Wolf,, Susanne: Neurodegeneration und Neuroprotektion - ein Dialog zwischen Immunsystem und Gehirn auf Zellebene
Neurodegeneration und Neuroprotektion -
ein Dialog zwischen Immunsystem und
Gehirn auf Zellebene
DISSERTATION

zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)

im Fach Biologie eingereicht an der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin


von Diplom-Biologin Susanne Wolf,,
geborene Peter, geboren am 23.06.69

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin: Prof. Dr. J. Mlynek

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I: Prof. Dr. B. Ronacher

Gutachter:
1. Prof. Dr. R. Lucius
2. Prof. Dr. R. Nitsch
3. Assist. Prof. Dr. T. Möller

eingereicht am: 29.09.2001

Datum der Promotion: 10. 12.2001

Zusammenfassung

Die Infiltration von T Zellen in das Zentrale Nervensystem (ZNS) ist ein Charakteristikum neuroinflammatorischer Erkrankungen wie der Multiplen Sklerose (MS) und ihrem Tiermodell der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), und führt zur Aktivierung intrinsischer Hirnmakrophagen, den Mikrogliazellen, zu axonaler Schädigung sowie zum Zusammenbruch der Blut-Hirnschranke. Die T Zellen, welche als erste im Gehirn erscheinen, sind vom Subtyp Th1, spezifisch für Bestandteile der Myelinscheide, wie das myelinbasische Protein (MBP), produzieren inflammatorische Zytokine und rekrutieren andere unspezifische T Zellen und Makrophagen. Da sich diese Zellen des Immunsystems gegen körpereigene Bestandteile richten, spricht man von autoreaktiven T Zellen und einer autoimmunen Erkrankung. Im ersten Teil meiner Dissertation habe ich den Einfluss dieser autoreaktiven T Zellen auf den Aktivierungszustand von Mikrogliazellen mit Hilfe muriner Schnittkulturpräparate von Hippocampus und entorhinalem Kortex untersucht, welche den myelinisierten Fasertrakt Tractus perforans mit seinen Ursprungsneuronen und Zielzellen enthielten. Gering aktivierte MBP-spezifische T Zellen induzierten die Expression der Aktivitätsmarker MHC-II und ICAM-1 auf den Mikroglia und die damit verbundene axonale Schädigung (Phagozytose) im gleichen Maße wie hochaktivierte unspezifische T Zellen. Nur Th1 Zellen konnten Mikroglia aktivieren. MBP-spezifische Th2 Zellen hingegen reduzieren die Th1 induzierte Mikrogliaaktivierung (ICAM-1) auf Kontrollniveau. MBP-spezifische Th1 Zellen konnten die Expression von B7 auf Mikrogliazellen modulieren, während die MBP-spezifischen Th2 Zellen diese Eigenschaft nicht besaßen. Durch diese Befunde kann die prominente Rolle von autoreaktiven Th1 Zellen beim Auslösen neuroinflammatorischer Prozesse auf ihre einmalige Fähigkeit, Mikrogliazellen zu aktivieren und deren kostimulatorische Moleküle zu modulieren, zurückgeführt werden. Gleichzeitig bieten die Daten eine mögliche Erklärung für die protektive Rolle von Th2 Zellen bei MS und EAE.

Es ist bekannt, dass autoreaktive T Zellen, wie die MBP-spezifischen Th1 Zellen, auch im gesunden Zustand im humanen und murinen T-Zell-Repertoire vorhanden sind. Die physiologische Funktion dieser Zellen ist unklar. Untersuchungen am Nervus opticus sowie im Rückenmark in vivo belegen, dass autoreaktive T Zellen und Makrophagen die Reorganisationsprozesse im ZNS nach traumatischer Schädigung positiv beeinflussen. Diese bei neuroinflammatorischen Erkrankungen so destruktiv wirkenden autoreaktiven T Zellen verhindern nach einem experimentell gesetzten Primärschaden im ZNS das Fortschreiten der Schädigung und es kommt zu einer fast vollständigen Regeneration des Gewebes. Im zweiten Teil meiner Promotionsarbeit habe ich versucht, die Mechanismen, welche hinter dieser Protektion stecken aufzuspüren. Dazu habe ich ebenfalls das in vitro Hirnschnittmodell benutzt. Für diese Fragestellungen wurden Akutschnitte verwendet, die ein Modell für primäre Schädigung im ZNS darstellen. MBP-spezifische Th2 Zellen hatten ein größeres protektives Potential als MBP-spezifische Th1 Zellen. Die nicht ZNS-spezifischen Th1 und Th2 Zellen benötigten ihr Antigen (OVA-Peptid), um signifikant protektiv zu wirken. Durch eine Superstimulation der OVA- und MBP-spezifischen T Zellen wurde eine Neuroprotektion auf gleichem Niveau erreicht. Die Neuroprotektion nach primärer Schädigung von ZNS Gewebe ist somit antigen- und stimulationsabhängig und wird hauptsächlich von Th2 Zellen unterstützt.

