zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)

von Diplom-Biologin Susanne Wolf,,
geborene Peter, geboren am 23.06.69

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin: Prof. Dr. J. Mlynek

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I: Prof. Dr. B. Ronacher

Gutachter:
1. Prof. Dr. R. Lucius
2. Prof. Dr. R. Nitsch
3. Assist. Prof. Dr. T. Möller

eingereicht am: 29.09.2001

Datum der Promotion: 10. 12.2001

Zusammenfassung

Die Infiltration von T Zellen in das Zentrale Nervensystem (ZNS) ist ein Charakteristikum neuroinflammatorischer Erkrankungen wie der Multiplen Sklerose (MS) und ihrem Tiermodell der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), und führt zur Aktivierung intrinsischer Hirnmakrophagen, den Mikrogliazellen, zu axonaler Schädigung sowie zum Zusammenbruch der Blut-Hirnschranke. Die T Zellen, welche als erste im Gehirn erscheinen, sind vom Subtyp Th1, spezifisch für Bestandteile der Myelinscheide, wie das myelinbasische Protein (MBP), produzieren inflammatorische Zytokine und rekrutieren andere unspezifische T Zellen und Makrophagen. Da sich diese Zellen des Immunsystems gegen körpereigene Bestandteile richten, spricht man von autoreaktiven T Zellen und einer autoimmunen Erkrankung. Im ersten Teil meiner Dissertation habe ich den Einfluss dieser autoreaktiven T Zellen auf den Aktivierungszustand von Mikrogliazellen mit Hilfe muriner Schnittkulturpräparate von Hippocampus und entorhinalem Kortex untersucht, welche den myelinisierten Fasertrakt Tractus perforans mit seinen Ursprungsneuronen und Zielzellen enthielten. Gering aktivierte MBP-spezifische T Zellen induzierten die Expression der Aktivitätsmarker MHC-II und ICAM-1 auf den Mikroglia und die damit verbundene axonale Schädigung (Phagozytose) im gleichen Maße wie hochaktivierte unspezifische T Zellen. Nur Th1 Zellen konnten Mikroglia aktivieren. MBP-spezifische Th2 Zellen hingegen reduzieren die Th1 induzierte Mikrogliaaktivierung (ICAM-1) auf Kontrollniveau. MBP-spezifische Th1 Zellen konnten die Expression von B7 auf Mikrogliazellen modulieren, während die MBP-spezifischen Th2 Zellen diese Eigenschaft nicht besaßen. Durch diese Befunde kann die prominente Rolle von autoreaktiven Th1 Zellen beim Auslösen neuroinflammatorischer Prozesse auf ihre einmalige Fähigkeit, Mikrogliazellen zu aktivieren und deren kostimulatorische Moleküle zu modulieren, zurückgeführt werden. Gleichzeitig bieten die Daten eine mögliche Erklärung für die protektive Rolle von Th2 Zellen bei MS und EAE.

Es ist bekannt, dass autoreaktive T Zellen, wie die MBP-spezifischen Th1 Zellen, auch im gesunden Zustand im humanen und murinen T-Zell-Repertoire vorhanden sind. Die physiologische Funktion dieser Zellen ist unklar. Untersuchungen am Nervus opticus sowie im Rückenmark in vivo belegen, dass autoreaktive T Zellen und Makrophagen die Reorganisationsprozesse im ZNS nach traumatischer Schädigung positiv beeinflussen. Diese bei neuroinflammatorischen Erkrankungen so destruktiv wirkenden autoreaktiven T Zellen verhindern nach einem experimentell gesetzten Primärschaden im ZNS das Fortschreiten der Schädigung und es kommt zu einer fast vollständigen Regeneration des Gewebes. Im zweiten Teil meiner Promotionsarbeit habe ich versucht, die Mechanismen, welche hinter dieser Protektion stecken aufzuspüren. Dazu habe ich ebenfalls das in vitro Hirnschnittmodell benutzt. Für diese Fragestellungen wurden Akutschnitte verwendet, die ein Modell für primäre Schädigung im ZNS darstellen. MBP-spezifische Th2 Zellen hatten ein größeres protektives Potential als MBP-spezifische Th1 Zellen. Die nicht ZNS-spezifischen Th1 und Th2 Zellen benötigten ihr Antigen (OVA-Peptid), um signifikant protektiv zu wirken. Durch eine Superstimulation der OVA- und MBP-spezifischen T Zellen wurde eine Neuroprotektion auf gleichem Niveau erreicht. Die Neuroprotektion nach primärer Schädigung von ZNS Gewebe ist somit antigen- und stimulationsabhängig und wird hauptsächlich von Th2 Zellen unterstützt.

