizuführen (Ben Nun et al. 1981; Burns 1983; Ota et al. 1990; Hickey et al. 1991; Rapalino 1993; Lazarow und Spiegler 1996; Martin 1997). Die vorliegende Arbeit zeigt, dass MBP-spezifische Th2 Zellen die höchste Kapazität besitzen, neuronales Gewebe vor sekundärer Degeneration zu schützen. Die Arbeiten mit transplantierten, ZNS-spezifischen T Zellen und der Immunisation mit Myelin-spezifischen Peptiden berichten alle von einer - wenn auch transienten EAE-ähnlichen Autoimmunerkrankung der Tiere (Kipnis et al. 1998; Cohen und Schwartz 2000; Moalem et al. 1999; Fisher et al. 2001). Da Th2 Zellen im Kontext der


68

EAE und MS keine Erkrankung hervorrufen bzw. therapeutisch wirken können, wäre die Injektion von MBP-spezifischen Th2 Zellen nach einem Hirntrauma die beste Möglichkeit, eine hohe Neuroprotektion ohne den Nebeneffekt einer autoimmunen Reaktion zu erlangen. Diese Untersuchungen werden zur Zeit im Labor von Prof. M. Schwartz durchgeführt.

Es ist erfreulich, dass diese Arbeit in Ansätzen die zwei Seiten der Autoimmunität im ZNS deutlich machen konnte. Wie so oft in der Wissenschaft ist die Wirkung bestimmter Faktoren kontextabhängig. Treffen MBP-spezifische T Zellen unter bestimmten, noch nicht vollständig geklärten Umständen auf intaktes Hirngewebe, wird dies durch direkte oder indirekte Wirkung angegriffen. Ist dieses Gewebe jedoch mechanisch geschädigt, können T Zellen der gleichen Art protektiv wirken. Vorausgesetzt dass Autoimmunität in bestimmten Zusammenhängen vorteilhaft ist, könnte damit auch das natürliche Vorkommen von autoantigenen T Zellen (Burns 1983) sowie das Phänomen des „Immunologischen Homunkulus“ (Cohen 1992) beantwortet werden. Die Immunologische Dominanz der hauptsächlichen Selbst-Antigene, die den Homunkulus bilden, wird durch natürlich vorkommende T und B Zellen und deren anti-idiotypisch, regulatorische Zellen enkodiert (Uder 1988). Tatsächlich wird die Idee, dass die primäre Aufgabe des Immunsystems die Unterscheidung zwischen Selbst und Nicht-Selbst ist, seit einiger Zeit in Frage gestellt. Die vorgestellten Ergebnisse stützen die Idee, dass das Immunsystem den Körper in seinen physiologischen Funktionen unterstützt, indem es Signale aus einem breiten Netzwerk von unterschiedlichen Geweben erhält ohne Selbst-Antigene notwendigerweise zu ignorieren. So kann das Immunsystem aktiviert werden, wenn Gefahr für den Körper droht, ohne exklusiv nur auf Signale von Pathogenen zu reagieren (Matzinger 1998; Anderson und Matzinger 2001).


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiML DTD Version 2.0
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Tue Oct 1 15:50:06 2002