Abstract

The invasion of T cells into the central nervous system (CNS) is a hallmark of neuro inflammatory diseases like multiple sclerosis (MS) and its rodent model, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), leading to activation of intrinsic macrophages, the microglia, axonal damage and break down of the blood brain barrier. The initial invading T cells are of the Th1 subtype and specific for parts of the myelin sheet like myelin basic protein (MBP). They produce inflammatory cytokines and recruit peripheral non-specific T cells and macrophages. Because these T cells are directed against a self antigen, they are called auto reactive T cells and the phenomenon an autoimmune disease. In the first part of my study I investigated the influence of auto reactive T cells on microglial cells' utilizing an organotypic slice culture system of hippocampus and entorhinal cortex. The slice culture contains a myelinated fibre tract - the tractus perforans - with its original and target neurons. Low activated MBP-specific T cells induced the expression of the activation markers ICAM-1 and MHC-II on microglia as well as microglial phagocytosis in the same manner as highly activated non-specific T cells. Only Th1 cells were able to activate microglia, while Th2 cells reduced the Th1 induced activation (ICAM-1 expression). MBP-specific Th1 cells could modulate the expression of co-stimulatory molecules B7-1 and B7-2, whereas MBP-specific Th2 cells could not. These findings could show why Th1 cells are responsible for EAE induction while Th2 cells can be protective.

Auto reactive T cells like MBP-specific T cells have been found in the normal human and murine T cell repertoire. The physiological function of these cells is still unclear. Studies using the models of optic nerve crush or spinal cord crush have shown that macrophages and auto reactive T cells are involved in reorganisation and regeneration after CNS trauma. These auto reactive T cells, which are usually known to be destructive, could prevent CNS tissue from secondary degeneration. In the second part of my study I tried to identify the mechanisms involved in this phenomenon. I also used the organotypic slice culture system. Immediately after preparation causing the primary injury the slices were cultivated with T cells. Th2 cells were found to be more potent to prevent form secondary damage than Th1 cells. The non-CNS specific OVA Th1 and Th2 cells required their antigen to be fully protective. When over stimulated, MBP- and OVA-specific Th1 and Th2 cells proved to be protective to the same extend. Neuroprotection after primary injury depends on the T cell‘s state of activation and their antigen specificity. Among the cells examined I found Th2 cells were most effective in preventing CNS tissue from secondary injury.

Schlagwörter:
Mikroglia, T Zellen, Th1, Th2, Neurodegeneration, Neuroprotektion, Multiple Sklerose

Keywords:
microglia, T cells, Th1, Th2, neurodegeneration, neuroprotection, multiple sclerosis