Abstract

The invasion of T cells into the central nervous system (CNS) is a hallmark of neuro inflammatory diseases like multiple sclerosis (MS) and its rodent model, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), leading to activation of intrinsic macrophages, the microglia, axonal damage and break down of the blood brain barrier. The initial invading T cells are of the Th1 subtype and specific for parts of the myelin sheet like myelin basic protein (MBP). They produce inflammatory cytokines and recruit peripheral non-specific T cells and macrophages. Because these T cells are directed against a self antigen, they are called auto reactive T cells and the phenomenon an autoimmune disease. In the first part of my study I investigated the influence of auto reactive T cells on microglial cells' utilizing an organotypic slice culture system of hippocampus and entorhinal cortex. The slice culture contains a myelinated fibre tract - the tractus perforans - with its original and target neurons. Low activated MBP-specific T cells induced the expression of the activation markers ICAM-1 and MHC-II on microglia as well as microglial phagocytosis in the same manner as highly activated non-specific T cells. Only Th1 cells were able to activate microglia, while Th2 cells reduced the Th1 induced activation (ICAM-1 expression). MBP-specific Th1 cells could modulate the expression of co-stimulatory molecules B7-1 and B7-2, whereas MBP-specific Th2 cells could not. These findings could show why Th1 cells are responsible for EAE induction while Th2 cells can be protective.

Auto reactive T cells like MBP-specific T cells have been found in the normal human and murine T cell repertoire. The physiological function of these cells is still unclear. Studies using the models of optic nerve crush or spinal cord crush have shown that macrophages and auto reactive T cells are involved in reorganisation and regeneration after CNS trauma. These auto reactive T cells, which are usually known to be destructive, could prevent CNS tissue from secondary degeneration. In the second part of my study I tried to identify the mechanisms involved in this phenomenon. I also used the organotypic slice culture system. Immediately after preparation causing the primary injury the slices were cultivated with T cells. Th2 cells were found to be more potent to prevent form secondary damage than Th1 cells. The non-CNS specific OVA Th1 and Th2 cells required their antigen to be fully protective. When over stimulated, MBP- and OVA-specific Th1 and Th2 cells proved to be protective to the same extend. Neuroprotection after primary injury depends on the T cell‘s state of activation and their antigen specificity. Among the cells examined I found Th2 cells were most effective in preventing CNS tissue from secondary injury.

Schlagwörter:
Mikroglia, T Zellen, Th1, Th2, Neurodegeneration, Neuroprotektion, Multiple Sklerose

Keywords:
microglia, T cells, Th1, Th2, neurodegeneration, neuroprotection, multiple sclerosis