Seiten: [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79] [80] [81] [82] [83] [84]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteNeurodegeneration und Neuroprotektion - ein Dialog zwischen Immunsystem und Gehirn auf Zellebene
1 Einleitung
1.1Destruktive Autoimmunität im Zentralen Nervensystem (ZNS) - das Zusammenspiel von T Zellen und Mikrogliazellen
1.1.1Multiple Sklerose
1.1.2Experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis (EAE)
1.1.3Die T Zellen und Kostimulation
1.1.4Die Mikrogliazelle - die lokale APC des ZNS
1.1.5Das Immunprivileg des ZNS
1.2Benigne Autoimmunität \|--\| Die Rolle von autoreaktiven T Zellen bei der Verhinderung von sekundären neuronalen Schäden nach einer Verletzung des ZNS
2 Hypothesen
3 Material und Methoden
3.1Die Hirnschnittkulturen - ein Modell für Neuroinflammation und Primärschaden von ZNS Gewebe
3.1.1Zusammensetzung der Medien
3.1.1.1Präparationsmedium (steril)
3.1.1.2Kulturmedium (steril)
3.1.1.3M Phosphatpuffer (PB)
3.1.2Die entorhinal-hippocampale Hirnschnittkultur
3.1.2.1Die Anatomie der entorhinal-hippocampalen Formation
3.1.2.2Präparation
3.1.2.3Kultivierung
3.1.2.4Tracen mit Mini Ruby
3.1.2.5Färben der toten Zellen im lebenden Hirnschnitt mit Propidiumjodid
3.1.2.6Fixierung
3.1.2.7Kryostatschnitte
3.2T Zellen
3.2.1Zusammensetzung der Medien
3.2.1.1Phosphatpuffer/Saline (PBS)
3.2.1.2FACS-Puffer
3.2.1.3MACS-Puffer (steril)
3.2.1.4T Zell Medium (cRPMI) für die Mauszellen (steril)
3.2.1.5Propagationsmedium für die Rattenzellen (steril)
3.2.1.6Proliferationsmedium für die Rattenzellen (steril)
3.2.1.7Antigene zur Stimulation der Rattenzellen
3.2.1.8Antigene zur Stimulation der Mauszellen
3.2.1.9Zytokine
3.2.2Die transgenen Mausstämme - Test auf Transgenität
3.2.3Präparation der T Zellen aus Milz und Lymphknoten
3.2.4Das MACS-System zum Sortieren der Zellen vor der Kokultivierung
3.2.5Intrazelluläres Markieren von T Zellen
3.2.6MBP-spezifische und unspezifisch aktivierte T Zellen
3.2.7MBP- und OVA-spezifische Th1 und Th2 Zellen
3.2.8MBP-, Copaxone 1- und OVA-spezifische T Zelllinien
3.3Diagnostische Methoden
3.3.1Immunhistochemie
3.3.1.1Bildgebende Verfahren - Mikroskopie
3.3.1.1.1Konfokale-Laserscanner-Mikroskopie
3.3.1.1.2Fluoreszenz- und Durchlichtmikroskopie
3.3.2Enzym-Linked-Immuno-Sorbent-Assay (ELISA)
3.3.3Fluorescence activated cell sorting (FACS)
3.3.4Auswertung und Analyse der Daten
4 Ergebnisse
4.1Unterschiedlicher Einfluss von MBP spezifischen und unspezifischen T Zellen auf den Aktivierungszustand von Mikrogliazellen in der Hirnschnittkultur
4.1.1Der Aktivierungsstatus der T Zellen
4.1.2Die Zytokinproduktion der aktivierten T Zell-Populationen
4.1.3Die Einwanderung der T Zellen in den Hirnschnitt
4.1.4Das allgemeine Überleben des neuronalen Gewebes nach T Zell-Invasion
4.1.5Die Mikrogliale Phagozytose von vormarkierten Axonen
4.1.6Die Expression von MHC-II und ICAM-1 auf Mikrogliazellen
4.1.7Der Einfluss von TNF-alpha und IFN-gamma auf die Aktivierung und Phagozytoseaktivität von Mikrogliazellen
4.2Das Potential von Th1 und Th2 Zellen, Mikrogliazellen zu aktivieren und die Expression von kostimulatorischen Molekülen zu modulieren
4.2.1Aktivierungsstatus, Zytokinproduktion und Transmigration der Th1 und Th2 Zellen
4.2.2Erhöhte GFS-IB4 Reaktivität der Mikrogliazellen wird von Th1 Zellen induziert
4.2.3Th1 und Th2 Zellen induzieren beide die CD40 Expression
4.2.4ICAM-1 wird durch Th1 Zellen induziert und durch Th2 Zellen supprimiert
4.2.5Die Expression von B7-1 und B7-2 wird von Th1 Zellen moduliert, von Th2 Zellen nicht
4.2.6Die Abhängigkeit der Modulation der kostimulatorischen Moleküle B7-1 und B7-2 von der Antigenspezifität der T Zellen
4.3Haben Th1 und Th2 Zellen ein unterschiedliches Potential, nach einer Verletzung von Hirngewebe den Sekundärschaden zu verhindern?
4.3.1MBP-spezifische und Copaxone 1-spezifische T Zellen schützen vor neuronalem Schaden
4.3.2MBP-spezifische Th2 Zellen können den Sekundärschaden stärker verhindern als MBP-spezifische Th1 Zellen
4.3.3MBP-spezifische T Zellen regen die Mikroglia nicht zur Phagozytose an
4.3.4Die Neuroprotektion der OVA-spezifischen T Zellen nach einem Primärschaden des ZNS wird durch antigenspezifische Stimulation verstärkt
4.3.5Die Protektion ist vom Aktivierungsgrad der eingesetzten T Zellen abhängig
5 Diskussion
5.1Neuroinflammation
5.1.1CD4+ T Zellen invadieren Hirngewebe und induzieren axonalen Schaden: unspezifisch aktivierte T Zellen versus MBP-spezifisch aktivierte T Zellen
5.1.2Der Einfluss der Subtypspezifität auf den Aktivierungszustand der Mikroglia: Th1 versus Th2
5.1.3Modulation der kostimulatorischen Moleküle B7-1 und B7-2: Th1 versus Th2 und der Einfluss der Antigenspezifität
5.2Neuroprotektion
Bibliographie Literaturverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis
Danksagung
Lebenslauf
Selbständigkeitserklärung

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Schematische Darstellung des entorhinalen Kortex und Hippocampus
Abb. 2: Schematische Darstellung der Lage des Hippocampus
Abb. 3: Schematische Darstellung der Tracing-Technik:
Abb. 4: Schematische Darstellung eines Dotplots für zwei Fluoreszenzen (FITC für z.B. CD4+ und PE für z.B. Vß8.1/2).
Abb. 5: Schematische Darstellung des Versuchsablaufs.
Abb. 6: Aktivitätsstatus der unspezifisch mit PMA (5 ng/ml)/Ionomycin (1 µg/ml) und MBP-spezifisch (3 µg/ml) stimulierten T Zellen.
Abb. 7: Die Zytokinproduktion der mit PMA (5ng/ml)/Ionomycin (1 µg/ml) oder MBP (3 µg/ml) stimulierten T Zellen nach 48 h Stimulation und 24 h Kokultivierung mit Hirnschnitten im Überstand der Kokulturen gemessen
Abb. 8: Invasion von T Zellen und allgemeiner Gewebeschaden
Abb. 9: Tracing des Tractus perforans (TP)
Abb. 10: Aktivierungsstatus der Mikroglia nach Behandlung mit PMA/Ionomycin- oder MBP-aktivierten T Zellen.
Abb.11 : Aktivierungsstatus der Mikroglia nach T Zellinvasion
Abb. 12: Aktivierung der Mikroglia durch Zytokine
Abb. 13: Aktivierungsstatus der MBP-spezifischen Th1 und Th2 Zellen nach Stimulation mit MBP.
Abb. 14: Zytokinproduktion der MBP- und OVA-spezifischen Th1 und Th2 Zellen (3-5 Millionen Zellen).
Abb. 15: Invasion von T Zellen in den Hirnschnitt
Abb. 16: Aktivitätsstatus der Mikroglia nach Behandlung mit MBP-spezifischen Th1 oder Th2 Zellen
Abb. 17: Aktivierungsstatus der Mikroglia nach Invasion von MBP-spezifischen Th1 und Th2 Zellen
Abb. 18: Expression der B7-Moleküle auf Mikroglia nach Behandlung mit MBP-spezifischen Th1 und Th2 Zellen mit (+Ag) und ohne (-Ag) Antigen; mit (K+) und ohne (K-) Zell-Zell-Kontakt.
Abb. 19: Expression der B7-Moleküle auf Mikroglia nach Behandlung mit OVA-spezifischen Th1 und Th2 Zellen mit (+Ag) und ohne (-Ag) Antigen; mit (K+) und ohne (K-) Zell-Zell-Kontakt.
Abb. 20: Die Modulation der kostimulatorischen Moleküle B7-1 und B7-2 durch MBP- und OVA-spezifische Th1 und Th2 Zellen.
Abb. 21: Aktivierungsstatus der OVA-spezifischen Th1 und Th2 Zellen nach Stimulation mit Antigen.
Abb. 22: Neuronales Überleben nach Behandlung mit OVA-, MBP- und COP- spezifischen T Zellen.
Abb. 23: Neuronales Überleben nach Behandlung mit MBP-spezifischen Th1 und Th2 Zellen mit (K+) und ohne (K-) Zell-
Zell-Kontakt.
Abb. 24: Neuroprotektion nach Behandlung mit MBP-spezifischen Th1 und Th2 Zellen
Abb. 25: Neuroprotektion: keine Phagozytose nach Th1 und Th2 Behandlung
Abb. 26: Neuronales Überleben nach Behandlung mit MBP- und OVA-spezifischen Th1 und Th2 Zellen mit (+Ag) und ohne (-Ag) Antigen ohne Zell-Zell-Kontakt (K-).
Abb. 27: Aktivierungsstatus der MBP- und OVA-spezifischen Th1 und Th2 Zellen nach Stimulation mit 5 ng/ml PMA und 1 µg/ml Ionomycin.
Abb. 28: Neuronales Überleben nach Behandlung mit MBP- und OVA-spezifischen Th1 und Th2 Zellen nach Stimulation mit PMA und Ionomycin ohne Zell-Zell-Kontakt.

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Tue Oct 1 15:50:06 2002