Inhaltsverzeichnis
Titelseite	Neurodegeneration und Neuroprotektion - ein Dialog zwischen Immunsystem und Gehirn auf Zellebene
1	Einleitung
1.1	Destruktive Autoimmunität im Zentralen Nervensystem (ZNS) - das Zusammenspiel von T Zellen und Mikrogliazellen
1.1.1	Multiple Sklerose
1.1.2	Experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis (EAE)
1.1.3	Die T Zellen und Kostimulation
1.1.4	Die Mikrogliazelle - die lokale APC des ZNS
1.1.5	Das Immunprivileg des ZNS
1.2	Benigne Autoimmunität \|--\| Die Rolle von autoreaktiven T Zellen bei der Verhinderung von sekundären neuronalen Schäden nach einer Verletzung des ZNS
2	Hypothesen
3	Material und Methoden
3.1	Die Hirnschnittkulturen - ein Modell für Neuroinflammation und Primärschaden von ZNS Gewebe
3.1.1	Zusammensetzung der Medien
3.1.1.1	Präparationsmedium (steril)
3.1.1.2	Kulturmedium (steril)
3.1.1.3	M Phosphatpuffer (PB)
3.1.2	Die entorhinal-hippocampale Hirnschnittkultur
3.1.2.1	Die Anatomie der entorhinal-hippocampalen Formation
3.1.2.2	Präparation
3.1.2.3	Kultivierung
3.1.2.4	Tracen mit Mini Ruby
3.1.2.5	Färben der toten Zellen im lebenden Hirnschnitt mit Propidiumjodid
3.1.2.6	Fixierung
3.1.2.7	Kryostatschnitte
3.2	T Zellen
3.2.1	Zusammensetzung der Medien
3.2.1.1	Phosphatpuffer/Saline (PBS)
3.2.1.2	FACS-Puffer
3.2.1.3	MACS-Puffer (steril)
3.2.1.4	T Zell Medium (cRPMI) für die Mauszellen (steril)
3.2.1.5	Propagationsmedium für die Rattenzellen (steril)
3.2.1.6	Proliferationsmedium für die Rattenzellen (steril)
3.2.1.7	Antigene zur Stimulation der Rattenzellen
3.2.1.8	Antigene zur Stimulation der Mauszellen
3.2.1.9	Zytokine
3.2.2	Die transgenen Mausstämme - Test auf Transgenität
3.2.3	Präparation der T Zellen aus Milz und Lymphknoten
3.2.4	Das MACS-System zum Sortieren der Zellen vor der Kokultivierung
3.2.5	Intrazelluläres Markieren von T Zellen
3.2.6	MBP-spezifische und unspezifisch aktivierte T Zellen
3.2.7	MBP- und OVA-spezifische Th1 und Th2 Zellen
3.2.8	MBP-, Copaxone 1- und OVA-spezifische T Zelllinien
3.3	Diagnostische Methoden
3.3.1	Immunhistochemie
3.3.1.1	Bildgebende Verfahren - Mikroskopie
3.3.1.1.1	Konfokale-Laserscanner-Mikroskopie
3.3.1.1.2	Fluoreszenz- und Durchlichtmikroskopie
3.3.2	Enzym-Linked-Immuno-Sorbent-Assay (ELISA)
3.3.3	Fluorescence activated cell sorting (FACS)
3.3.4	Auswertung und Analyse der Daten
4	Ergebnisse
4.1	Unterschiedlicher Einfluss von MBP spezifischen und unspezifischen T Zellen auf den Aktivierungszustand von Mikrogliazellen in der Hirnschnittkultur
4.1.1	Der Aktivierungsstatus der T Zellen
4.1.2	Die Zytokinproduktion der aktivierten T Zell-Populationen
4.1.3	Die Einwanderung der T Zellen in den Hirnschnitt
4.1.4	Das allgemeine Überleben des neuronalen Gewebes nach T Zell-Invasion
4.1.5	Die Mikrogliale Phagozytose von vormarkierten Axonen
4.1.6	Die Expression von MHC-II und ICAM-1 auf Mikrogliazellen
4.1.7	Der Einfluss von TNF- und IFN- auf die Aktivierung und Phagozytoseaktivität von Mikrogliazellen
4.2	Das Potential von Th1 und Th2 Zellen, Mikrogliazellen zu aktivieren und die Expression von kostimulatorischen Molekülen zu modulieren
4.2.1	Aktivierungsstatus, Zytokinproduktion und Transmigration der Th1 und Th2 Zellen
4.2.2	Erhöhte GFS-IB4 Reaktivität der Mikrogliazellen wird von Th1 Zellen induziert
4.2.3	Th1 und Th2 Zellen induzieren beide die CD40 Expression
4.2.4	ICAM-1 wird durch Th1 Zellen induziert und durch Th2 Zellen supprimiert
4.2.5	Die Expression von B7-1 und B7-2 wird von Th1 Zellen moduliert, von Th2 Zellen nicht
4.2.6	Die Abhängigkeit der Modulation der kostimulatorischen Moleküle B7-1 und B7-2 von der Antigenspezifität der T Zellen
4.3	Haben Th1 und Th2 Zellen ein unterschiedliches Potential, nach einer Verletzung von Hirngewebe den Sekundärschaden zu verhindern?
4.3.1	MBP-spezifische und Copaxone 1-spezifische T Zellen schützen vor neuronalem Schaden
4.3.2	MBP-spezifische Th2 Zellen können den Sekundärschaden stärker verhindern als MBP-spezifische Th1 Zellen
4.3.3	MBP-spezifische T Zellen regen die Mikroglia nicht zur Phagozytose an
4.3.4	Die Neuroprotektion der OVA-spezifischen T Zellen nach einem Primärschaden des ZNS wird durch antigenspezifische Stimulation verstärkt
4.3.5	Die Protektion ist vom Aktivierungsgrad der eingesetzten T Zellen abhängig
5	Diskussion
5.1	Neuroinflammation
5.1.1	CD4+ T Zellen invadieren Hirngewebe und induzieren axonalen Schaden: unspezifisch aktivierte T Zellen versus MBP-spezifisch aktivierte T Zellen
5.1.2	Der Einfluss der Subtypspezifität auf den Aktivierungszustand der Mikroglia: Th1 versus Th2
5.1.3	Modulation der kostimulatorischen Moleküle B7-1 und B7-2: Th1 versus Th2 und der Einfluss der Antigenspezifität
5.2	Neuroprotektion
Bibliographie	Literaturverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis	Abkürzungsverzeichnis
Danksagung
Lebenslauf
Selbständigkeitserklärung

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